CN111679034A - 一种苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于耐低温玉米自交系鉴定筛选技术领域，具体涉及一种苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法。所述耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法包括：对待测玉米苗进行低温胁迫处理及常温处理；检测两种处理方式所得玉米苗的指标；根据检测结果筛选出耐低温玉米自交系；其中，所述低温胁迫处理的条件为：6‑8℃培养7天；所述指标为苗长、叶绿素含量、脯氨酸含量。本发明确定了玉米自交系苗期低温鉴定的最佳处理条件，苗期耐低温性强的自交系在低温胁迫下幼苗植株形态较好，脯氨酸含量升高明显，叶绿素含量下降较少，能减少低温对植株苗期生长造成的损害，为苗期的生长发育提供了有力的保障，为大规模鉴定和筛选耐低温玉米种质奠定了基础。

Description

一种苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法

技术领域

本发明属于耐低温玉米自交系鉴定筛选技术领域，具体涉及一种苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法。

背景技术

玉米原产于热带和亚热带地区，整个生育时期需要较高的温度。玉米生长发育的早期阶段对低温胁迫较为敏感，此时遭遇低温会影响种子萌发，延迟出苗，降低出苗率，抑制幼苗、根、茎、叶的生长发育，阻碍光合作用，降低幼苗活力，极大地限制了其栽培范围和产量潜力。

早春低温冷害是影响玉米产量水平提高的重要因素之一，导致玉米大面积减产，虽然通过包衣手段可提高玉米种子的耐低温能力，但存在环境污染、成本增加、受环境影响大等问题。因此选育耐低温玉米新自交系仍然是提高玉米耐低温能力最有效措施。

现有研究表明，低温胁迫处理对玉米的生长速度、干物质积累、叶面积变化、组织变色等方面影响较为显著，利用低温胁迫处理对玉米的各方面影响程度能够鉴定筛选耐低温的玉米种质。但低温胁迫处理条件选择不适合，难以得到全面且准确的筛选结果。例如胁迫温度相对过高，无法对玉米植株苗期产生足够的选择压力；而胁迫温度相对过低，则会导致植株停止生长，甚至死亡；因此选择合适的低温胁迫处理条件是提高筛选准确性的技术难点之一。

CN107889578A公开了一种玉米萌发期耐低温指标筛选方法，通过该方法获得萌发期耐低温性较强的材料自交系丹340。然而技术人员在研究中发现，玉米在萌发期和苗期的生长是受不同的遗传因素控制的，萌发期与苗期耐低温性存在差异，以萌发期耐低温指标筛选苗期耐低温材料结果不够准确和全面，自交系丹340为苗期耐低温性最弱的材料。可见，CN107889578A所述筛选方法仅对玉米萌发期有效，玉米萌发期耐低温指标筛选方法无法鉴定筛选苗期玉米种质。

此外，玉米种质耐低温性能的筛选结果还与检测指标的选择有关。由于苗期玉米自交系的耐低温特性是由多基因控制的数量遗传性状，现有筛选方法通常选择生理生化指标或生长性能指标作为单一化指标不利于鉴定结果的准确性的提高；但若采取多个生理生化指标、生长性能指标作为筛选指标，又会造成检测成本过高，检测时间过长，操作复杂及因此带来较大误差等问题，难以准确反映玉米苗期耐低温性的强弱；此外，现有技术也有将低温与常温下某些性状的测定值的比值作为指标，但由于多数情况下相对值间差异不够显著，也难以准确评价苗期玉米自交系的耐低温特性。

因此，如何选择合适的低温胁迫处理条件及检测指标，使其既能够节省筛选时间、简化操作、降低检测成本，又能保证检测结果的准确性，成为苗期耐低温玉米自交系筛选技术亟需解决的技术难题之一。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法。本发明所述的鉴定筛选方法不仅实现了对苗期玉米自交系耐低温性能准确且全面的筛选鉴定，而且还能减少低温胁迫处理对玉米苗期生长造成的损害，为玉米苗期的生长发育提供了有力的保障，同时也为大规模鉴定和筛选耐低温玉米种质奠定了基础。

本发明所述的苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法，包括：对待测玉米苗分别进行低温胁迫处理及常温处理；检测两种处理方式所得玉米苗的指标；根据检测结果筛选出苗期耐低温玉米自交系；其中，所述低温胁迫处理的条件为：6-8℃培养7天；所述指标为苗长、叶绿素含量、脯氨酸含量。

本案研究发现，采取6-8℃低温胁迫处理7天的低温胁迫处理条件，既可以对苗期玉米自交系产生足够的选择压力，又能够最大程度减少低温胁迫对植株苗期生长造成的损害，为苗期的生长发育提供了有力的保障；同时，该低温胁迫处理条件可使各玉米自交系间差异显著，容易区别，从而排除因培养、处理条件等操作对检测结果的干扰，提高了筛选的准确性。

而且，本案筛选苗长、叶绿素含量、脯氨酸含量这三项指标作为检测指标，利用其形成优势互补，既可避免因单一指标检测带来的准确率低的问题，又可解决因过多指标检测导致的检测效率低、成本高、操作复杂的缺陷。特别是，本案不仅筛选出合适的检测指标，并且以低温胁迫处理与常温处理两种方式下测试值的比值作为筛选依据，能够更进一步放大玉米自交系本身性状及生理生化指标差异，体现自交系间耐低温性的强弱，从而更有助于提高检测结果的准确性。

优选地，所述低温胁迫处理的温度为6℃。

根据本发明的一些实施例，所述检测包括：统计苗长、叶绿素含量及脯氨酸含量；以三次重复平均值作为统计单位，统计计算公式如下：

苗长：玉米幼苗地上部分直到叶片可以伸展的最高点；

相对苗长＝(低温胁迫处理的苗长/常温处理的苗长)*100％；

叶绿素a浓度(mg/L)：Ca＝12.7A663-2.69A645；

叶绿素b浓度(mg/L)：Cb＝22.9A645-4.68A663；

叶绿素总浓度(mg/L)：C(a+b)＝Ca+Cb；

相对叶绿素＝(低温胁迫处理的叶绿素总浓度/常温处理的叶绿素总浓度)*100％；

相对脯氨酸＝(低温胁迫处理的脯氨酸含量/常温处理的脯氨酸含量)*100％。

根据本发明的一些实施例，所述鉴定筛选方法还包括：对检测结果进行数据处理及分析。所述数据处理及分析的方法可采用本领域常用方法，如Excel、SPSS23.0等。

根据本发明的一些实施例，所述低温胁迫处理采取光照培养，相对湿度保持在70-75％。

根据本发明的一些实施例，所述玉米苗为两叶一心期的玉米苗。

所述玉米苗可通过对玉米自交系种子进行自行培育而获得的。

本发明中，所述自行培育的步骤如下：

(1)种子的选取：选取玉米棒上长势整齐的种子，去掉头和尾，种子饱满度好，大小一致，每个温度三次重复，每次重复二十粒种子；

(2)盖花土：选取普通花土，用直径15cm花盆底装10cm花土，种胚朝上，待种子排列整齐后再盖4cm花土；

(3)幼苗培养：将发芽盒放入人工气候箱进行培养，温度保持在25℃，相对湿度保持在75％，恒温培养至两叶一心期。

本发明的有益效果如下：

本发明研究发现6℃低温处理7天为玉米自交系苗期低温鉴定的最适合的低温胁迫处理条件，苗期耐低温性强的自交系在此低温胁迫条件下幼苗植株形态较好，脯氨酸含量升高明显，叶绿素含量下降较少，能够对玉米苗期耐低温性能进行准确且全面的鉴定，同时还能减少低温胁迫处理对植株苗期生长造成的损害，为苗期的生长发育提供了有力的保障，同时也为大规模鉴定和筛选耐低温玉米种质奠定了基础。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的四144低温6℃和25℃处理7天的比较图。

图2是本发明实施例1提供的B73低温6℃和25℃处理7天的比较图。

图3是实施例1提供的8份玉米自交系的聚类分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1一种苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法

本实施例提供一种苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法，通过幼苗低温胁迫试验对8份东北地区生产上主要利用的玉米自交系进行苗期耐低温性鉴定，以评价这些自交系的耐低温性。

该玉米自交系种子由东北农业大学玉米研究所提供。试验材料名称及系谱见表1；

表1 8份玉米自交系种子

具体步骤如下：

(1)种子的选取：选取玉米棒上长势整齐的种子，去掉头和尾，种子饱满度好，大小一致，共120粒；将种子平均分成6组，每组20粒；其中低温胁迫处理3组，常温处理3组；

(2)盖花土：选取普通花土，用直径15cm花盆底装10cm花土，种胚朝上，待种子排列整齐后再盖4cm花土；

(3)幼苗培养：将发芽盒放入人工气候箱进行培养，温度保持在25℃，相对湿度保持在75％，恒温培养至两叶一心期；

(4)处理：将幼苗分别放入6℃和25℃培养箱中，光照培养7d，相对湿度保持在75％；

(5)指标检测：于第7天测定幼苗苗长、叶绿素含量和脯氨酸含量；

具体操作为以三次重复平均值作为统计单位，统计苗长，叶绿素含量、脯氨酸含量；

计算公式如下：

苗长：玉米幼苗地上部分直到叶片可以伸展的最高点；

相对苗长＝(低温胁迫处理的苗长/常温处理的苗长)*100％；

叶绿素a浓度(mg/L)：Ca＝12.7A663-2.69A645；

叶绿素b浓度(mg/L)：Cb＝22.9A645-4.68A663；

叶绿素总浓度(mg/L)：C(a+b)＝Ca+Cb；

相对叶绿素＝(低温胁迫处理的叶绿素总浓度/常温处理的叶绿素总浓度)*100％；

相对脯氨酸＝(低温胁迫处理的脯氨酸含量/常温处理的脯氨酸含量)*100％。

(6)鉴定筛选：通过对所述低温胁迫处理及常温处理后测得的指标数据进行数据处理及分析，鉴定筛选出耐低温玉米苗。所述数据处理及分析的方法可采用本领域常用方法，如Excel、SPSS23.0等。

具体检测及筛选结果如下：

1、苗期低温胁迫下玉米自交系长势及生理生化指标的检测结果，如表2。

表2低温胁迫下玉米自交系苗长测试结果

自交系

6℃苗长/cm

25℃苗长/cm

相对苗长

DNF266

26.67

a

37.00

abc

72.15％

a

中451

10.33

ef

36.33

bcd

28.51％

f

鲁原92

16.00

bc

32.33

de

49.46％

c

B73

14.00

cd

40.33

ab

34.72％

e

吉853

12.33

de

35.33

cde

35.06％

e

黄早四

9.67

f

41.00

a

23.62％

g

四144

17.00

b

32.00

e

53.55％

b

丹340

15.00

bc

36.33

bcd

41.29％

d

注：表2中字母表示5％水平差异显著水平

苗长可以反映植株的活力。从表2中可知，在25℃常温下，8个玉米自交系的苗长均达30cm以上，说明这些自交系苗期活力较高。在6℃低温胁迫下，各自交系苗长较对照均不同程度的降低。以相对苗长为指标，DNF266的耐低温性最强，可达72.15％，四144耐低温性较强，鲁原92、丹340次之，B73、吉853、中451耐低温性较弱，黄早四的耐低温性最弱，为23.62％。

图1是本发明实施例1提供的四144低温6℃和25℃处理7天的比较图。

图2是本发明实施例1提供的B73低温6℃和25℃处理7天的比较图。

2、苗期低温胁迫下玉米自交系脯氨酸含量的检测结果，如表3。

表3低温胁迫下玉米自交系脯氨酸含量测试结果

注：表3中字母表示5％水平差异显著水平

由表3可知，低温胁迫可以明显地增加玉米体内脯氨酸含量，低温胁迫下脯氨酸浓度提高显著的玉米自交系，具有较强的耐低温特性。与25℃常温下相比，6℃低温胁迫下各自交系的脯氨酸含量有不同程度的上升。依据相对脯氨酸含量，DNF266的脯氨酸含量较对照变化较大，耐低温性最强，而吉853和丹340的脯氨酸含量较对照变化较小，耐低温性较弱。

3、苗期低温胁迫下玉米自交系叶绿素含量的检测结果，如表4。

表4低温胁迫下玉米自交系叶绿素含量测试结果

自交系

6℃叶绿素含量

25℃叶绿素含量

相对叶绿素含量

DNF266

26.50mg/g

e

32.37mg/g

d

81.87％

b

中451

37.93mg/g

bc

46.30mg/g

a

81.93％

b

鲁原92

28.60mg/g

d

38.47mg/g

c

74.35％

d

B73

23.40mg/g

c

38.50mg/g

f

60.78％

g

吉853

26.13mg/g

f

38.00mg/g

d

68.77％

e

黄早四

24.67mg/g

a

31.93mg/g

e

77.25％

c

四144

30.80mg/g

a

34.60mg/g

b

89.02％

a

丹340

28.47mg/g

b

42.80mg/g

c

66.51％

f

注：表4中字母表示5％水平差异显著水平

由表4可知，在6℃低温胁迫下，各自交系的叶绿素含量较25℃常温下均有所下降，说明低温胁迫影响了各自交系苗期的光合作用。依据叶绿素含量，四144的叶绿素含量较对照降低的程度最小，耐低温性最强，而吉853和B73的叶绿素含量较对照降低的程度较大，耐低温性较弱。

4、不同耐低温性玉米自交系的聚类分析

以8个玉米自交系在25℃和6℃下的苗长、脯氨酸含量和叶绿素含量及其相对值共9个指标进行聚类分析，8个自交系可分为4类，如图3所示。

类Ⅰ为耐低温性强的自交系DN266和鲁原92，其在6℃低温胁迫下苗长和生理生化指标受影响较小。

类Ⅱ为耐低温性较强的自交系中451、B73和黄早四，其在6℃低温胁迫下苗长和生理生化指标受影响较小。

类III为为耐低温性较弱的自交系四144，其在6℃低温胁迫下苗长和生理生化指标受影响很大。

类Ⅳ为耐低温性最弱的自交系吉853和丹340，其在6℃低温胁迫下苗长和生理生化指标受影响较大。

5、4类不同耐低温性玉米自交系各性状平均相对值

表5 4类不同耐低温性玉米自交系各性状平均相对值

类别	相对苗长	相对脯氨酸	相对叶绿素
				I	0.61	2.91	0.78
II	0.29	1.73	0.89
				III	0.54	1.70	0.68
Ⅳ	0.38	1.34	0.73

上述鉴定筛选结果与8个玉米自交系实际耐低温性能相符合，验证了本发明所述鉴定筛选方法的可行性。

为了进一步验证本发明所述的鉴定筛选方法所取得的技术效果，申请人还提供以下对比试验：

1、不同温度处理和不同时间处理对玉米幼苗苗长的影响

表6不同温度处理和不同时间处理对玉米幼苗苗长

由表6可知，4℃条件下，幼苗处理7天和九天后幼苗死亡；低温处理9天后，少数自交系幼苗出现死亡；而本发明所述的6℃7天的低温胁迫处理条件能够最大程度减少低温对植株苗期生长造成的损害，为苗期的生长发育提供了有力的保障。

2、玉米自交系在各温度处理下的相对苗长

幼苗的苗长是衡量幼苗苗期耐低温的一个重要指标。玉米在苗期受到低温胁迫，会导致株高降低及出叶时间推迟。不同自交系的幼苗在低温下的生长能力有明显差异。以同步培养时间7天计算，各玉米自交系在各温度处理下的相对苗长测试结果如表7所示。

表7玉米自交系在各温度处理下的相对苗长

由表7可知，苗长能明显反映自交系间种子苗期耐低温的差异。就变异系数而言，6℃的苗长变异系数均最大，为0.36。就标准差而言，6℃苗长的标准差最大为0.15。说明在本发明所述的低温胁迫处理条件(6℃)下处理的各自交系间差异较大，容易区别自交系间差异，适合作为苗期耐低温性鉴定的低温胁迫条件。

3、玉米自交系在不同低温时间处理下的相对苗长

表8玉米自交系在不同低温时间处理下的相对苗长

由表8可知，就变异系数而言，低温处理7天的玉米自交系苗长的变异系数均最大分别为0.36，低温处理9天在苗长上显示出较大的选择压力，部分自交系植株出现死亡，因此未能有效的对不同自交系分级。就标准差而言，低温处理7天的玉米自交系苗长的标准差最大为0.15，说明低温处理7天时各自交系间差异较大，容易区别自交系间差异，适合作为苗期种子耐低温性鉴定的低温胁迫条件。

4、其他检测指标的考察

本申请还考察了在上述低温胁迫处理条件下，利用玉米幼苗的相对电导率指标作为筛选指标的鉴定结果，如表9所示。

表9低温胁迫处理条件下玉米幼苗的相对电导率的检测结果

自交系	第一次重复	第二次重复	第三次重复	第四次重复
					DNF266	1.67	25.15	0.54	0.03
中451	1.12	1.49	0.22	0.19
					B73	14.03	7.30	0.07	0.12
丹340	17.57	10.10	0.05	0.08
					鲁原92	9.17	3.18	0.06	0.09
吉853	1.89	5.14	0.12	0.12
					黄早四	7.65	5.01	0.07	0.08
四144	3.10	3.26	0.28	0.23

表10低温胁迫处理条件下苗期各玉米自交系的耐低温指标方差分析

注：*和**分别代表在0.05和0.01水平差异显著

由表9、表10可知，相对电导率在重复之间差异显著，但在自交系间差异不显著；而苗长、脯氨酸和叶绿素在多次重复之间差异不显著，但自交系间差异显著；说明本发明所选择的三个指标适合作为玉米自交系苗期耐低温性的筛选指标。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种苗期耐低温玉米自交系的鉴定筛选方法，其特征在于，包括：

对待测玉米苗分别进行低温胁迫处理及常温处理；

检测两种处理方式所得玉米苗的指标；

根据检测结果筛选出苗期耐低温玉米自交系；

其中，所述低温胁迫处理的条件为：6-8℃培养7天；

所述指标为苗长、叶绿素含量、脯氨酸含量。

2.根据权利要求1所述的鉴定筛选方法，其特征在于，所述低温胁迫处理的温度为6℃。

3.根据权利要求2所述的鉴定筛选方法，其特征在于，所述检测包括：统计苗长、叶绿素含量及脯氨酸含量；以三次重复平均值作为统计单位，统计计算公式如下：

苗长：玉米幼苗地上部分直到叶片可以伸展的最高点；

相对苗长＝(低温胁迫处理的苗长/常温处理的苗长)*100％；

叶绿素a浓度(mg/L)：Ca＝12.7A663-2.69A645；

叶绿素b浓度(mg/L)：Cb＝22.9A645-4.68A663；

叶绿素总浓度(mg/L)：C(a+b)＝Ca+Cb；

相对叶绿素＝(低温胁迫处理的叶绿素总浓度/常温处理的叶绿素总浓度)*100％；

相对脯氨酸＝(低温胁迫处理的脯氨酸含量/常温处理的脯氨酸含量)*100％。

4.根据权利要求3所述的鉴定筛选方法，其特征在于，所述鉴定筛选方法还包括：对检测结果进行数据处理及分析。

5.根据权利要求4所述的鉴定筛选方法，其特征在于，所述低温胁迫处理采取光照培养，相对湿度保持在70-75％。

6.根据权利要求5所述的鉴定筛选方法，其特征在于，所述玉米苗为两叶一心期的玉米苗。

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