CN116396976A - 通过单壁碳纳米管递送外源核酸到植物细胞的方法 - Google Patents
通过单壁碳纳米管递送外源核酸到植物细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116396976A CN116396976A CN202111611621.XA CN202111611621A CN116396976A CN 116396976 A CN116396976 A CN 116396976A CN 202111611621 A CN202111611621 A CN 202111611621A CN 116396976 A CN116396976 A CN 116396976A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- swnts
- dna
- rna
- complex
- swnt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002109 single walled nanotube Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 38
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 19
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims description 10
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 abstract description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 abstract 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 abstract 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 7
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010017472 Fumbling Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
- C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于单壁碳纳米管(SWNT)向植物细胞递送质粒DNA或mRNA的方法。所述的单壁碳纳米管能够高效的负载表达质粒DNA或RNA，能够将其递送至烟草叶片及水稻愈伤组织细胞中，并实现外源基因的表达。本发明提供的单壁碳纳米管具有较小的粒径，所述的递送方法无需任何外力，只需与愈伤组织共同孵育或直接侵染叶片即可实现外源核酸序列的递送，可作为有效递送基因编辑工具的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及递送外源核酸序列到植物细胞中的单壁碳纳米管复合物以及相应的转化方法。
背景技术
植物核酸序列递送系统--将外源核酸序列导入植物细胞的方法，是植物重要性状功能基因鉴定的前提和分子育种的基础，是植物分子育种技术中一项最基本的技术。根据转化过程中是否使用载体介导，通常可以分为载体介导转化和直接遗传转化。常用的载体介导法主要通过农杆菌侵染、病毒侵染、基因枪轰击和花粉管管道介导等转化方法进行遗传转化。但是农杆菌侵染法在双子叶植物中效率较高，而在单子叶植物中需要大量的摸索；病毒侵染法虽然在短时间内可获得较大的表达量，但每个宿主材料都要接种病毒载体，存在植株感染病毒的风险；基因枪法是常用的转基因手段，但是转化效率低、会产生大量嵌合体等问题，且不同的植物组织及材料会需要摸索不同的攻击速度；花粉管管道介导的基因转化方式则依赖于植物的开花授粉的时期。针对上述植物转基因技术当中的一些限制，研发新的基因编辑方法和挖掘新的核酸序列载体成为植物分子育种研究中的热点。
随着纳米生物技术的发展，纳米颗粒作为基因载体已广泛应用于动物细胞、医学领域和基因治疗等领域。纳米颗粒因其具有较大的比表面积可以高效的负载外源基因，且其毒性小、生物相容性好，能够保护外源基因免受核酸降解酶的干扰，相对于农杆菌或病毒改造的植物基因递送系统，纳米颗粒具有制备容易、稳定性好、容易修饰、生物和环境安全性高、能够跨物种转化等特点，正逐渐发展成为一类高效的植物基因编辑技术。
根据纳米材料的组成，可分为无机纳米材料和有机高分子纳米材料，目前应用于植物遗传转化的纳米基因载体以无机物纳米材料为主，包括以四氧化三铁构建的磁性纳米颗粒，以碳原子构成的单壁碳纳米管，以二氧化硅骨架构成的介孔二氧化硅纳米载体及胶体金纳米颗粒。这些纳米载体在对植物进行遗传转化时会使用到外力如磁场、真空和基因枪轰击的方法。因此，业内亟需一种简单可行、不借助外力因素的基于纳米颗粒介导的植物遗传转化方法。
发明内容
为了解决现有技术方法存在的限制，本发明目的之一在于提供一种单壁碳纳米管(SWNT)与外源DNA/RNA的复合物及其在植物遗传转化中的应用。本发明另一目的在于提供一种基于单壁碳纳米管的植物遗传转化方法，简单可行、不借助外力因素。
本发明的技术方案如下：本发明所述的单壁碳纳米管(SWNT) 与外源DNA/RNA的通过静电结合的复合物，其特征在于，SWNT 表面进行了正电荷修饰，由此可结合外源核酸分子例如质粒DNA、 RNA等。优选方案是，所述的SWNT的粒径为1*100nm。可以按照已知方法进行正电荷修饰，优选方案是在SWNT上先修饰有羧基，然后通过羧基修饰有聚乙烯亚胺(PEI)、氨基功能化PEG(NH2-PEG)、 3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane，APTS)等正电荷修饰基团。将含有外源基因的质粒DNA或体外转录获得的 mRNA与表面修饰了PEI的单壁碳纳米管通过静电作用相连接，得到 DNA-SWNT或mRNA-SWNT复合物。外源质粒可以是pBI221-GFP，优选的质粒包括植物基因过表达质粒和植物CRISPR基因编辑质粒； RNA可以是siRNA及mRNA，优选的为含α-globin或其他植物管家基因5’UTR及3’UTR的mRNA。
本发明所述的基于纳米颗粒的植物遗传转化方法，其特征在于，将所述DNA-SWNT/RNA-SWNT复合物与植物愈伤组织例如水稻愈伤组织共孵育，从而将外源基因递送至植物细胞；或者将所述 DNA-SWNT/RNA-SWNT复合物通过叶片注射而将外源基因递送至植物细胞例如本氏烟草。
具体操作步骤包括：
1)以羧基修饰的单壁碳纳米管为原料，制成羧基修饰单壁碳纳米管的悬液，活化单壁碳纳米管的羧基，然后加入PEI修饰，获得 PEI修饰的单壁碳纳米管的悬液；
2)提供含有外源目的基因的DNA质粒或者RNA序列；
3)将步骤1得到的悬液与步骤2的质粒DNA或者RNA序列混合，得到DNA-SWNT/RNA-SWNT复合物；
4)将所述DNA-SWNT/mRNA-SWNT复合物与植物愈伤组织例如水稻愈伤组织共孵育，从而将外源基因递送至植物细胞；或者将所述DNA-SWNT/mRNA-SWNT复合物通过叶片注射而将外源基因递送至植物细胞例如本氏烟草。
纳米材料的表面可进行电荷修饰，当纳米材料进行正电荷基团修饰后，可结合核酸分子。其中DNA结构的质粒是较稳定的核酸结构， mRNA同样可被带正电的纳米材料结合并同纳米颗粒一起进入植物组织及细胞中。发明人利用纳米材料与核酸的上述性质，在烟草叶片上皮细胞及水稻愈伤组织中验证了GFP质粒及mRNA在上述植物细胞中的高效表达。
本发明与现有技术相比，有益效果在于：形成复合物的操作过程简单，只需将SWNT颗粒与质粒DNA/mRNA直接孵育即可，所需时间短，直接孵育60min后可直接注射烟草叶片或滴加至水稻愈伤后即可实现转化。本发明提供了一种简单的、可重复的基于纳米颗粒的直接递送外源核酸序列的转化方法，无需借助外力即能穿越细胞壁递送外源核酸序列，这为植物基因功能的研究提供了重要的转化工具，也为利用基因编辑工具培育新品种奠定了基础。
附图说明
说明书附图用来帮助对本发明的进一步理解，因而构成本申请的一部分。但是，说明书附图仅仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限定。
图1：为实施例1SWNT颗粒的透射电子显微镜图。
图2：为实施例2外源质粒载体的结构示意图。
图3：为实施例3的SWNT负载外源DNA的琼脂糖凝胶电泳图及实施例4的SWNT负载mRNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图4：为实施例3DNA-SWNT复合物的透射电子显微镜图。
图5：为实施例5的烟草叶片激光共聚焦显微镜图，分别为烟草叶片表皮细胞的绿色荧光、明场照片及合并图片。
图6：为实施例6的水稻愈伤组织激光共聚焦显微镜图，分别为 DNA质粒和mRNA在水稻愈伤组织细胞中的绿色荧光、明场照片及合并图片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合实施例对本发明作更全面细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：SWNT-PEI的制备
称取30mg COOH-SWNT，用30mL无酶水悬起后，超声40min； 18000rpm离心1h后，取上清，632nm下测浓度后4℃放置过夜；通过浓度计算取2mg COOH-SWNT，新配制的EDC–NHS溶液，即 10mg EDC和10mg NHS加入2.5mL pH为4.5-5.0的100mM的MES 溶液逐滴加入COOH-SWNT悬液；超声15min后，COOH-SWNT悬液加入预洗的100,000超滤管，用0.1×PBS洗3次；上述悬液加入 40mg PEI(25 000MW)溶液，过夜16h以上；后加入无酶水洗去多余的PEI及其他离子，无酶水洗5次，最终超滤浓缩至原始体积； 632nm下测得其浓度为68mg/L，透射电子显微镜图如图1所示。
实施例2：外源DNA的制备
外源pBI221-GFP质粒载体的结构示意图见图2。将含 pBI221-GFP质粒的菌液在氨苄霉素抗性的平板上划线，37℃过夜培养，挑取单克隆于1.5mL离心管中摇菌，并于100mL锥形瓶中扩摇菌液，收集菌体后，提取质粒，并测质粒浓度为500-1000ng/μL。
实施例3：SWNT负载外源DNA实验
制备含有1μg DNA的DNA-SWNT复合物。DNA/SWNT质量比分别为1:0.034、1:0.041、1:0.048、1:0.054、1:0.061、1:0.068。 TAE(Tris-乙酸盐-EDTA)缓冲液，含有40mM Tris、20mM乙酸和1mM EDTA，用于电泳缓冲液和琼脂糖凝胶制备。纯质粒DNA 和DNA-SWNT复合物在1％(w/v)琼脂糖凝胶(Gel red)中以 120V电泳25分钟。结果显示DNA/SWNT质量比在1:0.048和 1:0.054之间的时候就能全部负载外源DNA。按照1:0.05的比例进行室温连接，SWNT负载外源DNA的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。图4则显示了连接了DNA的SWNT透射电子显微镜图。
实施例4：SWNT负载mRNA实验
制备含有1μg mRNA的mRNA-SWNT复合物。mRNA/SWNT 质量比分别为1:0.001、1:0.002、1:0.004、1:0.006、1:0.008、1:0.01。 TAE(Tris-乙酸盐-EDTA)缓冲液，含有40mMTris、20mM乙酸和1mM EDTA，用于电泳缓冲液和琼脂糖凝胶制备。mRNA和 DNA-SWNT复合物在2％(w/v)琼脂糖凝胶(Gel red)中以90V 电泳30分钟。结果显示mRNA/SWNT质量比在1:0.008和1:0.01 之间的时候就能全部负载mRNA。按照1:0.01的比例进行室温连接， SWNT负载mRNA的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。
实施例5：烟草叶片的转化实验
将DNA-SWNT复合物通过叶片注射而将外源DNA递送至本氏烟草细胞中。具体操作步骤包括：1)选取生长状态良好的约4周龄野生型烟草；2)将DNA-MSN复合物通过注射器注射的方法注射入叶片，约200μL每剂次；3)将注射后的烟草置于培养室培养(23℃， 16h光照/8h黑暗)；4)注射后72小时在激光共聚焦显微镜下观察外源基因GFP的表达情况。
实验过程中，本氏烟草种子播撒在灭菌的营养土与蛭石1:1的土壤混合物中发芽，放入标准的苗圃托盘。约23℃下16小时光照/18 小时黑暗培养。发芽的幼苗随后移植至新的土壤混合物中继续培养生长至4周龄用。实验时是用附着在植物上的完整叶片上进行的，并培养至数据采集时。选健康和完全发育的本氏烟草(4周龄)的叶子进行实验。用1ml无针注射器吸取200μL DNA-SWNT溶液(或任何对照溶液)。轻轻按压注射器，施加温和的压力小心以免损坏叶子，完成侵染。侵染后48-72小时之后，截取叶片在激光共聚焦下进行荧光蛋白表达的观察。外源目的基因为红色荧光蛋白RFP、绿色荧光蛋白GFP、黄色荧光蛋白YFP。以外源目的基因绿色荧光蛋白为例，取叶片或愈伤组织在激光共聚焦显微镜下观察，采用波长为488nm 的激发光，能够观察到绿色荧光的细胞即为阳性结果。截取叶片在激光共聚焦下进行绿色荧光蛋白表达的观察。结果如图5所示。
实施例6：水稻愈伤组织的转化实验
日本晴水稻种子消毒后，播种于N6培养基上诱导产生愈伤组织； DNA-SWNT溶液室温孵育60min/mRNA-SWNT 4℃孵育60min后滴加至水稻愈伤组织共同培养72h后，在激光共聚焦下进行绿色荧光蛋白表达的观察。结果如图6所示。通过实验发现，外源基因在水稻愈伤中转化效率高，滴加DNA-SWNT复合物的水稻愈伤的组织2d 时可实现大于80％的转化效率，且第6d时仍能检测到较强的荧光信号。外源mRNA在水稻愈伤中转化效率高，滴加mRNA-SWNT复合物的水稻愈伤的组织2d时可实现大于80％的转化效率，且第4d时仍能检测到较强的荧光信号。
通过在烟草叶片上皮细胞及水稻愈伤组织中验证GFP质粒及 mRNA在上述植物细胞中的高效表达，清楚地证明了外源基因通过 DNA-SWNT/mRNA-SWNT复合物已经成功转化到上述植物细胞中。
以上所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做出任何形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用以上所公开的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种单壁碳纳米管(SWNT)与外源质粒DNA或者RNA通过静电结合的复合物，其特征在于，对SWNT进行了正电荷修饰。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，在SWNT上修饰有羧基，通过所述羧基修饰有聚乙烯亚胺(PEI)、氨基功能化PEG(NH2-PEG)或3-氨丙基三乙氧基硅烷。
3.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的SWNT的粒径为1*100nm。
4.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述RNA是siRNA或者mRNA。
5.根据权利要求4所述的复合物，其特征在于，所述RNA是含α-globin或其他植物管家基因5’UTR和3’UTR的mRNA。
6.权利要求1所述的复合物在植物遗传转化外源核酸序列方面的应用。
7.权利要求1所述的复合物在水稻、烟草遗传转化外源核酸序列方面的应用。
8.一种植物遗传转化方法，其特征在于，将权利要求1所述DNA-SWNT或者RNA-SWNT复合物与植物愈伤组织例如水稻愈伤组织共孵育，从而将外源基因递送至植物细胞；或者将所述DNA-SWNT或者RNA-SWNT复合物通过叶片注射而将外源基因递送至植物细胞例如本氏烟草。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111611621.XA CN116396976A (zh) | 2021-12-27 | 2021-12-27 | 通过单壁碳纳米管递送外源核酸到植物细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111611621.XA CN116396976A (zh) | 2021-12-27 | 2021-12-27 | 通过单壁碳纳米管递送外源核酸到植物细胞的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116396976A true CN116396976A (zh) | 2023-07-07 |
Family
ID=87014724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111611621.XA Pending CN116396976A (zh) | 2021-12-27 | 2021-12-27 | 通过单壁碳纳米管递送外源核酸到植物细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116396976A (zh) |
-
2021
- 2021-12-27 CN CN202111611621.XA patent/CN116396976A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yan et al. | Nanotechnology strategies for plant genetic engineering | |
| US11634722B2 (en) | Plant gene editing systems, methods, and compositions | |
| Liu et al. | Preparation of fluorescence starch-nanoparticle and its application as plant transgenic vehicle | |
| US20020115219A1 (en) | Method for introducing foreign matters into living cells | |
| Ghogare et al. | Genome editing reagent delivery in plants | |
| HUE026053T2 (en) | Sequence-specific nuclease delivery by nanoparticle | |
| CN111575319B (zh) | 一种高效的crispr rnp和供体dna共位介导的基因插入或替换方法及其应用 | |
| CN109735562B (zh) | 一种经济植物有效根系转基因系统的构建方法 | |
| CN109136248A (zh) | 多靶点编辑载体及其构建方法和应用 | |
| CN102925488B (zh) | 磁性纳米载体介导的植物转基因方法 | |
| Law et al. | Organelle-targeted gene delivery in plants by nanomaterials | |
| Izuegbunam et al. | A nano-biomimetic transformation system enables in planta expression of a reporter gene in mature plants and seeds | |
| WO1999019497A1 (en) | Transgenic lemnaceae | |
| WO2019238772A1 (en) | Polynucleotide constructs and methods of gene editing using cpf1 | |
| CN111543307A (zh) | 一种白菜或青花菜CRISPR-Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法 | |
| CN116396976A (zh) | 通过单壁碳纳米管递送外源核酸到植物细胞的方法 | |
| JP2003512822A (ja) | 外来性遺伝子発現を調節するプロモーター | |
| WO1998042857A1 (fr) | Procede d'introduction genique | |
| CN113226336A (zh) | 一种在细胞中递送基因的方法 | |
| Finer | Plant nuclear transformation | |
| CN116463382A (zh) | 通过介孔二氧化硅纳米颗粒递送外源核酸到植物细胞 | |
| Morgan et al. | An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays | |
| CN108893486A (zh) | 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用 | |
| CN102260704A (zh) | 基于二氧化硅纳米粒子作为基因载体的植物转基因方法 | |
| Liu et al. | A simple and efficient carbon nanotube-based nanocarriers simultaneously delivers multiple plasmids into diverse mature tissues of monocotyledonous crops |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |