CN105039393A - 一种结缕草的高效农杆菌转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种结缕草的高效农杆菌转基因方法，其特征在于，所述方法包括步骤：1）从结缕草成熟种子中剥离出胚，将胚置于愈伤诱导培养基MT4培养基中培养至少3天；2）对含有外源质粒的农杆菌进行活化，利用液体愈伤继代培养基MT4-S液体培养基对农杆菌进行悬浮，得到农杆菌悬浮液；3）将步骤1）培养所得植物组织置于步骤2）所准备的农杆菌悬浮液中，真空干燥器处理30分钟后，缓慢振荡培养1小时；4）取出植物组织，置于含有乙酰丁香酮的MT4-S固体培养基中避光共培养至少3天；所述乙酰丁香酮的浓度为20mg/L。本发明转基因操作过程耗时短，仅需不足10天；无需复杂的操作，易于实施。

Description

一种结缕草的高效农杆菌转基因方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种结缕草的高效农杆菌转基因方法。

背景技术

自将外源DNA导入植物细胞后,植物基因工程得到迅速发展。将外源DNA导入植物成功与否与植物种类与基因导入技术等有关系。结缕草的遗传转化方法可分为原生质体转化法和不依赖于原生质体的转化。

由于原生质体培养操作复杂,且常常难以再生植株,该途径后来逐渐被人们放弃。不依赖原生质体的转化法主要有基因枪转化法和农杆菌介导转化法。

然而，目前对于结缕草的转化，仍存在操作复杂、需进行长时间体外培养和转化率低的问题。如利用悬浮细胞作为受体时，需对细胞进行长时间和专业的培养，且转化率并不尽人意；利用胚性愈伤组织作为外植体时，需要长时间的培养和对愈伤组织的选别工作，整个转基因过程长达3个月以上。

结缕草虽然因其具有耐践踏和耐干旱等优点，但也有不耐温、不耐寒等缺点，对其进行优良品种的选育工作是本领域的研究重点之一，而上述结缕草转基因工作所面临的问题极大的限制了本领域工作的深入开展。

因此，亟需寻找一种操作简便、转化率高且耗时较短的结缕草的转基因方法。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高效对结缕草进行转基因的方法，该方法不仅操作简便、转化率高，更重要的是所需时间非常短，该方法包括如下步骤：

1）从结缕草成熟种子中剪切出成熟胚，将胚置于愈伤诱导培养基中培养3-7天；

2）对含有外源质粒的农杆菌进行活化，利用液体愈伤继代培养基对农杆菌进行悬浮，得到农杆菌悬浮液；

3）将步骤1）培养所得植物组织置于步骤2）所准备的农杆菌悬浮液中，真空干燥器处理30分钟后，缓慢振荡培养1小时；

4）取出植物组织，置于含有乙酰丁香酮的固体愈伤继代培养基中避光共培养至少3天；所述乙酰丁香酮的浓度为20mgL^-1。

发明人通过大量的实验发现，对结缕草的成熟胚进行3-7天的预培养后，利用农杆菌介导法对结缕草进行转基因操作，可以获得较好的转化效率。如本发明的实施例所示，利用GUS活性检测法对转化效率时发现，仅需对结缕草成熟胚预培养3天，便可成功的利用农杆菌介导法对其进行转化。整个转基因过程总共仅需不足10天，相较于现有技术长达3个月的转基因过程而言，大幅提高了研究效率，极大促进了结缕草优良品种选育工作的开展。

在植物转基因领域当中，植物的种类和转基因方法对转基因的成功与否和效率高低起着决定性的作用。然而，至目前为止，对何种植物适合何种转基因方法，仍未形成共识。特别的，在转基因过程中，采取植物中的哪个部分作为外植体并进行何种处理可以获得高效的转化效果，更是没有定论。如《植物转基因技术的进展存在问题及突破方向》（董福双，河北农业科学,2011,15(3):57-65）所记载，利用不同转化方法对不同作物进行转基因操作，转化率的差异十分巨大，转化率可低至小于0.5%，且可重复性差。

本发明的发明人经过大量实验摸索发现，将预培养3天以上的成熟胚作为外植体时，不但可以成功对结缕草进行转化，更重要的时本发明大幅减少了整个转基因过程所耗费的时间。本领域人员可以理解的是，本发明极大的促进了结缕草其它相关研究的开展，尤其是促进了结缕草优良品种的选育工作。

本领域人员应当知晓，除大幅缩短转基因所需时间外，本发明对本领域还具有如下贡献：本发明无需进行长时且专业的细胞培养工作，提高了转基因的可重复性；本发明无需对外植体进行繁琐的灭菌工作，而以胚性愈伤组织作为外植体时，繁琐的灭菌工作是必须的。

优选的，所述步骤1）的培养时间为7天。

优选的，所述步骤4）中，共培养时间为9天。

优选的，步骤2）中农杆菌的活化方法为：于200rpm、28℃下，对含有外源质粒的农杆菌进行培养，培养基含有5gL^-1酵母提取物、10gL^-1细菌蛋白胨、5gL^-1氯化钠、50mgL^-1卡拉霉素，pH为7.0，培养至OD₆₀₀=0.3-0.6；利用MT4-S液体培养基对农杆菌进行重悬，调节悬浮液的OD₆₀₀=0.5。

所述外源质粒为含有植物抗性选择基因hpt基因和β-葡萄糖苷酸酶基因gus报告基因的pMDC99IG质粒。本领域人员应该理解，含有hpt基因和gus基因的pMDC99IG质粒只是可以用于本发明转基因操作的质粒，并不是对本发明的适用范围的限定。

优选的，所述农杆菌菌株为EHA105。

所述愈伤诱导培养基包含MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括：30gL^-1蔗糖、4mgL^-1维生素B1、100mgL^-1α-酮戊二酸、5mgL^-12,4-二氯苯氧乙酸、0.2mgL-¹6-苄氨基腺嘌呤，所述愈伤诱导培养基的pH值为5.8，用2gL^-1植物凝胶固化；所述液体愈伤继代培养基包含MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括：30gL^-1蔗糖、4mgL^-1维生素B1、100mgL^-1α-酮戊二酸、2mgL^-12,4-二氯苯氧乙酸、0.2mgL-¹6-苄氨基腺嘌呤，所述液体愈伤继代培养基的pH值为5.8；所述固体愈伤继代培养基的pH值为5.8，用2gL^-1植物凝胶固化。

优选的，所述方法还包括在步骤1）前对结缕草种子进行预处理，所述预处理步骤包括：

A）将种子在水中浸泡2天；

B)置于含1%活性氯的次氯酸钠溶液中搅拌灭菌2小时，然后用无菌水反复清洗。

本发明的有益效果：

1）本发明转基因操作过程耗时短，仅需不足10天；

2）本发明无需复杂的操作，易于实施。

附图说明

图1为对结缕草种子成熟胚进行不同时间的预培养后的状态图，图中，0、1、2、3、4、5、6、7分别为未经培养、培养1天，培养2天，培养3天，培养4天，培养5天，培养6天、培养7天后的状态图；

图2为结缕草成熟胚经不同时间预培养再进行转化后的转化结果图；

图3为本发明对结缕草预培养成熟胚转化成功后的状态图，箭头所指为GUS染色斑点。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1）1)从结缕草成熟种子中剥离出胚，分为5组，将胚置于愈伤诱导培养基MT4培养基中培养；其中，第1组培养3天，第2组培养4天，第3组培养5天，第4组培养6天，第5组培养7天；设置两个对照组，对照组1采取上述方法培养1天，对照组2采取上述方法培养2天；将含有植物抗性选择基因hpt基因和β-葡萄糖苷酸酶基因gus报告基因的pMDC99IG质粒是通过冻融法转入农杆菌EHA105菌株中；于200rpm、28℃下，对含有上述外源质粒的农杆菌进行培养，培养基含有5gL^-1酵母提取物、10gL^-1细菌蛋白胨、5gL^-1氯化钠、50mgL^-1卡拉霉素，pH为7.0，培养至OD₆₀₀=0.3-0.6，然后在3500rpm下对所得培养菌液进行离心20min收集；利用MT4-S液体培养基对农杆菌进行重悬，调节悬浮液的OD₆₀₀=0.5；

2）将步骤1）培养所得植物组织置于步骤2）所准备的农杆菌悬浮液中，真空干燥器处理30分钟后，缓慢振荡培养1小时；

3）取出植物组织，置于含有乙酰丁香酮的MT4-S固体培养基中分别避光共培养3天、5天、7天和9天；所述乙酰丁香酮的浓度为20mgL^-1。

共培养后，将步骤4）所得物置于GUS染色剂中，37℃孵育过夜，次日对GUS蓝色斑点进行计数。10ml的GUS染色剂含有50mgL^-1的X-Gluc（溶于二甲基甲酰胺中）0.1ml、500mM磷酸盐缓冲剂1ml、100%甲醇2ml和0.5%TritonX-1006.9ml。

转化结果如图2所示，对照组1和对照组2均未转化成功，当培养3天（第1组）以上时，转化成功。转化的效率随着培养时间上升而提高。

Claims (10)

1.一种结缕草的高效农杆菌转基因方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

1）从结缕草成熟种子中剥离出胚，将胚置于愈伤诱导培养基中培养至少3天；

2）对含有外源质粒的农杆菌进行活化，利用液体愈伤继代培养基对农杆菌进行悬浮，得到农杆菌悬浮液

3）将步骤1）培养所得植物组织置于步骤2）所准备的农杆菌悬浮液中，真空干燥器处理30分钟后，缓慢振荡培养1小时；

4）取出植物组织，置于含有乙酰丁香酮的固体愈伤继代培养基中避光共培养至少3天；所述乙酰丁香酮的浓度为20mgL^-1。

2.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤1）的培养时间为7天。

3.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤4）中，共培养时间为9天。

4.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤2）中农杆菌的活化方法为：于200rpm、28℃下，对含有外源质粒的农杆菌进行培养，培养基含有5gL^-1酵母提取物、10gL^-1细菌蛋白胨、5gL^-1氯化钠、50mgL^-1卡拉霉素，pH为7.0，培养至OD₆₀₀=0.3-0.6。

5.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，利用MT4-S液体培养基对农杆菌进行悬浮时，调节悬浮液的OD₆₀₀=0.5。

6.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述外源质粒为含有植物抗性选择基因hpt基因和β-葡萄糖苷酸酶基因gus报告基因的pMDC99IG质粒。

7.根据权利要求6所述的转基因方法，其特征在于，所述含有植物抗性选择基因hpt基因和β-葡萄糖苷酸酶基因gus报告基因的pMDC99IG质粒是通过冻融法转入农杆菌中的。

8.根据权利要求1、4、5、7中任一项所述的转基因方法，其特征在于，所述农杆菌菌株为EHA105。

9.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基包含MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括：30gL^-1蔗糖、4mgL^-1维生素B1、100mgL^-1α-酮戊二酸、5mgL^-12,4-二氯苯氧乙酸、0.2mgL-¹6-苄氨基腺嘌呤，所述愈伤诱导培养基的pH值为5.8，用2gL^-1植物凝胶固化；所述液体愈伤继代培养基包含MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括：30gL^-1蔗糖、4mgL^-1维生素B1、100mgL^-1α-酮戊二酸、2mgL^-12,4-二氯苯氧乙酸、0.2mgL-¹6-苄氨基腺嘌呤，所述液体愈伤继代培养基的pH值为5.8；所述固体愈伤继代培养基的pH值为5.8，用2gL^-1植物凝胶固化。

10.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤1）前对结缕草成熟种子进行预处理，所述预处理步骤包括：

A）将种子在水中浸泡2天；

B)置于含1%活性氯的次氯酸钠溶液中搅拌灭菌2小时，然后用无菌水反复清洗。