ES2207395B1 - Nuevos factores transcripcionales hsf y su utilizacion en plantas transgenicas. - Google Patents

Abstract

Nuevos factores transcripcionales HSF y su utilización en plantas transgénicas. El objeto de la presente invención es un factor transcripcional denominado HaHSFA10, que ha sido clonado en nuestro laboratorio, y que se expresa específicamente en los embriones zigóticos de las semillas de girasol. Además HaHSFA10 es capaz de activar transcripcionalmente a promotores de genes sHSP (small Heat Shock Protein) expresados durante la embriogénesis en el girasol (Helianthus annuus). La estructura de los elementos en cis HSE(Heat Shock cis Elements) presentes en dichos promotores nos ha permitido definir requisitos para la activación transcripcional por HaHSFA10 y confirmar la presencia de HSFs (Heat Shock transcription Factors) funcionalmente equivalentes a HaHSFA10 en otras plantas como el tabaco (Nicoti ana tabacum). Esta información permite proponer el uso de HaHSFA10 (o de HSFs equivalentes) para alterar específicamente la expresión de los genes a los que regula cualquiera de estos factores (porejemplo las mencionadas sHSPs) en semillas de distintas especies de plantas transgénicas.

Description

Nuevos factores transcripcionales HSF y su utilización en plantas transgénicas.

Sector de la técnica

Agricultura. Herramienta biotecnológica para: 1.- La obtención de plantas transgénicas de distintas especies que expresen los genes regulados por HaHSFA10 (en el girasol), o regulados por factores funcionalmente equivalentes a HaHSFA10 (en otras plantas), bien a niveles mayores de lo normal (por sobre-expresión de HaHSFA10), o que prolonguen temporalmente o extiendan espacialmente su expresión (por expresión ectópica de HaHSFA10 tras la germinación de las semillas). Los genes regulados por HaHSFA10 en las plantas transgénicas incluirían las sHSP embrionarias, cuya expresión en distintas especies vegetales sin modificar ha sido correlacionada con distintas propiedades de posible utilidad: por ejemplo, la conservación de su capacidad de germinación y la tolerancia al estrés hídrico y térmico antes y durante la germinación de las semillas. 2.- Incrementar la transcripción de genes quiméricos con secuencias HSE derivadas de los promotores regulados por HaHSFA10.

Estado de la técnica

La expresión de los genes se controla primariamente a nivel transcripcional mediante otros genes reguladores -los factores transcripcionales (FT). Estos actúan como activadores (FTA) o represores (FTR) de complejos multiprotéicos que incluyen las polimerasas de RNA y otros componentes comunes de la maquinaria transcripcional [ver por ejemplo las revisiones por Kornberg, R. Trends Cell Biol 9, M46-49.1999; y (en vegetales) por Singh, K. B. Plant Physiol 118, 1111-1120. 1998; Liu, L., White, M. J. y MacRae, T. H. Eur J Biochem 262, 247-257. 1999]. La clonación e identificación de factores transcripcionales implicados, de forma crítica y suficientemente específica, en la regulación de distintos conjuntos de genes ha permitido alterar simultáneamente su expresión en animales y plantas transgénicas. Para ello se han utilizado dos estrategias conocidas respectivamente por "ganancia de función" (En plantas transgénicas ver por ejemplo: Kasuga, M., Liu, Q., Miura, S., Yamaguchi, S. K. & Shinozaki, K. Nat Biotechnol 17, 287-91. 1999) y "pérdida de función" (un ejemplo reciente de esto en plantas transgénicas sería: Schmitz, G., Tillmann, E., Carriero, F., Fiore, C., Cellini, F. y Theres, K. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 1064-1069. 2002). En la "ganancia de función", la sobre-expresión (generalmente ectópica y constitutiva) de un FTA, o alternativamente la reducción de la expresión de un FTR, produce una mayor expresión de los genes regulados por dicho factor. Esto provoca efectos fenotípicos positivos dependientes de la función de dichos genes (que consecuentemente también se incrementa). La "pérdida de función" es una estrategia complementaria que provoca el efecto opuesto reduciendo específicamente la expresión de un FTA (o alternativamente incrementando la de un FTR). Las estrategias de "pérdida de función" han tenido en general mayores problemas técnicos derivados de la redundancia funcional de otros FTs (Riechmann JL y Ratcliffe OJ Curr Opin Plant Biol 3, 423-434. 2000). En vegetales, las estrategias de "ganancia de función" han producido efectos claros sobre la tolerancia al calor de las plantas adultas (Prändl R, Hinderhofer K, Eggers-Schumacher G y Schöffl F Mol Gen Genet 258, 269- 78. 1998), al frío (Kim JC, Lee S H, Cheong YH, Yoo CM, Lee SI, Chun HJ, Yun DJ, Hong JC, Lee SY, Lim CO y Cho MJ. Plant J 25, 247-59. 2001); y también frente a otros tipos de estrés (Kasuga, M., Liu, Q., Miura, S., Yamaguchi, S. K. & Shinozaki, K. Nat Biotechnol 17, 287-91. 1999; Park, J. M., Park, C. J., Lee, S. B., Ham, B. K., Shin, R. & Paek, K. H. Plant Cell 13, 1035-46. 2001). La identificación de factores transcripcionales críticos y específicos para la regulación de genes implicados en cada uno de dichos procesos posibilitó el éxito de dichas aproximaciones. Existen incluso patentes previas que proponen el uso de FTs para la ganancia de función en plantas transgénicas. Algunas de ellas también contemplan la posible alteración de distintas características de la semilla (por ejemplo US6160202, US6248937, WO9955840), incluyendo la tolerancia a la falta de riego y al estrés osmótico (US6248937, WO9955840). Dichas patentes son similares a nuestra solicitud únicamente en procedimientos metodológicos de conocimiento usual, y en la posible utilidad o finalidad general de las patentes: por ejemplo en la construcción de los genes quiméricos, la producción de plantas transgénicas de distintas especies, la descripción y evaluación de las posibles características mejoradas, etc. La diferencia esencial con esta solicitud es el uso de una nueva herramienta biotecnológica: un FT completamente distinto, HaHSFA10, que clonamos e identificamos mediante la evaluación funcional incluida en la descripción, los ejemplos y las figuras adjuntas.

El trabajo de nuestro grupo ha contribuido a la identificación de las sHSPs (small Heat Shock Proteins) embrionarias de plantas como genes con posibles funciones complementarias a las proteínas LEA (Late Embryogenesis Abundant) en la tolerancia al estrés hídrico, tanto en semillas como en tejidos vegetativos (citado recientemente en la revisión de Hoekstra, F. A., Golovina, E. A. y Buitink, J. Trends Plant Sci 6, 431-438. 2001). Observaciones de nuestro laboratorio, y de otros grupos, permiten relacionar la tolerancia a la desecación de las semillas y al vigor de germinación con la expresión embrionaria de genes sHSP (ver por ej. Coca, M. A., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant Mol Biol 25, 479-492. 1994; Alamillo, J., Almoguera, C., Bartels, D. y Jordano, J. Plant Mol Biol 29, 1093-1099. 1995; Bettey, M. y Finch-Savage, W. E. Seed Science Research 8, 347-355. 1998). Dichas observaciones también están apoyadas por el efecto de genes mutantes en especies modelo como Arabidopsis thaliana. Así, la tolerancia a la desecación de las semillas y la expresión de las sHSPs se reduce en algunos mutantes (por ej. abi3-6, lec1-2, y fus3-3); mientras que otros mutantes similares que no presentan efectos sobre la expresión de sHSPs tienen una tolerancia normal (por ej. abi3-1, lec2-1 y emb266; Wehmeyer, N., y Vierling, E. Plant Physiol 122, 1099-108, 2000). El conocimiento de los factores transcripcionales implicados específicamente en la activación del subconjunto de genes sHSP con expresión embrionaria en plantas, permitiría su sobre-expresión coordinada por "ganancia de función"; lo que pudiera producir efectos beneficiosos mediados por estas sHSPs: por ejemplo, sobre la tolerancia a aumentos incontrolados de la temperatura y la humedad de las semillas antes de la germinación. Este tipo de estrés es un problema importante en la producción y almacenamiento de semillas, pues conduce a la pérdida de su vigor de germinación.

Nuestro laboratorio ha identificado elementos en cis implicados en la regulación embrionaria de genes sHSP de girasol, e identificado algunas peculiaridades del mecanismo de su activación transcripcional (ver por ejemplo: Almoguera, C., Prieto-Dapena, P., y Jordano, J. Plant J 13, 437-46. 1998; Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant Physiol 121, 723-730. 1999; Rojas, A., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant J 20, 601-610. 1999; Rojas A, Almoguera C, Carranco R, Scharf KD y Jordano J. Plant Physiol 129, en prensa, 2002). Esto ha permitido finalmente la donación de un FTA (que denominamos HaHSFA10) implicado específicamente en la activación transcripcional en semillas de promotores sHSP. HaHSFA10 es un FT muy peculiar perteneciente a la familia de los HSFs (Heat Shock transcription Factors). Los HSFs están generalmente implicados en la respuesta transcripcional al estrés por aumento brusco de la temperatura (choque térmico, o heat shock). Aunque se sabía que este tipo de factores estaba implicado en la regulación de la expresión de genes sHSP durante el desarrollo embrionario en semillas del girasol y de otras plantas (ver por ejemplo, Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. 1996; Prändl, R. y Schöffl, F. Plant Mol Biol 31, 157-162. 1996; Almoguera, C., Prieto-Dapena, P., y Jordano, J. Plant J 13, 437-46. 1998), se desconocía que los HSFs implicados tuvieran la suficiente especificidad. Este es también el caso de ABl3, otra familia de FTs implicada en la regulación de las sHSPs embrionarias (Wehmeyer, N., Hernández, L. D., Finkelstein, R. R. y Vierling, E. Plant Physiol 112, 747-757.1996; Rojas, A., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant J 20, 601-610. 1999; Wehmeyer, N. y Vierling, E. Plant Physiol 122, 1099-1108. 2000); pero con funciones pleiotrópicas muy diversas y no restringidas al desarrollo embrionario (ver Wehmeyer, N., Hernández, L. D., Finkelstein, R. R. y Vierling, E. Plant Physiol 112, 747-757.1996, las referencias citadas por estos autores; y la revisión por Rohde, A., Kurup, S. y Holdsworth, M. Trends Plant Sci 5, 418-419. 2000). De hecho HaHSFA10 es, en el momento de escribir esta solicitud, el único ejemplo conocido en todos los organismos eucariotas (plantas, hongos y animales) de un HSF expresado específicamente durante el desarrollo embrionario: en su caso, en los embriones zigóticos de las semillas del girasol. Los restantes HSFs descritos hasta el momento tienen, bien una expresión muy generalizada en ausencia de estrés térmico, o en el caso de algunos HSFs vegetales su expresión es también generalizada pero inducible por choque térmico [ver por ejemplo las revisiones: Morimoto, R. I. Genes Dev 12, 3788-3796. 1998 (para HSFs animales); Schöffl, F., Prändl, R. y Reindl, A. Plant Physiol 117, 1135-1141. 1998; Nover, L., Bharti, K., Dbring, P., Mishra, S. K., Ganguli, A. y Scharf, K. D. Cell Stress Chaperones 6, 177-189. 2001 (para HSFs vegetales); y otras referencias incluidas en estas revisiones]. Sólo uno de los HSFs animales, el HSF4 humano, tiene una cierta especificidad de tejido; aunque su expresión no es específica de embriones (Tanabe, M., Sasai, N., Nagata, K., Liu, X. D., Liu, P. C., Thiele, D. J. y Nakai, A. J Biol Chem 274, 27845-27856. 1999). Por lo tanto, ningún resultado antecedente permitía suponer que los HSFs implicados en la regulación transcripcional de las sHSPs en semillas del girasol tuvieran una especificidad embrionaria. Además de esta información crucial sobre HaHSFA10 (incluida en el ejemplo 1 de esta solicitud), mostramos que HaHSFA10 es capaz de activar transcripcionalmente, en embriones de girasol, a dos promotores de genes sHSP expresados durante la embriogénesis en el girasol: Hahsp17.7G4 y Hahsp17.6G1; uno de los cuales (Hahsp17.6G1) no es activable por choques térmicos (Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997) y hemos descrito previamente su activación selectiva utilizando otros HSFs de tomate (Rojas A, Almoguera C, Carranco C, Scharf KD y Jordano J. Plant Physiol 129, en prensa. 2002). La estructura de los elementos en cis HSE presentes en dichos promotores nos ha permitido definir requisitos para la activación transcripcional por HaHSFA10 y confirmar la presencia de HSFs (Heat Shock transcription Factors) funcionalmente equivalentes a HaHSFA10 en otras plantas como el tabaco (Nicotiana tabacum). Esta última información es vital para permitir el uso de estrategias de ganancia de función usando HaHSFA10 en plantas transgénicas de especies distintas al girasol (ver también el ejemplo 5).

Además de las referencias mencionadas anteriormente, quisiéramos destacar los siguientes precedentes, que sin anticipar el objeto de nuestra invención, creemos que refuerzan la viabilidad de nuestra solicitud:

1.- (En relación con la ganancia de función mediada por sHSPs). Recientemente se ha publicado que la sobre-expresión constitutiva en plantas transgénicas homólogas de una sola sHSP de Arabidopsis thaliana (AtHSP17.6), usando un gen quimérico con secuencias reguladoras del gen 35S CaMV, incrementa la tolerancia a la falta de riego y al estrés osmótico durante la germinación de dichas plantas. Este efecto es limitado (ver Sun, W., Bernard, C., van De Cotte, B., Van Montagu, M., y Verbruggen, N. Plant J 27, 407-415. 2001); pero es concebible que pudiera incrementarse usando un FT que incremente la expresión simultánea de más de una sHSP. Debe tenerse en cuenta que con la determinación de la secuencia genómica de Arabidopsis thaliana se han identificado 13 genes sHSP distintos, y que existen indicios de una multiplicidad similar en otras especies vegetales (ver Scharf, K. D., Siddique, M., y Vierling, E. Cell Stress Chaperones 6, 225-237. 2001). Nuestra invención identifica a un FT utilizable para conseguir dicho incremento simultáneo de expresión de sHSPs.

2.- Nuestra invención también contempla el uso, en plantas transgénicas, de HaHSFA10 como FTA de genes quiméricos con secuencias HSE derivadas de promotores regulados por dicho factor. Un uso análogo ha sido demostrado anteriormente para otros FTAs (por ejemplo REB, PBF y O2 de Oriza sativa) y otras secuencias reguladoras (ver Yang, D., Wu, L., Hwang, Y. S., Chen, L., y Huang, N. Proc Natl Acad Sci USA 98, 11438-11443. 2001); e incluso dicho uso ha sido protegido por una patente (W00183792). Estos antecedentes apoyan la viabilidad de nuestra propuesta alternativa sin anticiparla. Tampoco nuestros estudios previos, mencionados más arriba en este apartado, sobre los HSEs de Hahsp17.6G1G1 y de Hahsp17.7G4G4 anticipan dicha propuesta; pues esta requiere la clonación y verificación funcional de HaHSFA10 como el activador de los mencionados genes.

Descripción de la invención Breve descripción de la invención

El objeto de la presente invención es un factor transcripcional activador, de tipo Heat Shock Factor (HSF), denominado HaHSFA10 en girasol (la secuencia de nucleótidos, SEC. ID. N°: 1, que codifica este factor está depositada en la base de datos GenBank con el número de acceso AY099451), y cualquier otro factor transcripcional activador de tipo Heat Shock Factor, de girasol o cualquier otra planta, que se exprese específicamente o restrinja su capacidad de activación transcripcional en embriones de semillas en desarrollo. La activación transcripcional de estos factores se realiza preferentemente a través de elementos en cis de choque térmico (HSE) "imperfectos", es decir con una estructura semejante a los HSEs de los genes sHSP de girasol Hahsp17.6G1 y Hahsp 17.7G4.

Igualmente se incluyen en esta invención los factores transcripcionales que presentan modificaciones (deleciones o substituciones de aminoácidos, particularmente las substituciones por los residuos excepcionales indicados en la Figura 1) y/o los factores derivados de las modificaciones de estos HSFs, siempre que mantengan la misma funcionalidad en cuanto a capacidad de activación transcripcional mencionada anteriormente.

Estos factores transcripcionales son utilizados para conseguir ganancia de función en plantas transgénicas mediante su sobre-expresión con un gen quimérico, en semillas y/o ectópica, constitutiva y/o inducible. Esta utilización comprende los siguientes pasos:

a)

Construcción de un gen quimérico fusionando las secuencias HSF, especialmente HaHSFA10, a un promotor y a otras secuencias reguladoras apropiadas, según el tipo de sobre-expresión deseada.

b)

Introducción en la planta del gen quimérico (mediante transformación con Agrobacterium, biolística o electroporación)

c)

Evaluación de la expresión en las plantas transgénicas del HSF, y de la de los genes regulados por dicho HSF (especialmente las sHSP expresadas normalmente en las semillas).

La ganancia de función conseguida con la utilización de estos factores transcripcionales pudiera mejorar diversas propiedades de las semillas (su conservación, su capacidad de germinación, su tolerancia al estrés) como consecuencia de la sobre-expresión de los genes activados transcripcionalmente por dichos factores HSF.

Estos HSFs serían, asimismo, utilizables para potenciar la expresión en plantas transgénicas de otros genes quiméricos que contengan elementos en cis HSE de genes activados transcripcionalmente de forma natural por dichos HSFs, u otros HSEs imperfectos (naturales o sintéticos). Dichos genes quiméricos están fusionados a promotores que dirigen la expresión de secuencias codificantes correspondientes a proteínas o péptidos con utilidad, y de cualquier origen (biológicos: vegetal, animal, etc.; o sintético).

Para conseguir ganancia de función y/o potenciar la expresión de genes, también es posible utilizar factores HSF quiméricos que incorporen parcialmente secuencias y características del factor HaHSFA10 (naturales o mejoradas mediante diversas
modificaciones).

Las plantas transgénicas (monocotiledóneas o dicotiledóneas) de cualquier cosecha que incorporen los genes quiméricos construidos y utilizados según se menciona anteriormente en esta memoria constituyen otro objeto adicional de esta invención.

Breve descripción del contenido de las figuras Figura 1 Comparaciones con otros HSFs

Secuencia de amino ácidos de HaHSFA10 en, y cerca de, la hélice alfa de reconocimiento del ADN (\alpha3). La predicción de estructura secundaria (en el esquema superior) se basa en la resuelta para el DBD del HSF de Kluyveromyces lactis (KI, P22121, Harrison, C. J., Bohm, A. A., y Nelson, H. C. Science 263, 224-227, 1994). Las otras secuencias de HSFs incluyen el HSF2 de Homo sapiens (Hs-2, Q03933), AtHSFA9 de Arabidopsis thaliana (At-9, BAA97129) y dos ESTs de Solanum tuberosum (St-EST, BG886969) y Lycopersicon esculentum (Le-EST, AW930998). Los símbolos y números de acceso de estas secuencias se indican, entre paréntesis, en cada caso. Los amino ácidos invariantes se marcan mediante cajas. El residuo excepcional de arginina presente en posición 131 de HaHSFA10 y en la equivalente de los dos ESTs vegetales se resalta en negrita, así como el residuo de ácido aspártico que reemplaza a la glicina en la proteína de Saccharomyces cerevisiae Skn7 (U00485). De forma similar indicamos la substitución de un residuo conservado sin carga, en la posición 114, por otro cargado positivamente (H o R) en Skn7 y los HSFs de tipo A10. Los puntos gruesos en el extremo inferior resaltan las posiciones de estas substituciones de amino ácidos (posiciones numeradas respecto a la secuencia de HaHSFA10). Mediante análisis filogenéticos (Neighbor-joining) de la secuencia completa de los DBD de estos y otros HSFs vegetales de clase A, hemos corroborado el agrupamiento de St-EST, Le-EST y Ha-A10 (valor bootstrap de la rama 0.985, confirmado mediante 1000 repeticiones del algoritmo).

Figura 2 Patrones de acumulación de los mRNAs de HaHSFA10

Panel superior: expresión de mRNAs durante la embriogénesis zigótica y su desaparición al germinar las semillas. El estado de desarrollo se indica como días tras la antesis (dpa) o tras la imbibición (dpi). Panel inferior: ausencia de mRNAs en órganos vegetativos en condiciones control (C) o de choque térmico (HS). La acumulación marginal de mRNAs en respuesta al estrés hídrico (DS) se detectó únicamente tras tiempos de autoradiografía (72h) mucho más largos que los utilizados para los embriones y germínulas (18h). Marcadores de peso molecular (MW): DNA marcado del vector pBluescript (SK+) digerido con HpaII. La cantidad y calidad de las muestras de RNA total usadas en los ensayos de protección con Ribonucleasa A se verificó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% (fotografías en la parte inferior de cada panel). El esquema en la parte más inferior de esta figura muestra el extremo 5' de las secuencias transcritas de HaHSFA10 (línea sólida: UTR, caja: región codificante en la que la posición prevista para el intrón conservado se indica con un triángulo oscuro); y la ribosonda antisentido sin digerir (Sonda) usada en estos ensayos (línea punteada). Las líneas más gruesas, en la parte inferior, muestran la interpretación de la identidad de los fragmentos de mRNA protegidos 1 y 2 (señalados con flechas en ambos paneles). Las posiciones de nucleótidos en el mapa corresponden a las de la SEC. ID. N°: 1. El signo de interrogación muestra un posible sitio de iniciación alternativo del mRNA.

Figura 3 Especificidad en semillas de la expresión de la proteína HaHSFA10

La inmuno-detección, mediante ensayos Western, confirmó la acumulación de la proteína HaHSFA10 durante la embriogénesis zigótica (a partir de 8 dpa) y en semillas maduras (22 dpa, panel superior y datos no mostrados). Tras la germinación detectamos niveles muy bajos de la proteína HaHSFA10 (señalada con una flecha), aunque sólo hasta los 5dpi y en condiciones control (C). Los tratamientos de estrés por calor (H) o déficit de agua (D) no re-indujeron la acumulación de la proteína HaHSFA10 en órganos vegetativos, pues no se detectó incluso forzando el tiempo de exposición de la autoradiografía hasta los 30 min (ver el panel inferior). En este caso, como control positivo incluimos la muestra de embriones de 12 dpa (E). Marcadores de peso molecular, indicados en kD, a la izquierda. La calidad y cantidad de las muestras se confirmó mediante tinción de las proteínas totales con Ponceau-S (parte superior, P), o mediante inmuno-detección usando anticuerpos frente a HSC70 (parte inferior, 70).

Figura 4 El cDNA de HaHSFA10 codifica un FTA funcional

Panel A (parte superior): Remplazamiento funcional del gen HSF de levadura ScHsf1 por HaHSFA10. Se depositaron sobre placas con medio YPD gotas, de un volumen de 3 \mul, con diluciones seriadas (en pasos de 1:10, a partir de cultivos en fase logarítmica media) de las cepas de levadura RSY4 indicadas. Las placas se incubaron a las temperaturas indicadas a la izquierda y se fotografiaron tras 4 días de cultivo. Parte inferior (A): Ensayos de activación transcripcional en levadura usando plásmidos con el gen delator de la \beta-Galactosidasa y un promotor mínimo fusionado a los HSEs naturales (WT) y mutantes (m) de los genes Hahsp17.7G4 (G4HSE) y Hahsp17.6G1 (G1 HSE). Se muestran los valores medios obtenidos en ensayos de la actividad \beta-Galactosidasa usando la cepa RSY4 con HaHSFA10 transformada con el plásmido indicado. En cada caso se promediaron los valores (en duplicado) obtenidos con tres transformantes independientes para cada plásmido. Los barras muestran los errores estándar. Panel B: Activación en trans del promotor de Hahsp17.6G1 usando el plásmido efector de HaHSFA10 en embriones de girasol bombardeados con micro-proyectiles. Las barras representan la actividad del gen delator de \beta-Glucuronidasa (GUS) normalizada con un control interno de luciferasa (LUC). En estos experimentos usamos plásmidos delatores con genes quiméricos descritos anteriormente (-1486::GUS y -1486(m)::GUS, Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant Physiol 121, 723-730. 1999), que fueron bombardeados con (+A10), o sin (-A10), el plásmido efector de HaHSFA10. Se muestran los errores estándar de los valores promedio de actividad (n>25).

Figura 5 Activación transcripcional de genes quiméricos con el promotor de Hahsp17.7G4; y efecto específico del HSE mutante P en embriones

El esquema de la parte superior (A) muestra el contexto del promotor de los genes quiméricos usados en estos experimentos. Dichos genes incluyen uno (WT) con los HSEs naturales (-1132::GUS, Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. 1996); y los HSEs mutantes descritos previamente: el "casi-nulo" mutE (m), y el "perfecto" mutP (P) [ver respectivamente: Almoguera, C., Prieto-Dapena, P., y Jordano, J. Plant J 13, 437-46. 1998; y Rojas, A., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant J 20, 601-610. 1999]. Se subrayan los núcleos de las repeticiones de secuencias consenso en los HSEs; y se indican con minúsculas las substituciones de nucleótidos (en los mutantes). Los puntos y los óvalos representan, respectivamente, las posiciones de contacto críticas y las "mellas" en las secuencias consenso del HSE WT. Panel B: Activación en trans, de los distintos genes quiméricos, por el plásmido efector de HaHSFA10 en embriones de girasol bombardeados con micro-proyectiles. Las barras muestran las actividades medias de \beta–Glucuronidasa (GUS) normalizadas con luciferasa (LUC, errores y tamaños de muestra como en la Figura 5B). En cada caso se indica el gen quimérico bombardeado con (+A10), o sin (-A10), el plásmido efector de HaHSFA10. Se observa una activación en trans reducida con el mutante P, que se resalta con sombreado más oscuro. Panel C: Expresión de los genes quiméricos en plantas transgénicas de tabaco; a la izquierda resultados que muestran que el mutante P no afecta a la expresión en condiciones control (C) o tras choques de calor (HS); a la derecha se ilustra la reducción de la actividad del gen P (en comparación con WT) en embriones a los 28 dpa. En este caso el efecto es estadísticamente significativo y similar al observado con la activación por HaHSFA10 en embriones de girasol, lo que se indica con el mismo sombreado usado en el panel B.

Figura 6 Activación transcripcional de genes quiméricos con los promotores de Hahsp17.7G4 y Hahsp17.6G1 en hojas de girasol

En cada caso se indica el gen quimérico bombardeado con (+A10), o sin (-A10), el plásmido efector de HaHSFA10. Se observa una activación significativa y similar de los promotores de Hahsp17.7G4 (G4, en el gen-1132::GUS, WT en la Figura 6B) y Hahsp17.6G1 (G1, en el -1486::GUS, ver la Figura 5B). La actividad de los genes quiméricos se representa y se normaliza como se explica en las leyendas de las Figuras 4B y 5B. Tamaño de muestra (n=10).

Figura 7 Esquemas de los tres genes quiméricos usados en los ejemplos "Ea" y "Eb"

En la parte superior se muestra el mapa del plásmido pSKHSFA10-F, del que derivan todos estos genes, con las secuencias completas de cDNA de HaHSFA10 (ver también la SEC. ID. N°: 1). Se indican las dianas de restricción que flanquean las secuencias de HaHSFA10 usadas en la construcción de los genes. En la parte inferior se muestran esquemas con las cassettes de expresión correspondientes a los genes quiméricos a1, a2 y a3. En cada caso se incluyen las respectivas secuencias reguladoras 5'-flanqueantes (incluyendo los promotores), 3'-flanqueantes (incluyendo los terminadores). Se indican las dianas de restricción usadas para ensamblar, en cada caso, el fragmento de ADN con las secuencias de HaHSFA10 (sombreado). El resto de las secuencias de los vectores binarios descrito en el texto de los ejemplos correspondientes no se representa en esta Figura.

Figura 8 Descripción de la secuencia de nucleótidos de un mRNA completo de HaHSFA10 y la traducción de la proteína correspondiente

Esta secuencia se determinó mediante el ensamblamiento de las correspondientes a dos clones de cDNA (HaHSFA10-36 y HaHSFA10-38). Dichos cDNAs tienen 5'-UTRs incompletos cuyos extremos se indican mediante trazos verticales en la primera (HaHSFA10-38) y segunda (HaHSFA10-36) líneas de la secuencia. La flecha indica la posición esperada para un intrón conservado presente en las secuencias genómicas. Bajo la secuencia de nucleótidos se muestra la traducción conceptual (in silico) de la proteína HaHSFA10. El codón de terminación se indica en negrita. También se indican los dominios putativos 15 identificados mediante comparaciones de secuencia con otros HSFs: el DBD con la substitución excepcional de un amino ácido (R, resaltado); el dominio de oligomerización con las repeticiones solapantes de siete residuos (HR-A/B) indicadas mediante pequeños círculos y asteriscos; una posible señal de localización nuclear bipartita (NLS); otras zona con repeticiones carboxilo-terminal (HR-C); y finalmente posibles motivos AHA (subrayados) con 20 residuos de triptófano (w1-w3).

Descripción detallada de la invención

La realización práctica de esta invención, representada con los ejemplos y figuras adjuntos, utiliza técnicas convencionales de Biología Molecular, Microbiología, ADN recombinante; y de producción de plantas transgénicas, que son de uso común en laboratorios especializados en estos campos. Estas técnicas están explicadas con suficiente detalle en la literatura científica [ver por ejemplo: Sambrok J, Fritsch EF, y Maniatis T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 2ª Edición. 1989; Glover DM, DNA Cloning, IRL Press, 1985; Lindsey K., Plant Tissue Culture Manual, Kluwer Academic Publishers. 1993; y Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers. 1992]. Los términos técnicos usados en esta solicitud (por ejemplo, cDNA, intrón, poly-A, promotor, 5'-UTR, RLM-RACE, mRNA, transgén, gen quimérico, gen delator -por reporter gene-, gen ortólogo, promotor, vector, vector binario, plásmido efector, expresión, transformación, sistema homólogo, sistema heterólogo, secuencia nativa -por wild-type o WT- etc.) son estándar y comprensibles sin ambigüedad por un experto en la materia. Ejemplos de descripciones precisas de los mismos se encuentran por ejemplo en WO0183792 (entre en las solicitudes de patentes citadas anteriormente), además de explicaciones adicionales que pueden encontrarse en la literatura científica citada en este y otros apartados de nuestra solicitud. Para otros detalles más específicos, se citan las referencias bibliográficas pertinentes en el lugar correspondiente de esta solicitud.

Clonación y propiedades de HaHSFA10

El cDNA de HaHSFA10 ha sido donado en nuestro laboratorio mediante una estrategia de híbrido sencillo (one-hybrid) en Saccharomyces cerivisiae (descrita de modo general por Li, J. J., y Herskowitz, I. Science 262, 1870-1874. 1993). Los detalles del procedimiento de donación son irrelevantes para nuestra invención, y serán descritos con detalle en otra publicación una vez presentada esta solicitud. Sin embargo, tanto el método de donación, como algunas peculiaridades de HaHSFA10 observadas en su secuencia (SEC. ID. N°: 1 y Figura 1), son relevantes en tanto que esta información pudiera utilizarse para obtener FTs homólogos de otras plantas con patrones de expresión y características funcionales semejantes a las determinadas para HaHSFA10. El cebo de ADN usado para la donación de HaHSFA10 tiene una triple repetición directa de las secuencias HSE proximales (desde la posición -89 a -57) del promotor Hahsp17.7G4. La secuencia de nucleótidos de este promotor ha sido descrita con anterioridad (Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. 1996). Dicho cebo se utilizó para donar distintos FTs a partir de una genoteca de cDNAs preparada con embriones de girasol a los 14 días tras la antesis. Este cebo se eligió en base a observaciones preliminares que indicaban que contenía sitios de unión para distintos FTs (HSFs y otros diferentes); aunque se desconocía tanto la identidad de dichos factores como su especificidad (ver Almoguera, C., Prieto-Dapena, P., y Jordano, J. Plant J 13, 437-446. 1998, y las consideraciones expuestas anteriormente en el apartado de "Estado de la Técnica").

El nombre asignado al FT objeto de nuestra invención, HaHSFA10, refleja las características y peculiaridades estructurales deducidas de la determinación de su secuencia (SEC. ID. N°: 1 y Figura 1 y 8). Debemos destacar la escasa conservación de la secuencia de nucleótidos de todos los HSFs donados hasta el momento, por lo que sólo son útiles las comparaciones de la traducción a amino ácidos de la secuencia de nucleótidos del cDNA de HaHSFA10 (SEC. ID. N°: 1). Incluso dichas comparaciones deben limitarse a dos regiones de la secuencia de amino ácidos que muestran una mayor conservación: el dominio de unión al ADN (DBD) y el dominio de oligomerización (OD), presentes en todos los HSFs, pues se trata de unos FTs que se unen al ADN como trímeros [ver por ejemplo las revisiones: Morimoto, R. I. Genes Dev 12, 3788-3796. 1998 (para HSFs animales); Schöffl, F., Prändl, R. y Reindl, A. Plant Physiol 117, 1135-1141. 1998; Nover, L., Bharti, K., Döring, P., Mishra, S. K., Ganguli, A. y Scharf, K. D. Cell Stress Chaperones 6, 177-189. 2001 (para HSFs vegetales); y otras referencias incluidas en estas revisiones]. Dichas comparaciones permiten que los datos resumidos a continuación (e ilustrados por la SEC. ID. N°: 1 y la Figura 1 y 8) puedan utilizarse para identificar tentativamente en otras plantas distintas al girasol otros HSFs con una estructura y funciones similares a las de HaHSFA10 (es decir posibles genes ortólogos). Sin embargo, las características funcionales de estos genes ortólogos y sus patrones de expresión no pueden ser inferidas exclusivamente de su secuencia. El conjunto de nuestras observaciones sobre HaHSFA10 (SEC. ID. N°: 1 y Figuras 2-6) es lo que permite demostrar su utilidad, e inferir una utilidad similar para posibles genes ortólogos de otras especies vegetales (ver especialmente la explicación de los datos ilustrados por la Figura 5C, que apoyan la existencia de al menos un gen ortólogo a HaHSFA10 en plantas de Nicotiana tabacum).

HaHSFA10 claramente muestra las características de los HSF de plantas de clase A. En consecuencia, la secuencia de aminoácidos obtenida muestra una inserción de 21 residuos entre las repeticiones hidrofóbicas HR-A y HR-B, presentes en el OD (ver Nover, L., Scharf, K. D., Gagliardi, D., Vergne, P., Czarnecka, V. E., y Gurley, W. B. Cell Stress Chaperones 1, 215-223. 1996). Sin embargo tanto el OD como el DBD de HaHSFA10 muestran una clara divergencia con los respectivos dominios presentes en el resto de HSFs de clase A clonados hasta el momento en vegetales (ver Nover, L., Bharti, K., Döring, P., Mishra, S. K., Ganguli, A. y Scharf, K. D. Cell Stress Chaperones 6, 177-189. 2001; y la Figura 1). Esto incluye especialmente la presencia de un residuo de arginina que reemplaza a una glicina conservada en todos los HSFs (animales y vegetales). Este cambio ocurre en una posición que flanquea la hélice de reconocimiento del ADN (\alpha3) en el DBD. Sólo hemos podido encontrar en las bases de datos dos ESTs (Expressed Sequence Tags), de Solanum tuberosum y Lycopersicon esculentum, con secuencias parciales (cDNAs incompletos) correspondientes a mRNAs que pudieran codificar HSFs con la misma substitución (Figura 1). Se desconoce incluso si los mRNA completos, correspondientes a dichos EST, existen y llegan a traducirse a proteína; así como su patrón de expresión -salvo la presencia respectiva de mRNAs incompletos en tubérculos y frutos- o alguna característica funcional de dichos posibles HSFs. El único ejemplo de un FT semejante a un HSF con una substitución de la glicina invariante es SKN7, en la levadura Saccharomyces cerevisiae (Morgan, B. A., Banks, G. R., Toone, W. M., Raitt, D., Kuge, S., y Johnston, L. H. Embo J 16, 1035-1044. 1997; ver la Figura 1). Otra característica que distingue a HaHSFA10 es el re-emplazamiento por arginina de una tirosina conservada en la mayoría de los HSFs vegetales de clase A (ver Nover, L., Bharti, K., Döring, P., Mishra, S. K., Ganguli, A. y Scharf, K. D. Cell Stress Chaperones 6, 177-189. 2001), lo que incluye a AtHSFA9, el HSF de Arabidopsis thaliana que globalmente presenta una secuencia de amino ácidos más semejante a HaHSFA10 (ver la R en la posición 114; Figura 1 y 8). Estas dos substituciones de amino ácidos, y los resultados de otros análisis filogenéticos de la secuencia de HaHSFA10 mencionados en la explicación de la Figura 1, nos permiten concluir que HaHSFA10 y los dos ESTs mencionados anteriormente representarían a un nuevo subgrupo de HSFs vegetales de clase A, al que hemos denominado A10. Este subgrupo sería suficientemente distinto del A9, y del resto de los subgrupos propuestos anteriormente, para considerarlo aparte. En la SEC. ID. N°: 1 señalamos otras características estructurales poco usuales deducidas de la secuencia de amino ácidos de HaHSFA10: Una región ácida situada amino-terminalmente respecto al DBD (los amino ácidos en las posiciones 7-66); y tres motivos AHA (Aromatic Hydrophobic and Acidic) bastante peculiares. Dichos motivos AHA son semejantes a los encontrados en los dominios de activación de otros HSF vegetales de clase A (ver Döring, P., Treuter, E., Kistner, C., Lyck, R., Chen, A., y Nover, L. Plant Cell 12(2), 265-278, 2000; Nover, L., Bharti, K., Döring, P., Mishra, S. K., Ganguli, A. y Scharf, K. D. Cell Stress Chaperones 6, 177-189. 2001). Sin embargo HaHSFA10 difiere en el número total de motivos AHA (tres), en sus secuencias, y en su posición dentro de la molécula (particularmente en la presencia de un motivo AHA en el extremo carboxilo).

Las siguientes observaciones adicionales determinan que el FT HaHSFA10, caracterizado por las secuencias de nucleótidos y de amino ácidos codificadas por su cDNA (SEC. ID. N°: 1, y otras comparaciones más detalladas en la Figura 1), posee las propiedades adecuadas para los usos propuestos en esta solicitud. De modo resumido, estas propiedades incluyen: 1.- La especificidad embrionaria de la expresión de HaHSFA10, comprobada tanto a nivel de mRNA (Figura 2) como de proteína (Figura 3), utilizando técnicas con la suficiente sensibilidad. 2.- La capacidad de HaHSFA10 de sustituir funcionalmente al HSF de Saccharomyces cerevisiae (ScHSF1) y de activar a genes quiméricos con un promotor mínimo y los HSEs naturales de los genes sHSP de girasol Hahsp17.7G4 y Hahsp17.6G1 (Figura 4A). 3.- Que HaHSFA10 es capaz de activar transcripcionalmente a los promotores de Hahsp17.6G1 (Figura 4B) y de Hahsp17.7G4 (Figura 5B) en embriones de girasol; siendo además el promotor de Hahsp17.6G1 específico de embriones (Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997), y selectivo para su activación transcripcional por otros HSFs heterólogos de tomate (ver Rojas A, Almoguera C, Carranco C, Scharf KD y Jordano J. Plant Physiol 129, en prensa, 2002). 4.- El efecto negativo de un HSE mutante (P, Figura 5A) sobre la activación transcripcional en embriones de promotor Hahsp17.7G4. Dicho efecto ha sido observado tanto con HaHSFA10 en embriones de girasol (Figura 5B); como con otros HSFs endógenos de plantas transgénicas de tabaco (Nicotiana tabacum), en este caso específicamente en semillas y sin afectar a la activación transcripcional por calor de dicho promotor en tejidos vegetativos (Figura 5C). Esta última propiedad de HaHSFA10 confirmaría: A.- La identificación de HaHSFA10 como un FTA implicado en la activación embrionaria de los genes sHSP de girasol Hahsp17.7G4 y Hahsp17.6G1 y de otros genes similares en otras plantas. B.- La existencia de HSFs funcionalmente equivalentes a HaHSFA10 en plantas distintas al girasol (en nuestro ejemplo el tabaco); y por tanto la posibilidad de utilizar HaHSFA10 para estrategias de "ganancia de función" en dichas plantas.

A modo de ejemplos demostrativos de la utilidad de HaHSFA10, como herramienta biotecnológica para los usos propuestos en esta solicitud, describimos con más detalle dichos resultados experimentales y las figuras acompañantes correspondientes.

Ejemplos de realización de la invención Ejemplo 1 Patrones de expresión del mRNA y la proteína de HaHSFA10 (Figuras acompañantes 2 y 3)

Los patrones de acumulación de los ARN mensajeros de HaHSFA10 se determinaron mediante la técnica de la protección frente a la Ribonucleasa A (RNAsa A), descrita con detalle en publicaciones anteriores de nuestro grupo [Almoguera C, Coca MA, Jordano J. Plant Physiol. 107: 765-773, 1995; Carranco, R., Almoguera, C., y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997]. Esta técnica combina una gran especificidad con una sensibilidad muy alta, permitiendo la detección de mRNAs poco abundantes (1 pg mRNA, ver por ejemplo Meisinger, C., y Grothe, C. Mol Biotechnol 5, 289-291.1996), y procedentes de un único gen distinguible de otros muy homólogos (en un caso extremo de genes que sólo se diferencian en un único nucleótido, ver Almoguera, C., Shibata, D., Forrester, K., Martin, J., Arnheim, N., y Perucho, M. Cell 53, 549-554. 1988). Para estos experimentos usamos una colección de muestras de RNA total purificadas a partir de embriones de girasol y de distintos órganos de plantas cultivadas en condiciones control o sometidas a diferentes condiciones de estrés. Estas mismas muestras han sido usadas previamente para otros análisis de acumulación de mRNAs durante la embriogénesis del girasol, y para estudiar mediante protección frente a RNAsa A la respuesta al calor y la desecación de otros genes de girasol. Por tanto, nuestros estudios anteriores nos proporcionan controles positivos adecuados para la expresión durante la embriogénesis y para el efecto de los distintos tratamientos de estrés en plantas de girasol. Las referencias bibliográficas correspondientes a dichos estudios también contienen los detalles de los procedimientos experimentales usados para el cultivo de las plantas, los distintos tratamientos y la purificación de las muestras de ARN [Almoguera, C., Coca, M. A., y Jordano, J. Plant J 4, 947-958. 1993; Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. 1996; Carranco, R., Almoguera, C., y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997].

Para producir la sonda de RNA (ribosonda) usada para detectar los ARNm de HaHSFA10, primero clonamos, como un fragmento EcoRI-PstI, uno de sus cDNAs (HSFA10-36) en el vector pBluescript SK+ (de Stratagene). Así obtuvimos el plásmido pSKHSFA10-36, a partir del cual preparamos un nuevo plásmido pSKHSFA10-RI clonando de nuevo en pBluescript SK+ el fragmento obtenido mediante digestión de pSKHSFA10-36 con EcoRI. La orientación de dicho fragmento es tal que tras linearizar pSKHSFA10-RI con XhoI, la transcripción in vitro (ver detalles en Carranco, R., Almoguera, C., y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997) con la RNA polimerasa de T3 produce la ribosonda de 507 nucleótidos usada en nuestros experimentos. Esta ribosonda incluye las secuencias de la cadena no-codificante de HaHSFA10, desde una posición situada inmediatamente 3' de la posición prevista para el intrón, hasta el extremo 5' del cDNA (ver el esquema en la parte inferior de la Figura 2 y la SEC. ID. N°: 1). Con dicha sonda, tras hibridación con las muestras de ARN y digestión con RNAsa A, esperábamos la detección de un fragmento de ARN protegido de un tamaño de 395 nucleótidos. La detección de este fragmento (marcado con "1" en la Figura 2) requiere la hibridación de la ribosonda con los mRNAs de HaHSFA10 sin que ocurra ningún desapareamiento. Esto ha permitido distinguir específicamente los patrones de acumulación de los mRNAs de este gen. En la parte superior de la Figura 2 se muestra que los mRNAs del gen HaHSFA10 se empiezan a acumular en semillas en desarrollo, desde fases tempranas de la embriogénesis zigótica; y que éstos desaparecen muy pronto tras la imbibición y germinación de las semillas. Así, los mRNAs de HaHSFA10 se detectan a partir de los 8 días tras la antesis (dpa), su acumulación se incrementa hasta los 18 dpa y posteriormente empieza a disminuir. Dichos mRNAs son apenas detectables a los 5 días tras la imbibición (dpi); además son indetectables, en condiciones control, tanto en germínulas de mayor edad (14 dpi), como en distintos órganos (tallos y hojas) de plantas adultas (datos mostrados el panel inferior de la Figura 2).

Puesto que tratamientos de estrés por calor inducen la expresión de algunos HSF vegetales (ver los datos revisados por Nover, L., Bharti, K., Döring, P., Mishra, S. K., Ganguli, A. y Scharf, K. D. Cell Stress Chaperones 6, 177-189. 2001), investigamos un posible comportamiento semejante en el caso de HaHSFA10. Adicionalmente estudiamos una posible respuesta al estrés hídrico, ya que la expresión de los genes sHSP potencialmente regulados por HaHSFA10 se inducen durante la fase de desecación de la embriogénesis (ver por ejemplo, Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. 1996; Carranco, R., Almoguera, C., y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997). Ninguna de dichas condiciones de estrés indujo la acumulación de los mRNAs de HaHSFA10 tras la embriogénesis zigótica. Tan sólo detectamos niveles muy bajos de mRNAs inducidos por el estrés hídrico en hojas y tallos, para lo que necesitamos incrementar substancialmente el tiempo de autoradiografía (ver los resultados mostrados en el panel inferior de la Figura 2 y la leyenda correspondiente).

Nuestros experimentos de protección con RNAsa A también detectaron al menos dos fragmentos adicionales de ARN protegidos (marcados con "2" en la Figura 2). Dichos fragmentos, de una tamaño aproximado de 350 nucleótidos, son demasiado grandes para ser explicados por complementaridad de secuencia completa (del 100%) con otro gen HSF; ya que tan sólo la secuencia de nucleótidos de la región DBD se conserva, y usualmente lo hace de forma escasa. Pensamos que las interpretaciones más probables para dichos fragmentos podrían ser (ver el esquema inferior en la Figura 2): 1.- La detección de mRNAs con el intrón sin procesar (unspliced), en cuyo caso la ribosonda protegería un fragmento de 361 nucleótidos desde la posición esperada para el intrón; o, 2.- La detección de mRNAs con un extremo 5' más corto. En ambos casos la detección de distintos mRNAs, aunque todos ellos procedentes del gen HaHSFA10, explicaría sus idénticos y muy peculiares patrones de acumulación.

La acumulación de un mRNA no siempre conlleva su traducción (síntesis) y acumulación de la proteína correspondiente, que normalmente es la responsable de la función del gen en cuestión. Por ello, hemos obtenido anticuerpos específicos frente a la proteína HaHSFA10 y, con ellos, hemos analizado la expresión (acumulación) de la dicha proteína durante la embriogénesis zigótica del girasol y en plantas control, o sometidas a los distintos tratamientos de estrés. El antígeno utilizado, para la producción de los anticuerpos poli-clonales en conejos, es una proteína recombinante expresada en células BL21 de Escherichia coli a partir del plásmido pRSET-HSFA10\DeltaBglII. Este plásmido contiene las secuencias del cDNA de HaHSFA10 entre BglII (posición 683) y PstI (posición 1247), insertadas en el vector pRSET-A (de Invitrogen). El antígeno se purificó mediante cromatografía de afinidad por metal en columnas TALON® (de Clontech, usando los procedimientos descritos por este fabricante). Los anticuerpos obtenidos se purificaron, a partir del suero completo, mediante adsorción sobre el antígeno inmovilizado en membranas Immobilon™-P (de Millipore). Esto se hizo esencialmente como se describe por Almoguera, C., Coca, M. A., y Jordano, J. Plant J 4, 947-958 (1993). Para la inmunodetección utilizamos membranas de Immobilon™-P y el sistema ECL+PIus™ (de Amersham Biosciences). Los anticuerpos primarios purificados se usaron con una dilución final de 1:4000 en hibridaciones a 4°C durante unas 16h (ver también los detalles en Almoguera, C., Coca, M. A., y Jordano, J. Plant J 4, 947-958, 1993). Las incubaciones con los anticuerpos secundarios, diluidos 1:20000, fueron durante 1 h a 25°C. Las autoradiografías se obtuvieron por exposición durante 5 min de película BioMax MS (de Kodak). Para las hibridaciones con los anticuerpos frente a HSC70 (de StressGen Biotechnologies Corp., diluidos 1:2000), las membranas se reciclaron usando los procedimientos y el kit Re-Blot Plus (de Chemicon International).

Los resultados de los experimentos de inmunodetección (análisis Western) mostrados en la Figura 3 confirmaron la mayor parte de nuestras observaciones sobre la acumulación de mRNA de HaHSFA10 (Figura 2): Así, detectamos la proteína HaHSFA10 en embriones desde los 8 dpa y verificamos su ausencia en tallos y hojas de planta en condiciones control y tras los diferentes tratamientos de estrés. Tras la germinación, la proteína HaHSFA10 persiste a un nivel bajo, pero (como en caso de los mRNAs correspondientes) sólo hasta los 5 dpi. También apreciamos algunas diferencias con los resultados de mRNA, ya que no conseguimos detectar la acumulación de la proteína HaHSFA10 en respuesta al estrés hídrico en tejidos vegetativos (comparar las Figuras 2 y 3). La proteína HaHSFA10 detectada en embriones tiene un peso molecular aparente de 53.7 kD. Este peso es mayor que el predicho por la traducción de la secuencia de nucleótidos del cDNA (43.9 kD); pero una discrepancia similar tiene precedentes en otros HSFs (ver por ejemplo los datos revisados por Nover, L., Scharf, K. D., Gagliardi, D., Vergne, P., Czarnecka, V. E., y Gurley, W. B. Cell Stress Chaperones 1, 215-223. 1996).

De todos los resultados experimentales mostrados en este ejemplo (ilustrado con las Figuras 2 y 3) concluimos que el gen HaHSFA10 tiene un patrón de expresión excepcional para un HSF (considerando todas las observaciones previas en sistemas animales y vegetales resumidas en el apartado de Estado de la Técnica). La detección de la proteína HaHSFA10, antes de (y durante) la fase de desecación de la embriogénesis zigótica del girasol, indica claramente que este factor podría estar implicado en funciones especializadas; como la activación transcripcional durante el desarrollo embrionario de genes sHSP, como Hahsp17.6 G1 y Hahsp17.7 G4. Los resultados experimentales incluidos en los ejemplos adicionales confirmarían funcionalmente esta hipótesis, mostrando así la utilidad de nuestra invención. Aunque también hemos sido incapaces de detectar la proteína HaHSFA10 en raíces, y por tanto verificamos su ausencia en todos los órganos vegetativos del girasol analizados en distintas condiciones, nuestros resultados no excluyen la expresión de la proteína HaHSFA10 y las de otros HSFs similares (del nuevo grupo propuesto A10) en otras situaciones de desarrollo: por ejemplo en gametos, frutos. Se desconocen los patrones de expresión de los HSFs similares identificados en base a comparaciones de secuencia y análisis filogenéticos (Figura 1) salvo la acumulación de sus mRNAs incompletos en frutos de tomate (Le-EST, AW930998) o en tubérculos de patata (St-EST, BG886969). No podemos descartar que en otras especies vegetales la expresión de HSFs de tipo A10 muestre una especificidad algo distinta de la de HaHSFA10. Así, además de en semillas, dichos HSFs pudieran expresarse en otras condiciones de desarrollo y órganos, como los tubérculos, donde también se ha descrito la expresión de sHSPs en ausencia de estrés (ver Lubaretz, O., y Zur Nieden, U. Planta 215, 220-228. 2002). Incluso en este caso, la especialización de los HSFs de tipo A10 sería lo suficientemente alta para los usos propuestos. La especificidad embrionaria de HaHSFA10 ha facilitado la identificación de dicho FT en el sistema de girasol. Las peculiaridades estructurales y otras características, que distinguen funcionalmente a HaHSFA10 y que se detallan en los siguientes ejemplos, permitirían la identificación tentativa de otros HSFs semejantes que tendrían las mismas utilidades.

Ejemplo 2 Funcionalidad de HaHSFA10 en la levadura Saccharomyces cerevisiae: activación transcripcional de genes quiméricos con los HSE naturales de Hahsp17.6G1 y Hahsp17.7G4 (Figura acompañante 4A )

En primer lugar hemos confirmado la integridad y actividad transcripcional de la(s) proteína(s) HaHSFA10 codificadas por las secuencias de nucleótidos del cDNA ensamblado en la SEC. ID. N°: 1. Para ello construimos un vector de expresión apropiado para levaduras que contiene la secuencia codificante completa de HaHSFA10, desde el primer residuo de metionina presente hasta la posición 1254 en el 3'-UTR. Este vector nos ha permitido el re-emplazamiento funcional del único HSF de Saccharomyces cerevisiae (ScHsf1) por HaHSFA10. La deleción cromosómica del gen ScHsf1 es letal y no permite el crecimiento de la levadura incluso a temperaturas normales (sin choque de calor); sin embargo dicha cepa mutante es viable tras re-introducir el gen ScHsf1 en un plásmido con el marcador URA3 (ver el experimento control mostrado en la parte superior de la Figura 4A y Boscheinen, O., Lyck, R., Queitsch, C., Treuter, E., Zimarino, V., y Scharf, K. D. Mol Gen Genet 255, 322-331. 1997). Hemos producido otra cepa de levadura con HaHSFA10 como su único HSF (cepa RSY4::HaHSFA10). Los resultados en la parte superior de la Figura 4A demuestran que a 28°C (e incluso a 35°C) dicha cepa tiene una viabilidad comparable a la de la cepa original (con ScHsf1 en el plásmido). En cambio, sólo la cepa con ScHsf1 es viable hasta los 37°C. Ambas cepas tuvieron además una tasa de duplicación similar en medio líquido YPD a 28°C (aproximadamente de unas 2-2.5 horas, datos no mostrados en la Figura). Estos resultados son comparables a los obtenidos en experimentos análogos usando otros HSFs de clase A procedentes de Lycopersicon peruvianum (Boscheinen, O., Lyck, R., Queitsch, C., Treuter, E., Zimarino, V., y Scharf, K. D. Mol Gen Genet 255, 322-331. 1997).

También hemos usado la cepa RSY4::HaHSFA10 para demostrar la capacidad de activación transcripcional de distintos genes quiméricos por HaHSFA10, investigando además la dependencia de dicha activación de la complejidad de los HSEs presentes en cada caso. Dichos genes quiméricos contienen un gen delator (la \beta-Galactosidasa), un promotor mínimo de levaduras (Cyc1), y distintos HSE (con secuencias naturales, o mutagenizadas) donados frente al promotor mínimo). Estos HSEs proceden de dos genes sHSP de girasol expresados durante la embriogénesis. En primer lugar, mostramos que HaHSFA10 es capaz de activar a un gen quimérico a través las secuencias de los HSEs de Hahsp17.7G4 (Figura 4A: panel inferior izquierdo, WT). Estas secuencias comprenden dos regiones HSE (una proximal y otra distal respecto al promotor) con su espaciado y repeticiones naturales. Estos resultados confirman la capacidad de activación transcripcional de HaHSFA10, a través los HSEs de Hahsp17.7G4, sin la multimerización utilizada para donar dicho FT mediante one-hybrid. El nivel de activación obtenido se redujo considerablemente en una cepa con otro gen quimérico con una versión mutante (no funcional) de dichos HSEs (Figura 4A: panel inferior izquierdo, m). Destacamos, sin embargo, que el nivel de activación residual de dicho gen quimérico es mayor que el observado en experimentos similares con otros HSFs vegetales y plásmidos con otros HSEs no funcionales (aproximadamente 1, ver Bharti, K., Schmidt, E., Lyck, R., Heerklotz, D., Bublak, D., y Scharf, K. D. Plant J 22, 355-365. 2000). Los HSEs de gen mutante "m" aún conservan un pequeño número de núcleos de repeticiones con similitud a las secuencias GAA y TTC, aunque espaciadas por otras secuencias sin esta similitud (es decir con "mellas" o gaps entre los núcleos de secuencia conservada; ver Almoguera, C., Prieto-Dapena, P., y Jordano, J. Plant J 13, 437-46. 1998, y el esquema en la Figura 5A). Por lo tanto, estas observaciones nos sugirieron que HaHSFA10 pudiera unirse y activar eficientemente la transcripción a través de otros HSEs naturales con una estructura similar. Esta hipótesis se ha verificado con las observaciones realizadas utilizando genes quiméricos análogos con secuencias HSE sin modificar (WT), o en su versión mutante no funcional (m), procedentes del gen Hahsp17.6G1. Dichas secuencias contienen un número menor de repeticiones que en caso de Hahsp17.7G4, y los núcleos repetidos ya están espaciados por "mellas" en la versión natural sin modificar (Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997). Así, mientras que el gen quimérico con la versión WT del HSE de Hahsp17.6G1 se activó eficientemente por HaHSFA10, en el gen con el HSE mutante no funcional (m), que conserva un único núcleo de tipo GAA, la actividad residual se redujo hasta los niveles usuales mencionados anteriormente (es decir 1, Figura 4A: panel inferior derecho). Los resultados experimentales en este ejemplo demuestran que el FT HaHSFA10, codificado por el cDNA correspondiente a la SEC. ID. N°: 1, es capaz de sustituir funcionalmente en levaduras a ScHsf1 (a temperaturas de crecimiento <35°C) y de activar a genes quiméricos con los HSEs de Hahsp17.6G1 o Hahsp17.7G4.

A continuación señalamos los detalles específicos más relevantes de los procedimientos experimentales de este apartado. Para la substitución de ScHsf1 por HaHSFA10 fue necesaria la construcción de un plásmido (pSKHSFA10-F, ver su mapa en la Figura 7 del apartado "otros ejemplos"), derivado del vector pBluescript SK+ (de Stratagene), con las secuencias ensambladas completas de HaHSFA10. Esto se hizo ligando un fragmento de ADN de 120bp, con las secuencias desde el extremo 5' del cDNA hasta el sitio de StyI en la posición 122 de la secuencia de nucleótidos SEC. ID. N°: 1, junto con resto de las secuencias del cDNA HaHSFA10-36 clonadas en dicho vector (en el plásmido pSKHaHSF-36). Las secuencias del fragmento de 120 pb se clonaron por RLM-RACE (usando materiales y procedimientos descritos por Invitrogen, el fabricante de Kit GeneRacer™); y se amplificaron por PCR usando los oligonucleótidos HSFA10-RACE (posiciones 265-241 de la cadena no codificante del cDNA) y TOPO-1 (5'-atcATATTCTCCTTCAAAAA-3'). El vector de expresión para levaduras se construyó sustituyendo las secuencias de LpHSFA2 [fragmento de ADN SalI-SacI en un plásmido derivado de pAD5\Delta descrito previamente (Boscheinen, O., Lyck, R., Queitsch, C., Treuter, E., Zimarino, V., y Scharf, K. D. Mol Gen Genet 255, 322-331. 1997)], por el fragmento correspondiente con las secuencias de HaHSFA10 en pSKHSFA10-F. Para sustituir ScHsf1 por HaHSFA10 en la estirpe de Saccharomyces cerevisiae RSY4, dicha estirpe mutante, con ScHsf1 en un plásmido URA3, se transformó con el plásmido pAD5\Delta-HSFA10 (el vector de expresión de HaHSFA10 para levaduras). El plásmido con ScHsf1 se eliminó posteriormente tras cultivo durante 5 días en medio SD-LEU seguido de plaqueo a baja densidad en medio SD+FOA; finalmente comprobamos el contenido plasmídico de la estirpe mediante PCR. Para los aspectos generales de este procedimiento, ver la substitución de ScHsf1 por otros HSFs descrita anteriormente con suficiente detalle por Boscheinen, O., Lyck, R., Queitsch, C., Treuter, E., Zimarino, V., y Scharf, K. D. Mol Gen Genet 255, 322-331. (1997).

La estirpe Saccharomyces cerevisiae RSY4 y los procedimientos para los ensayos de actividad \beta-Galactosidasa también han sido descritos anteriormente con suficiente detalle (Boscheinen, O., Lyck, R., Queitsch, C., Treuter, E., Zimarino, V., y Scharf, K. D. Mol Gen Genet 255, 322-331. 1997). Los plásmidos con el gen delator de \beta-Galactosidasa se construyeron a partir del vector pZJ (Slater, M. R., y Craig, E. A. Mol Cell Biol 7, 1906-1916.1987) y de las respectivas secuencias HSE (WT, m) contenidas en otros genes quiméricos (Hahsp17.7G4::GUS y Hahsp17.6G1::GUS) descritos anteriormente (ver, respectivamente, Almoguera, C., Prieto-Dapena, P., y Jordano, J. Plant J 13, 437-446. 1998, y Rojas A, Almoguera C, Carranco C, Scharf KD y Jordano J. Plant Physiol 129, en prensa, 2002). En resumen, cada HSE se amplifico por PCR a partir de cada gen quimérico GUS. Tras digestión con SalI, en las dianas de restricción introducidas en los extremos de los fragmentos de ADN amplificados, cada fragmento se clonó en la diana XhoI de pZJ. En cada caso se comprobó la secuencia, y orientación respecto al promotor Cyc1 en pZJ, de cada secuencia HSE amplificada. Los fragmentos de ADN así amplificados tienen un tamaño de 88 bp (con los HSEs de Hahsp17.6G1), o de 107 bp (con HSEs de Hahsp17.7G4). Las parejas de oligonucleótidos usadas para las amplificaciones por PCR fueron: 5'-TAATAATCCGTcGAcAAAAAAGC-3' y 5'-GGATATTGtCgACGTAGTAG-3' (en el caso de los HSEs de Hahsp17.6G1); y 5'-CCACCTCAgTcgaCCTCTTTT-3', junto con 5'-AAGAAGGGtcGAcTGAGTAAT-3' (en el caso de los HSEs de Hahsp17.7G4). Se indican con letras minúsculas las substituciones de nucleótidos realizadas para introducir las dianas de SalI (para más detalles respecto a las construcciones con secuencias HSE de Hahsp17.6G1, ver también lo descrito por Rojas A, Almoguera C, Carranco C, Scharf KD y Jordano J. Plant Physiol 129, en prensa, (2002).

Ejemplo 3 Activación transcripcional del promotor de Hahsp17.6G1 por HaHSFA10 en embriones de girasol (Figura acompañante 4B)

Los resultados experimentales obtenidos en levaduras con el gen quimérico que contiene el HSE natural de Hahsp17.6G1 (Figura 4A, G1 HSE) sugirieron que el propio promotor del gen Hahsp17.6G1 pudiera ser activado transcripcionalmente por HaHSFA10 en embriones de girasol. Dicho promotor confiere un patrón de expresión único (específico de semillas y no inducible por calor) entre los genes sHSP vegetales; una característica hipotéticamente relacionada con la peculiar estructura de sus HSEs (Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997; Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant Physiol 121, 723-730. 1999).

En este ejemplo mostramos (Figura 4B), mediante expresión transitoria en embriones de girasol, que HaHSFA10, expresado a partir de un plásmido efector apropiado, es capaz de activar a un gen quimérico con el promotor de Hahsp17.6G1 (-1486::GUS); mientras que dicha activación no ocurre en otro gen quimérico [-1486(m)::GUS] que difiere del anterior en tres sustituciones críticas de nucleótidos en los HSEs.

Ejemplo 4 Activación transcripcional del promotor de Hahsp17.7G4 por HaHSFA10 en embriones de girasol (Figuras acompañantes 5A y 5B)

De forma análoga al ejemplo anterior, en este ejemplo mostramos que HaHSFA10 también es capaz de activar a un gen quimérico con el promotor de Hahsp17.7G4 (del que derivaron las secuencias HSE usadas para la clonación de HaHSFA10), y que dicha activación también depende de nucleótidos críticos para la unión de HSFs a los HSEs (Figuras 5A y 5B).

Los detalles metodológicos no descritos previamente en la literatura científica, correspondientes a los experimentos de los ejemplos 3 y 4, y las referencias bibliográficas para procedimientos (o material) descrito anteriormente se incluyen a continuación. En el caso del promotor de Hahsp17.6G1, ya habíamos descrito los genes quiméricos GUS utilizados (Rojas A, Almoguera C, Carranco C, Scharf KD y Jordano J. Plant Physiol 129, en prensa, 2002); y el efecto de las sustituciones en los HSEs sobre su activación transcripcional por HSFs endógenos en embriones de plantas transgénicas de tabaco [Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant Physiol 121, 723-730. (1999); o incluso por HSFs heterólogos (de tomate) en embriones de girasol (Rojas A, Almoguera C, Carranco C, Scharf KD y Jordano J. Plant Physiol 129, en prensa, 2002)]. Los genes con el promotor de Hahsp17.7G4, las condiciones experimentales para la expresión transitoria en embriones de girasol, los procedimientos de normalización de la actividad GUS con luciferasa, y el análisis estadístico de los resultados han sido descritos con detalle por Rojas, A., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant J 20, 601-610 (1999). El plásmido efector utilizado en estos experimentos (p35S::HSFA10) contiene la secuencia completa del cDNA de HaHSFA10 clonada tras el promotor y estimulador (enhancer) del gen 35S CaMV procedente del plásmido pBI221 (Jefferson, R.A. Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405. 1987). El plásmido p35S::HSFA10 se obtuvo sustituyendo, en pBI221, las secuencias de gen GUS por las de HaHSFA10. Estas últimas se purificaron como un fragmento de ADN de 1300pb, con extremos de EcoRV y SacI, que se obtuvo por restricción del plásmido pSKHSFA10-F (descrito anteriormente en esta solicitud, ver la Figura 7 en "otros ejemplos"). Dicho fragmento se ligó en pBI221, digerido a su vez con SmaI y SacI.

Ejemplo 5 Efecto específico, en embriones de girasol y de plantas transgénicas de tabaco, de las mutaciones que perfeccionan el HSE del promotor de Hahsp17.7G4: Existencia de HSFs funcionalmente equivalentes a HaHSFA10 en Nicotiana tabacum (Figuras acompañantes 5A-5C)

Nuestros estudios previos de la activación transcripcional de los genes sHSP de girasol habían determinado que el gen Hahsp18.6G2 responde a choques de calor, pero en cambio, y a diferencia de HaHsp17.7G4 y Hahsp17.6G1, que Hahsp18.6G2 no se activa durante la embriogénesis zigótica (ver Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997). Los promotores de HaHsp17.7G4 y HaHsp18.6G2 se asemejan en la presencia de dos regiones HSE de tamaño y posición comparable (I: proximal y II: distal, respecto al promotor); pero las regiones HSE de Hahsp18.6G2 difieren en su mayor perfección (o ajuste a la secuencia consenso repetida aGAA/TTCt), en el sentido de que carecen de "mellas" o espaciamientos entre los núcleos (core repeats) de las repeticiones conservadas en cada región (ver la Figura 5A para los HSEs de Hahsp17.7G4). Por ello, en primer lugar, y dado que HaHSFA10 es capaz de activar transcripcionalmente en embriones de girasol al promotor de Hahsp17.7G4 a través de sus HSEs (ver Figura 5B), decidimos estudiar como afecta a dicha activación las mutaciones que hacen que dichos HSEs se "perfeccionen" y se parezcan más a los de Hahsp18.6G2. En el esquema de la Figura 5A presentamos la secuencia de dichas mutaciones (P) realizadas en el mismo contexto que el resto de los genes quiméricos con el promotor de Hahsp17.7G4 (Rojas, A., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant J 20, 601-610. 1999). Los datos presentados en la parte derecha de la Figura 5B muestran el efecto observado en este sistema: una reducción estadísticamente significativa (F=9.82, P=0.002) de la activación por HaHSFA10 del gen quimérico P comparado con el WT. Dicha reducción se ve acompañada por un aumento significativo (F=40.01, P=0.0001) de la actividad basal (es decir sin HaHSFA10) del gen P, si ésta se compara con la de los genes WT y m.

Estos resultados demuestran una característica funcional novedosa y diferencial para HaHSFA10: que dicho FT es capaz de activar a través de los HSEs naturales (WT) del gen Hahsp17.7G4 de forma más eficiente que a través de su versión mutante perfeccionada (P). En cambio otros HSFs se comportan de la forma contraria, lo que explicaría el incremento de la actividad basal dependiente de la integridad de los HSEs (debida a la activación más eficiente de P por otros HSFs presentes en embriones de girasol), o la similar actividad transcripcional observada previamente en embriones de girasol con los mismos genes quimérico WT y P, pero usando un HSF diferente: LpHSFA1 (ver Rojas, A., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant J 20, 601-610. 1999).

Adicionalmente mostramos en este ejemplo el análisis, usando plantas transgénicas de tabaco, del efecto de la versión mutante P de los HSEs sobre la regulación del gen quimérico correspondiente durante el desarrollo embrionario y en respuesta a los choques de calor (Figura 5C). El uso de dicho sistema heterólogo es posible ya que previamente habíamos mostrado que con él podemos reproducir fielmente la regulación transcripcional del gen Hahsp17.7G4 en ambas condiciones (Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. 1996; Almoguera, C., Prieto-Dapena, P., y Jordano, J. Plant J 13, 437-46. 1998). Por tanto, estos estudios de expresión estable son complementarios de los de expresión transitoria utilizados en girasol (el sistema homólogo, Figura 5B), y nos permiten además determinar las características funcionales de los HSFs de tabaco implicados en la activación embrionaria del promotor Hahsp17.7G4. Los resultados que se presentan en el panel izquierdo de la Figura 5C demuestran que en comparación con el gen quimérico WT, el gen mutante P no se vio afectado en su respuesta a choques de calor en germínulas. Ambos genes muestran niveles de actividad estadísticamente similares en condiciones control (F=0.06, P=0.81) y tras la inducción por calor (F=0.002, P=0.96). Sin embargo, durante el desarrollo embrionario observamos una reducción significativa de la actividad del gen mutante P, que además ocurre específicamente durante la fase de desecación (28 dpa, F=36.5, P=0.0001), pero no en etapas anteriores (16 dpa, F=1.67, P=0.2). Por tanto, el efecto negativo del HSE mutante P en las plantas transgénicas de tabaco es altamente específico y se restringe a la fase de la embriogénesis zigótica donde se produce la mayor activación transcripcional del promotor Hahsp17.7G4. Además dicho efecto es similar, e incluso más drástico, que el observado sobre la activación por HaHSFA10 de dicho promotor usando el mismo gen quimérico en el sistema homólogo de embriones de girasol (comparar las Figuras 5B y 5C). Estos resultados nos permiten inferir que en las plantas de tabaco existen HSFs con características funcionales análogas a las de HaHSFA10 y que su implicación en la activación transcripcional del promotor Hahsp17.7G4 se restringe a fases determinadas de la embriogénesis; de acuerdo con el resto de las observaciones sobre HaHSFA10 en el sistema homólogo de girasol. Dichos factores estarían también implicados en la regulación embrionaria de genes sHSPs de tabaco que probablemente tienen HSEs de estructura similar a los de Hahsp17.7G4 y Hahsp17.6G1. Esta conclusión apoya que HaHSFA10 pueda usarse para aproximaciones de "ganancia" de función tanto en el sistema homólogo (girasol) como en plantas transgénicas heterólogas: por ejemplo el tabaco u otras solanáceas; y probablemente en cualquier monocotiledónea o dicotiledónea transformable, ya que la expresión de genes sHSP en semillas mediada por HSFs parece conservarse evolutivamente (según datos en las referencias y revisiones citadas en el apartado de estado de la técnica).

A continuación damos los detalles metodológicos no descritos previamente en la literatura científica, correspondientes a los experimentos con las plantas transgénicas de tabaco incluidos en este ejemplo, y las referencias bibliográficas para los procedimientos (o el material) descrito anteriormente. El plásmido binario con el gen quimérico con el HSE mutante P se obtuvo clonando en pBIN19 (Bevan, M. Nucl. Acids Res. 12, 8711-872. 1987; N° de acceso U09365) un fragmento de ADN con dicho gen (con extremos de SalI y SacI). Dicho fragmento lo obtuvimos por restricción del plásmido SK-1132::GUS(mutP), que previamente hemos descrito (Rojas, A., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant J 20, 601-610. 1999). Los transformantes primarios (T0), y la primera generación de plantas transgénicas descendientes (T1), con los genes binarios tanto de -1132(mutP)::GUS como de

\hbox{-1132(WT)::GUS}

, se obtuvieron mediante los procedimientos descritos por Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. (1996). Se analizaron en cada caso varias plantas transgénicas con un número similar (1-3) de eventos de integración del transgén. Para los ensayos de expresión durante el desarrollo embrionario se usaron plantas T0 y para los de la respuesta al calor sus descendientes (plantas T1). Los procedimientos para la determinación de la actividad fluorimétrica de la actividad GUS y para el análisis estadístico de los datos se describen en Almoguera, C., Prieto-Dapena, P., y Jordano, J. Plant J 13, 437-446. (1998). Los tratamientos de choque térmico fueron durante 2.5 h a 42°C, seguidos de 3h de recuperación a 25°C antes de las determinaciones de actividad GUS. Ejemplo 6 Activación transcripcional por HaHSFA10 de los promotores de Hahsp17.6G1 y Hahsp17.7G4 en hojas de girasol: (Figura acompañante 6)

Algunos de los usos propuestos para HaHSFA10 en esta solicitud requerirían su expresión ectópica (es decir fuera de los embriones) o en sistemas heterólogos (distintos al girasol); y que en estas condiciones HaHSFA10 sea capaz de activar transcripcionalmente a los genes sHSP expresados normalmente en embriones durante el desarrollo. Los datos mostrados en los ejemplos experimentales anteriores muestran la capacidad de activación transcripcional de HaHSFA10 a través de los HSEs apropiados en un sistema heterólogo muy distante evolutivamente al girasol (la levadura Saccharomyces cerevisiae, Ejemplo 2); y sugieren la existencia de HSFs funcionalmente equivalentes (de tipo A10) en especies vegetales distintas al girasol (tabaco en el Ejemplo 5). Adicionalmente, en este ejemplo, mostramos la capacidad de activación transcripcional de los promotores de Hahsp17.6G1 y Hahsp17.7G4 por sobre expresión ectópica de HaHSFA10 en hojas de girasol (Figura 6). Los genes quiméricos con ambos promotores (con sus HSEs WT respectivos) se activan con una eficiencia comparable en un órgano vegetativo en el que no se expresa HaHSFA10 (ver las Figuras 2 y 3) ni se activan transcripcionalmente ninguno de estos promotores en ausencia de estrés (calor o desecación), o incluso tras tratamientos de estrés (sólo en el caso de Hahsp17.6G1; ver Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. 1996; Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. J Biol Chem 272, 27470-27475. 1997; Carranco, R., Almoguera, C. y Jordano, J. Plant Physiol 121, 723-730. 1999). Este ejemplo, junto con los anteriores, confirmaría la posibilidad de usar HaHSFA10 para la activación transcripcional ectópica (en hojas y otros órganos vegetativos) de genes sHSP semejantes a Hahsp17.6G1 y Hahsp17.7G4 en el girasol y otras plantas.

Las condiciones experimentales de la expresión transitoria en hojas de girasol difieren de lo descrito anteriormente en esta memoria para los experimentos análogos realizados con embriones en los siguientes puntos: el material vegetal utilizado son trozos cuadrangulares de 1 cm^{2} (del primer par de hojas verdaderas, sin el nervio principal), que se esterilizaron por lavados sucesivos con Etanol (70%, durante 1 min) e hipoclorito sódico (2% + 1 gota de Triton X-100, durante 30 min), seguido de varios aclarados con agua estéril. Dichos trozos se cultivan (con la cara correspondiente al haz dispuesta hacia arriba), 24h antes, y otras 24h tras el bombardeo con micro-proyectiles, sobre medio sólido MS con sacarosa (2%), y las hormonas 6-benzilaminopurina (1 mg/ml) y 1-naftalenoacético (0.1 mg/ml). Las condiciones para el bombardeo con el sistema Biolistic PDS-1000 He (de Biorad) difieren únicamente en el uso de membranas de ruptura de 900 psi (en vez de 1500 psi).

Otros ejemplos (Figura 7 acompañante)

El ejemplo "Ea" representa la construcción de distintos genes quiméricos que permiten la sobre-expresión, constitutiva o regulada de proteína(s) HaHSFA10 (y eventualmente de otros HSFs funcionalmente equivalentes) en distintas plantas transgénicas (sus esquemas se muestran en la Figura 7). Los ejemplos anteriores, junto con los antecedentes mencionados en el Estado de la Técnica (y en especial, Sun, W., Bernard, C., van De Cotte, B., Van Montagu, M., y Verbruggen, N. Plant J 27, 407-415, 2001) indican que la consecuencia de dichas manipulaciones experimentales sería la ganancia de función consecuencia de la sobre-expresión (y/o expresión ectópica) de los genes sHSP activados transcripcionalmente de forma específica por dichos factores (esto último según los ejemplos 2-7). Ni la producción de plantas transgénicas de distintas especies transformables, ni los procedimientos para la verificación de la sobre-expresión de dichas sHSPs y de sus efectos son en sí mismos novedosos o particularmente cruciales para nuestra invención; existiendo descripciones suficientemente detalladas de ejemplos análogos con demostrada eficiencia en la literatura científica y en las bases de datos de patentes. Igualmente podemos decir de la construcción de los genes quiméricos, apartado en el que el único punto crucial (el objeto de nuestra invención) es la inclusión del cDNA de HaHSFA10 (completo o parcialmente modificado), o en su caso de otras secuencias que codifiquen HSFs funcionalmente análogos y que por lo tanto pudieran producir efectos similares sobre la expresión de genes sHSP regulados por dichos factores. Por ello, aquí nos concentramos en la descripción de los detalles críticos y de las modificaciones más evidentes, cubriendo otros aspectos de conocimiento general con algunas referencias bibliográficas pertinentes. El ejemplo "Eb", contempla un uso complementario de HaHSFA10: la activación de genes quiméricos "diana" con distintas utilidades, utilizando para ello genes quiméricos "efectores" como los usados en el ejemplo A.

Ea.- Genes quiméricos para aumentar la expresión de los genes regulados naturalmente por HaHSFA10, o por HSFs similares, en distintas plantas

En este ejemplo describimos, de forma no excluyente, tres genes quiméricos construidos en nuestro laboratorio y utilizables para ganancia de función por sobre-expresión de HaHSFA10 en distintas plantas transgénicas; concretamente (ver la Figura 7):

a1.- Gen para la sobre-expresión "constitutiva" de HaHSFA10 utilizando el promotor y enhancer de 35S CaMV. Las secuencias codificantes del gen GUS en el plásmido binario pBI101.1 (número de acceso de secuencia U12639), que además contiene un terminador del gen nos, se sustituyeron por las del cDNA de HaHSFA10 (ya clonado tras dicho promotor y enhancer en el plásmido efector p35S::HaHSFA10, descrito en el ejemplo 4). Así, un fragmento de ADN de 2168 pb con extremos romos SphI (por tratamiento con la DNA polimerasa de T4) y SacI, purificado a partir de p35S::HaHSFA10 se liga al fragmento de ADN de 12033 pb obtenido por digestión con SmaI y SacI de pBI101.1.

Este ejemplo es análogo a lo descrito para otros genes quiméricos utilizados para la ganancia de función por expresión ectópica el factor ABI4 (patente US6248937). La sobre-expresión constitutiva de otros HSFs vegetales, usando genes quiméricos semejantes a los descritos en este apartado, no ha producido efectos negativos sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas transgénicas; y ha permitido una ganancia de función (el aumento de la termo-tolerancia) consecuencia de la activación específica de los genes sHSP regulados por dichos factores (Prändl R, Hinderhofer K, Eggers-Schumacher G y Schöffl F Mol Gen Genet 258, 269-78. 1998; Mishra SK et al. Genes & Development 16, en prensa, 2002). Por tanto no es probable que la sobre-expresión constitutiva de HaHSFA10 sea nociva para las plantas transgénicas; aunque en los siguientes ejemplos se presentan distintas soluciones alternativas para dicha posibilidad.

a2.- Gen para la sobre-expresión específica en semillas de HaHSFA10. Usamos el promotor y secuencias reguladoras del gen de girasol Hads10, contenidas en el vector de expresión ds10EC1. Dichas secuencias inducen niveles de expresión muy elevados en distintos tejidos embrionarios, y no la permiten en tejidos vegetativos y otros órganos salvo una expresión residual en el polen (Prieto-Dapena, P., Almoguera, C., Rojas, A., y Jordano, J. Plant Molecular Biology 39, 615-627. 1999; y Patente PCT/ES99/00017). Este gen se construye en dos pasos. Las secuencias utilizadas de HaHSFA10 se obtienen, como un fragmento de ADN de 1258 pb, mediante doble restricción con EcoRV y SmaI del plásmido pSKHSFA10-F (descrito en el ejemplo 2). Dicho fragmento se liga al vector de expresión ds10EC1 (descrito en nuestra patente PCT/ES99/00017), que previamente se prepara mediante restricción con EcoRI y relleno de los extremos con klenow. Se verificó que la orientación del inserto de HaHSFA10 respecto al promotor en ds10EC1 es correcta, obteniendo así el plásmido intermedio pds10EC1::HaHSFA10. La versión binaria final de este plásmido (pBIN19::ds10EC1::HaHSFA10) se obtuvo clonando en el vector pBin19 (Bevan, M. Nucl. Acids Res. 12, 8711-872. 1987; N° de acceso U09365), que previamente se digirió con ambos enzimas, el fragmento de ADN de unas 5 Kb, obtenido por doble restricción con SalI y SacI a partir del plásmido pds10EC1::HaHSFA10.

a3.- Gen para la sobre-expresión de HaHSFA10 utilizando el promotor y las secuencias reguladoras de Hahsp17.7G4 (contenidas en el gen quimérico - 1132(\DeltaBglII)::GUS, Almoguera C, Rojas A, y Jordano, J. Plant Phys 129, 313-341 (2002); o modificaciones de dichas secuencias, por ejemplo según nuestra patente Española P9602746). Con este transgen la proteína HaHSFA10 se produce a partir de un promotor activado por ella (demostrado con el ejemplo 4), lo que provocaría un lazo de retro-alimentación (feedback) que amplifica esta activación y la cantidad final de HaHSFA10. Además, y dado el patrón de expresión observado con el gen -1132(\DeltaBglII)::GUS en plantas transgénicas de tabaco, el nuevo transgen serviría no sólo para sobre-expresar HaHSFA10 en semillas, sino también ectópicamente y de forma inducible, por ácido abscísico (ABA), o por calor, en tejidos vegetativos (ver también la expresión del gen -1132::GUS, una fusión traduccional muy similar a -1132(\DeltaBglII)::GUS que aunque se induce peor por calor, lo hace bien en respuesta a ABA, Coca, M. A., Almoguera, C., Thomas, T. L. y Jordano, J. Plant Mol Biol 31, 863-876. 1996). La expresión ectópica de la proteína HaHSFA10 en respuesta a tratamientos de calor pudiera ser muy ventajosa, ya que en estas condiciones no se expresa normalmente HaHSFA10 (Figuras 2 y 3), y precisamente el aumento de temperatura conduce a un deterioro del vigor de germinación (Bentsink, L., Alonso Blanco, C., Vreugdenhil, D., Tesnier, K., Groot, S. P., y Koornneef, M. Plant Physiol 124, 1595-1604. 2000), lo que pudiera evitarse por ganancia de función con HaHSFA10.

Una estrategia de expresión transgénica similar ha sido utilizada con éxito para conseguir una mayor tolerancia al frío y a la falta de riego en plantas que sobre-expresan el factor DREB1A usando genes quiméricos bajo el control del promotor del gen Atrd29A (activado transcripcionalmente por dicho factor); eliminando así inconvenientes derivados de la sobre-expresión constitutiva de DREB1A con el promotor y enhancer 35S CaMV (ver, Kasuga, M., Liu, Q., Miura, S., Yamaguchi, S. K. & Shinozaki, K. Nat Biotechnol 17, 287-91. 1999). En nuestro caso la construcción del transgen con las secuencias de HaHSFA10 y de Hahsp17.7G4 se ha hecho de la forma siguiente: El fragmento de ADN del cDNA HaHSFA10 con extremos de EcoRV y SacI (de 1300pb) se obtiene a partir de pSKHSFA10-F (plásmido descrito en el ejemplo 2); y se clona en un vector binario derivado de pBI 101.1 que contiene el gen quimérico -1132(\DeltaBglII)::GUS::nos (descrito por Almoguera C, Rojas A, y Jordano, J. Plant Phys 129, 313-341. 2002). Esto se hizo eliminando primero el fragmento de ADN con las secuencias codificantes del gen GUS (mediante doble restricción con SmaI y SacI), y ligando después el fragmento anteriormente indicado (de 1300 pb) con las secuencias de HaHSFA10.

Mediante los genes a2 y a3 intentamos producir efectos fenotípicos por el HaHSFA10 acumulado durante la embriogénesis, sin los inconvenientes de su expresión ectópica continuada en tejidos vegetativos (no probables, pero posibles con el gen a1). Como controles negativos usaremos plantas transgénicas en las que el gen GUS se expresa utilizando los promotores y secuencias reguladoras correspondientes. La expresión de los transgenes puede verificarse y cuantificarse usando determinaciones fluorimétricas (plantas GUS) y anticuerpos específicos disponibles para la inmuno-detección en Westerns de HaHSFA10. Los efectos fenotípicos de la sobre-expresión sobre el crecimiento y la apariencia general de las plantas transgénicas pueden determinarse por procedimientos estándar. La viabilidad de germinación de las semillas se determinaría sometiéndolas a pruebas de envejecimiento y deterioro controlado, mediante tratamientos de humedad (85%) y temperatura (40°C) elevadas; estudiando a continuación la viabilidad de germinación (Bentsink, L., Alonso Blanco, C., Vreugdenhil, D., Tesnier, K., Groot, S. P., y Koornneef, M. Plant Physiol 124, 1595-1604. 2000). La tolerancia a la desecación de las semillas tras la germinación se analizaría mediante otros procedimientos descritos previamente (Sun, W., Bernard, C., van De Cotte, B., Van Montagu, M., y Verbruggen, N. Plant J 27, 407-415, 2001).

Podrían obtenerse de forma análoga otros genes quiméricos que contengan las secuencias del cDNA de HaHSFA10 (o de otro HSF funcionalmente equivalente), y promotores y secuencias reguladoras 5'-flanqueantes o 3'-flanqueantes (terminadores) procedentes de otros genes. Esto no supone complicaciones técnicas adicionales a lo descrito anteriormente, por lo que sería fácilmente realizables por personas con conocimientos suficientes en el sector de la técnica de la invención. Así por ejemplo, serían fácilmente concebibles genes quiméricos con otros promotores constitutivos (de origen viral o diferente) que muestren similar eficiencia y especificidad a las de 35S CaMV en plantas transgénicas (como es el caso de lo descrito por: Daraselia, N. D., Tarchevskaya, S., y Narita, J. O. Plant Physiol 112, 727-733, 1996; Maiti, I. B., Gowda, S., Kiernan, J., Ghosh, S. K., y Shepherd, R. J. Transgenic Res 6, 143-156. 1997; Medberry, S. L., y Olszewski, N. E. Plant J 3, 619-626. 1993; y M Ni, D Cui, J Einstein, S Narasimhulu, CE Vergara, y SB Gelvin. Plant J 7, 661-676. 1995). También dichos genes quiméricos pudieran derivar de otros vectores binarios distintos a pBIN19 (el usado en todos nuestros ejemplos, número de acceso de secuencia U09365). Igualmente, para conferir expresión específica de HaHSFA10 en semillas pudieran utilizarse otros promotores y secuencias reguladoras de genes vegetales que codifican proteínas de reserva, u otros productos expresados exclusivamente en semillas durante diversas etapas del desarrollo (véanse por ejemplo las siguientes referencias bibliográficas y patentes, así como otros documentos citados en ellas: Thomas TL, en Plant Cell, vol 5, pp 1401-1410, 1993; Gatehouse JA, y Shirsat AH, en Control of Plant Gene Expression, pp 357-375, CRC press, 1993; y las patentes USA números: 5530192, 5530194 y 5420034). Adicionalmente, pudieran utilizarse genes quiméricos con distintos promotores y secuencias reguladoras que permitan la expresión inducible de HaHSFA10 en plantas transgénicas, por ejemplo utilizando sistemas inducibles por etanol, receptores de hormonas esteroides, u otros agentes. Incluso dichos sistemas pueden combinarse con procedimientos para la amplificación de los mRNAs inducidos mediante replicasas virales, como por ejemplo los que se detallan en las siguientes referencias: Gatz C, y Lenk I. Trends in Plant Science 3, 352-358. 1998; Martínez, A., Sparks, C., Hart, C. A., Thompson, J., y Jepson, I. Plant J 19, 97-106. 1999; Zuo, J., Niu, Q. W., y Chua, N. H. Plant J 24, 265-273. 2000; Mori, M., Fujihara, N., Mise, K., y Furusawa, I. Plant J 27, 79-86. 2001; y Frey, A. D., Rimann, M., Bailey, J. E., Kallio, P. T., Thompson, C. J., y Fussenegger, M. Biotechnol Bioeng 74, 154-163. 2001.

Otra posible variación evidente de nuestro procedimiento sería la modificación (mutagénesis, deleción o adición de residuos de amino ácidos o de nucleótidos) de las secuencias de HaHSFA10 (según la SEC. ID. N°: 1 y la Figura 1); o el uso análogo de otros HSFs funcionalmente equivalentes a HaHSFA10 (teniendo en cuenta las características de este último factor según los datos en los ejemplos 1-6). Así en otros HSFs la deleción de determinadas secuencias [por ejemplo repeticiones hidrofóbicas carboxilo-terminales (HR_C) también presentes en HaHSFA10: ver la SEC. ID. N°: 1] provoca su trimerización, la unión eficiente al ADN, e incluso su activación transcripcional en ausencia de calor (ver los datos revisados por Morimoto, R. I. Genes Dev 12, 3788-3796. 1998; Schöffl, F., Prändl, R. y Reindl, A. Plant Physiol 117, 1135-1141. 1998), o en ausencia de otros estímulos externos (Zhu, Z., y Mivechi, N. F. J Cell Biochem 73, 56-69. 1999). Es más, la modificación de amino ácidos concretos (incluso de un único residuo) en el DBD puede producir HSFs mutantes que activen mejor la transcripción específicamente y sin cambios en su unión al ADN (ver, Bulman, A. L., Hubl, S. T., y Nelson, H. C. J Biol Chem 276, 40254-40262. 2001). Dichos precedentes hacen concebible que el propio HaHSFA10 pudiera mejorar su capacidad de activación transcripcional específica mediante modificaciones análogas. Incluso otros HSFs distintos pudieran adquirir fácilmente las características útiles de HaHSFA10, mediante pequeños cambios de secuencia (por ejemplo con una, o dos, de las substituciones de amino ácidos extraordinarias presentes en los HSF de tipo A10 y señaladas en la Figura 1); o mediante la combinación, en nuevos HSF quiméricos, de cualquiera de las secuencias y dominios descritos en la SEC. ID. N°: 1, y en la Figura 1, con otros dominios y secuencias procedentes de otros HSFs. Un ejemplo de esta última posibilidad se ha demostrado recientemente con dos HSFs animales: ver Ahn, S. G., Liu, P. C., Klyachko, K., Morimoto, R. I., y Thiele, D. J. Genes Dev 15, 2134-2145. (2001).

Los distintos genes quiméricos podrían ser transformados eficientemente a otras plantas diferentes del tabaco (el sistema modelo usado en el ejemplo 5) y de mayor importancia económica; como por ejemplo el girasol, la soja, la colza, la "canola", el maíz, el trigo, la cebada, el arroz, la "casava", la judía, el cacahuete, etc. La transformación genética de dichas plantas es posible y está documentada suficientemente en la literatura científica: veáse por ejemplo Lindsey K, Ed. (1993). [Plant Tissue Culture Manual. Kluwer Academic Publishers]; y la revisión por Christou [Trends in Plant Science. 1: 423-431, 1996]. Estas y otras posibilidades adicionales también se contemplan y se documentan suficientemente, por ejemplo, en las siguientes patentes relacionadas con nuestra invención: US6248937, US6160202 y WO0183792.

Eb. Genes para potenciar con HaHSFA10 la expresión de otros genes quiméricos en plantas transgénicas (Figura acompañante 7)

Los mismos genes quiméricos (y sus posibles modificaciones) que permiten la sobre-expresión en semillas (y/o ectópica) de HaHSFA10, y que se describen en el ejemplo "Ea" (ver la Figura 7), pueden usarse para incrementar la expresión de cualquier otro gen quimérico "diana" que contenga secuencias HSE activables por HaHSFA10. Estos genes quiméricos "diana" pueden introducirse en la plantas transgénicas que sobre-expresan HaHSFA10 tanto por transformación genética directa como mediante cruzamiento sexual con otras plantas que los contengan. Las secuencias HSE en los genes quiméricos "diana" pueden derivar de Hahsp17.6G1, Hahsp17.7G4 o de cualquier otro gen sHSP (ver las características estructurales apropiadas para la activación por HaHSFA10 determinadas experimentalmente en el ejemplo 5). Los genes quiméricos diana contendrían, además de un promotor activable por HaHSFA10 a través de dichos HSEs, las secuencias que codifiquen un producto (péptido o proteína, natural o sintético/a) con propiedades útiles: como proteínas de reserva, enzimas de la biosíntesis de lípidos, proteínas con actividad farmacológica etc. (ver nuestras Solicitudes de Patentes Españolas 9602746 9701215, y PCT/ES99/00017). En las plantas transgénicas donde se combinara la sobre-expresión de HaHSFA10 con la presencia de dichos genes quiméricos diana se producirían simultáneamente dos efectos beneficiosos: la ganancia de función a consecuencia de la activación de los genes sHSP nativos de la planta (los expresados normalmente en semillas y activados por HSFs semejantes a HsHSFA10); y una mayor producción de la proteína útil con la potenciación de su efecto sobre la composición proteica o lipídica de la semilla (consecuencia de la activación del gen quimérico diana).

Los usos de HaHSFA10 contemplados en el ejemplo "Eb" admitirían todas las variaciones descritas en una patente previa (WO0183792). Dicha patente difiere de nuestra solicitud únicamente en el uso de distintos FTs, y por tanto de diferentes secuencias reguladoras (que en nuestro caso son HSEs peculiares) incluidas en los genes quiméricos activados por dichos factores. Para otros detalles técnicos de conocimiento general aplicables a este uso de HaHSFA10 puede consultarse WO0183792 y un artículo reciente relacionado con dicha patente (Yang, D., Wu, L., Hwang, Y. S., Chen, L., y Huang, N. Proc Natl Acad Sci USA 98, 11438-11443, 2001).

<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas

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<120> Nuevos factores transcripciones HSF y su utilización en plantas transgénicas

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<130> Factores transcripcionales HSF

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<140> PCT/ES03 / 00348

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<141> 2003-07-10

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<160> 7

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 1434

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<212> DNA

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<213> Helianthus annuus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (61)..(1173)

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<400> 1

99

910

911

912

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<210> 2

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<211> 371

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<212> PRT

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<213> Helianthus annuus

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<400> 2

913

914

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<210> 3

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligo TOPO-1

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<400> 3

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atcatattct ccttcaaaaa

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20

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<210> 4

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<211> 23

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligo HSE G1a

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<400> 4

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taataatccg tcgacaaaaa agc

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23

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<210> 5

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligo HSE G1b

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<400> 5

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ggatattgtc gacgtagtag

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20

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<210> 6

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligo HSE G4a

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<400> 6

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ccacctcagt cgacctcttt t

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<210> 7

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<223> Oligo HSE G4b

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<400> 7

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aagaagggtc gactgagtaa t

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21

Claims (10)

1. El factor transcripcional activador, de tipo Heat Shock Factor (HSF), denominado HaHSFA10 en girasol, caracterizado porque está codificado por la traducción de la secuencia de nucleótidos SEC. ID. N°: 1 depositada en la base de datos GenBank con el número de acceso AY099451.

2. Factores transcripcionales activadores, de tipo Heat Shock Factor (HSF), de girasol o de cualquier otra planta, y particularmente HaHSFA10, caracterizado(s) porque se expresa(n) específicamente o restringen su capacidad de activación transcripcional en embriones de semillas en desarrollo.

3. Factor transcripcional activador según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por su preferente capacidad de activación transcripcional a través de elementos en cis de choque térmico (HSE) "imperfectos", es decir con una estructura semejante a los HSEs de los genes sHSP de girasol Hahsp17.6G1 y Hahsp17.7G4.

4. Factor transcripcional activador según la reivindicación 1 caracterizado adicionalmente por modificaciones (deleciones o substituciones de aminoácidos, particularmente las substituciones por los residuos excepcionales indicados en la Figura 1); o factores derivados de las modificaciones de estos HSFs, y particularmente de HaHSFA10, que mantengan su funcionalidad en cuanto a capacidad de activación transcripcional según las reivindicaciones 2 y 3.

5. Utilización de un factor transcripcional activador según las reivindicaciones 1-4, para ganancia de función en plantas transgénicas mediante su sobre-expresión con un gen quimérico, en semillas y/o ectópica, constitutiva y/o inducible. Dicha utilización comprende los siguientes pasos:

d)

Construcción de un gen quimérico fusionando las secuencias HSF, especialmente HaHSFA10, a un promotor y a otras secuencias reguladoras apropiadas, según el tipo de sobre-expresión deseada.

e)

Introducción en la planta del gen quimérico (mediante transformación con Agrobacterium, biolística o electroporación)

f)

Evaluación de la expresión en las plantas transgénicas del HSF, y de la de los genes regulados por dicho HSF (especialmente las sHSP expresadas normalmente en las semillas).

6. Utilización de un factor transcripcional (HSF) según la reivindicación 5, caracterizada porque la ganancia de función conlleva efecto(s) sobre la conservación de las semillas, su capacidad de germinación, y/o de su tolerancia al estrés como consecuencia de la sobre-expresión de los genes activados transcripcionalmente por dicho HSF.

7. Utilización de un factor transcripcional activador según las reivindicaciones 1-4, para potenciar la expresión en plantas transgénicas de otros genes quiméricos que contengan elementos en cis HSE de genes activados transcripcionalmente de forma natural por dicho factor, u otros HSEs imperfectos (naturales o sintéticos) según se define en la reivindicación
3.

8. Utilización de un factor transcripcional activador según la reivindicación 7 caracterizada porque los genes quiméricos están fusionados a promotores que dirijan la expresión de secuencias codificantes correspondientes a proteínas o péptidos con utilidad (y de cualquier origen, biológico: vegetal, animal, etc.; o sintético).

9. Utilización de un factor transcripcional activador según las reivindicaciones 5-8, caracterizados porque dichos factores son HSFs quiméricos que incorporan parcialmente secuencias y características de HaHSFA10 (normales o mejoradas según la reivindicación 4).

10. Las plantas transgénicas (monocotiledóneas o dicotiledóneas) de cualquier cosecha que incorporen los genes quiméricos construidos según las reivindicaciones 5-9.