BRPI0116305B1 - moléculas de dna associadas com proliferação e desenvolvimento de células de plantas e métodos de produzir plantas com tamanho de órgão aumentado. - Google Patents

Abstract

"moléculas de ácido nucléico associadas com proliferação e desenvolvimento de células vegetais e seus usos". a presente invenção fornece um polipeptídeo semelhante a ant que compreende na direção do término n para o término c dois domínios de ligação de dna de ap2 seguidos no término c por uma subseqüência de aminoácidos do grupo que consiste de xaa-ser-ser-ser-arg-glu, aaa-ser-asn-ser-arg-glu e asn-ser-ser-ser-arg-asn, em que xaa é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de gly, ala, val, leu e lle. tal gene que codifica o polipeptídeo semelhante a ant pode ser sobre expresso em uma planta transgênica para fornecer traços agronomicamente desejados com base no tamanho aumentado dos órgãos da planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS

DE DNA ASSOCIADAS COM PROLIFERAÇÃO E DESENVOLVIMENTO

DE CÉLULAS DE PLANTAS E MÉTODOS DE PRODUZIR PLANTAS COM TAMANHO DE ÓRGÃO AUMENTADO".

CAMPO DA INVENÇÃO

Descrito aqui são invenções no campo da biologia molecular vege- tal e engenharia genética vegetal, incluindo moléculas de ácido nucléico isola- das codificando polipeptídeos semelhantes a AINTEGUMENTA (semelhantes a ANT) que são úteis no fornecimento de traços agronômicos, horticulturaís e qualificativos das plantas. Além disso, os polipeptídeos assim codificados e an- ticorpos capazes de ligar os polipeptídeos são abrangidos pela presente inven- ção, A presente invenção também diz respeito aos métodos de identificar e iso- lar moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos semelhantes a ANT. Também divulgado são polipeptídeos, anticorpos, construções de DNA recombinante, plantas transgênicas caracterizadas pelo tamanho aumentado dos órgãos da planta, métodos para produzir e usar as moléculas de ácido nu- cléico, polipeptídeos, anticorpos e construções de DNA recombinante, FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Um dos objetivos da engenharia genética vegetal é produzir plantas com características e traços agronômica, horticultura ou economi- camente importantes. Os traços de interesse particular incluem rendimento alto, qualidade melhorada e estabilidade alta. Embora o rendimento de uma planta seja grandemente influenciado por fatores ambientais externos, pare- ce que o rendimento da planta é determinado, em parte, pelo tamanho in- trínseco de vários órgãos/tecidos (como sementes, frutos, raízes, folhas, tu- bérculos, caules e bulbos) que são por sua vez determinados por fatores desenvolventes internos, A intensificação do rendimento de uma planta pode ser alcançada geneticamente modificando a planta de modo que o tamanho intrínseco dos órgãos da planta seja aumentado.

As plantas têm características de desenvolvimento únicas que as distinguem de outros eucariontes. As células vegetais não sofrem migra- ção. Assim, acredita-se que a divisão celular e expansão das células sejam os mecanismos predominantes pelos quais o número e posição dos órgãos primordiais são determinados e também pelos quais o tamanho intrínseco e forma de cada um dos órgãos da planta são controlados. Acredita-se que existam reguladores de desenvolvimento que controlam proliferação celular e desenvolvimento e tamanho intrínseco dos órgãos da planta. Quando in- teragir com os fatores ambientais externos, os reguladores de desenvolvi- mento determinam o tamanho eventual dos órgãos da planta. Portanto, a identificação/isolamento dos reguladores de desenvolvimento que controlam proliferação celular e desenvolvimento e tamanho intrínseco dos órgãos pode ser desejável. Tais reguladores de desenvolvimento podem ser usados na engenharia genética para produzir plantas transgênicas tendo tamanho intrínseco aumentado dos órgãos de interesse e subseqüentemente maior rendimento.

Gu et al. (Development 125:1509-1517 (1998)) recentemente reportaram que o gene de AGL8 de Arabidopsis, um gene de caixa de MADS, deve estar envolvido na mediação de diferenciação das células em plantas de Arabidopsis durante o desenvolvimento do fruto e da folha. Como AGAMOUS e outros genes de caixa de MADS de planta, AGL8 codifica um polipeptídeo de cerca de 260 aminoácidos incluindo um domínio de MADS de ligação de DNA altamente conservado de cerca de 56 aminoácidos (Rie- chamnn e Meyerowitz, Biol. Chem, 378:1079-1101 (1997)). Eles também reportaram que a expressão ectópica do gene de AGL8 sob controle de um promotor constitutivo em plantas de Arabidopsis poderia aumentar o tama- nho das sementes e dos frutos e retardar a senescência em plantas de Ara- bidopsis transgênicas (WO 99/00503). O gene de APETALA2 (AP2) de Arabidopsis foi recentemente mostrado ser capaz de controlar a massa de sementes em plantas de Arabi- dopsis e tabaco transgênicas (WO 97/14659). O polipeptídeo de AP2 contém dois motivos de 68 aminoácidos de forma tandém repetidos designados como domínio de ligação de DNA de AP2 (Jofuku, et al., Plant Cell 6:1211- 1225 (1994)), que são homólogos ao domínio de ligação de DNA dos poli- peptídeos de ligação do elemento resposta de etileno. Vários estudos sugeri- ram que o gene de AP2 é um gene homeótico que controla três processos durante o desenvolvimento da flor em plantas de Arabidopsis: (1) o estabe- lecimento da identidade do meristema da flor (Irish e Sussex, Plant Cell 2:741-753 (1990); Bowman et al., Development 119:721-743 (1993)); (2) a especificação da identidade do órgão da flor e regulação da organogênese foral (Komaki et al., Development 104:195-203 (1988); Bowman et al., Plant Cell 1:37-42 (1989); Bowman et al., Development 112:1-20 (1991); Kunst et al., Plant Cell 1:1195-1208 (1989); Jofuku et al., Plant Cell 6:1211-1225 (1994)); e (3) a regulação temporal e espacial da atividade do gene homeóti- co da flor (Drews et al., Cell 65:991-1002 (1991)). Estudos genéticos mostra- ram que o gene AP2 é também requerido para desenvolvimento de óvulo e semente normal (Jofuku et al., Plant Cell 6:1211-1225 (1994); Leon- Kloosterziel et al., Plant Cell 6:385-392 (1994); e Modrusan et al., Plant Cell 6:339-349 (1994)). Plantas de Arabidopsis transgênicas, onde o gene de AP2 foi expresso na orientação anti-sentido sob o controle do promotor constitutivo do vírus 35S de mosaico de couve-flor, produziu semente com massa e teores de proteína total e ácido graxo aumentados (WO 97/14659).

Plantas transgênicas de Arabidopsis e tabaco, onde o gene de AP2 foi sobre expresso na orientação sentido sob controle do promotor constitutivo de ví- rus 35S de mosaico de couve-flor, produziu semente com massa diminuída e teor de proteína total diminuído (WO 97/14659).

Foi mostrado por dois estudos recentes que o gene de AINTE- GUMENTA (ANT) de Arabidopsis deve executar um papel na regulação do desenvolvimento celular e números de células durante a organogênese (Mi- zukami e Fisher, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 97:942-947 (2000); Krizek, De- velop. Genet. 25:224-236 (1999)). O gene de ANT pertence à grande família do gene de AP2 e codifica um fator de transcrição que pode executar um papel crítico na regulação do desenvolvimento do óvulo e do gametófito fe- minino (Klucher et al., Plant Cell 8:137-153 (1996); Elliot et al., Plant Cell 8:155-168 (1996)). Em um estudo (Mizukami e Fisher, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:942-947 (2000)), foi informado que quando o gene de ANT fosse ecotopicamente expresso em plantas de Arabidopsis sob o controle de um promotor constitutivo do vírus 35S de mosaico de couve-flor, as folhas, cau- les, pedicelos, sépalas, pétalas, estames, gineceus, óvulos e frutos das plantas transgênicas foram dramaticamente aumentados sem alterar sua morfologia superficial. A massa das folhas e flores foi aumentada tanto quanto três vezes acima daquela nas plantas de controle, devido à expres- são ectópica do gene de ANT. A expressão ectópica do gene de ANT na planta de tabaco também resultou em órgãos de tamanho aumentado com- parando ao tipo selvagem. Porém, as plantas transgênicas contendo uma constructo de expressão de 35S/ANT eram machos estéreis e as plantas mais transgênicas contendo um constructo de expressão de 35S/ANT tam- bém eram fêmeas estéreis. Apenas plantas de T1 expressando relativa- mente baixos níveis do gene de ANT puderam gerar sementes quando sub- metidas à polinização a mão com pólen do tipo selvagem. Em outro estudo, Kriszek (Krizek, Develop. Genet. 25:224-236 (1999)) reportou que a expres- são ectópica do gene de ANT sob o controle de um promotor constitutivo de vírus 35S de mosaico de couve-flor produziu grandes órgãos florais sem al- terar o número e forma destes órgãos. As plantas transgênicas contendo um constructo de expressão de 35S/ANT eram machos estéreis e mostraram redução severa na fertilidade feminina. Krizek não observou o tamanho au- mentado dos órgãos vegetativos.

Nenhum DNA que codifica polipeptídeos semelhantes a ANT em outras plantas, especialmente milho, soja, arroz e algodão, foi isolado, se- qüenciado ou funcionalmente caracterizado. Considerando que a natureza complexa de controle de tamanho de órgãos em plantas e que a base gené- tica para a diversidade de interespécies de plantas do fenótipo deve ser de alterações menores na estrutura ou expressão de genes reguladores ortólo- gos (Doebley e Lukens, Plant Cell 10:1075-1082 (1998); Somerville e So- merville, Science 285:380-383 (1999)), há muito interesse em identificar nas plantas os genes que, como o gene de ANT, podem ser usados para con- trolar o tamanho de órgão intrínseco das plantas quando ecotopicamente expressos nas células das plantas e subseqüentemente intensificam o ren- dimento econômico das plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção, em um aspecto, fornece uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ou complemento desta, em que a seqüência de nucleotídeos codifica um poli- peptídeo semelhante a ANT tendo na direção do término N para o término C dois domínios de ligação de DNA de AP2 seguidos no término C por uma subseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Xaa- Ser-Ser-Ser-Arg-Glu, Xaa-Ser-Asn-Ser-Arg-Glu e Asn-Ser-Ser-Ser-Arg-Asn, em que Xaa é um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral alifática e selecionado do grupo que consiste em Gly, Ala, Vai, Leu e lie. A presente invenção, em outro aspecto, fornece uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo: (1) uma seqüência de ácido nu- cléico que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 60% de identidade de seqüência a uma seqüência se- lecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 9, 11 e 13; (2) uma seqüência de nucleotídeos que hibrida sob condições rigorosas com o complemento de uma segunda seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 9, 11 e 13; (3) uma seqüência de nu- cleotídeos que tem pelo menos 60% de identidade de seqüência a um mem- bro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 8, 10 e 12; ou (4) uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a (1), (2) ou (3).

As moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção podem também compreender um promotor operavelmente ligado ou região de promotor parcial. O promotor pode ser um promotor constitutivo, um pro- motor induzível ou um promotor tecido-específico. O promotor constitutivo pode ser, por exemplo, um promotor de vírus 35S de mosaico de couve-flor (CaMV) (patentes US 5.858.742 e 5.352.605) ou o promotor de actina de arroz (RACT1) (patente US 5.641.876). O promotor tecido-específico pode ser ativo em tecido vegetativo ou tecido reprodutivo. O promotor de tecido- específico ativo em tecido reprodutivo pode ser um promotor semente- específico. O promotor de tecido-específico ativo em tecido vegetativo pode ser um promotor raiz-específico, broto-específico, meristema-específico ou folha-específico. A molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção pode ainda também compreender uma seqüência não transferida de 5', se- qüência não transferida de 3', íntrons ou suas combinações. A presente invenção também fornece um método para obter uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica toda ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo semelhante a ANT, o método compreendendo as etapas de: (a) sondar um cDNA ou bibli- oteca genômica com uma sonda de hibridização compreendendo uma se- qüência de nucleotídeos codificando toda ou uma parte da seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo, em que a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 9, 11 e 13; (b) identificar um clone de DNA que hibrida sob condições rigoro- sas com a sonda de hibridização; (c) isolar o clone de DNA identificado na etapa (b); e (d) seqüenciar a inserção de cDNA ou fragmento genômico con- tido no clone de DNA isolado na etapa (c) em que a molécula de ácido nu- cléico seqüenciada codifica toda ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo semelhante a ANT. A presente invenção também ainda fornece um método para obter uma molécula de ácido nucléico que codifica toda ou uma parte subs- tancial da seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo semelhante a ANT compreendendo: (a) sintetizar um primeiro e segundo iniciadores de oligonu- cleotídeo, em que as seqüências dos primeiro e segundo iniciadores de oli- gonucleotídeo codifica duas partes diferentes de um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 9, 11 e 13; e (b) amplificar e obter a molécula de ácido nucléi- co diretamente das amostras de mRNA, das bibliotecas genômicas ou das bibliotecas de cDNA usando os primeiro e segundo iniciadores de oligonu- cleotídeo da etapa (a) em que a molécula de ácido nucléico codifica toda ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo seme- lhante a ANT. A presente invenção, em outro aspecto, fornece um polipeptídeo substancialmente purificado, a seqüência de aminoácidos deste: (1) com- preende na direção do término N para o término C dois domínios de ligação de DNA de AP2 seguidos no término C por uma subseqüência de aminoáci- dos selecionada do grupo que consiste em Xaa-Ser-Ser-Ser-Arg-Glu, Xaa- Ser-Asn-Ser-Arg-Glu e Asn-Ser-Ser-Ser-Arg-Asn, em que Xaa é um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral alifática e selecionado do grupo que consiste em Gly, Ala, Vai, Leu, e lie; (2) é codificada por uma primeira se- qüência de nucleotídeos que especificamente hibrida sob condições rigoro- sas com o complemento de uma segunda seqüência de nucleotídeos seleci- onada dos grupos que consiste em SEQ ID NOs.: 1,3, 5, 7, 8, 10 e 12; (3) é codificada por uma terceira seqüência de nucleotídeos que tem pelo menos 60% de identidade de seqüência a um membro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 8, 10 e 12; ou (4) tem pelo menos 60% de identidade de seqüência a um membro selecionado do grupo que con- siste em SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 9, 11 e 13. A presente invenção, e outro aspecto, fornece anticorpos que especificamente liga aos polipeptídeos semelhantes a ANT da presente in- venção e constructos de DNA recombinante que compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam os polipeptídeos semelhantes a ANT da presente invenção. A presente invenção também fornece uma planta transformada compreendendo no seu genoma uma molécula de ácido nucléico isolada que compreende: (A) uma seqüência de não codificação de 5' que funciona na célula para causar a produção de uma molécula de mRNA; que está ope- ravelmente ligada a (B) uma seqüência de nucleotídeos estrutural, em que a seqüência de nucleotídeos estrutural codifica um polipeptídeo a seqüência de aminoácidos deste tem pelo menos 60% de identidade de seqüência a um membro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 9, 11 e 13; que está operavelmente ligada a uma seqüência não transferida de 3' que funciona na dita célula para causar terminação de transcrição. A presente invenção também fornece um método para aumentar o tamanho de um ou mais órgãos da planta de uma planta expressando ecotopicamente uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptí- deo a seqüência de aminoácidos deste tem pelo menos 60% de identidade de seqüência a um membro do grupo que consiste em SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 9, 11 e 13 ou compreende na direção do término N para o término C dois domínios de ligação de DNA de AP2 seguido no término C por uma subse- qüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Xaa-Ser- Ser-Ser-Arg-Glu, Xaa-Ser-Asn-Ser-Arg-Glu e Asn-Ser-Ser-Ser-Arg-Asn, em que Xaa é um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral alifática e selecionado do grupo que consiste em Gly, Ala, Vai, Leu e lie. O método da presente invenção para aumentar o tamanho de um ou mais órgãos da planta de uma planta compreende as etapas de: (a) inserir dentro do geno- ma de uma planta uma molécula de ácido nucléico exógena compreendendo na direção 5’ para 3' e operavelmente ligada, (i) um promotor que funciona nas células de um tecido vegetal selecionado, (ii) uma seqüência de nucleo- tídeos estrutural que causa a produção de um polipeptídeo semelhante a ANT a seqüência de aminoácidos deste tem pelo menos 60% de identidade de seqüência a um membro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 9, 11 e 13 ou compreende na direção do término N para térmi- no C dois domínios de ligação de DNA de AP2 seguidos no término C por uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Xaa- Ser-Ser-Ser-Arg-Glu, Xaa-Ser-Asn-Ser-Arg-Glu e Asn-Ser-Ser-Ser-Asn, em que Xaa é um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral alifática e selecionado do grupo que consiste em Gly, Ala, Vai, Leu e lie, e (iii) uma seqüência de nucleotídeos não transferida de 3' que funciona nas células da planta para causar terminação de transcrição e a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' de uma seqüência de RNA; (b) obter células vegetais transformadas contendo a molécula de ácido nucléico exógena da etapa (a); e (c) regenerar das células vegetais transformadas uma planta transformada que ecotopicamente expressa o polipeptídeo semelhante a ANT nas células da planta. A molécula de ácido nucléico exógena pode op- cionalmente incluir íntrons, seqüências líderes não transferidas de 5' ou ou- tras seqüências de nucleotídeos designadas para intensificar a transcrição e/ou transferência. A presente invenção também fornece um tecido vegetal, como semente, que é derivado de uma planta transformada da presente invenção. A presente invenção ainda também fornece um método para selecionar uma planta tendo tamanho aumentado de órgãos da planta, o dito método compreendendo as etapas de: (A) obter DNA genômico de uma plu- ralidade de plantas; (B) analisar o DNA genômico de cada uma da pluralida- de de plantas para determinar a presença ou ausência de um marcador de DNA que está geneticamente ligado a uma seqüência de nucleotídeos com- plementar a uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 10 e 12 ou complementos destas; e (C) selecionar a dita planta contendo o dito marcador de DNA. A presente invenção também fornece a expressão de moléculas de ANT em plantas de milho. Especificamente, ela fornece a expressão de moléculas de ANT de Arabidopsis em plantas de milho sob o promotor de SSU1A e o promotor de pox1.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E LISTAGENS DE SEQÜÊNCIA A Figura 1 mostra uma comparação das seqüências de aminoá- cidos do ANT de Arabidopsis e dois polipeptídeos semelhantes a ANT de soja. As seqüências de aminoácidos foram alinhadas usando software de especialidade em análise de seqüências Window32 MegAlign® 4.00 de DNASTAR, Inc. (Madison, Wl) usando o princípio de parâmetros predefini- dos (Gap Penalty: 11; Gap Length Penalty: 3; Ktuple: 2), com base no méto- do de Hein (Hein, Methods Mol. Biol. 25:349-364 (1994)). A Figura 2 mostra uma comparação das seqüências de aminoá- cidos do ANT de Arabidopsis e polipeptídeos semelhantes a ANT de soja, arroz, algodão e de milho. A Figura 3 mostra uma árvore filogênica de GhANTI, ANT, GmANTI, GmANT2, OsANTI, OsANT2 e ZmANTI. A Figura 4 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57913. A Figura 5 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57914. A Figura 6 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57955. A Figura 7 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57925. A Figura 8 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57926. A Figura 9 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57927. A Figura 10 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57928. A Figura 11 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57929. A Figura 12 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57930. A Figura 13 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57931. A Figura 14 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57932. A Figura 15 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57933. A Figura 16 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57934. A Figura 17 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57988. A Figura 18 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON57991. A Figura 19 mostra um mapa de plasmídeo para o vetor de transformação da planta pMON71250. A invenção pode ser mais completamente entendida a partir da descrição detalhada a seguir e da Listagem de Seqüência em anexo que formam parte deste pedido de patente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é com base, em parte, no isolamento e ca- racterização de moléculas de ácido nucléico que codificam os polipeptídeos semelhantes a ANT de plantas incluindo soja, milho, arroz e algodão. Os polipeptídeos semelhantes a ANT da presente invenção, como polipeptídeo de ANT de Arabidopsis, contém dois domínios de ligação de DNA de AP2 altamente conservados. Foi também descoberto que os polipeptídeos se- melhantes a ANT da presente invenção e o polipeptídeo de ANT de Arabi- dopsis compreendem três regiões altamente conservados no término N an- tes dos domínios de ligação de DNA de AP2, e uma região conservada na extremidade do término C. Porém, os polipeptídeos codificados pelas molé- culas de ácido nucléico aqui descritas compartilham menos que 60% de identidade de seqüência de aminoácidos com o polipeptídeo de ANT de Arabidopsis ou menos que 60% de identidade de seqüência de nucleotídeos com a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de ANT de Arabidopsis, conforme mostrado nas Tabelas 1 e 2. Além disso, o término C de cada um dos polipeptídeos semelhantes a ANT aqui descritas é não mais que aqueles do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis após os domínios de ligação de DNA de AP2. Por fim, duas regiões conservadas adicionais (som- breadas) no término C estão apenas presentes nos polipeptídeos seme- lhantes a ANT da presente invenção, mas ausentes no polipeptídeo de ANT de Arabidopsis. Uma "proteína de ANT de colheita" conforme aqui usado é uma proteína com identidade substancial à SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 9, 11 e 13 ou que compreende um polipeptídeo tendo na direção do término N para o término C dois domínios de ligação de DNA de AP2 seguidos no término C por uma subseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Xaa-Ser-Ser-Ser-Arg-Glu (SEQ ID NO.: 25), Xaa-Ser-Asn-Ser-Arg-Glu (SEQ ID NO.: 26) e Asn-Ser-Ser-Ser-Arg-Asn (SEQ ID NO.: 27), em que Xaa é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em Gly, Ala, Vai, Leu e lie.

As designações dos resíduos de aminoácidos aqui referidas, conforme recomendado pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC- IUB, estão listadas na Tabela 3. MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADAS DA PRESENTE INVEN- ÇÃO

Um aspecto da presente invenção relaciona-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ou complemento desta, em que a seqüência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo tendo na direção do término N para o término C dois domínios de ligação de DNA de AP2 seguidos no término C por uma subseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Xaa-Ser-Ser-Ser-Arg- Glu, Xaa-Ser-Asn-Ser-Arg-Glu e Asn-Ser-Ser-Ser-Arg-Asn, em que Xaa é um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral alifática e selecionado do grupo que consiste em Gly, Ala, Vai, Leu, e lie. Em uma modalidade pre- ferida, a subseqüência de aminoácidos é selecionada do grupo que consiste em Ser-Ser-Leu-Xaa-Thr-Ser-Xaa-Ser-Ser-Ser-Arg-Glu, Ser-Ser-Leu-Xaa- Pro-Ser-Xaa-Ser-Asn-Ser-Arg-Glu, Ser-Ser-Leu-Xaa-Thr-Ser-Xaa-Ser-Asn- Ser-Arg-Glu e Ser-Leu-Xaa-Asn-Ser-Ser-Ser-Arg-Asn. Em uma modalidade particular preferida, o polipeptídeo da presente invenção também compreen- de uma segunda subseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Leu-Gly-Phe-Ser-Leu-Ser, Leu-Gly-Phe-Ser-Leu-Thr, Met-Pro- Leu-Lys-Ser-Asp-Gly-Ser, Met-Pro-Leu-Arg-Ser-Asp-Gly-Ser, Met-Pro-lle- Lys-Ser-Asp-Gly-Ser, Pro-Lys-Leu-Glu-Asp-Phe e Pro-Lys-Val-Glu-Asp-Phe. O termo "molécula de ácido nucléico" como aqui usado significa uma molécula de ácido desoxirribonucléico (DNA) ou molécula de ácido ri- bonucléico (RNA). As moléculas de DNA e RNA são construídas de nucleo- tídeos ligados de extremidade a extremidade, em que cada um dos nucleotí- deos contém um grupo fosfato, uma metade de açúcar e ou uma base de purina ou de pirimidina. As moléculas de ácido nucléico podem ser um polí- mero simples ou de filamento duplo de nucleotídeos lido da extremidade 5' para a 3’. As moléculas de ácido nucléico podem também opcionalmente conter bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas que per- mitem leitura correta através de uma polimerase e não alteram a expressão de um polinucleotídeo codificado por aquela molécula de ácido nucléico. O termo "uma molécula de ácido nucléico isolada" como aqui usado significa uma molécula de ácido nucléico que não está mais acompa- nhada por alguns dos materiais com os quais ela está associada no seu es- tado natural ou a uma molécula de ácido nucléico a estrutura desta não é idêntica àquela de nenhuma molécula de ácido nucléico de ocorrência natu- ral. Exemplos de uma molécula de ácido nucléico isolada incluem: (1) DNAs que têm a seqüência de parte de uma molécula de DNA genômica de ocor- rência natural mas não são flanqueadas por duas seqüências de codificação que flanqueiam aquela parte da molécula no genoma do organismo em que é de ocorrência natural; (2) uma molécula de ácido nucléico incorporada em um vetor ou DNA genômico de um procariota ou eucariota de uma forma que a molécula resultante não seja idêntica a qualquer vetor ou DNA genômico de ocorrência natural; (3) uma molécula separada como um cDNA, um frag- mento genômico, um fragmento produzido pela reação de cadeia de polime- rase (PCR), ou um fragmento de restrição; (4) DNAs recombinantes; e (5) DNAs sintéticos. Uma molécula de ácido nucléico isolada também pode ser compreendida de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

Também é contemplado pelos inventores que as moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção também incluem tipos conhe- cidos de modificações, por exemplo, marcações que são conhecidas na téc- nica, metilação, "gorros", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo. Outras modificações conhecidas incluem modificações de internucleotídeo, por exemplo, aquelas com acoplamentos não carregados (fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, car- bamatos, etc.) e com acoplamentos carregados (fosforotioatos, fosforoditio- atos, etc.), aquelas contendo metades pendentes, como, proteínas (incluindo nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos notáveis, poli-L-lisina, etc.), aque- las com intercaladores (acridina, psoralen, etc.), aquelas contendo quelantes (metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquiladores e aquelas com ligações modificadas. O termo "seqüência de nucleotídeos" como aqui usado significa padrões tanto sentido quanto anti-sentido de uma molécula de ácido nucléi- co ou de filamentos único individuais ou duplos. Ele inclui, mas não é limita- do a, plasmídeos de replicação própria, seqüências cromossômicas e polí- meros infecciosos de DNA ou RNA.

Uma seqüência de nucleotídeos é dita ser "complemento" de outra seqüência de nucleotídeos se elas apresentarem complementaridade completa. Como aqui usado, as moléculas são ditas apresentar "comple- mentaridade completa" quando todo nucleotídeo de um das seqüências é complementar a um nucleotídeo da outra.

Como aqui usado ambos os termos "uma seqüência de codifica- ção" e "uma seqüência de nucleotídeos estrutural" significam uma seqüência de nucleotídeos que é traduzida em um polipeptídeo, usualmente por mRNA, quando colocado sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. Os limites da seqüência de codificação são determinados por um códon de iní- cio de transferência no término 5’ e um códon de parada de transferência no término 3’. Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não é limitado a, DNA genômico, cDNA, e seqüências de nucleotídeos recombinantes.

Os polipeptídeos semelhantes a ANT da invenção, como outros polipeptídeos, têm diferentes domínios que executam diferentes funções.

Assim, as seqüências de codificação não precisam ser de comprimento total, desde que o domínio funcional desejado do polipeptídeo seja expresso. As características distintivas dos polipeptídeos semelhantes a ANT são debati- das em detalhes nos Exemplos. O termo "DNAs recombinantes" ou "moléculas de DNA recombi- nante" como aqui usado significa DNAs que contêm uma modificação gene- ticamente criada através de manipulação por meio de metagênese, enzimas de restrição e similares. O próprio ácido nucléico pode vir ou de fontes de ocorrência natural ou pode ser criado no laboratório. Também pode incluir todos os vetores criados por engenharia de DNA, por exemplo, todas as moléculas de DNA incluídas aqui designadas por pMON. Por exemplo, pode incluir moléculas contendo DNA ou cDNA de ocorrência natural, ou molécu- las de DNA de origem sintética em um plasmídeo, ou isolado. O termo "DNAs sintéticos" como aqui usado significa os DNAs montados de blocos de construção de oligonucleotídeo que são sintetizados usando procedimentos quimicamente conhecidos àqueles versados na téc- nica. Estes blocos de construção são ligados e tratados por calor para for- mar segmentos de DNA que são depois enzimaticamente montados para construir o DNA completo. "Quimicamente sintetizado", como relacionado a uma seqüência de DNA, significa que os nucleotídeos de componente foram montados in vitro. A síntese química manual de DNA pode ser acompanhada usando procedimentos bem estabelecidos, ou síntese química automatizada pode ser realizada usando uma de várias máquinas comercialmente dispo- níveis.

Ambos termos "polipeptídeo" e "proteína", como aqui usados, significam um polímero composto de aminoácidos conectado por ligações de peptídeo. Uma unidade de aminoácido em um polipeptídeo (ou proteína) é chamada um resíduo. Os termos "polipeptídeo" e "proteína" também se apli- cam a qualquer polímero de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrên- cia natural correspondente, como também para quaisquer polímeros de ami- noácido de ocorrência natural. A natureza essencial de tais análogos de aminoácidos de ocorrência natural é que, quando incorporados em um poli- peptídeo, esse polipeptídeo especificamente é reativo a anticorpos eliciados do mesmo polipeptídeo, mas, consistindo inteiramente de aminoácidos de ocorrência natural. É bem conhecido na técnica que proteínas ou polipeptí- deos podem sofrer modificação, incluindo mas não limitado à, formação de ligação de dissulfeto, gama-carboxilação de resíduos de ácidos glutâmico, glicosilação, ligação de lipídio, fosforilação, oligomerização, hidroxilação e ADP-ribosilação. Modificações exemplares estão descritas na maioria dos textos básicos, como, por exemplo, Proteins - Structure and Molecular Pro- perties, 2a ed., T. E. Creighton, W., H. Freeman and Company, Nova Iorque (1993), aqui incorporado por referência na íntegra. Muitas revisões detalha- das estão disponíveis sobre este assunto, como, por exemplo, aquelas for- necidas por Wold, F., Post-translational Protein Modifications. Perspectives and Prospects, pp. 1-12 em Post-translational Covalent Modification of Pro- teins, B. C. Johnson, Ed. Academic Press, Nova Iorque (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-M (1990) e Rattan et al., Protein Synthesis: Post- translational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sei. 663:48-62 (1992), aqui incorporados por referência na sua íntegra. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar em um polipeptídeo, incluindo a cadeia principal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácidos e as terminações amino ou carboxila. Na realidade, o bloqueio do grupo amino ou carboxila em um poli- peptídeo, ou ambos, por uma modificação covalente, é comum em polipeptí- deos sintéticos e de ocorrência natural e tais modificações podem estar pre- sentes em polipeptídeos da presente invenção, também. Por exemplo, o re- síduo do término amino de polipeptídeos feito em E. Coli ou outras células, antes do processamento proteolítico, quase invariavelmente será N- formilmetionina. Durante a modificação pós-translacional do polipeptídeo, um resíduo de metionina no término de NH2 pode ser excluído. Adequadamente, esta invenção contempla o uso de ambas variantes de término amino con- tendo metionina e sem metionina do polipeptídeo da invenção. Assim, como aqui usado, os termos "proteína" e "polipeptídeo" incluem qualquer proteína ou polipeptídeo que é modificado por qualquer processo biológico ou não biológico. Os termos "aminoácido" e "aminoácidos" referem-se a todos ami- noácidos de ocorrência natural e, a menos que do contrário limitado, análo- gos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de uma ma- neira semelhante como aminoácidos de ocorrência natural. Esta definição é significada incluir norleucina, ornitina, homocisteína e homosserina. O termo "seqüência de aminoácidos" significa a seqüência de aminoácidos em um polipeptídeo (ou proteína) que é escrito começando com o resíduo de término amino (término N) e finalizando com o resíduo de término carboxila (término C). O termo "uma subseqüência de aminoácidos" significa uma parte da seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo. Uma subseqüência de aminoácidos geralmente tem um comprimento de 3 a 50 resíduos de aminoácido.

Ambos os termos "polipeptídeo substancialmente purificado" e "proteína substancialmente purificada", como aqui usados, significa um poli- peptídeo ou proteína que é separada substancialmente de todas as outras moléculas normalmente a ela associadas no seu estado nativo e é a espécie predominante presente em uma preparação. Uma molécula substancial- mente purificada pode ser mais que 60% livre, preferivelmente 75% livre, mais preferivelmente 90% livre e mais preferivelmente 95% livre das outras moléculas (exclusivo solvente) presentes na mistura natural.

Como aqui usado o termo "domínio de ligação de DNA de AP2" significa um motivo de 68 aminoácidos encontrado no polipeptídeo de APE- TALA2 (AP2) de Arabidopsis como informado por Jofuku et al., Plant Cell 6:1211-1225 (1994) e no WO 97/14659 como sendo homólogo ao domínio de ligação de DNA das proteínas de ligação de elemento de resposta de etileno. Com referência às figuras 2a e 2b para os propósitos de definir a seqüência de aminoácidos de polipeptídeos da presente invenção um domí- • nio de ligação de DNA de AP2 significa um motivo de aminoácido a seqüên- cia de aminoácidos desta é determinada ter pelo menos 85% de identidade de seqüência à seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de ANT de Arabi- dopsis (gi1244708) entre o aminoácido 281 e o aminoácido 354 ou entre o aminoácido 383 e o aminoácido 448, usando o programa Gap no WISCON- SIN PACKAGE versão 10.0-UNIX de Genetics Computer Group, Inc. com base no método de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), aqui incorporado por referência na sua íntegra) usando o grupo de parâme- tros de falta para comparação em pares (para comparação da seqüência de aminoácidos: Gap Penalty Creation = 8, Gap Extension Penalty = 2). "Porcentagem de identidade de seqüência" é determinada com- parando duas seqüências otimamente alinhadas em uma janela de compa- ração, em que a parte do polinucleotídeo ou da seqüência de aminoácidos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) quando comparado à seqüência de referência (que não compre- ende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucléico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as seqüências para render o número de posições igualadas, dividindo o nú- mero de posições igualadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de seqüência.

Como aqui usado o termo "polipeptídeo semelhante a ANT si- gnifica um polipeptídeo, em que a sobreexpressão de uma molécula de áci- do nucléico exógena que codifica o dito polipeptídeo em uma planta trans- gênica em que a seqüência de aminoácidos do dito polipeptídeo é substan- cialmente idêntica a uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13. Preferivelmente, a sobreexpressão de uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo seme- lhante a ANT da presente invenção sob o controle de um promotor constitu- tivo em uma planta transgênica tem efeitos mínimos na fertilidade feminina ou fertilidade masculina ou ambos destes da planta transgênica. 0 termo "tamanho intrínseco" como aqui usado significa o tama- nho de um órgão ou tecido de uma planta, que desenvolveu sob condições ideais de desenvolvimento, na maturidade ou qualquer outro tempo de defi- nição em seu ciclo de vida.

Ambos os termos "substancialmente idêntica" e "identidade si- gnificativa", usados em referência às seqüências de aminoácidos ou se- qüências de nucleotídeos, significam que uma seqüência de aminoácidos ou uma seqüência de nucleotídeos tem pelo menos 60% de identidade de se- qüência comparada à outra seqüência de aminoácidos ou seqüência de nu- cleotídeos como uma seqüência de referência usando o programa Gap no WISCONSIN PACKAGE versão 10.0-UNIX de Genetics Computer Group, Inc., com base no método de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), aqui incorporado por referência na sua íntegra) usando o conjunto de parâmetros predefinidos para comparação em pares (para comparação da seqüência de aminoácido: Gap Creation Penalty = 8, Gap Extension Penalty = 2; para comparação da seqüência de nucleotídeos: Gap Creation Penalty = 50; Gap Extension Penalty = 3).

Um aspecto da presente invenção fornece uma molécula de áci- do nucléico isolada que compreende uma seqüência de nucleotídeos ou complemento desta, em que a seqüência de nucleotídeos codifica um poli- peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 70% ou 75% de iden- tidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 80% ou 85% de iden- tidade de seqüência, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de seqüência, e preferivelmente pelo menos 98% de identidade de seqüência para um membro selecionado do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9, 11 e 13.

Polipeptídeos que são seqüências de compartilhamento "subs- tancialmente similar" como acima observado a exceto que as posições do resíduo que são idênticas podem se diferir por alterações de aminoácidos conservadores. As substituições de aminoácidos conservadores referem-se à capacidade de intercambiamento dos resíduos tendo cadeias laterais si- milares. "Substituições de aminoácidos conservadores" significa substitui- ções de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácidos nativos com outro(s) aminoácido(s) tendo cadeias laterais similares. Os substitutos con- servadores para um aminoácido dentro de uma seqüência de aminoácidos nativos podem ser selecionados de outros membros do grupo aos quais o aminoácido de ocorrência natural pertence. Por exemplo, um grupo de ami- noácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais de hidroxila ali- fáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservadores pre- feridos são: valina-leucina, valina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutâmico e asparagina- glutamina.

Alguém de habilidade na técnica reconhecerá que os valores da identidade substancial acima de seqüências de nucleotídeos podem ser apropriadamente ajustados para determinar identidade de seqüências cor- respondentes de duas seqüências de nucleotídeos que codifica os polipeptí- deos da presente invenção considerando a degeneração do códon, substi- tuições de aminoácidos conservadores, posições de estrutura de leitura e similares. A identidade substancial das seqüências de nucleotídeos para estes propósitos normalmente significa identidade de seqüência de pelo me- nos 35%.

Como aqui usado levedura regularmente refere-se a Saccha- romyces cerevissiae mas também pode incluir Schizosacchoramyces pombe e outras variedades (do gênero Pichia, por exemplo). Milho refere-se Zea Mays e todas as espécies e variedades que podem ser reproduzidas com ele. Trigo refere-se a todas variedades de Triticum aestivum incluindo, mas não limitado às variedades de trigo de primavera, inverno e todas facultati- vas. Trigo inclui qualquer outra espécie de trigo, incluindo, mas não limitado a trigo durum (Triticum durum), espelta (Triticum spelta), emmer (Triticum dicoccum) e trigo selvagem (Triticum monococcum). Trigo também inclui qualquer espécie que pode ser criada com quaisquer uma das espécies de trigo acima mencionadas e descendência das ditas cruzas (incluindo triticale, um híbrido de trigo e centeio). Soja refere-se a Glicina max e Glycine soja e qualquer variedade que pode ser criada com eles. Arroz refere-se a Oyyza sativa e qualquer espécie ou variedade que pode ser criada com ele. Ceva- da refere-se a Hordeum vulgare e qualquer espécie ou variedade que pode ser criada com ele. Aveia refere-se a Avena sativa e qualquer espécie ou variedade que pode ser criada com ele. Cânula é um nome cunhado recen- temente dado à semente, óleo e refeição produzidos por plantas de colza geneticamente modificadas, óleo de colza (Brassica napus L.) e nabo (B. canzpestris L), aqui cânula inclui todas as plantas e organismos de colza que podem ser reproduzidos com eles. E. coli e Escherichia coli como aqui usa- do inclui organismos das espécies de Escherichia coli e todas as cepas deste organismo; isto é, E. coli K12. E. coli e Escherichia coli como aqui usado pode também incluir qualquer organismo que pode conjugar com qualquer cepa de E. coli quando uma for uma cepa de F+ ou Hfr e a outra não for B. subtilis e Bacillus subtilis refere-se a todo organismo do gênero Bacillus, espécie subtilis. Agrobacterium tunzifaciens como aqui usado inclui todas as cepas e tipos destas espécies. Gramas de relva incluem todas as espécies e cepas de grama plantadas, ou que pode ser plantada, para pro- duzir uma relva, incluindo, mas não limitado; um gramado, um campo para jogar um jogo (isto é, futebol americano, beisebol ou futebol), e todas as áreas de um campo de golfe (isto é, marco, parte lisa, gramado, parte aci- dentada, etc.). Algodão refere-se a todas as plantas no gênero Gossypium e todas as plantas que podem ser reproduzidas com ele. O termo "degeneração de códon" significa divergência no código genético que permite variação da seqüência de nucleotídeos sem afetar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. O técnico qualifi- cado é bastante consciente do "códon-bias" apresentado por uma célula hospedeira específica em uso de códons de nucleotídeos para especificar um aminoácido dado. Portanto, ao sintetizar um gene para expressão ectó- pica em uma célula de anfitrião, é desejável projetar o gene tal que sua fre- qüência de uso de códon alcance a freqüência de uso de códon preferida da célula de anfitrião.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolada que compreende uma seqüência de nucleotídeos ou complemento desta, em que a seqüência de nucleotídeos híbrida sob condi- ções rigorosas com o complemento de uma segunda seqüência de nucleotí- deos codificando um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos se- lecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9,11 e 13.

As condições de hibridização são dependentes da seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Como aqui usado "condições rigorosas" são selecionadas para ser cerca de 5o C abaixo do ponto de fun- dição térmica (Tm) para a seqüência específica em uma resistência iônica e pH definidos. O "ponto de fundição térmica" é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) na qual 50% de uma molécula designada hibridizam com uma molécula completamente complementar. Condições rigorosas apropriadas que promovem hibridização de DNA, por exemplo, 6,0 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 X SSC a 50°C, são conhecidas por aqueles versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, incorporados aqui por referência na sua íntegra. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa condição rigorosa de cerca de 2,0 X SSC a 50°C a uma severidade alta de cerca de 0,2 X SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser elevada de baixas condições rigorosas em temperatura ambiente, cerca de 22°C, a condições rigorosas altas a cerca de 65°C. Tanto temperatura quanto concentração de sal podem ser variadas, ou a temperatura ou a concentração de sal podem ser manti- das constantes, enquanto a outra variável é alterada. Para o propósito desta descrição, condições rigorosas incluem pelo menos uma lavagem em 2,0 X SSC em uma temperatura de pelo menos cerca de 50°C durante 20 minutos, ou condições equivalentes.

Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos ou complemento desta, em que a seqüência de nucleotídeos hibrida sob condições moderadamente rigorosas como 2,0 X SSC e cerca de 65°C para o complemento de uma segunda seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13.

Em uma modalidade particularmente preferida, uma molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos ou complemento desta, em que a seqüência de nucleotídeos hibrida sob condições de severidade alta como 0,2 X SSC e cerca de 65°C para o complemento de uma segunda seqüência de nucleotídeos codifican- do um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9,11 e 13.

As moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo semelhante a ANT da presente invenção podem ser combinadas com outras seqüências não nativas ou "heterólogas" em uma variedade de formas. Por seqüências "heterólogas" é significado qualquer seqüência que não é en- contrada naturalmente ligada à seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo semelhante a ANT, incluindo, por exemplo, combinações de seqüências de nucleotídeo da mesma planta que não são encontradas natu- ralmente ligadas uma à outra, ou as duas seqüências originam de duas es- pécies diferentes.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolada que compreende uma seqüência de nucleotídeos es- trutural e operavelmente ligada às seqüências reguladoras, em que a se- qüência de nucleotídeos estrutural codifica um polipeptídeo tendo uma se- qüência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a um membro se- lecionado de grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9,11 e 13. O termo "operavelmente ligada", como usado em referência a uma seqüência reguladora e uma seqüência de nucleotídeos estrutural, si- gnifica que a seqüência reguladora causa expressão regulada da seqüência de nucleotídeos estrutural operavelmente ligada. "Expressão" significa a transcrição e acumulação estável de RNA sentido ou anti-sentido derivado da molécula de ácido nucléico da presente invenção. Expressão também pode referir a transferência de mRNA para dentro de um polipeptídeo. "RNA sentido" quer dizer transcrição de RNA que inclui o mRNA e assim pode ser transferido para dentro do polipeptídeo ou proteína pela célula. "RNA anti- sentido" quer dizer uma transcrição de RNA que é complementar a toda ou parte de uma transcrição primária alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Pat. U. S. N.° 5.107.065, incorporada aqui por referência). A complementaridade de um RNA anti-sentido pode ser com qualquer parte da transcrição de gene específica, isto é, na seqüência de não codificação de 5’, seqüência de não transferência de 3’, íntrons ou a seqüência de codifi- cação. "Transcrição de RNA" significa o produto que é o resultado de trans- crição catalisada por RNA polimerase de uma seqüência de DNA. Quando a transcrição de RNA for uma transcrição complementar perfeita da seqüência de DNA, ela é denominada transcrição primária ou pode ser uma seqüência de RNA derivada de processamento de pós transcrição da transcrição primá- ria e é denominado RNA maduro. O termo "sobreexpressão" significa a expressão de um poli- peptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico exógena introduzida em uma célula hospedeira, em que o dito polipeptídeo normalmente não é qualquer um presente na célula hospedeira, ou em que o dito polipeptídeo está presente na dita célula hospedeira em um nível mais alto que normal- mente expresso do gene endógeno que codifica o dito polipeptídeo.

Por "expressão ectópica" é significado aquela expressão de uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo em um tipo de cé- lula diferente de um tipo de célula nas quais a molécula de ácido nucléico normalmente é expressada, em um tempo diferente de um tempo no qual a molécula de ácido nucléico normalmente é expressada ou em um nível de expressão diferente do nível nos quais a molécula de ácido nucléico nor- malmente é expressada. "Inibição de anti-sentido" significa a produção transcrições anti- sentido de RNA capaz de suprimir a expressão do polipeptídeo alvo. "Co- supressão" significa a produção de transcrições sentido de RNA capaz de suprimir a expressão de genes idênticos ou estranhos substancialmente si- milares ou endógenos (Patente U. S. N° 5.231.020, incorporada aqui por re- ferência). O termo "um gene" significa o segmento de DNA que está en- volvido na produção de um polipeptídeo. Tal segmento de DNA inclui se- qüências reguladoras que precedem (seqüências de não codificação de 5') e seguindo (seqüências de não codificação de 3’) a região de codificação como também seqüências intervenientes (íntrons) entre os segmentos de codificação individuais (éxons). Um "gene nativo" significa um gene confor- me encontrado na natureza com suas próprias seqüências reguladoras. "Gene quimérico" significa qualquer gene que não é um gene nativo, com- preendendo seqüências reguladoras e codificadoras que não são encontra- das juntas na natureza. Conseqüentemente, um gene quimérico pode com- preender seqüências reguladoras e seqüências de codificação que são deri- vadas de diferentes fontes, ou seqüências reguladoras e seqüências de co- dificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira dife- rente que aquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" significa um gene nativo na sua localização natural no genoma de um organismo. Um "gene estranho" significa um gene não normalmente encontrado no orga- nismo hospedeiro, mas que é introduzido dentro do organismo hospedeiro por transferência de gene. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos dentro de um organismo não nativo, ou genes quiméricos.

Um "transgene" é um gene que foi introduzido dentro do genoma por um procedimento de transformação. "Seqüências reguladoras" significa seqüências de nucleotídeos localizadas a jusante (seqüências de não codificação de 5'), dentro, ou des- cendente (seqüências não trasladada de 3’) de uma seqüência de nucleotí- deos estrutural, e que influencia a transcrição, processamento ou estabilida- de de RNA, ou transferência da seqüência de nucleotídeos estrutural asso- ciada. As seqüências reguladoras podem incluir promotores, seqüências lí- deres de transferência, íntrons e seqüências de reconhecimento de poliade- nilação. O termo "seqüência promotora" significa uma seqüência de nu- cleotídeos que é capaz de, quando localizada em cis para uma seqüência de nucleotídeos estrutural codificando um polipeptídeo, funcionar de uma forma que direcionar a expressão de uma ou mais moléculas de mRNA que codifi- ca o polipeptídeo. Tais regiões de promotores são tipicamente encontradas ascendente à seqüência de ATG de trinucleotídeo no sítio de início de uma região de codificação de polipeptídeo. As seqüências de promotores podem também incluir seqüências das quais transcrição de RNA de seqüências de transferência (tRNA) ou de RNA robossômico (rRNA) é iniciada. A transcri- ção envolve a síntese de uma cadeia de RNA representando um filamento de DNA bifilamentar. Por "representando" é significado que o RNA é idêntico na seqüência com um filamento do DNA; é complementar ao outro filamento de DNA, que fornece modelo para sua síntese. A transcrição ocorre pelo processo usual de emparelhamento de base complementar, catalisado e minuciosamente examinado pela enzima RNA polimerase. A reação pode ser dividida em três estágios descritos como iniciação, alongamento e termi- nação. A iniciação começa com a ligação de RNA polimerase ao DNA bifila- mentares (DS ou ds). A seqüência de DNA requerida para a reação de inici- ação define o promotor. O sítio no qual o primeiro nucleotídeo está incorpo- rado é denominado o sítio de partida ou ponto de partida de transcrição. O alongamento descreve a fase durante a qual a enzima se move ao longo do DNA e estende a cadeia de RNA em desenvolvimento. O alongamento en- volve o rompimento da estrutura de DNA bifilamentar em que a região tran- sientemente não ferida existe como um dúplex de RNA-DNA híbrido e um filamento único deslocado de DNA. A terminação envolve reconhecimento do ponto no qual nenhuma outra base deve ser adicionada à cadeia. Para terminar a transcrição, a formação de ligações de fosfodiéster deve cessar e o complexo de transcrição deve se desfazer. Quando a última base for adiei- onada à cadeia de RNA, o híbrido de RNA-DNA é rompido, o DNA retorna à forma de um estado duplo, e a enzima de RNA polimerase e molécula de RNA são ambos liberados do DNA. A seqüência de DNA requerida para a reação de terminação é denominada o terminador. A seqüência de promotor consiste em elementos próximos e mais distantes, os últimos elementos freqüentemente referidos como intensi- ficadores. Conseqüentemente, um "intensificador" é uma seqüência de DNA que pode estimular a atividade de promotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para intensificar o nível ou es- pecificidade de tecido de um promotor. Os promotores podem ser derivados na sua íntegra de um gene nativa, ou podem ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expres- são de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambi- entais.

Os promotores que são conhecidos ou são encontrados para causar a transcrição de DNA em células vegetais podem ser usados na pre- sente invenção. Tais promotores podem ser obtidos de uma variedade de fontes como plantas e viroses de plantas. Vários promotores, incluindo pro- motores constitutivos, promotores induzíveis e promotores tecidos- específicos, que são ativos em células vegetais foram descritos na literatura.

Prefere-se que o promotor particular selecionado deva ser capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo para dar o fenótipo desejado. Além dos promotores que são conhecidos causar transcrição de DNA em células vegetais, outros promoto- res podem ser identificados para o uso na presente invenção triando uma biblioteca de cDNA vegetal por genes que são seletivamente ou de prefe- rência expressos nos tecidos alvos e depois determinar as regiões de pro- motores. O termo "promotor constitutivo" significa uma seqüência regula- dora que causa expressão de uma seqüência de nucleotídeos estrutural na maior parte das células ou tecidos na maioria das vezes. Os promotores constitutivos são ativos sob a maior parte das condições ambientais e esta- dos de desenvolvimento ou diferenciação de célula. Uma variedade de pro- motores constitutivos é bem conhecida na técnica. Exemplos de promotores constitutivos que são ativos em células vegetais incluem, mas não são limi- tados aos promotores de neopalina sintase (NOS); vírus de mosaico de cou- ve-flor (CaMV) 19 S e 35S (freqüentemente denominados aqui 35S, ou um derivado deste é denominado e35S {Patentes US 5.359.142, 5.196.525, 5.322.938, 5.164.316 e 5.424.200}); o promotor de vírus de mosaico de ta- baco; os promotores de vírus de mosaico de escrofulária; e promotores de actina, como o promotor de gene de actina de Arabidopsis (ver, por exemplo, Hung et al., Plant Mol. Biol. 33:125-139 (1997), aqui incorporado por referên- cia na sua íntegra). O termo "promotor induzível" significa uma seqüência reguladora que causa expressão condicional de uma seqüência de nucleotídeos estrutu- ral sob a influência de alterar as condições ambientais ou condições de desenvolvimento. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não são limitados a, promotor induzível pela luz da subunidade pequena de vibulose- 1,5-bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO); o promotor induzível por seca de milho (Busk et al., Plant J. 11:1285-1295 (1997), aqui incorporado por refe- rência na sua íntegra); o promotor induzível por frio, seca e sal alto de batata (Kirch, Plant Mol. Biol. 33:897-909 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra); um promotor induzível por nitrato derivado do gene de reducta- se de nitreto de espinafre (Back et al., Plant Mol. Biol. 17:9 (1991), aqui in- corporado por referência na sua íntegra); promotor induzível por ácido salicí- clico (Uknes et al., Plant Cell 5:159-169 (1993); Bi et al., Plant J. 8:235-245 (1995) aqui incorporado por referência na sua íntegra); o fragmento do pro- motor E1 de elementos de resposta a auxina (AuxREs) na soja (Glicina max L.) (Liu et al., Plant Physiol. 175:397-407 (1997), aqui incorporado por refe- rência na sua íntegra); o promotor de GST6 de Arabidopsis responsivo à auxina (também responsivo ao ácido salicíclico e peróxido de hidrogênio) (Chen et al., Plant J. 10:955-966 (1996), aqui incorporado por referência na sua íntegra); o promotor de parC induzível por auxina de tabaco (Sakai et al., Plant Cell Physiol. 37:906-913 (1996), aqui incorporado por referência na sua íntegra); um elemento de resposta a biotina de plantas (Streit et al., Mol.

Plant. Microbe Interact. 10:933-937 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra); o promotor responsivo ao ácido abscísico de hormônio de estresse (Sheen et al., Science 274:1900-1902 (1996), aqui incorporado por referência na sua íntegra); o promotor de ln2-2 de milho ativado por proteto- res herbicidas de benzenossulfonamida (De Veylder et al., Plant Cell Physiol. 38:568-577 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra); um pro- motor induzível por tetraciclina, como o promotor para o gene de arginina descarboxilase de Avena sativa L. (aveia) (Masgrau et al., Plant J. 11:465- 473 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra); e um elemento responsivo a ácido salicíclico (Stange et al., Plant J. 11:1315-1324 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra). O termo "promotor tecido-específico" significa uma seqüência reguladora que causa transcrições ou transcrições intensificadas de DNA em células ou tecidos específicos em tempos específicos durante o desenvolvi- mento da planta, como em tecidos vegetativos ou tecidos reprodutivos.

Exemplos de promotores tecido-específicos sob controle de desenvolvi- mento incluem promotores que iniciam transcrição apenas (ou primaria- mente apenas) em certos tecidos, como tecidos vegetativos, por exemplo, raízes, folhas ou caules, ou tecidos reprodutivos, como fruta, óvulos, se- mentes, pólen, pistilos, flores ou qualquer tecido embrionário. Os promotores tecido-específicos reprodutivos podem ser, por exemplo, óvulo-específicos, embriões-específicos, endosperma-específicos, integumento-específicos, cobertura de semente-específicos, pólen-específicos, pétala-específicos, sépala-específicos ou algumas combinações destes. Alguém habilitado na técnica reconhecerá que um promotor tecido-específico pode direcionar ex- pressão de seqüências operavelmente ligadas em tecidos diferentes que o tecido alvo. Assim, conforme aqui usado um promotor tecido-específico é um que direciona expressão preferencialmente no tecido alvo, mas também leva a certa expressão em outros tecidos também. Outro conjunto de promotores preferidos são promotores intensificados ou específicos de raiz como o CaMV derivado de promotor 4 as-1 ou o promotor de POX1 de trigo (tam- bém freqüentemente denominado pox1) (Pat. U. S. N.° 5.023.179, especifi- camente aqui incorporado por referência; Hertig et al., 1991).

Uma variedade de promotores especificamente ativos em teci- dos vegetativos, como folhas, caules, raízes e tubérculos, pode ser usada para expressar as moléculas de ácido nucléico da presente invenção.

Exemplos de promotores tubérculo-específicos incluem, mas não são limita- dos a, promotores de patatina da classe I e II (Bevan et al., EMBO J. 8:1899- 1906 (1986); Koster-Topfer et al., Mol Gen Genet. 219:390-396 (1989);

Mignery et al., Gene. 62:27-44 (1988); Jefferson et al., Plant Mol. Biol. 14:995-1006 (1990), aqui incorporado por referência na sua íntegra), o pro- motor para os genes de ADPGPP de tubérculo de batata, tanto subunidades grandes quanto pequenas; o promotor de sacarose sintase (Salanoubat e Belliard, Gene. 60:47-56 (1987), Salanoubat and Belliard, Gene. 84:181-185 (1989), aqui incorporado por referência na sua íntegra); e o promotor para as proteínas de tubérculo principal incluindo os complexos de proteína de 22 kd e inibidores de proteinase (Hannapel, Plant Physiol. 101: 703-704 (1993), aqui incorporado por referência na sua íntegra). Exemplos de promotores folha-específicos incluem, mas não são limitados aos promotores de ribulose bifosfato carboxilase (RBCS ou RuBISCO) (ver, por exemplo, Matsuoka et al., Plant J. 6:311-319 (1994), aqui incorporado por referência na sua ínte- gra); o promotor de gene de proteína de ligação a/b de clorofila de colheita suave (ver, por exemplo, Shiina et al., Plant Physiol. 115:477-483 (1997);

Casal et al., Plant Physiol. 116:1533-1538 (1998), aqui incorporado por refe- rência na sua íntegra); e o promotor de gene relacionado a myb de Arabi- dopsis thaliana (Atmybõ) (Li et al., FEBS Lett. 379:117-121 (1996), aqui in- corporado por referência na sua íntegra). Exemplos de promotor raiz- específico incluem, mas não são limitados ao promotor para o gene de ácido quitinase (Samac et al., Plant Mol. Biol. 25: 587-596 (1994), aqui incorporado por referência na sua íntegra); os subdomínios raiz-específicos do promotor de CaMV35S que foi identificado (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A) 86:7890-7894 (1989), aqui incorporado por referência na sua íntegra); o promotor de ORF13 de Agrobacterium rhizogenes que apresenta atividade alta em raízes (Hansen et al., Mol. Gen. Genet. 254:337-343 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra); o promotor para o gene raiz- específico de tabaco RB7 (Patente U. S 5.750.386; Yamamoto et al., Plant Cell 3:371-382 (1991), aqui incorporado por referência na sua íntegra); e os promotores específicos em células de raiz informados por Conkling et al. (Conkling et al., Plant Physiol. 93:1203-1211 (1990), aqui incorporado por referência na sua íntegra).

Outra classe de promotores tecido-específicos vegetativos úteis são promotores meristemáticos (ponta da raiz e cume da raiz). Por exemplo, os promotores "SHOOTMERISTEMLESS" e "SACRECROW" que são ativos nos meristemas de broto em desenvolvimento ou cume de raiz (Di Laurenzio et al., Cell 86:423 - 433 (1996); Long, Nature 379:66-69 (1996); aqui incorpo- rados por referência na sua íntegra), podem ser usados. Outro exemplo de um promotor útil é aquele que controla a expressão de gene de HMG2 de reduetase de coenzima A de 3-hidróxi-3-metilglutarila cuja expressão é res- trita a tecidos meristemáticos e florais (zona secretória do estigma, grãos de pólen maduros, tecido vascular do gineceu e óvulos fertilizados) (ver, por exemplo, Enjuto et al., Plant Cell. 7:517-527 (1995), aqui incorporado por referência na sua íntegra). Também outro exemplo de um promotor útil é aquele que controla a expressão de genes knl-relacionados de milho e ou- tras espécies que mostram expressão meristema-específica (ver, por exem- plo, Granger et al., Plant Mol. Biol. 31:373-378 (1996); Kerstetter et al., Plant Cell 6:1877-1887 (1994); Hake et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol.

Sei. 350:45-51 (1995), aqui incorporados por referência na sua íntegra). Ou- tro exemplo de um promotor meristemático é o promotor de KNAT1 de Ara- bidopsis thaliana. No cume do broto, transcrição de KNATI está localizada principalmente no meristema do cume do broto; a expressão de KNATI no meristema de broto diminui durante a transição floral e é restrita ao córtex do talo de inflorescência (ver, por exemplo, Lincoln et al., Plant Cell 6:1859- 1876 (1994), aqui incorporado por referência na sua íntegra).

Os promotores semente-específicos adequados podem ser deri- vados dos genes a seguir: MAC1 de milho (Sheridan et al., Genetics 142:1009-1020 (1996), aqui incorporado por referência na sua íntegra); Cat3 de milho (GenBank N° L05934, Abler et al., Plant Mol. Biol. 22:10131-1038 (1993), aqui incorporado por referência na sua íntegra); vivparous-1 de Ara- bidopsis (Genbank N° U93215); Atimycl de Arabidopsis (Urao et al., Plant Mol. Biol. 32:571-57 (1996); Conceicao et al., Plant 5:493-505 (1994), aqui incorporado por referência na sua íntegra); napA de Brassica napus (Genbank N° J02798); a família de gene de napin de Brassica napus (Sjo- dahl et al., Planta 197:264-271 (1995), aqui incorporado por referência na sua íntegra). O promotor óvulo-específico para gene de BEL1 (Reiser et al.

Cell 83:735-742 (1995), Genbank N° U39944; Reiser et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 91:5761-5765 (1994) todos estes são aqui incorporados por refe- rência na sua íntegra) também podem ser usados. Os promotores de MEA (FIS1) e FIS2 específicos em ovo e célula central também são promotores tecidos-específicos reprodutores úteis (Luo et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 97:10637-10642 (2000); Vielle-Calzada, et al., Genes Dev. 13:2971-2982, (1999); aqui incorporados por referência na sua íntegra).

Um promotor pólen-específico de milho foi identificado em milho (Guerrero et al., Mol. Gen. Genet. 224:161-168 (1990), aqui incorporado por referência na sua íntegra). Outros genes especificamente expressos em pó- len foram descritos (ver, por exemplo, Wakeley et al., Plant Mol. Biol. 37:187- 192 (1998); Ficker et al., Mol. Gen. Genet. 257:132-142 (1998); Kulikauskas et al., Plant Mol. Biol. 34:809-814 (1997); Treacy et al., Plant Mol. Biol. 34:603-611 (1997); todos destes são aqui incorporados por referência na sua íntegra).

Promotores derivados de genes que codificam proteínas de ar- mazenamento embrionárias, que incluem o gene que codifica a proteína de armazenamento 2S de Brassica napus (Dasgupta et al, Gene 133:301-302 (1993), aqui incorporado por referência na sua íntegra); a família do gene de proteína de armazenamento de semente 2s de Arabidopsis; o gene que co- difica oleosina 20kD de Brassica napus (Genbank N° M63985); os genes que codificam oleosina A (Genbank N° U09118) e oleosina B (Genbank N° U09119) de soja; o gene que codifica oleosina de Arabidopsis (Genbank N° Z17657); o gene que codifica oleosina 18kD de milho (Genbank N° J05212, Lee, Planta Mol. Biol. 26:1981-1987 (1994), aqui incorporado por referência na sua íntegra); e o gene que codifica proteína rica em enxofre de peso mo- lecular baixo de soja (Choi et al., Mol. Gen. Genet. 246:266-268 (1995), aqui incorporado por referência na sua íntegra), também podem ser usados.

Os promotores derivados genes de codificação de zeína (inclu- indo os genes 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD e gama) (Pedersen et al., Cell 29: 1015-1026 (1982), aqui incorporado por referência na sua íntegra) também podem ser usados. As zeínas são um grupo de proteínas de arma- zenamento encontrado no endosperma de milho.

Por exemplo, outros promotores conhecidos para funcionar em milho, incluem os promotores para os genes a seguir: waxy, Brittle, Shur- nken 2, enzimas de Ramificação I e II, sintases de milho, enzimas de desra- mificação, oleosinas, glutelinas e sacarose sintases. Um promotor particu- larmente preferido para a expressão de endosperma de milho é o promotor para o gene de glutelina de arroz, mais particularmente o promotor de Osgt- 1 (Zheng et al., Mol. Cell Biol. 13: 5829-5842 (1993), aqui incorporado por referência na sua íntegra). Exemplos de promotores adequados para ex- pressão em trigo incluem aqueles promotores para as subunidades de ADPglicose pirofosforilase (ADPGPP), o grânulo ligado e outras sintases de milho, as enzimas de ramificação e desramificação, as proteínas abundantes de embriogênese, as gliadinas e as gluteninas. Exemplos de tais promotores em arroz incluem aqueles promotores para as subunidades de ADPGPP, o grânulo ligado e outras sintases de milho, as enzimas de ramificação, as en- zimas de desramificação, sacarose sintases e as glutelinas. Um promotor particularmente preferido é o promotor para glutelina de arroz, Osgt-1.

Exemplos de tais promotores para cevada incluem aqueles para as subuni- dades de ADPGPP, o grânulo ligado e outras sintases de milho, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sacarose sintases, as hor- deínas, as globulinas de embrião e as proteínas aleurona-específicas.

Um promotor de tomate ativo durante o amadurecimento da fru- ta, senescência e abscisão de folhas e, menos, de flores pode ser usado (Blume et al., Plant J. 72:731-746 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra). Outros promotores exemplares incluem o promotor pistilo- específico na batata (Solarium tuberosum L.) gene de SK2, codificando uma endocitinase básica pistilo-específica (Ficker et al., Plant Mol. Biol. 35:425- 431 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra); o gene de Blec4 de ervilha (Pisum sativum cv. Alasca), ativo no tecido epidérmico de cumes de broto vegetativo e floral de alfafa transgênica. Isto o torna uma ferramenta útil para alvejar a expressão de genes estranhos na camada epidérmica de brotos ativamente crescentes. O promotor tecido-específico de E8 de tomate também é útil para direcionar a expressão de gene em frutas. É reconhecido que promotores adicionais que podem ser utiliza- dos são descritos, por exemplo, na Patente U. S. Nos. 5.378.619, 5.391.725, 5.428.147, 5.447.858, 5.608.144, 5.614.399, 5.633.441, 5.633.435, e 4.633.436 todas destas são aqui incorporadas na sua íntegra. Além disso, um intensificador tecido-específico pode ser usado (Fromm et al., The Plant Cell 7:977-984 (1989), aqui incorporado por referência na sua íntegra). Tam- bém é reconhecido que desde então na maioria dos casos os limites exatos das seqüências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter atividade de promotor idênti- ca. "Por exemplo" significa um exemplo que serve para ilustrar um preceito ou agir como um exercício, e não é inclusive de todos os possíveis exemplos, ou modalidades, e age como apenas um representante simples de uma classe muito maior. "Isto é" ou "por exemplo" significa no (por) exemplo e pode ser lido como "por exemplo." A "seqüência líder de transferência" significam uma seqüência de DNA localizada entre a seqüência promotora de um gene e a seqüência de codificação. A seqüência líder de transferência está presente no mRNA completamente processado a jusante à seqüência de início de transferência. A seqüência líder de transferência pode afetar o processo da transcrição primária do mRNA, estabilidade do mRNA ou eficiência de transferência.

Exemplos de seqüências líderes de transferência foram descritos (Turner e Foster, Molecular biotechnology 3:225 (1995), aqui incorporado por referên- cia na sua íntegra).

As "seqüências não transferidas de 3'" significa seqüências de DNA localizadas a jusante de uma seqüência de nucleotídeos estrutural e inclui seqüências que codificam poliadenilação e outros sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou expressão de gene. As funções de sinal de poliadenilação em plantas para causar a adição de nu- cleotídeos de poliadenilato à extremidade 3' do precursor de mRNA. A se- qüência de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma varie- dade de genes de planta ou de T-DNA. Um exemplo da seqüência de polia- denilação é a seqüência de 3' de neopalina sintase (NOS 3'; Fraley et al., Proc, Natl. Acad. Sei. USA 80: 4803-4807 (1983), aqui incorporado por refe- rência na sua íntegra). O uso de diferentes seqüências não transferidas de 3' é exemplificado por Ingelbrecht et al., Plant Cell 1:671-680 (1989), aqui in- corporado por referência na sua íntegra. "Propogule" inclui todos os produtos de meiose e mitose, inclu- indo, mas não limitado à, semente e partes da planta capaz de propagar em uma planta nova. Por exemplo, propogule inclui um broto, raiz, ou outra parte de planta que é capaz de crescimento em uma planta inteira. Propo- gule também inclui enxertos onde uma parte de uma planta é enxertada em outra parte de uma planta diferente (até mesmo de uma espécie diferente) para criar um organismo vivo. Propogule também inclui todas as plantas e sementes produzidas clonando ou reunindo produtos meióticos, ou permitin- do produtos meióticos vir formar um embrião ou ovo fertilizado (naturalmente ou com intervenção humana).

As moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção também podem incluir íntrons. Em geral, expressão ideal em monocotiledô- neas e algumas plantas dicotiledôneas é obtida quando uma seqüência de íntrons é inserida entre a seqüência promotora e a seqüência de gene es- trutural ou, opcionalmente, pode ser inserida na seqüência de codificação estrutural para fornecer uma seqüência de codificação suspensa. Um exem- plo de uma tal seqüência de íntrons é o íntron HSP 70 descrito no WO 93/19189, aqui incorporada por referência na sua íntegra.

Os procedimentos de laboratório em tecnologia de DNA recom- binante usados aqui são aqueles bem conhecidos e comumente emprega- dos na técnica. Técnicas padrão são usadas para clonagem, isolamento, amplificação e purificação de DNA e RNA. As reações em geral enzimáticas que envolvem DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e as outras são executadas de acordo com as especificações do fabricante.

Em geral, estas técnicas e várias outras técnicas são executadas de acordo com Sambrook et al., Molecular Cloning molecular - A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989).

Outro aspecto da presente invenção relaciona a uma molécula de ácido nucléico isolada tendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 8, 10 e 12 ou comple- mento desta, que contém marcadores de DNA. Marcadores de DNA da pre- sente invenção incluem "marcadores dominantes" ou "co-dominantes." "Mar- cadores co-dominantes" revelam a presença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo diplóide) em um local. "Marcadores dominantes" revelam a presen- ça de apenas um único alelo por local. A presença do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, uma faixa de DNA) é uma indicação que o alelo está presente ou na condição homozigoto ou heterozigoto. A ausência do fenótipo de marcador dominante (por exemplo ausência de uma faixa de DNA) é meramente evidência que "algum outro" alelo indefinido está pre- sente. No caso de populações onde os indivíduos são predominantemente homozigotos e os locais são predominantemente dimórficos, marcadores dominantes e co-dominantes podem ser igualmente valiosos. Uma vez que as populações tornam-se mais heterozigóticas e mutialélicas, marcadores co-dominantes freqüentemente tornam-se mais informativos do genótipo que marcadores dominantes. Exemplos de marcadores de DNA incluem polimor- fismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado aleatório (RAPD), polimorfismo de repetição de seqüência simples (SSR), seqüências polimórficas amplificadas cliváveis (CAPS), polimorfismo de comprimento de fragmento ampliado (AFLP) polimorfismo de nucleotídeo simples (SNP).

Os marcadores de DNA podem ser desenvolvidos de moléculas de ácido nucléico que usam endonucleases de restrição, a PCR e/ou infor- mação de seqüência de DNA. Os métodos para isolar os marcadores de DNA são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo, Birren e Lai, Nonmammalian Genomic Analyse, Academic Press, Inc, San Diego, Califór- nia, USA; Londres, Inglaterra, UK, pp. 75-134 (1996); Brown et al., Methods of Genome Analysis in Plants, ed. Jauhar, CRC Press, Inc. Boca Raton, Fló- rida, USA; Londres, Inglaterra, UK (1996) ambos destes são aqui incorpora- dos por referência na sua íntegra).

Marcadores de RFLP são co-dominantes e altamente abundan- tes em genomas de planta e têm um nível médio de polimorfismo. RFLP é resultado de alterações de base simples, inserções/deleções. Os marcado- res de RFLP podem ser desenvolvidos por uma combinação de digestão de endonuclease de restrição e hibridização do Southern Blotting. CAPSs são marcadores co-dominantes e altamente abundantes em genomas de planta e têm um nível médio de polimorfismo. CAPS é re- sultado de alterações de base simples, inserções/deleções. Os marcadores de CAPS podem ser desenvolvidos de digestão de endonuclease de restri- ção de produtos de PCR. RAPDs são marcadores dominantes e muito altamente abun- dantes em genomas de planta e têm um nível médio de polimorfismo. RAPD é resultado de alterações de base simples e inserções e deleções em geno- mas de planta. Os marcadores de RAPDs podem ser desenvolvidos de am- plificação de DNA com iniciadores fortuitos.

Marcadores de AFLP são dominantes e co-dominantes. Eles são altamente abundantes em genomas de planta e apresentam um nível médio de polimorfismo. AFLP é resultado de alterações de base simples, inserções e deleções. Os marcadores de AFLP podem ser desenvolvidos por PCR de um subconjunto de fragmentos de restrição de iniciadores de adaptadores estendidos. SSR é resultado de alterações de comprimento repetidas. Os marcadores de SSR são co-dominantes e apresentam um grau médio de abundância em genomas de planta e um nível alto de polimorfismo. Em mé- dia, 1 SSR é encontrado a cada 21 e 65 kb em dicotiledôneas e monocotile- dôneas. Menos nucleotídeos de CG são encontrados em dicotiledôneas que em monocotiledôneas. Não há nenhuma correlação entre a abundância de SSRs e o conteúdo de DNA nuclear. A abundância de toda combinação de SSR de tri- e tetranucleotídeo juntamente foi informada ser equivalente àquela das combinações de dinucleotídeo totais. Repetições mono-, di- e tetranucleotídeo estão todas localizadas nas regiões de não codificação de DNA, enquanto 57% desses SSRs de trinucleotídeo contendo CG estão lo- calizados dentro das regiões de codificação de gene. Todos SSRs de trinu- cleotídeo repetidos compostos inteiramente de AT são encontrados nas re- giões de não codificação, (Brown et al., Methods of Genome Analysis in Plants, ed. Jauhar, CRC Press, Inc, Boca Raton, Flórida, USA; Londres, In- glaterra, UK, pp. 147-159, (1996)). O desenvolvimento de SSRs requer informação de seqüência de DNA. Os SSRs podem ser identificados nas SEQ NOs: 1, 3, 5, 7, 8, 10 e 12 ou complemento destas, usando o programa de BLASTIN para examinar as seqüências pela presença/ausência de SSRs. SNP é resultado de alterações de base simples. Eles são alta- mente abundantes e apresentam uma miríade de polimorfismo (Rafalski, et al., Em: Nonmamnialian Genomic Analysis, ed. Birren e Lai, Academic Press, San Diego, CA, pp. 75-134 (1996), a totalidade deste é aqui incorpo- rado por referência). Desenvolvimento de SNPs também requer informação de seqüência de DNA.

Isolamento e identificação de moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos semelhantes a ANT de soja, milho, arroz e algodão são descritos em detalhes nos Exemplos. Toda ou uma parte substancial das moléculas de ácido nucléico da presente invenção pode ser usada para isolar cDNAs e moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos homólogos das mesmas espécies de planta ou outras.

Uma "parte significativa" de uma seqüência de nucleotídeos compreende bastante da seqüência para proporcionar isolamento e/ou iden- tificação específica de uma molécula de ácido nucléico que compreende a seqüência. As seqüências de nucleotídeos podem ser avaliadas manual- mente por alguém de habilidade na técnica, ou usando ferramentas de com- paração e identificação de seqüências com base em computador que em- pregam algoritmos como BLAST (Basic Local Alingment Search Tool;

Altschul et al., J. Moí. Biol. 215\403-410 (1993); também ver www.nebi.nlm.nih.gov/BLAST/). Em geral, uma seqüência de trinta ou mais nucleotídeos contíguos é necessária para putativamente identificar uma se- qüência de nucleotídeos como homóloga a um gene. Além disso, com res- peito às seqüências de nucleotídeos, sondas de oligonucleotídeos gene- específicas compreendendo 30 ou mais nucleotídeos contíguos podem ser usadas em métodos seqüência-dependentes de identificação de gene (por exemplo, hibridização do Sul) e isolamento (por exemplo, hibridização in situ de colônias bacterianas ou placas de bacteriófago). Além disso, podem ser usados oligonucleotídeos curtos de 12 ou mais nucleotídeos como iniciado- res de amplificação em PCR para obter uma molécula de ácido nucléico par- ticular que compreende os iniciadores. O técnico habilitado, tendo o benefí- cio das seqüências como aqui informado, pode agora usar toda ou uma parte substancial das seqüências descritas para propósitos conhecidos àquele habilitado nesta técnica. Adequadamente, a atual invenção compre- ende as seqüências completas como informado na Listagem de Seqüências em anexo, como também partes significativas dessas seqüências como aci- ma definido. O isolamento das moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos homólogo usando protocolos seqüência-dependentes é bem conhecido na técnica. Exemplos de protocolos seqüência-dependentes in- cluem, mas não são limitados a, métodos de hibridização de molécula de ácido nucléico e métodos de amplificação de DNA e RNA como exemplifica- do por vários usos de tecnologias de amplificação de molécula de ácido nu- cléico (por exemplo, reação de cadeia de polimerase, reação de cadeia de ligase).

Por exemplo, moléculas de ácido nucléico estruturais que codifi- cam outro polipeptídeo semelhante a ANT, ou como cDNAs ou DNAs genô- micos, podem ser isoladas diretamente usando toda ou uma parte substan- cial das moléculas de ácido nucléico da presente invenção como sonda de hibridização de DNA para triar cDNA ou bibliotecas genômicas de qualquer planta desejada empregando metodologia bem conhecida àqueles versados na técnica. Métodos para formar tais bibliotecas são bem conhecidos na téc- nica. Sondas de oligonucleotídeos específicas com base nas moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser designadas e sintetizadas por métodos conhecidos na técnica. Além disso, podem ser usadas as se- qüências inteiras das moléculas de ácido nucléico diretamente para sinteti- zar as sondas de DNA através de métodos conhecidos ao técnico habilitado como marcação de DNA de iniciador aleatório, transferência de entalhe ou técnicas de marcação de extremidade, ou sondas de RNA usando sistemas de transcrição in vitro disponíveis. Além disso, iniciadores específicos podem ser designados e usados para amplificar uma parte ou todas as seqüências.

Os produtos de amplificação resultantes podem ser marcados diretamente durante as reações de amplificação ou marcados após reações de amplifica- ção, e usados como sondas para isolar cDNA de comprimento total ou os DNAs genômícos sob condições de severidade apropriada.

Alternativamente, as moléculas de ácido nucléico de interesse podem ser ampliadas de amostras de ácido nucléico usando técnicas de amplificação. Por exemplo, as moléculas de ácido nucléico descritas podem ser usadas para definir um par de iniciadores que podem ser usados com a reação de cadeia de polimerase (Mullis, et al., Cold Spring Harbor Symp.

Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich et al., EP 50.424; EP 84.796, EP 258.017, EP 237.362; Mullis, EP 201.184;. Mullis et al., US 4.683.202; Erlich, US 4.582.788; e Saiki, R., et al., US 4.683.194 todas destas são aqui incor- poradas por referência na sua totalidade) para ampliar e obter qualquer mo- lécula de ácido nucléico desejada diretamente de mRNA, de cDNA, de bibli- otecas genômicas ou de bibliotecas de cDNA. PCR e outros métodos de amplificação in vitro também podem ser úteis, por exemplo, para clonar se- qüências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos a ser expressos, para produzir moléculas de ácido nucléico para usar como sondas para detectar a presença do mRNA desejado nas amostras, para seqüenciação de ácido nucléico, ou para outros propósitos.

Além disso, podem ser usados dois segmentos curtos das molé- culas de ácido nucléico da presente invenção em protocolos de reação de cadeia de polimerase para ampliar moléculas de ácido nucléico mais longas que codificam homólogos de um polipeptídeo semelhante a ANT de DNA ou RNA. Por exemplo, o técnico habilitado pode seguir o protocolo de RACE (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8998 (1988), aqui incorporado por referência na sua íntegra) para gerar cDNAs usando PCR para ampliar cópias da região entre um ponto simples na transcrição e a extremidade 3’ e 5’. Os iniciadores orientados nas direções 3’ e 5' podem ser designados das moléculas de ácido nucléico da presente invenção. Usando sistemas de 3'RACE ou 5'RACE comercia Imente disponíveis (Gibco BRL, Life Technolo- gies, Gaithersburg, Maryland, U.S.A), fragmentos de 3' ou 5' específicos po- dem ser isolados (Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989) ambos destes são aqui incorporados por refe- rência na sua íntegra). Produtos gerados pelos procedimentos de 3' e 5' RACE podem ser combinados para gerar os cDNAs de comprimento total (Frohman e Martin, Techniques 1: 165 (1989), aqui incorporado por referên- cia na sua íntegra).

As moléculas de ácidos nucleio de interesse podem também ser sintetizadas, ou por completo ou em parte, especialmente onde for desejável fornecer seqüências preferidas de plantas, por técnicas bem conhecidas conforme descrito na literatura técnica. Ver, por exemplo, Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982), e Adams et al., J.

Am. Chem. Soc. 105:661 (1983), ambos destes são aqui incorporados por referência na sua íntegra). Assim, toda ou uma parte das moléculas de ácido nucléico da presente invenção usando códons preferidos pode ser sintetiza- da por um hospedeiro de planta selecionado. Por exemplo, os códons prefe- ridos de planta podem ser determinados dos códons usados mais freqüen- temente nas proteínas expressas em uma espécie hospedeira de planta par- ticular. Outras modificações das seqüências de gene podem resultar em mutantes tendo atividade levemente alterada. A disponibilidade das seqüências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos semelhantes a ANT facilita a triagem imunológica de bibliote- cas de expressão de cDNA. Os polipeptídeos sintéticos que representam as partes das seqüências de aminoácidos de polipeptídeos semelhantes a ANT podem ser sintetizados. Estes polipeptídeos podem ser usados para imuni- zar animais para produzir anticorpos monoclonais e policlonais com especifi- cidade para polipeptídeos compreendendo as seqüências de aminoácidos.

Estes anticorpos podem então ser usados para triar bibliotecas de expressão de cDNA para isolar clones de cDNA de comprimento total de interesse (Lemer, Adv. Immunol. 36: 1 (1984); Sambrook et al., Molecular Cloning: A

Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Har- bor, (1989)). É compreendido que as pessoas versadas na técnica estão familiarizadas com os materiais de recurso padrão que descrevem as condi- ções e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isola- mento de anticorpos (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Em: Antibodies: A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1988)).

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se aos métodos para obter uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo semelhante a ANT a seqüên- cia de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de seqüência em um membro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13. Um método da presente invenção para obter uma molécula de áci- do nucléico que codifica toda ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo semelhante a ANT compreendendo: (a) sondar uma cDNA ou biblioteca genômica com uma sonda de hibridização compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica toda ou uma parte substancial de um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos exposta em qualquer uma de SEQ Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13 ou uma seqüência de aminoácidos exposta em qualquer uma de SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13 com substituições de aminoácido conservadoras; (b) identificar um clone de DNA que híbrida sob condições rigorosas com a sonda de hibridização;

(c) isolar o clone de DNA identificado na etapa (b); e (d) seqüenciar o cDNA ou fragmento genômico que compreende o clone isolado na etapa (c) em que a molécula de ácido nucléico seqüenciada codifica toda ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo semelhante a ANT.

Outro método da presente invenção para obter uma molécula de ácido nucléico codificando toda ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo semelhante a ANT compreendendo: (a) sintetizar um primeiro e um segundo iniciadores de oligonucleotídeo, em que as seqüências dos primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo codifi- cam duas partes diferentes de um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13; e (b) ampliar e obter a molécula de ácido nucléico diretamente das amostras de mRNA, de bibliotecas genômicas ou de bibliotecas de cDNA usando os primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo da etapa (a) em que a molécula de ácido nucléico codifica toda ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo semelhante a ANT.

As moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção também podem ser usadas em tecnologia anti-sentido para suprimir a ex- pressão de gene semelhante a ANT endógena. Para realizar isto, uma molé- cula de ácido nucléico derivada de uma seqüência de nucleotídeos selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 8, 10 e 12 é clonada e operavelmente ligada a um promotor tal que o filamento anti-sentido de RNA será transcrito. O constructo é então transformado em plantas e o fila- mento anti-sentido de RNA é produzido. Em células vegetais, foi sugerido que RNA anti-sentido inibe a expressão de gene impedindo a acumulação de mRNA que codifica a enzima de interesse (ver, por exemplo, Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8805-8809 (1988), e Patente U. S. N° 4.801.340; ambos destes são aqui incorporados por referência na sua ínte- gra). O segmento de ácido nucléico a ser introduzido em geral será substancialmente idêntico a pelo menos uma parte do gene ou genes se- melhantes a ANT endógenos a ser reprimidos. Porém, a seqüência não ne- cessita ser perfeitamente idêntica para inibir a expressão. Os vetores re- combinantes da presente invenção podem ser designados tal que o efeito inibidor aplica a outros genes dentro de uma família de genes que apresen- tam homologia ou homologia significativa ao gene alvo.

Para supressão anti-sentido, a seqüência introduzida não preci- sa também ser de comprimento total relativo ao produto de transcrição pri- mário ou mRNA completamente processado. Em geral, homologia mais alta pode ser usada para compensar o uso de uma seqüência mais curta. Além disso, a seqüência introduzida não necessita ter o mesmo padrão de íntron ou de éxon, e a homologia de segmentos de não codificação pode ser igualmente eficaz. Normalmente, uma seqüência dentre cerca de 30 ou 40 nucleotídeos e cerca de nucleotídeos de comprimento totais deve ser usada, entretanto uma seqüência de pelo menos cerca de 100 nucleotídeos é prefe- rida, uma seqüência de pelo menos cerca de 200 nucleotídeos é mais prefe- rida, e uma seqüência de cerca de 500 a cerca de 1700 nucleotídeos é es- pecialmente preferida.

As moléculas de RNA catalíticas ou ribozimas também podem ser usadas para inibir a expressão de genes semelhantes a ANT. É possível designar ribozimas que especificamente emparelham virtualmente com qualquer RNA alvo e cliva a cadeia principal de fosfodiéster em um local es- pecífico, assim funcional mente inativando o RNA alvo. Realizando esta di- vagem, a ribozima não é em si alterada, e é assim capaz de reciclar e clivar outras moléculas, tornando-a uma enzima verdadeira. A inclusão de se- qüências de ribozima dentro de RNAs anti-sentidos as confere atividade de divagem de RNA, desse modo aumentando a atividade recombinante das construções de DNA. Várias classes de ribozimas foram identificadas. Uma classe de ribozimas é derivada de vários RNAs circulares pequenos que são capazes de divagem própria e replicação em plantas. Os RNAs replicam ou isolada- mente (RNAs viróides) ou com um vírus auxiliar (RNAs satélites). Exemplos incluem viróide de pústula solar de abacate e os RNAs satélites de vírus de manchas redondas de tabaco, vírus de faixa transiente de alfafa, vírus mote- ado de tabaco aveludado, vírus moteado de Solanum nodiflorum e vírus moteado de trevo subterrâneo. O modelo e uso de ribozimas RNA- específicas alvos são descritos em Haseloff et al. Nature 334:585-591 (1988), aqui incorporado por referência na sua íntegra.

As moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção também podem ser usadas em co-supressão de sentido para modular ex- pressão de genes endógenos semelhantes a ANT. O efeito supressivo pode ocorrer onde a seqüência introduzida não conter nenhuma sequência de co- dificação per se, mas só íntron ou seqüências não transferidas homólogas às seqüências presentes na transcrição primária da seqüência endógena. A seqüência introduzida em geral será substancialmente idêntica à seqüência endógena intencionada ser reprimida. Esta identidade mínima será tipica- mente maior que cerca de 65%, mas uma identidade mais alta pode exercer uma repressão mais eficaz de expressão das seqüências endógenas. Identi- dade substancialmente maior de mais que cerca de 80% são preferidos, en- tretanto cerca de 95% para identidade absoluta são mais preferidos. Como com regulamento anti-sentido, o efeito deve aplicar-se a qualquer outra pro- teína dentro de uma família semelhante de genes que apresentam homolo- gia ou homologia significativa.

Para supressãode sentido, a seqüência introduzida, precisando menos que identidade absoluta, não precisa também ser de comprimento total, relativo ao produto de transcrição primário ou mRNA completamente processado. Isto pode ser preferido para evitar a produção simultânea de algumas plantas que são sobreexpressadas. Uma identidade mais alta em uma seqüência de comprimento mais curto que total compensa uma se- qüência mais longa, menos idêntica. Além disso, a seqüência introduzida não necessita ter o mesmo padrão de íntron ou de éxon, e a identidade de segmentos de não codificação será igualmente eficaz. Normalmente, uma seqüência das faixas de tamanho acima observadas para regulamento anti- sentido é usada.

Alterações em fenótipos de planta podem ser produzidas espe- cificamente inibindo expressão de um ou mais genes mediante à inibição ou co-supressão de anti-sentido (Patente U. S. N°s 5.190.931, 5.107.065 e 5.283.323, aqui incorporadas por referência na sua íntegra). Um constructo de co-supressão de anti-sentido pode agir como um regulador negativo do- minante de atividade do gene. Embora mutações convencionais possam render regulamento negativo de atividade do gene, estes efeitos são mais provavelmente recessivos. O regulamento negativo dominante disponível com um método transgênico pode ser vantajoso de uma perspectiva de pro- criação. Além disso, a capacidade de restringir a expressão de fenótipo es- pecífico nos tecidos reprodutivos da planta pelo uso de promotores tecido- específicos pode conferir vantagens agronômicas relativo às mutações con- vencionais que podem ter um efeito em todos os tecidos nos quais um gene mutante usualmente é expresso. A pessoa versada na técnica saberá que considerações especi- ais estão associadas com o uso anti-sentido ou tecnologias de co-supressão para reduzir a expressão de genes particulares. Por exemplo, o próprio nível de expressão de genes sentidos ou anti-sentido pode requerer o uso de dife- rentes genes quiméricos que utilizam elementos reguladores diferentes co- nhecidos ao técnico habilitado. Uma vez as plantas transgênicas são obtidas por meio de um dos métodos acima descritos, será necessário triar plantas transgênicas individuais por aquelas que mais eficazmente apresentam o fenótipo desejado. Adequadamente, o técnico habilitado desenvolverá méto- dos para triar números grandes de transformantes. A natureza destas tria- gens em geral será selecionada por razões práticas, e não é uma parte ine- rente da invenção. Por exemplo, pode-se triar procurando alterações na ex- pressão do gene usando anticorpos específicos para o polipeptídeo codifica- do pelo gene sendo suprimido, ou a pessoa pode estabelecer ensaios que especificamente medem a atividade da enzima. Um método preferido será um que permite processar números grandes de amostras rapidamente, uma vez que será esperado que um número grande de transformantes será ne- gativo para o fenótipo desejado.

Toda ou uma parte substancial das moléculas de ácido nucléico da presente invenção também pode ser usada como sondas para genética e fisicamente mapear os genes que eles são uma parte, e como marcadores para características ligadas àqueles genes. Tais informações podem ser úteis na reprodução de planta para desenvolver linhas com fenótipos dese- jados. Por exemplo, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser usadas como marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). Southern blots (Maniatis et al., Molecular Coning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989) Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N. I., aqui incorporado por referência na sua íntegra) de DNA genômico de planta reduzido por restrição pode ser sonda- do com os fragmentos de ácido nucléico da presente invenção. Os padrões de banda resultantes podem ser então submetidos a análises genéticas usando programas de computação como MapMaker (Lander et al., Geno- mics 1:174-181 (1987), aqui incorporado por referência na sua íntegra) para construir um mapa genético. Além disso, os fragmentos de ácido nucléico da presente invenção podem ser usados para sondar Southern blots contendo DNAs genômicos tratados com endonuclease de restrição de um grupo de indivíduos representando o pai e progênie de uma estrutura genética defini- da. A segregação dos polimorfismos de DNA é observada e usada para cal- cular a posição da seqüência de nucleotídeos da presente invenção previa- mente no mapa genético obtido usando esta população (Botstein et al., Am. J Hum. Genet. 32:314-331 (1980), aqui incorporado por referência na sua íntegra). A produção e uso de sondas derivadas de gene de planta para o uso em mapa genético são é descrita em Bematzky e Tanksley, Plant Mol.

Biol. Repórter 4:37-41 (1986), aqui incorporado por referência na sua ínte- gra. Numerosas publicações descrevem mapa genético de clones de cDNA específicos usando a metodologia esboçada acima ou variações desta. Por exemplo, populações de cruza entre si de F2, populações de cruza anterior, populações fortuitamente acasaladas, linhas quase isogênicas, germeplas- mas exóticos e outros grupos de indivíduos podem ser usados para o mape- amento. Tais metodologias são bem conhecidas para aquele habilitado na técnica.

Sondas de ácido nucléico derivadas das moléculas de ácido nu- cléico da presente invenção também podem ser usadas para mapeamento físico (isto é, colocação de seqüências em mapas físicos; ver Hoheisel et al., Em: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, e referências nele citadas).

Em outra modalidade, sondas de ácido nucléico derivadas das moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser usadas em mapeamento de hibridização de fluorescência direta in situ (FISH) (Trask, Trends Genet. 7:149-154 (1991), aqui incorporado por referência na sua ín- tegra). Embora métodos atuais de mapeamento de FISH favorecem o uso de clones grandes (vários a várias centenas de KB; ver Laan et al., Genome Res. 5:13-20 (1995), aqui incorporado por referência na sua íntegra), melho- rias na sensibilidade pode permitir desempenho do mapeamento de FISH usando sondas mais curtas.

Uma variedade de métodos com base em amplificação de ácido nucléico de mapeamento genético e físico pode ser realizada usando as moléculas de nucleotídeo da presente invenção. Exemplos incluem amplifi- cação alelo-específica (Kazazian et al., J. Lab. Clin. Med. 11:95-96 (1989), aqui incorporado por referência na sua íntegra), polimorfismo de fragmentos ampliados por PCR (CAPS; Sheffield et al., Genomics 16:325-332 (1993), aqui incorporado por referência na sua íntegra), ligação alelo-específica (Landegren et al., Science 241:1077-1080 (1988) aqui incorporado por refe- rência na sua íntegra), reações de extensão de nucleotídeo (Sokolov et al., Nucleic Acid Res. 18:3671 (1990) aqui incorporado por referência na sua íntegra), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al., Nat. Genet. 7:22-28 (1997) aqui incorporado por referência na sua íntegra) e Happy Mapping (Dear e Cook, Nucleic Res Acid.. 17:6795-6807 (1989) aqui incorporado por referên- cia na sua íntegra). Para estes métodos, a seqüência de um fragmento de ácido nucléico é usada para designar e produzir pares de iniciadores para o uso na reação de amplificação ou em reações de extensão de iniciador. A designação de tais iniciadores é bem conhecida para aqueles versados na técnica. Em métodos que empregam mapa genético com base em PCR, pode ser necessário identificar as diferenças da seqüência de DNA entre os pais da cruza de mapeamento na região que corresponde à seqüência de nucleotídeo. Porém, em geral não são necessários métodos de mapeamen- to.

As moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção podem encontrar uso na identificação de perda de fenótipos mutantes de função de uma planta, devido a uma mutação em um ou mais genes endó- genos que codificam o polipeptídeo semelhante a ANT. Isto ou pode ser rea- lizado usando protocolos de rompimento de gene alvejado ou identificando mutantes específicos para estes genes contidos em uma população de plantas portando mutações em todos os possíveis genes (Ballinger e Ben- zer, Proc. Natl. Acad Sei U. S. A. 86:9402-9406 (1989); Koes et al., Proc.

Natl. Acad Sei U. S. A. 92:8149-8153 (1995); Bensen et al., Plant Cell 7:75- 84 (1995) todos destes são aqui incorporados por referência na sua íntegra). O método anterior pode ser realizado de dois modos. Primeiro, podem ser usados segmentos curtos das moléculas de ácido nucléico da presente in- venção em protocolos de reação de cadeia de polimerase junto com um ini- ciador de seqüência de marcador de mutação em DNAs preparados de uma população de plantas em que transposons mutantes ou algum outro ele- mento de DNA que causa mutação foi introduzido. A amplificação de um fragmento de DNA específico com estes iniciadores indica a inserção do elemento marcador de mutação dentro ou próximo dos polipeptídeos seme- lhantes a ANT de codificação do gene da planta. Alternativamente, as molé- cuias de ácido nucléico da presente invenção podem ser usadas como uma sonda de hibridização contra produtos de amplificação de PCR gerados da população de mutação usando o iniciador de seqüência de marcação de mutação junto com um iniciador de sítio genômico arbitrário, como aquele para um adaptador sintético fixo ao sítio da enzima de restrição. Com qual- quer método, uma planta contendo uma mutação no gene endógeno que codifica os polipeptídeos semelhantes a ANT pode ser identificada e obtida.

Esta planta mutante pode ser então usada para determinar ou confirmar a função natural dos polipeptídeos semelhantes a ANT aqui descritos. Métodos para introduzir mutações genéticas em genes de planta são bem conhecidos. Por exemplo, sementes ou outro material de planta podem ser tratadas com uma substância química mutagênica, de acordo com técnicas padrão. Tais substâncias químicas incluem, mas não são limi- tadas a, o seguinte: sulfato de dietila, imina de etileno, metanossulfonato de etila e N-nitroso-N-etiluréia. Altemativamente, radiação de ionização de fon- tes como, por exemplo, raios X ou raios gama, pode ser usada. Mutantes desejados são selecionados analisando a massa de semente aumentada, conteúdo de óleo e outras propriedades. Métodos para determinar expressão de gene, mesmo expressão de um gene de um transgene introduzido é comum na técnica, e inclui RT- PCR, Nerthern Blots e Taqman®. Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é descrito como um método de detectar e quantificar a presença de um DNA ou molécula de RNA/cDNA e é descrito completamente nas instru- ções fornecidas pelo fabricante, e no seu website. Brevemente, no caso de uma seqüência genômica uma sonda de oligonucleotídeo de FRET é desi- gnada que sobrepõe o flanqueamento genômico e insere junção de DNA. A

sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na seqüência de DNA inserida e um na seqüência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Hibridização da sonda de FRET resulta na divisão e liberação da metade fluorescente longe da metade de extinção na sonda de FRET. Um sinal fluorescente indica a pre- sença do DNA inserido de fraqueamento/transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas.

POLIPEPTÍDEOS SUBSTANCIALMENTE PURIFICADOS A presente invenção, em outro aspecto, fornece um polipeptídeo substancialmente purificado a seqüência de aminoácidos deste compreen- dendo na direção do término N para o término C dois domínios de ligação de DNA de AP2 seguidos no término C por uma subseqüência de aminoácidos selecionada de grupo que consiste em Xaa-Ser-Ser-Ser-Arg-Glu, Xaa-Ser- Asn-Ser-Arg-Glu e Asn-Ser-Ser-Ser-Arg-Asn, preferivelmente selecionado do grupo que consiste em Ser-Ser-Leu-Xaa-Thr-Ser-Xaa-Ser-Ser-Ser-Arg- Glu, Ser-Ser-Leu-Xaa-Pro-Ser-Xaa-Ser-Asn-Ser-Arg-Glu, Ser-Ser-Leu-Xaa- Thr-Ser-Xaa-Ser-Asn-Ser-Arg-Glu e Ser-Leu-Xaa-Asn-Ser-Ser-Ser-Arg-Asn em que Xaa é um resíduo de aminoácido tendo uma corrente lateral alifática e selecionado do grupo que consiste em Gly, Ala, Vai, Leu e lie. Em uma modalidade particular preferida, o polipeptídeo substancialmente purificado da presente invenção também compreende uma segunda subseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Leu-Gly-Phe-Ser-Leu- Ser, Leu-Gly-Phe-Ser-Leu-Thr, Met-Por-Leu-Lys-Ser-Asp-Gly-Ser, Met-Pro- Leu-Arg-Ser-Asp-Gly-Ser, Met-Pro-lle-Lys-Ser-Asp-Gly-Ser, Pro-Lys-Leu- Glu-Asp-Phe e Pro-Lys-Val-Glu-Asp-Phe. Em alguns grupos de aminoáci- dos, as correntes laterais são descritas como tendo correntes laterais alifáti- cas. As correntes laterais alifáticas são designadas freqüentemente como uma corrente lateral de compostos químicos orgânicos nas quais os átomos de carbono estão ligados em cadeias abertas, por exemplo Gly, Ala, Vai, Leu e lie. A presente invenção, em outro aspecto, fornece um polipeptídeo substancialmente purificado, a seqüência de aminoácidos deste é codificada por uma primeira seqüência de nucleotídeos que especificamente hibrida sob condições rigorosas com o complemento de uma segunda seqüência de nucleotídeos selecionado dos grupos que consiste em SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 8, 10 e 12. A presente invenção, em outro aspecto, fornece um polipeptídeo substancialmente purificado, a seqüência de aminoácidos deste é codificada por uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 70% ou 75% de identidade de se- qüência, mais preferivelmente pelo menos 80% ou 85% de identidade de seqüência, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 98% de identida- de de seqüência com um membro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1,3, 5, 7, 8, 10 e 12. A presente invenção, em outro aspecto, fornece um polipeptídeo substancialmente purificado a seqüência de aminoácidos deste tendo peio menos 60% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 70% ou 75% de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 80% ou 85% de identidade de seqüência, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de seqüência, e mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade de seqüência a uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidos por síntese química, ou mais preferivelmente, através de expressão em um hospedeiro adequado bacteriano ou eucariótico. Métodos adequados para expressão são descritos por Sambrook, et al., (Em: Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Har- bor, Nova Iorque, (1989)), aqui incorporado por referência na sua íntegra), ou textos semelhantes.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem incluir polipeptídeo de fusão. Um polipeptídeo que compreende um ou mais regiões de polipeptídeos adicionais não derivadas daquele polipeptídeo é um poli- peptídeo de "fusão". Tais moléculas podem ser derivadas para conter car- boidrato ou outras metades (como hemocianina de lapa, etc.). O polipeptí- deo de fusão da presente invenção é produzido preferivelmente por meios recombinantes.

As moléculas de polipeptídeo da presente invenção também po- dem incluir polipeptídeos codificados por toda ou uma parte substancial das seqüências de codificação do polipeptídeo expostas em SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 8, 10 e 12 ou complemento destas ou, fragmentos ou fusões destas em que os resíduos de aminoácidos conservadores, dispensáveis ou não perti- nentes foram adicionados, substituídos ou excluídos. Um exemplo de um tal homólogo é o polipeptídeo homólogo (ou proteína) de espécies diferentes.

Um tal homólogo pode ser obtido por qualquer de uma variedade de méto- dos. Por exemplo, como indicado acima, uma ou mais das seqüências divul- gadas (toda ou uma parte substancial de umas seqüências de codificação de polipeptídeo selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 8, 10 e 12 e complemento destas) serão usadas para definir um par de inici- adores que pode ser usado para isolar as moléculas de ácido nucléico de codificação homóloga de quaisquer espécies desejadas. Tais moléculas po- dem ser expressas para render homólogos através de meios recombinantes.

Outro aspecto da presente invenção fornece anticorpos, antíge- no de moléculas de ligação de cadeia simples, ou outras proteínas que es- pecificamente ligam aos polipeptídeos da presente invenção e os seus ho- mólogos, fusões ou fragmentos. Tais anticorpos podem ser usados quantita- tiva ou qualitativamente para detectar os polipeptídeos da presente inven- ção. Como aqui usado, é dito um anticorpo "especificamente liga" a uma molécula de polipeptídeo da presente invenção se tal ligação não for compe- titivamente inibida pela presença de moléculas não relacionadas. Os anti- corpos que especificamente ligam os polipeptídeos da presente invenção podem ser policlonais ou monoclonais, e pode compreender imunoglobulinas intactas, ou partes de ligação a antígenos de fragmentos de imunoglobulinas (como (F(ab’), F(ab’)2), ou imunoglobulinas de cadeia simples produzíveis, por exemplo, por meios recombinantes). É compreendido que os médicos estão familiarizados com os materiais de recurso padrão que descrevem as condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento dos anticorpos (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Em Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1988), a íntegra deste está aqui incorporada por referência).

Moléculas de ácido nucléico que codificam toda ou parte dos polipeptídeos semelhantes a ANT da presente invenção podem ser expres- sas, através de meios recombinantes, para render polipeptídeos que podem por sua vez ser usados para eliciar anticorpos que são capazes de ligar aos polipeptídeos expressos. Pode ser desejável derivar os anticorpos obtidos, por exemplo, com um grupo de ligando (como biotina) ou um grupo marca- dor detectável (como um grupo fluorescente, um radioisótopo ou uma enzi- ma). Tais anticorpos podem ser isolados em imunoensaios para aquele poli- peptídeo. Em uma modalidade preferida, tais anticorpos podem ser usados para triar bibliotecas de expressão de cDNA para isolar clones de cDNA de comprimento total de genes semelhantes a ANT (Lemer, Adv. immunol. 36: 1 (1984); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1989)).

CONSTRUÇÕES DE DNA RECOMBINANTE DE PLANTAS E PLANTAS

TRANSFORMADAS

As moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção podem encontrar uso particular na criação de plantas transgênicas em que polipeptídeos de ANT e semelhantes a ANT são sobre-expressos. A sobre expressão de polipeptídeos de ANT ou semelhantes a ANT em uma planta pode aumentar o tamanho dos órgãos da planta, por exemplo, sementes, frutas, raízes, tubérculos, talos, bolbos e folhas, e assim conduz a melhoria no rendimento da planta. Também pode ser desejável produzir uma planta pela sobre expressão de polipeptídeos de ANT ou semelhantes a ANT que são de tamanho e/ou de altura maior(es), por exemplo aumentado(s). Será particularmente desejável aumentar o tamanho da semente, proteínas da semente, óleos da semente e carboidrato da semente em plantas de colheita nas quais a semente é diretamente usada para consumo animal ou humano ou para propósitos industriais. Exemplos de tais colheitas incluem soja, ca- nola, colza, algodão (caroços de algodão), girassol, e grãos como milho, tri- go, arroz, centeio e similares. O termo "planta transgênica" significa uma planta que contém um ácido nucléico exógeno que pode ser derivado das mesmas espécies de planta ou de uma espécie diferente. Por "exógeno" é significado que uma molécula de ácido nucléico origina de fora da planta que a molécula de ácido nucléico é introduzida. Uma molécula de ácido nucléico exógena pode ter uma seqüência de nucleotídeos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Alguém habilitado na técnica entende que uma molécula de ácido nucléico exógena pode ser uma molécula de ácido nucléico heteróloga deri- vada de uma espécie de planta diferente que a planta na qual a molécula de ácido nucléico é introduzida ou pode ser uma molécula de ácido nucléico derivada da mesma espécie de planta como a planta na qual ela é introduzi- da. Célula vegetal, como usado aqui, inclui sem limitação, culturas de suspensão de sementes, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos. O termo "genoma" como é aplicado às células vegetais abrange não só o DNA cromossômico encontrado dentro do grão, mas o DNA da or- ganela encontrado dentro dos componentes subcelulares da célula. Os DNAs da presente invenção introduzidos em células vegetais podem ser, portanto, ou cromossomicamente integrados ou localizar na organela. O termo "genoma" como se aplica às bactérias abrange tanto cromossomo e plasmídeos dentro de uma célula hospedeira bacteriana. DNAs de codifica- ção da presente invenção introduzidos em células hospedeiras bacterianas podem ser portanto ou cromossomicamente integrados ou localizados no plasmídeo.

Moléculas de ácido nucléico exógenas podem ser transferidas em uma célula vegetal pelo uso de um constructo de DNA recombinante (ou vetor) designado para um tal propósito.

A presente invenção também fornece um constructo de DNA recombinante de planta (ou vetor) para plantas transgênicas produtoras, em que o constructo de DNA recombinante de planta (ou vetor) compreende uma seqüência de nucleotídeos estrutural codificando um polipeptídeo se- melhante a ANT. O método que é bem conhecido àquele habilitado na técni- ca para preparar o constructo de DNA recombinante de planta (ou vetor) da presente invenção pode ser usado. Este método inclui técnicas de DNA re- combinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Tais técnicas são descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1989); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, N. I. (1989).

Um constructo de DNA recombinante de planta (ou vetor) da presente invenção contém uma seqüência de nucleotídeos estrutural codifi- cando um polipeptídeo semelhante a ANT da presente invenção e opera- velmente ligado às seqüências reguladoras ou eiementos de controle. As seqüências reguladoras exemplares incluem mas não são limitadas a pro- motores, seqüências de líder de transferência, íntrons, seqüências de 3' não transferidas. Os promotores podem ser constitutivos, induzíveis ou os pro- motores tecido-específicos.

Um constructo de DNA recombinante de planta (ou vetor) da presente invenção compreenderá um marcador selecionável que tipicamente confere um fenótipo selecionável em células vegetais. Também podem ser usados marcadores selecionáveis para selecionar plantas ou células vege- tais que contêm as moléculas de ácido nucléico exógena codificando os po- lipeptídeos da presente invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência antibiótica (por exemplo, canamicina, bleomicina de G418, higromicina, etc.), ou resistência a herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limita- dos a, um neo gene (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 799:183-188 (1985)) cujos codifica a resistência de canamicina e pode ser selecionado por usar canamicina, G418, etc.; um gene de barra que codifica a resistência de bia- lafos; um gene de sintase de EPSP mutante (Hinchee et al., Bio/Technology 6:915-922 (1988)) que codifica resistência de glifosato; um gene de nitrilase que confere resistência à bromoxinila (Stalker et al., J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (1988)); um gene de sintase de acetolactato mutante (ALS) que confere resistência a imidazolinona ou sulfoniluréia (Pedido de Patente Europeu 154.204 (11 de setembro de 1985)); e um gene de DHFR resistente a metotrexato (Thillet et al., J. Biol. Chem. 263:12500-12508 (1988)).

Um constructo de DNA recombinante de planta (vetor) da pre- sente invenção podem também incluir um marcador triável. Os marcadores triáveis podem ser usados para monitorar a expressão. Marcadores triáveis exemplares incluem um gene de β-glicuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405 (1987); Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987)); um gene de local R que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetal (Dellaporta et al., Stadler Symposium 7 7:263-282 (1988)); um gene β- lactamase (Sutcliffe et al., Proc. Nad. Acad. Sei. (U. S. A.) 75:3737-3741 (1978)), um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al., Science 234:856-859 (1986)) um gene de xylE (Zukowsky et al., Proc. Nad. Acad. Sei. (U.S.A) 80:1101-1105 (1983)) que codifica um catecol dioxigenase que pode con- verter catecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikatu et al., Bio/Technol. 8:241-242 (1990)); um gene de tirosinase (Katz et al., J Gen.

Microbiol. 729:2703-2714 (1983)) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa a melanina; uma α-galactosidase transformará um substrato de α-galactose cromogêni- co.

Incluídos dentro dos termos "genes selecionais ou de marcado- res triável" estão também os genes que codificam um marcador secretável cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificar ou selecionar células transformadas. Exemplos incluem marcadores que codificam um an- tígeno secretável que pode ser identificado através da interação de anticor- po, ou mesmo enzimas secretáveis que podem ser cataliticamente detecta- das. As proteínas secretáveis encaixam dentro de várias classes, incluindo proteínas pequenas, difusíveis detectáveis, por exemplo, por ELISA, enzi- mas ativas pequenas em solução extracelular (por exemplo, α-amilase, β- lactamase, fosfinotricina transferase), ou proteínas que são inseridas ou capturadas na parede das células (como proteínas que incluem uma se- qüência líder com aquela encontrada na unidade de expressão de extensão ou PR-S de tabaco). Outros possíveis genes marcadores selecionáveis e/ou tiráveis serão óbvios àqueles de habilidade na técnica.

Além de um marcador selecionável, pode ser desejoso usar um gene repórter. Em alguns exemplos um gene repórter pode ser usado com ou sem um marcador selecionável. Os genes repórteres são genes que não estão tipicamente presentes no organismo ou tecido recipiente e tipicamente codificam proteínas que resultam em alguma alteração fenotípica ou propri- edade enzimática. São fornecidos exemplos de tais genes em K. VVising et al. Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988), que é aqui incorporado por referên- cia. Genes de repórteres preferidos incluem o beta-glucuronidase (GUS) do local de uidA de E. coli, o gene de cloranfenicol acetila transferase de Tn9 de E. coli, a proteína fluorescente verde da água-viva bioluminescente Aequo- rea victoria e os genes de luciferase de vaga-lumes Photinus pyralis. Um ensaio para detectar a expressão de gene repórter pode ser então executa- do em um momento adequado após o dito gene ser introduzido nas células recipientes. Um tal ensaio preferido requer o uso do gene que codifica beta- glucuronidase (GUS) do local de uidA de E. coli como descrito por Jefferson et al., (Biochem. Soc. Trans. 15, 17-19 (1987)) para identificar as células transformadas.

Na preparação dos constructos de DNA recombinante (vetores) da presente invenção, os vários componentes da construção ou seus frag- mentos normalmente serão inseridos dentro de um vetor de clonagem con- veniente, por exemplo, um plasmídeo que é capaz de replicação em um hospedeiro bacteriano, por exemplo, E. coli. Numerosos vetores de clona- gem existem que foram descritos na literatura, muitos destes estão comerci- almente disponíveis. Após cada clonagem, o vetor de clonagem com a in- serção desejada pode ser isolado e submetido à manipulação adicional, como digestão de restrição, inserção de novos fragmentos ou nucleotídeos, ligação, deleção, mutação, ressecção, etc. assim para trabalhar os compo- nentes da seqüência desejada. Uma vez que o constructo foi concluído, ele pode ser transferido então para um vetor apropriado para manipulação adi- cional conforme a maneira de transformação da célula hospedeira.

Um constructo de DNA recombinante de planta (vetor) da pre- sente invenção pode também incluir um peptídeo de trânsito de cloroplasto para alvejar o polipeptídeo da presente invenção no plastídeo. O termo "plastídeo" significa a classe de organelas de célula vegetal que incluem amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, elaioplastos, eoplastos, etioplastos, leucoplastos e proplastídeos. Estas organelas são de reprodução própria, e contém o que é comumente denominado o "genoma de cloroplasto," uma molécula de DNA circular que varia em tamanho de cerca de 120 a cerca de 217 kb, dependendo das espécies de planta, e que usualmente contém uma região de repetição invertida. Muitos polipeptídeos localizados em plastídeo são expressos de genes nucleares como precursores e são alvejados no plastídeo por um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) que é removido durante as etapas de importação. Exemplos de tais polipeptídeo de cloro- plasto incluem a subunidade pequena de ribulose-1,5-bifosfato carboxilase (ssRUBISCO, SSU), sintase de 5-enolpiruvatosiquimato-3-fosfato (EPSPS), ferredoxina, ferredoxina oxidorreductase, a proteína I e a proteína I de com- plexo suave de colheita e tiorredoxina F. Foi demonstrado que polipeptídeos de não-plastídeo podem ser alvejados no cloroplasto por uso de fusões de polipeptídeos com um CTP e que uma seqüência de CTP é suficiente para alvejar um polipeptídeo no plastídeo. Aquele habilitado na técnica também reconhecerá vários outros constructos de DNA recombinante que podem ser feitos utilizando a funcionalidade de um peptídeo de trânsito de plastídeo particular para importar a enzima no plastídeo da célula vegetal dependendo da especificidade de tecido do promotor. A presente invenção também fornece uma planta transgênica compreendendo em seu genoma um ácido nucléico isolado que compreen- de: (A) uma seqüência de não codificação que funciona na célula para cau- sar a produção de uma molécula de mRNA; que está operavelmente ligada a (B) uma seqüência de nucleotídeos estrutural codificando um polipeptídeo semelhante a ANT desta invenção; que está operavelmente ligada a (C) uma seqüência de 3' não transferido que funciona na dita célula para causar ter- minação da transcrição. Preferivelmente, a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo semelhante a ANT tem pelo menos 60% de identidade de se- qüência, pelo menos 65% de identidade de seqüência, pelo menos 70% de identidade de seqüência ou pelo menos 75% de identidade de seqüência a um membro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9, 11 e 13. Mais preferivelmente, a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo semelhante a ANT tem pelo menos 80% de identidade de seqüência, pelo menos 85% de identidade de seqüência ou pelo menos 90% de identidade de seqüência a um membro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9, 11 e 13. Até mesmo mais preferivelmente, a seqüência de aminoácidos do o polipeptídeo semelhante a ANT tem pelo menos 95% ou 98% de identidade de seqüência a um membro selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9, 11 e 13. Preferivelmente, a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo semelhante a ANT é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9, 11 e 13. O polipeptídeo acima des- crito também pode ter uma das seqüências de expostas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9, 11 e 13 com substituições de aminoácido conservadoras.

As plantas transgênicas da presente invenção preferivelmente foram incorporadas no seu genoma ou transformadas nos seus genomas de cloroplasto ou de plastídeo uma molécula de ácido nucléico exógena (ou "transgene"), que compreende uma seqüência de nucleotídeos estrutural que codifica pelo menos um polipeptídeo semelhante a ANT tendo uma se- qüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9, 11 e 13. As plantas transgênicas são também significadas compreender progênie (descendente, descendência, etc.) de qualquer gera- ção de uma tal planta transgênica. Uma semente de qualquer geração de todas tais plantas transgênicas em que a dita semente compreende uma seqüência de DNA codificando o polipeptídeo semelhante a ANT da pre- sente invenção também é um aspecto importante da invenção.

Em uma modalidade, as plantas transgênicas da presente in- venção terão tamanho aumentado das sementes, frutas, raízes, tubérculos, talos, bolbos e folhas devido à sobreexpressão de uma molécula de ácido nucléico exógena codificando um polipeptídeo semelhante a ANT. Em uma modalidade preferida, as plantas transgênicas da presente invenção terão tamanho aumentado das sementes, frutas, raízes e tubérculos. Em uma mo- dalidade mais preferida, as plantas transgênicas da presente invenção terão tamanho aumentado das sementes e frutas. Em uma modalidade particular- mente preferida, as plantas transgênicas da presente invenção terão tama- nho aumentado das sementes e proporcionalmente teores aumentados de proteínas de semente, óleos de semente ou carboidrato de semente. O termo "tamanho aumentou", como aqui usado em referência a um órgão (por exemplo, semente, raiz, broto, talo, etc.) da planta transgênica da presente invenção, significa que o órgão tem um volume ou peso seco significativamente maior ou ambos quando comparado ao volume ou peso seco do mesmo órgão de uma planta do tipo selvagem correspondente. É reconhecido que pode haver variação natural no tamanho de um órgão de umas espécies de planta particulares. Porém, o órgão de tamanho aumenta- do da planta transgênica da presente invenção pode ser identificado sub- metendo à amostra uma população de órgãos e determinando se a distribui- ção normal dos tamanhos de órgão é maior, em média, que a distribuição normal dos tamanhos do órgão de uma planta do tipo selvagem. O volume ou peso seco de um órgão é, em média, usualmente pelo menos 5% maior, 10% maior, 30% maior, 50% maior, 75% maior, mais usualmente pelo me- nos 100% maior e mais usualmente pelo menos 200% maior que nas espé- cies de planta do tipo selvagens correspondentes. O constructo de DNA da presente invenção pode ser introduzido no genoma de um hospedeiro de planta desejado por uma variedade de téc- nicas de transformação convencionais que são bem conhecidas àquele ha- bilitado na técnica. Os métodos preferidos de transformação de células ou tecidos vegetais são o método de transformação mediada por Agrobacterium e a biolísticas ou método de transformação mediada por disparo de partícu- las. Vetores de transformação de planta adequados para o propósito de transformação mediada por Agrobacterium incluem aqueles derivados de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, como também aqueles descri- tos, por exemplo, por Herrera-Estrella et al., Nature 303:209 (1983); Bevan, Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721 (1984); Klee et al., Bio-technology 3(7): 637-642 (1985); e publicação EPO 120.516. Além dos vetores de transfor- mação de planta derivados dos plasmídeos de Ti ou de indução de raiz (Ri) de Agrobacterium, métodos alternativos podem ser usados para inserir os constructos de DNA desta invenção em células vegetais. Tais métodos po- dem envolver, mas não são limitados a, por exemplo, o uso de lipossomas, eletroporação, substâncias químicas que aumentam absorção de DNA livre, liberação de DNA livre por bombardeio de microprojetil e transformação usando vírus ou pólen.

Um vetor de expressão de plasmídeo adequado para a introdu- ção de um ácido nucléico codificando um polipeptídeo semelhante a ANT em monocotiledôneas usando eletroporação ou transformação mediada por dis- paro de partículas é composta do seguinte: um promotor que é constitutivo ou tecido-específico; um íntron que fornece um sítio de junção para facilitar a expressão do gene, como o íntron de Hsp70 (Publicação do PCT W093/19189); e uma seqüência de 3' de poliadenilação como a seqüência de 3' de neopalina sintase (NOS 3’; Fraiey et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 80: 4803-4807(1983)). Este cassete de expressão pode ser montado em réplicons de cópia alta adequados para a produção de quantidades grandes de DNA.

Um exemplo de um vetor de cassete de plasmídeo Ti para transformação de planta é pMON-17227. Este vetor é descrito na Publicação do PCT WO 92/04449, aqui incorporado por referência na sua íntegra, e contém um gene que codifica uma enzima que confere resistência de glifo- sato (denominado CP4) que é um gene marcador de excelente seleção para muitas plantas. O gene é fundido com o peptídeo de trânsito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis (CTP2) e expresso do promotor de FMV como nele descrito. Certas partes de vetores de pMON aqui descritos (isto é, nas figuras) têm elementos descritos na dita publicação do PCT. Todos os veto- res de transformação incluem uma borda esquerda (LB), borda direita (RB), orf-7, p-NOS, NOS 3' e um marcador selecionável, além de outro elemento requerido para propagação em bactérias, inserção no DNA genômico da planta e propagação em calo e plantas maduras.

Quando números adequados de células (ou protoplastos) con- tendo a molécula de ácido nucléico exógena codificando um polipeptídeo semelhante a ANT for obtidos, as células (ou protoplastos) podem ser culti- vadas para regenerar dentro de plantas inteiras. Tais técnicas de regenera- ção contam com a manipulação de certos fito-hormônios em um meio de desenvolvimento de cultura de tecido, tipicamente contando com um marca- dor de biocida e/ou herbicida que foi introduzido junto com as seqüências de nucleotídeos desejadas. A escolha da metodologia para a etapa de regene- ração não é crítica, com protocolos adequados sendo disponíveis para hos- pedeiros de Leguminosas (alfafa, soja, trevo, etc.), Umbelíferas (cenoura, aipo, pastinaca), Crucíferas (repolho, rabanete, canola/colza, etc.), Cucurbi- táceas (melões e pepino), Gramíneas (trigo, cevada, arroz, milho, etc.), So- lanáceas (batata, tabaco, tomate, pimentas), várias colheitas florais, como girassol e árvores contendo nozes, como amêndoas, cajueiros, nozes e pe- cãs. Por exemplo, ver Ammirato et al., Handbook of Plant Cell Culture - Crop Species. Macmillan Publ. Co. (1984); Shimamoto et al., Nature 338:274-276 (1989); Fromm, UCLA Symposium on Molecular Strategies for Crop Impro- vement, 16-22 de abril de 1990. Keystone, CO (1990); Vasil et al., Bio/Technology 8:429-434 (1990); Vasil et al., Bio/Technology 10:667-674 (1992); Hayashimoto, Plant Physiol. 93:857-863 (1990); e Datta et al., Bio- technology 8:736-740 (1990). A regeneração vegetal de protoplastos cultiva- dos é descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nova Iorque, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração também pode ser obtida deste de calo de planta, explantes, órgãos, ou partes. Tais técnicas de rege- neração são descritas, em geral, em Klee et al., Ann. Rev. Plant Phys. 38:467-486 (1987).

Uma planta transgênica formada usando métodos de transfor- mação de Agrobacterium tipicamente contém um único gene exógeno em um cromossomo. Tais plantas transgênicas podem ser denominadas como sendo heterozigotas para o gene exógeno adicionado. Mais preferido é uma planta transgênica que é homozigota para o gene exógeno adicionado; isto é, uma planta transgênica que contém dois genes exógenos adicionados, um gene no mesmo local em cada cromossomo de um par de cromossomos.

Uma planta transgênica homozigoto pode ser obtida acasalando sexual- mente (fertilização cruzada contínua) uma planta transgênica segregante contendo um único gene exógeno, germinando alguma da semente produzi- da e analisando as plantas resultantes produzidas quanto ao gene exógeno de interesse. Uma explicação de o que Agrobacterium é, e como chegou a ser usado na técnica pode ser visto em Box 21.1, página, 1108, no texto Bi- ochemistry and Molecular Biology of Plants, editores Buchanan, Gruissem e Jones, American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD (ISBN 0- 943088-39-9). O desenvolvimento ou regeneração das plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucléico exógena codificando um polipeptídeo de interesse é bem conhecido na técnica. Preferivelmente, as plantas rege- neradas são polinizadas entre si para fornecer plantas transgênicas homozi- góticas, como acima debatido. Do contrário, o pólen obtido das plantas re- generadas é cruzado com as plantas desenvolvidas de sementes de linha- gens agronomicamente importantes. Inversamente, o pólen de plantas des- tas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção que contém um polipeptídeo se- melhante a ANT desejado é cultivada usando métodos bem conhecidos a alguém versado na técnica.

As plantas que podem ser feitas ter tamanho aumentado de ór- gãos da planta pela prática da presente invenção incluem, mas não são li- mitadas a, Acácia, alfafa, aneto, maçã, abricó, alcachofra, rúcula, aspargos, abacate, banana, cevada, feijões, beterraba, amora-preta, mirtilo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cantalupo, cenoura, mandioca, couve- flor, aipo, cereja, coentro, cítrico, clementinas, café, milho, algodão, pepino, pinheiro de Douglas, berinjela, endívia, escarola, eucalipto, funcho, figos, cabaça, uva, toranja, espécie de melão pequeno e doce ("honey dew"), jica- ma, kiwi, alface, alho-poró, limão, lima, pinheiro de Loblolly, manga, melão, cogumelo, noz, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental, ma- mão, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, pinheiro, abacaxi, musa, ameixa, romã, álamo, batata, abóbora, marmelo, "radiata pine", chicória, rabanete, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinheiro do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba-açucareira, cana-de-açúcar, girassol, batata-doce, avelã, mexerica, chá, tabaco, tomate, relva, uma videi- ra, melancia, trigo, inhames e abobrinha.

Os órgãos vegetais (por exemplo, semente) obtidos das plantas transgênicas da presente invenção podem ser analisados de acordo com procedimentos bem conhecidos para identificar órgãos com característica desejada. O tamanho aumentado pode ser determinado pesando os órgãos (por exemplo, semente) ou através de inspeção visual. O teor de proteína é convenientemente medido pelo método de Bradford et al., Anal. Biochem. 72: 248 (1976). O teor de óleo pode ser determinado usando espectroscopia de NIR ou procedimentos padrão como cromatografia gasosa. A presente invenção também fornece partes das plantas trans- gênicas da presente invenção. Partes de planta, sem limitação, incluem se- mente, endosperma, óvulo e pólen. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a parte de planta é uma semente. A presente invenção também fornece método para gerar uma planta transgênica tendo tamanho aumentado de um ou mais órgãos da planta, o método também compreendendo as etapas de a) introduzir no ge- noma da planta uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende nas direções de 5' para 3’ i) um promotor que funciona nas células da dita planta, o dito promotor operavelmente ligado a; ii) uma seqüência de nucleo- tídeos estrutural codificando um polipeptídeo semelhante a ANT a seqüência de aminoácidos deste é substancialmente idêntica a um membro seleciona- do do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13, a dita seqüên- cia de nucleotídeos estrutural operavelmente ligada a; iii) uma seqüência de nucleotídeos de 3' não transferida que funciona nas ditas células da dita planta para causar terminação de transcrição; b) obter células vegetais transformadas contendo a seqüência de nucleotídeos da etapa (a); e c) re- generar as ditas células vegetais transformadas em uma planta transforma- da em que o dito polipeptídeo semelhante a ANT é sobreexpresso.

As sementes maiores, ou sementes com características dife- rentes que as normais (isto é, amido, açúcar, ou óleo aumentado ou dimi- nuído) de plantas podem ser usados para melhorar a eficiência de muitos processos em instalações industriais. Por exemplo, etanol pode ser produzi- do de milho ou outro grão de amido. O grão é moído primeiro em farinha e é depois emplastado com água para formar um mingau. Enzimas são adicio- nadas ao mingau para converter o amido no açúcar simples, dextrose. Amô- nia também é adicionada para o controle de pH e como um nutriente para o fermento. O mingau é processado em uma temperatura alta, etapa de cozi- mento para reduzir os níveis de bactéria antes da fermentação. O mingau é esfriado e transferido para as fermentadoras onde o fermento é adicionado e a conversão de açúcar em etanol e dióxido de carbono começa. Após fer- mentação, a "cerveja" resultante é transferida para destilação onde o etanol é separado da "destilaria" residual. O etanol é concentrado para prova 190 usando destilação convencional e depois é desidratado a cerca de prova 200 em um sistema de peneira molecular. Após este etanol anidro ser misturado com cerca de 5% de desnaturante e ele está pronto para ser enviado para terminais de gasolina ou varejistas. O processo acima é conhecido como "moagem a seco", também há um processo chamado "moagem a úmido." Sementes maiores, ou sementes com mais amido, podem ser esperadas render um rendimento maior por semente de etanol que as sementes con- vencionais.

Os Estados Unidos e o resto do mundo usam milho principal- mente como alimento de gado. 67% da produção de milho mundial em 1997 foram consumidos como alimento para animais. Nos Estados Unidos, o mi- lho representa 86% do grão usado como alimento. Milho de entalhe é o tipo comercial mais importante de milho cultivado nos Estados Unidos. Predomi- nantemente amarelo ou branco, o grão de milho entalhe forma um entalhe na coroa do grão na maturidade. Outros tipos comerciais principais de milho incluem: milho de pederneira, milho doce e pipoca. Milhos de especialidade cultivados comercialmente nos Estados Unidos incluem milho céreo, milho de teor de amilose alto, milho de teor de óleo alto e milho de teor de lisina alto. O milho ou outra semente produzida como parte da presente invenção pode ser usado como milho alimentício, e pode ser esperado conter valor mais líquido por semente que a semente convencional, não transgênica.

Os exemplos a seguir são fornecidos para elucidar melhor a prá- tica da presente invenção e não devem ser interpretados de forma alguma como limitação do escopo da presente invenção. Aqueles versados na técni- ca reconhecerão que várias modificações, mutilações, etc., podem ser feitas nos métodos e genes aqui descritos embora não divergindo do espírito e escopo da presente invenção. Nos exemplos a seguir as referências ao ban- co de dados de propriedade e bibliotecas de propriedade, por exemplo, de clones de DNA, descrevem bancos de dados e bibliotecas privados disponí- veis aos inventores de Monsanto Biotechnology LLC. EXEMPLO 1 Este exemplo ilustra como os clones de cDNA codificando poli- peptídeos semelhantes a ANT de soja foram identificados e isolados.

Para identificar genes semelhantes a ANT de soja em bancos de dados de propriedade, uma análise de semelhança usando o software de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), aqui incorporado por referência na sua íntegra) foi exe- cutado. A seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis (g1244708) foi usada como uma dúvida para procurar e alinhar bancos de dados de DNA de soja que foram transferidos em todas as seis estruturas de leitura, usando o algoritmo de TBLASTN fornecido pelo NCBI. Tal análise de semelhança dos bancos de dados de propriedade resultou na identificação de numerosos contíguos de ESTs e de cDNA tendo valor E tão alto quanto 8,00E-92, ou uma contagem de P tão alto quanto 337, com o alinhamento predominantemente limitado ao domínio de ligação de DNA de AP2.

Para determinar se os clones identificados compreendem se- qüências de codificação que codificam os homólogos do ANT de Arabidop- sis, todos os hits foram submetidos à montagem de contíguos usando o al- goritmo de Montagem de GCG fornecido por Incyte Genomics, Inc., (Paio Alto, CA) que resultou na formação de 36 contíguos para 100 hits superio- res. Sete clones, LIB3242-515-P1-J1-C1, LIB3242-362-Q1-JI-B1, LIB3242- 345-Q1-J1-F1, LIB3209-010-Q1-BI-B7, LIB3242-690-P1-J1-E6, LIB3139- 020-P1-N1-D12 e 701124935H1, cada um contendo um códon de início de ATG putativo e cada um representando um dos sete contíguos superiores oi_>m respeito a semelhança ao ANT de Arabidopsis, foram escolhidos para seqüenciação de inserção de comprimento total. O alinhamento subse- qüente das seqüências de comprimento total obtidas com o polipeptídeo de ANT de Arabidopsis mostrou que eles compartilham pouca semelhança com o ANT de Arabidopsis fora do domínio de ligação de DNA de AP2, sugerindo que aquelas seqüências não são provavelmente seqüências de codificação de polipeptídeos semelhantes a ANT.

Considerando o fato os genes contendo domínio de ligação de DNA de AP2 representam uma família grande de genes de planta com o domínio de ligação de DNA de AP2 altamente conservado, seria improvável que a seqüência de codificação de polipeptídeos semelhantes a ANT) pu- desse ser identificada fielmente através da pesquisa de BLAST convencional por hits superiores. Isto pode explicar por que os hits de BLAST superiores na comparação da seqüência padrão acima pode não ser seqüências de codificação de polipeptídeos semelhantes a ANT. Os inventores da presente invenção prognosticaram que os domínios funcionais (ativação de transcri- ção) são provável residir nas seqüências de flanqueamento e a semelhança das seqüências em tais regiões com a ANT de Arabidopsis pode ser espera- da para genes que executam funções semelhantes.

Com base na suposição, foram analisados todos os hits com um valor de E abaixo de 1E-7 para buscar por semelhança das seqüências para o término N do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis antes dos dois domínios de ligação de DNA de AP2. Três seqüências (ESTs) foram identificadas, que classificaram 45°, 61° e 66°, respectivamente, na lista de BLAST, todas três seqüências mostrando semelhança moderada (valor E variando de 2.00E-15 a 4,00E-10) para a seqüência do término N antes dos dois domínios de liga- ção de DNA de AP2 do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis. Duas destas três seqüências foram subsequentemente ligadas uma à outra usando análi- se de contíguos de seqüência. Uma segunda rodada de BLAST foi executa- da usando ESTs identificados como dúvidas, que resultou na identificação de dois DNAs potencialmente de comprimento total (contendo um início de transferência de ATG putativo), a saber LIB3242-100-Q1-J1-E2 (plasmídeo CPR67663) e LIB3242-078-P1-J1-F10 (plasmídeo CPR67626). Quando bi- bliotecas de cDNA forem preparadas com poli-dT como um iniciador, o inici- ador fica na extremidade de 3' do mRNA. Transcriptase reversa usa este poli-dT como um iniciador e estende um polinucleotídeo de DNA (freqüente- mente chamado um cDNA ou cópia do DNA) usando o mRNA como um mo- delo. Freqüentemente, a transcriptase reversa não estende o polinucleotídeo de DNA novo o comprimento inteiro do mRNA, resultando em cópias trans- critas. Um modo para encontrar clones de comprimento totais putativos é procurar o ATG putativo (o AUG), o sítio de início de transferência provável.

As inserções inteiras de CPR67663 e CPR67626 foram seqüen- ciadas e as seqüências de comprimento total deste dois cDNAs foram no- meadas como GmANTI (SEQ ID NO: 1) e GmANT2 (SEQ ID NO: 3), res- pectivamente. Foram transferidos GmANTI e GmANT2 em seqüências de aminoácido (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4) usando o código genético pa- drão, como mostrado na Listagem de Seqüências. A pesquisa do domínio de proteína de Pfam mostrou que o polipeptídeo de GmANTI e GmANT2 cada um contém dois domínios de ligação de DNA de AP2 típicos.

Três observações principais foram feitas quando GmANTI, GmANT2 transferidos e os hits de BLAST superiores convencionais descri- tos acima foram alinhados com ANT de Arabidopsis. Primeiro, o dois domí- nios de ligação de DNA de AP2 dos polipeptídeos de GmANT2 e GmANTI compartilham homologias até melhores com o polipeptídeo de ANT de Ara- bidopsis que os hits superiores com o polipeptídeo de ANT de Arabidopsis, sugerindo que GmANTI e GmANT2 podem ter atividade semelhante a ANT.

Segundo, pela comparação das sequências de ANT, polipeptídeos de GmANT2 e GmANTI, quatro segmentos altamente conservados foram iden- tificados no término N antes dos domínios de ligação de DNA de AP2 (Figura 1), sugerindo que estas regiões podem representar alguns papéis funcionais.

Além disso, eles podem ser usados como uma assinatura na identificação de outros homólogos de ANT de outras plantas. Terceiro, as seqüências de término C dos polipeptídeos de GmANTI e GmANT2 após os domínios de ligação de DNA de AP2 contêm pequena, se houver, homologia àquela do ANT mas eles compartilham segmentos conservados (Figura 1) entre si, su- gerindo que aquelas partes das seqüências não só podem executar função adicional ou distinguível do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis, mas tam- bém podem ser usadas para identificar genes semelhantes que do contrário seriam perdidos se o término C dos domínios de ligação de DNA de AP2 do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis fossem usados como seqüência de dú- vida. Esta região do término C distingue as novas seqüências reivindicadas na presente invenção do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis e podem ser usadas por alguém versado na técnica para identificação adicional das ditas seqüências relacionadas com esta presente invenção. Para um exemplo de como as bibliotecas de cDNA usadas neste exemplo foram construídas, veja o Exemplo 6. EXEMPLO 2 Este exemplo ilustra como os genes semelhantes a ANT de ar- roz foram identificados e como um clone de cDNA codificando um polipeptí- deo semelhante a ANT de arroz foi isolado. O término N de 297 resíduos de aminoácidos do polipeptídeo de GmANTI (297 aminoácidos do término N da SEQ ID NO: 2) que correspon- de à região de seqüência de aminoácidos antes dos domínios de ligação de DNA de AP2 (às vezes se referido aqui como "GmANT com domínios de ligação de AP2 excluídos"), foi usado como a seqüência de dúvida para rea- lizar a análise de semelhança de bancos de dados de arroz de propriedade, usando procedimentos semelhantes como descrito no Exemplo 1. Seis con- tíguos de BAC de arroz foram identificados conter estruturas de leitura abertas potenciais com valores de E que variam de 5e-17 a 9e-07. Este seis contíguos foram derivados de dois sítios cromossômicos. Comparando as estruturas de leitura abertas que codificam os polipeptídeos semelhantes a ANT, foi observado que os seis contíguos identificados podem ser repre- sentados através de dois contíguos OJ000103_04.0303.C9 e 0J000315_30.0419.C7, respectivamente, uma vez que cinco do seis contí- guos todos contêm uma estrutura de leitura aberta que codifica o mesmo polipeptídeo semelhante a ANT. Ao usar o término C de 200 resíduos de aminoácido de GmANTi após os domínios de ligação de DNA de AP2 como a seqüência de dúvida na análise de semelhança de bancos de dados de arroz de propriedade, os mesmo seis contíguos também foram identificados.

Porém, quando o término C de 200 resíduos de aminoácido do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis após os domínios de ligação de DNA de AP2 foram usados como a seqüência de dúvida, o seis contíguos de BAC de arroz não foram identificados. Uma combinação de algoritmos de GenScan (Burge e Karlin, J. Mol. Biol. 268: 78-94 (1997), aqui incorporado por referência na sua íntegra) e GenMark (Lukashin e Borodovsky, Nucleic Acid Res. 26: 1107- 1115 (1998), aqui incorporado por referência na sua íntegra) prognosticaram uma estrutura de leitura aberta (ORF) de cada um dos dois contíguos de BAC de arroz. O software de GeneMark.hmm (versão 2.2) foi usado para prognosticar os genes/éxons. Os éxons prognosticados de 0J000103_04.0303.C9 codificam um polipeptídeo de 540 resíduos de ami- noácido e a seqüência de codificação foi designada como OsANTI, e os éxons prognosticados de 0J000315_30.0419.C7 (SEQ ID NO: 7) codificam um polipeptídeo de 669 resíduos de aminoácido e a seqüência de codifica- ção é designada como OsANT2 (SEQ ID NO: 8). RT-PCR foi executada para isolar o cDNA de comprimento total que pode ter sido transcrito do último gene prognosticado OsANTI. Dois ini- ciadores, GAGCGTGTGCATGGTTGGTG (pOsANT1-10) (SEQ ID NO: 23) e CTCGAGGCATCTGTCCAGGCTGCAAAAAC (pOsANT1-2) (SEQ ID NO: 24) foram designados por clonagem de RT-PCR, onde pOsANT1-10 trata a calor a -8 ascendente ao começo da estrutura de leitura aberta predita e pO- sANT1-2 trata a calor na parada da estrutura de leitura aberta predita. RNAs de arroz total foram isolados de raízes, folhas e panículas, e foram submeti- dos à síntese de cDNA monofilamentar usando transcriptase reversa de Su- perscript II (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), usando as con- dições recomendadas pelo fabricante. Os cDNAs de arroz sintetizados foram então usados como o modelo para amplificação de PCR usando os iniciado- res gene-específico pOsANT1-10 e pOsANT1-2 e a Polimerase de DNA de Taq de Alta Fidelidade de Platina (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Condições de ciclização de PCR foram como segue: 94°C, 40 segun- dos, seguidos por 30 ciclos de 94°C, 25 segundos; 55°C, 30 segundos e 68°C, 2 minutos 30 segundos. O produto de amplificação foi verificado e pu- rificado através de eletroforese em gel de agarose. O cDNA de ANT de ar- roz, nomeado como OsANTI, foi ampliado da panícula de RNAs arroz, mas não daqueles de raízes e folhas, sugerindo expressão diferencial de tecido do gene. O cDNA de OsANTI purificado foi então clonado em vetor de TA (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), e um clone livre de erro de PCR foi identificado através de seqüenciação (técnicas de seqüenciação para isto e outros exemplos são descritos no exemplo 23). A região de codificação (SEQ ID NO: 5) de OsANTI é 1926 pb que codifica um polipeptídeo (SEQ ID NO: 6) de 641 resíduos de aminoácido. Comparação da seqüência mostrou divergências múltiplas na estrutura do gene do OsANTI autêntico do prog- nosticado. Análise de seqüência de polipeptídeo mostra que o polipeptídeo de OsANTI compartilha homologia alta com ANT, polipeptídeo de GmANTI e GmANT2 nos domínios de ligação de DNA de AP2, compartilha segmen- tos conservados no término N, e compartilha segmentos conservados com o polipeptídeo de GmANTI e GmANT2, mas não com o polipeptídeo de ANT, no término C. Para um exemplo de como as bibliotecas de cDNA usadas neste exemplo foram construídas, veja o Exemplo 6. EXEMPLO 3 Este exemplo ilustra como os clones de cDNA de algodão codifi- cando o polipeptídeo semelhante a ANT foram identificados e isolados.

Para identificar o clone de cDNA de algodão codificando o poli- peptídeo semelhante a ANT, a seqüência de 297 aminoácidos no término N de GmANTI foi usada como a seqüência de dúvida para pesquisar os ban- cos de dados de algodão de propriedade empregando uma análise de se- melhança usando o software de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), aqui incorporado por refe- rência na sua íntegra) (técnicas semelhantes foram empregadas como no Exemplo 1). Estes bancos de dados incluíram seqüências de EST de algo- dão. Três clones de cDNA de propriedade, foram identificados LIB3582-058- P1-K1-E4, LÍB3829-001 -Q1-K6-E4 e LÍB3582-030-P1-K1-D12, como os úni- cos hits que mostraram homologia apropriada, com contagens de E = 4e-12, 3e-11 e 1e-05, respectivamente. Os primeiros dois clones foram parciais, enquanto o terceiro, LIB3582-030-P1-K1-D12, pareceu ser um clone de comprimento cheio. Esta determinação foi feita pesquisando o códon de iní- cio, AUG, o códon de início putativo só estava presente no clone LIB3582- 030-P1-K1-D12. A seqüência de comprimento total foi determinada como no exemplo 1. A seqüenciação confirmou que a SEQ ID NO: 10 é um cDNA de comprimento total que compartilha homologia com o polipeptídeo de ANT de Arabidopsis (Figura 1 e 2) tanto dentro quanto fora dos domínios de ligação de DNA de AP2. Este gene foi nomeado GhANTI (Figura 2; SEQ ID NO: 10). GhANTI (SEQ ID NO: 10) é de 1758 pb no comprimento, codificando um polipeptídeo (SEQ ID NO: 11) de 585 resíduos de aminoácido. Para um exemplo de como as bibliotecas de cDNA usadas neste exemplo foram construídas, veja o Exemplo 6. EXEMPLO 4 Este exemplo ilustra como as seqüências de nucleotídeos que codificam polipeptídeo semelhante a ANT de milho foram identificadas.

Acreditava-se por parte dos inventores que usando genes se- melhantes a ANT de monocotiledôneas em vez de suas contrapartes de di- cotiledôneas para pesquisar seqüências semelhantes a ANT em outras mo- nocotiledôneas poderia conduzir a combinações melhores uma vez que a divergência evolutiva seria esperada que fosse menos significativa. O

OsANTI de arroz com seu domínio de ligação de DNA de AP2 excluído (SEQ ID N° 6; OsANT1-AP2 é equivalente aos aminoácidos 1-288 e 457-642 juntos) foi usado em vez do GmANTI usado no exemplo 3. A pesquisa foi feita empregando uma análise de semelhança usando o software de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), aqui incorporado por referência na sua íntegra) de bancos de dados de propriedade (pesquisa foi semelhante àquela feita no exemplo 1). Uma tal pesquisa identificada, além de um número de seqüências de DNA genômi- cas parciais, um clone de cDNA, LIB3245-486-P1-K1-D7, com um valor de E de 1e-05. A inserção de comprimento totai deste cione de cDNA (plasmídeo CPR82516) foi seqüenciada e designada como ZmANU (SEQ ID NO: 12). A análise de seqüência indica que é uma seqüência de codificação parcial que codifica o término C dos 255 resíduos de aminoácido de um polipeptídeo semelhante a ANT de milho (SEQ ID NO: 13), compartilhando perto de 60% de identidade de seqüência com o polipeptídeo de OsANTI (ver Tabela 1).

Para um exemplo de como as bibliotecas de cDNA usadas neste exemplo foram construídas, veja o Exemplo 6. EXEMPLO 5 COMPARAÇÃO DE SEQÜÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS DE ANT E SEME- LHANTES A ANT O dados na Tabela 1 representam um cálculo da porcentagem de identidade de seqüência das seqüências de aminoácidos expostas em SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 11 e 13 e polipeptídeo de ANT de Arabidopsis (gi1244708). Os alinhamentos de seqüência e cálculos de porcentagem de identidade de seqüência foram executados usando Gap no WISCONSIN PACKAGE versão 10.0-UNIX de Genetics Computer Group, Inc. com base no método de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)) usan- do o conjunto de parâmetros predefinidos para comparação em pares (Gap Creation Penalty = 8; Gap Extension Penalty = 2). Tabela 1 mostra que as seqüências de aminoácidos do polipeptídeo semelhante a ANT da presente invenção tiveram menos de 60% de identidade de seqüência do que o poli- peptídeo de ANT de Arabidopsis. O dados na Tabela 2 representam um cálculo da porcentagem de identidade de seqüência das seqüências de nucleotídeos expostas em SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 8, 10, e 12 e ANT de Arabidopsis (gi 1244707). Os alinhamentos de seqüência e cálculos de porcentagem de identidade foram executados usando Gap no WISCONSIN PACKAGE versão 10.0-UNIX de Genetics Computer Group, Inc. com base no método de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)) usando o conjunto de parâmetros predefinidos para comparação em pares (Gap Creation Penalty = 50; Gap Extension Penalty = 3). Tabela 2 mostra que as seqüências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo semelhante a ANT da presente invenção tive- ram menos de 60% de identidade de seqüência à seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de ANT de Arabidopsis.

A seqüência de aminoácidos deduzida do polipeptídeo de ANT de Arabidopsis (g1244708, Klucher et al., Plant Cell 8:137-153 (1996)) é comparada com aquelas do polipeptídeo semelhante a ANT da presente in- venção, incluindo polipeptídeo de GmANTI e GmANT2 de soja, polipeptídeo de OsANTI e OsANT2 de arroz, polipeptídeo de GhANTI de algodão, e po- lipeptídeo de ZmANTI (seqüência parcial) de milho (Figura 2). O alinha- mento múltiplo foi executado usando o software CLUSTALW versão 1.74 do domínio público (Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994), aqui incorporado por referência na sua íntegra) usando parâmetros predefi- nidos. A Figura 2 mostra que todos os polipeptídeos semelhantes a ANT da presente invenção e o polipeptídeo de ANT de Arabidopsis contêm dois motivos de ligação de DNA altamente conservados (domínios), um lo- calizado a 281-354, o outro a 383-448, com referência ao polipeptídeo de ANT de Arabidopsis. Os 14 resíduos de aminoácido extras do polipeptídeo de OsANT2 dentro do segundo domínio de ligação de DNA de AP2 é prova- velmente um resultado de prognóstico de gene inexato de seqüências ge- nômicas de arroz naquela região. A comparação também identifica várias regiões conservadas fora dos domínios de ligação de DNA de AP2, ambos nos términos N e C. Há pelo menos três regiões (sombreadas) no término N que são altamente conservadas ao longo de todos os polipeptídeos seme- Ihantes a ANT. Também há três regiões conservadas (sombreadas) no tér- mino C, com o polipeptídeo de ANT de Arabidopsis mostrando homologia mínima, especialmente para as primeiras duas regiões. Todas estas se- qüências conservadas fora do domínio de ligação de DNA de AP2 são úni- cas para os genes semelhantes a ANT, sugerindo que elas podem ser im- portantes para a função semelhante a ANT, e podem ser usadas como as seqüências de assinatura na identificação de codificação das seqüências que codificam outros polipeptídeos semelhantes a ANT. A relação relativa (árvore fiiogênica) de GhANTI, ANT, GmANTI, GmANT2, OsANTI e ZmANT 1 é mostrada na Figura 3 (para SEQ ID's, ver figura). O alinhamento múltiplo foi executado primeiro de acordo com o procedimento descrito para a Figura 2 e depois a árvore filogênica foi construída usando o software PHYLIP (Phylogeny Inference Package) ver- são 3.5c desde que: "Felsenstein, J., 1993. PHYLIP versão 3.5c.Distributed by the author. Department of Genetics, University of Washington, Seattle".

Sub-rotinas e parâmetros usados foram: "seqboot" (parâmetro: -D 'Molecular Sequences' -R 100 -J 'Bootsrap'), "protdist" (parâmetro: -P ’ΡΑΜ', -M 'Yes 100'), "kitsch" (parâmetro: -U 'Yes', -P 2.00000, -L 'No' -R 'No' -S 'No' -J 'No' - M 'Yes, 100’ -- 'No') e "consentido" (parâmetro: -R 'Yes').

Pesquisa ampla de genoma sugere que Arabidopsis tenha ape- nas um gene de ANT (g1244708), enquanto inesperadamente arroz apa- rentemente tem dois genes semelhantes a ANT (OsANTI e OsANT2). A Fi- gura 3 mostra que os semelhantes a ANT pareceram divergir entre monoco- tiledôneas e dicotiledôneas e que o GhANTI de algodão não pode ser o ge- ne semelhante a ANT mais próximo daquelas espécies. EXEMPLO 6 Este exemplo ilustra como bibliotecas de cDNA (Tabela 4), que contêm clones de cDNA identificados no Exemplo 1 ao Exemplo 4, foram construídas. A biblioteca de cDNA (LIB3209) é gerada de tecido de flor parci- al a totalmente aberta de cultivo de Asgrow 3244 (Asgrow Seed Company, Des Moines, lowa U. S. A.) de soja. O tecido de flor parcial a totalmente aberta é colhido de plantas desenvolvidas em uma câmara ambiental sob ciclos diurnos de 12 h/noturnos de 12 h. A temperatura diurna é aproxima- damente 29°C e a temperatura noturna é aproximadamente 24°C. Terra é conferida e aguada diariamente para manter as condições de umidade uni- formes. Um total de 3 gramas de tecido de flor é colhido e imediatamente gelado em gelo seco. O tecido colhido é então armazenado a -80°C até pre- paração do RNA. O RNA é purificado do tecido armazenado e a biblioteca de cDNA é construída como descrito no Exemplo 21. A biblioteca de cDNA normalizada (LIB3139) é preparada de cultivo de raízes de Asgrow 3244 de cultivo de soja colhidas de plantas des- envolvidas em um campo. As plantas são desarraigadas e enxaguadas de- pressa em um balde de água. As raízes são então cortadas das plantas, co- locadas imediatamente em tubos de 14 ml de poliestireno e imersas em gelo seco. As amostras de raiz colhidas são então transferidas para um congela- dor a -80°C para armazenamento. Uma primeira amostras de raiz é colhida de 76 plantas no estágio V4; uma segunda amostra de raiz (ca. 28 g), de plantas de 15 dias após florescer (DAF); uma terceira amostra de raiz (ca. 61 g), de plantas de 25 DAF; uma quarta amostra de raiz (ca. 38 g), de plantas de 35 DAF; uma quinta amostra de raiz (ca. 28g), de plantas de 45 DAF; uma sexta amostra de raiz (ca. 22g), de plantas de 55 DAF; uma sétima amostra de raiz (ca. 27g), de plantas de 65 DAF; e uma oitava amostra de raiz (ca. 40g), de plantas de 75 DAF. RNA total (Soy6) é preparado da pri- meira amostra de raiz; o RNA total (Soy25), da segunda amostra de raiz; o RNA total (Soy29), da combinação de quantidades iguais da terceira e quarta amostras de raiz; o RNA total (Soy31), da combinação de quantida- des iguais da quinta e sexta amostras de raiz; e o RNA total (Soy39), da combinação de quantidades iguais da sétima e oitava amostra de raiz. O RNA é purificado do tecido armazenado e quatro bibliotecas de cDNA são construídas como descrito no Exemplo 21. Quantidades iguais de materiais de DNA das quatro bibliotecas de cDNA, na forma DNA bifilamentar, são misturadas e usadas como o material de partida para normalização. DNA de soja genômico biotinilado é usado como o acionador para a reação de nor- malização. DNA de plasmídeo bifilamentar representando aproximadamente 1X106 unidades de formação de colônia é usado como o alvo. DNA de plas- mídeo bifilamentar é isolado usando protocolos padrão. Aproximadamente 4 microgramas do DNA genômico biotinilado são misturados com aproxima- damente 6 microgramas de DNA de plasmídeo bifilamentar e deixado hibri- dar. Híbridos de DNA de plasmídeo genômico são capturados de DNA em Dynabeads M280 Streptavidin (Dynal Biotech, Oslo, Noruega). As dynabe- ads com híbridos capturados são colhidas com um ímã. Os híbridos captu- rados são eluídos em água. Os clones resultantes são submetidos a uma segunda rodada de hibridização idêntica à primeira. A biblioteca de cDNA de SOYMON019 é gerada de tecido de raiz de cultivo de soja Cristalina (USDA Soybean Germplasm Collection, Ur- bana, leinóis U. S. A.) e FT108 (Monsoy, Brasil) (plasma de germe tropical).

As raízes são colhidas das plantas desenvolvidas em uma câmara ambiental sob ciclos diurnos de 12 h/noturnos de 12 h. A temperatura diurna é aproxi- madamente 29°C e a temperatura noturna aproximadamente 24°C. Terra é conferida e aguada diariamente para manter as condições de umidade uni- formes. Aproximadamente 50 g e 56 g de raízes são colhidos de cada um dos cultivos de Cristalina e de FT108 e imediatamente gelados em gelo seco. O tecido colhido é depois armazenado a -80°C até a preparação do RNA. O RNA é purificado do tecido armazenado e a biblioteca de cDNA é construída como descrito no Exemplo 21. A biblioteca de cDNA de SOYMON032 é preparada do tecido de meristema de semente de soja seca reidratada de cultivo de Asgrow A4922 (Asgrow Seed Company, Des Moines, lowa U. S. A.). As sementes de su- perfície esterilizada são germinadas em meio líquido durante 24 horas. O eixo de semente é então submetida à excisão da semente mal de germina- ção, é colocado em meio de cultura de tecido e é incubado durante a noite a 20°C na escuridão. O tecido de suporte é removido do explante antes da colheita. São colhidos aproximadamente 570 mg de tecido e gelados em nitrogênio líquido. O tecido colhido é depois armazenado a -80°C até a pre- paração de RNA. O RNA é purificado do tecido armazenado e a biblioteca de cDNA é construída como descrito no Exemplo 21. A biblioteca de cDNA de SOYMON038 é gerada de sementes secas reidratadas de variedade Asgrow A3237 de soja (Asgrow Seed Com- pany, Des Moines, lowa U. S. A.). Explantes foram preparados para trans- formação após germinação das sementes de superfície esterilizada em meio de tecido sólido. Após 6 dias, 28°C e 18 horas de luz por dia, as sementes germinadas foram submetidas ao choque frio a 4°C durante 24 horas. O te- cido meristêmico e parte da hipocotila são removidos e cotiledônea submeti- do à excisão. O explante preparado foi depois ferido para infecção de Agro- bacterium. Os 2 gramas de tecido colhido são congelados em nitrogênio lí- quido e armazenados a -80°C até preparação de RNA. O RNA é purificado do tecido armazenado e a biblioteca de cDNA é construída como descrito no Exemplo 21. A biblioteca de cDNA de SOYMON037 é gerada de tecido de eixo etiolado e radical de cultivo de soja A3244 (Asgrow Seed Company, Des Moines, lowa U. S. A.). As sementes são plantadas em vermiculita úmi- da, enroladas e mantidas em temperatura ambiente em escuridão compieta até a colheita. Tecido de eixo etiolado e hipocotila é colhido nos dias 2, 3 e 4 pós-plantação. Um total de 1 grama de cada tipo de tecido é colhido nos dias 2, 3 e 4 após plantar e imediatamente gelado em nitrogênio líquido. O tecido colhido é depois armazenado a -80°C até preparação de RNA. O RNA é pu- rificado do tecido armazenado e a biblioteca de cDNA é construída como descrito no Exemplo 21. A biblioteca de cDNA de LIB3582 é gerada de eixo de sementes de 24 dpa (dias pós-antese) colhido de plantas de algodão. A variedade Coker 312 de Gossypium hirsutum é usada para coleta. As sementes são plantadas em bandejas contendo terra de plantar vaso pré-misturada com fertilizantes. As plantas são desenvolvidas em uma estufa em ciclos diurno de 16 h/noturno de 8 h com uma umidade relativa média de ca. 50%. A tem- peratura diurna e noturna são respectivamente 32,2°C e 23,3°C (90°F e 74°F). Os níveis de luz do dia são medidos a 600-1000 mEinsteins/m2. As plantas são diariamente aguadas pela manhã e quando necessário pela tar- de. As plantas recebem 1 ou 2 aplicações de Pix para controlar o desenvol- vimento excessivo. Gorgulhos são removidos das plantas 24 dpa e abertas e os tecidos são divididos para colher as sementes. As sementes colhidas são dissecadas para remover eixo dos outros tecidos. O tecido de eixo colhido é imediatamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C até preparação de RNA total. O RNA é preparado do tecido armazenado e a biblioteca de cDNA é construída como descrito no Exemplo 22. A biblioteca de cDNA de LIB3829 é preparada de tecido de gine- ceu de quadrados 1/3 desenvolvidos (ca. 0.4 cm de broto de flor) colhido de plantas de algodão. A variedade Nucotton33B de Gossypium hirsutum é usada para coleta. As sementes são plantadas em bandejas contendo terra de plantar vaso pré-misturada com fertilizantes. As plantas são desenvolvi- das em uma estufa em ciclos diurnos de 16 h/noturnos de 8 h com uma umi- dade relativa média de ca. 50%. A temperatura diurna e noturna são respec- tivamente 32,2°C e 23,3°C (90°F e 74°F). Os níveis de luz de dia são medi- dos a 600-1000 mEinsteins/m2. As plantas são diariamente aguadas pela manhã e quando necessário peia tarde. As piantas recebem 1 ou 2 aplica- ções de Pix para controlar o desenvolvimento excessivo. Quadrados 1/3 desenvolvidos (ca. 0.4 cm de broto de flor) são colhidos de plantas de algo- dão. Os quadrados colhidos são dissecados para remover gineceu dos ou- tros tecidos. O tecido de gineceu colhido é imediatamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C até preparação de RNA total. O RNA é preparado do tecido armazenado e a biblioteca de cDNA é construída como descrito no Exemplo 22. A biblioteca de cDNA de SATMON012 é gerada de mudas de milho de 2 dias pós-germinação (DK604, Dekalb Genetics, Dekalb, llinóis U. S. A.). As sementes são plantadas em um papel de filtro úmido em uma bandeja tampada que é mantida na escuridão até germinação (um dia). De- pois as bandejas contendo as sementes são transferidas para a estufa e cul- tivadas em ciclos diurno de 15 h/noturno de 9 h até 2 dias pós-germinação. A temperatura diurna é aproximadamente 26,6°C (80°F)e a temperatura no- turna é aproximadamente 21,1°C (70°F). O tecido é colhido quando as mu- das tiverem 2 dias. No estágio de dois dias, o coleorriza é empurrado pela cobertura da semente e a raiz primária (a radícula) é partida em pedaços do coleorriza mas é pouco visível. Também, neste estágio de dois dias, o co- leóptilo está quase emergindo da cobertura da semente. As mudas de 2 dias pós-germinação são depois imersas em nitrogênio líquido e esmagadas. O tecido colhido é armazenado a -80°C até preparação de RNA total. O RNA é purificado do tecido armazenado e a biblioteca de cDNA é construída como descrito no Exemplo 21. EXEMPLO 7 CONSTRUÇÃO DE pMON57913 pMON57913 é um vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium e expressão constitutiva de ANT em Arabidopsis. Para clonar o ANT de Arabidopsis, dois genes iniciadores específicos, ANT-1 e ANT-2, foram elaborados com base na informação de seqüência de ANT (U41339) do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia que faz parte da Bibli- oteca Nacional de Medicina, por sua vez é parte dos Institutos Nacionais de Saúde (NCBI). A seqüência para ANT-1 é CGCGGCGAATTCA- TGAAGTCTTTTTGTGATAATG (SEQ ID NO: 14) que trata a calor no sítio de começo translacional de ANT e introduz um sítio de EcoRI na extremidade de 5’, enquanto a seqüência de ANT-2 é CGCGGCGTCGACGAA- TCAGCCCAAGCAGC (SEQ ID NO: 15) que trata a calor no último códon de ANT e introduz um sítio de Sall na extremidade do iniciador. RT-PCR foi executada para isolar ANT de Arabidopsis. Especificamente, cDNAs foram preparados de RNAs de muda de Arabidopsis jovem com Sobrescrito II transcriptase inversa de SuperScript II usando os procedimentos recomen- dados pelo fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gainthersburg, MD). PCR foi então executada para ampliar o cDNA de ANT usando o cDNA aci- ma preparado como o modelo, e ANT-1 e ANT-2 como os iniciadores. As condições de ciclismo térmico foram como segue: 94°C, 40 segundos, se- guidos por 30 ciclos de 94°C, 25 segundos; 55°C, 30 segundos e 68°C, 2 minutos 30 segundos. O cDNA de ANT ampliado foi purificado por eletrofo- rese em gel, e ligado ao vetor de clonagem de TA usando os procedimentos recomendados pelo fabricante (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli para propagação de plasmídeo (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Manual Laboratory, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989). As células transformadas foram banhadas em meio seletivo apropriado (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Manual Laboratory, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989) e as colô- nias foram marcadas depois horas ou dias. Plasmídeos foram preparados de colônias individuais e a seqüência de inserção completa foi determinada. Várias técnicas de seqüenciação são conhecidas na técnica, incluindo metodologias de seqüenciação com base em fluorescência. Estes métodos têm a capacidade de detecção, automatização e instrumentação necessária para a análise de grandes volumes de dados de seqüência. Atu- almente, o 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div., Foster City, CA) permite a eletroforese e coleta de dados mais rápido.

Com estes tipos de sistemas automatizados, são detectados produtos de reação de seqüência marcados com tintas fluorescentes e os dados introdu- zidos diretamente para o computador, produzindo um cromatograma que é subseqüentemente visto, armazenado e analisado usando os programas de software correspondentes. Estes métodos são conhecidos àqueles versados na técnica e foram descritos e revisados (Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1999), a totalidade deste é aqui incorporada por referência).

Para clonar ANT em um vetor de expressão, a seqüência de co- dificação de ANT de um clone foi liberada do vetor de TA digerindo com EcoRI e Sall. Este segmento de DNA linear foi então religado ao pMON23435 de vetor binário que tinha sido linearizado por EcoRI e Xhol, usando T4 DNA ligase de DNA (BRL/Life Technology, Inc., Gainthersburg, MD). A reação de ligação foi executada de acordo com a instrução do fabri- cante. O plasmídeo resultante foi confirmado por mapeamento de restrição (por exemplo, ver Griffiths et al., A Introduction to Genetic Analysis, 6a Edi- ção, pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W. H. Freeman and Co., Nova Iorque) e seqüenciação. Uma vez que o sítio de clonagem de EcoRI-Xhol no vetor foi clonado por um promotor CAMV e 35S a jusante (5') e marcador de epi- topo (Flag, que codifica o oligo peptídeo DYKDDDK, SIGMA, St Louis) na direção para baixo (3'), o ANT de Arabidopsis neste constructo é desse modo marcado no término C pelo marcador de epitopo Flag e será acionado transcricionalmente pelo promotor CaMV e35S na transformação em Arabi- dopsis. EXEMPLO 8 CONSTRUÇÃO DE pMON57914 pMON57914 foi construído da mesma maneira como para pMON57913 (ver Exemplo 7) exceto que o vetor pMON23435 foi digerido com EcoRI e Sall. Ele assim contém o gene de ANT sem a Flag, sob o con- trole do promotor de e35S para transformação de Arabidopsis e expressão constitutiva. EXEMPLO 9 CONSTRUÇÃO DE pMON57955 pMON57955 é um vetor binário com GmANTI (SEQ ID NO 2) mais a Flag sob o controle do promotor de e35S. üm par de iniciadores de PCR, GnANT1-1 (SEQ ID NO: 16) e GmANTI-2 (SEQ ID NO: 17), foi elabo- rado que trata a calor no começo e parada translacional, respectivamente, com pGmANT1-2 que introduz um sítio de Xhol na extremidade da seqüên- cia de codificação para que uma fusão de dentro da estrutura com a Flag, como descrito no Exemplo 7. Estes dois iniciadores foram usados para am- pliar o GmANTI usando o plasmídeo CPR67663 (ver Exemplo 1) como o modelo. As condições de reação de PCR foram como descrito no Exemplo 7. GmANTI ampliado por PCR foi clonado no vetor de TA, e deste um clone livre de erro foi identificado, usando os procedimentos essencialmente iguais aos descritos no Exemplo 7. Para clonar o gene de GmANTI em um vetor binário para transformação e expressão da planta, o plasmídeo de TA con- tendo GmANTI foi digerido com EcoRI e Xhol, e a inserção foi purificada por eletroforese em gel que foi depois ligado a pMON23450 linearizado pelas mesmas enzimas. EXEMPLO 10 CONSTRUÇÃO DE pMON57925 pMON57925 é um vetor binário com gene de GmANT2 mais a Flag no término C sob o controle do promotor CaMV e35S. Um par de inicia- dores de PCR, GmANT2-1 (Seq ID NO: 18) e GmANT2-2 (SEQ ID NO: 19), foi elaborado que trata a calor no começo e parada translacional, respecti- vamente, com pGmANT2-2 que introduz um sítio de Xhol no término da se- qüência de codificação. Após digestão com a enzima de restrição Xhol, e religação ao plasmídeo apropriado uma fusão dentro da estrutura com a Flag pode ser criada, como descrito no Exemplo 7. Estes dois iniciadores foram usados para ampliar o GmANT2 usando o plasmídeo CPR67626 (ver Exemplo 1) como o modelo. As condições da reação de PCR, o procedi- mento de clonagem de TA e a triagem de clone livre de erro são essencial- mente iguais aos descritos no Exemplo 9. Uma vez um clone livre de erro foi obtido, GmANT2 foi liberado do vetor de TA digerindo com EcoRV e Xhol, seguido por purificação do gel. Para preparar o vetor binário para a clona- gem de GmANT2, pMON34450 foi digerido primeiro com Bglll, seguido pelo tratamento de Kienow para cegar as extremidades e, após inativação da en- zima, também digerindo o plasmídeo com Xhol. O vetor resultante foi ligado ao fragmento de GmANT2 que foi então propagado em E. coli., e um clone correto foi identificado por mapeamento de restrição e seqüenciação. EXEMPLO 11 CONSTRUÇÃO DE pMON57926 pMON57926 é um vetor binário com GmANTI (Figura 1; SEQ ID NO: 2) mais a Flag sob o controle do Arabidopsis o promotor de Napin para semente expressão específica (patente USA 6.281.410, por exemplo, ver Exemplo 2). Para preparar o fragmento de GmANTI, o mesmo vetor de TA contendo GmANTI como descrito no Exemplo 9 foi digerido por EcoRV e Xhol. Para preparar o vetor de expressão para clonagem, pMON57233 ten- do o promotor de Napin e a Flag que flanqueia o sítio de clonagem, foi dige- rido primeiro com Bglll, seguido por tratamento de Kienow para cegar as ex- tremidades; após inativação da enzima de Kienow, o vetor linearizado foi também digerido por Xhol que foi depois purificado e ligado ao fragmento de gene de GmANTI preparado como no Exemplo 9. EXEMPLO 12 CONSTRUÇÃO DE pMON57927 pMON57927 é um vetor binário em que o gene de GmANT2 com a Flag no término C está sob o controle do promotor de Napin para expres- são semente-específica. Essencialmente o mesmo procedimento foi usado na construção como aquele no Exemplo 11, exceto que o plasmídeo de TA contendo GanANT2 do Exemplo 10 foi usado como a fonte de GmANT2. EXEMPLO 13 CONSTRUÇÃO DE pMON57928 pMON57928 é um vetor binário com o gene de ANT de Arabi- dopsis mais a Flag sob o controle do promotor de Napin para expressão se- mente-específica. Para preparar a inserção, o cassete de ANT como descrito no Exemplo 7 foi liberado de pMON57913 digerindo primeiro com EcoRI, seguido por tratamento de Klenow para cegar as extremidades de restrição.

EcoRI cria extremidades de DNA com projeções de 5' de DNA monofila- mentar de 5'. Uma enzima com uma atividade de poiimerização de DNA (como o fragmento de Klenow de DNA polimerase I de E. Coli) pode ser usada para adicionar nucleotídeos para preencher a dita projeção, criando uma extremidade "cega" (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989). O pMON57913 lineari- zado também foi digerido com Sall, e o ANT liberado mais Flag foi purificado por eletroforese em gel. O vetor de expressão binário que contém o promo- tor de Napin foi essencialmente preparado do mesmo modo como para o exemplo 11.0 vetor e a inserção preparados foram ligados por T4 DNA liga- se e a construção foi confirmada através de mapeamento de restrição. EXEMPLO 14 CONSTRUÇÃO DE pMON57930 pMON57930 é um vetor binário em que o gene de ANT mais a Flag está sob o controle do promotor de subunidade pequena RUBISCO, SSU1A, para expressão broto-específica (Patente US 5.498.830). O cassete de ANT foi essencialmente preparado do mesmo modo como no Exemplo 13. O vetor de expressão binário foi pMON57231, que contém o promotor SSU1A, seguido clonando os sítios incluindo Ncol e Sall. PMON57231 foi digerido primeiro com Ncol, seguido por tratamento de Klenow para gerar uma extremidade cega. Após inativação do polimerase de Klenow, o pMON57231 linearizado foi digerido também com Sall, e o vetor resultante foi purificado por eletroforese em gel. O vetor purificado foi então ligado ao cassete de ANT preparado usando procedimentos padrão e direções forne- cidas pelo fabricante como descrito no Exemplo 7. EXEMPLO 15 CONSTRUÇÃO DE pMON57931 pMON57931 é um vetor binário com gene de ANT sozinho (sem a Flag de epitopo, ver Exemplo 14, por exemplo, com Flag) direcionado pelo promotor de pSSUIA para expressão broto-específica em plantas. Para pre- parar a seqüência de codificação de ANT, pMON57914 como descrito no Exemplo 8 foi digerido primeiro por EcoRI, seguido por tratamento com Kle- now para gerar uma extremidade cega; após inativação de Klenow, o plas- mídeo linearizado foi digerido também com Saii. O fragmento de ANT resul- tante foi purificado por eletroforese em gel, e ligado ao pMON57231 que foi linearizado e preparado do mesmo modo como aquele no Exemplo 14. EXEMPLO 16 CONSTRUÇÃO DE pMON57932 pMON57932 é um vetor binário com gene de ANT mais a Flag direcionado por um promotor raiz-específico, o promotor de RB7 de tabaco. O cassete de ANT foi essencialmente preparado do mesmo modo descrito no Exemplo 13. O vetor binário foi preparado como segue: pMON57253, que carrega o promotor de RB7, foi digerido primeiro com Bglll, seguido por tra- tamento de Klenow para cegar a extremidade; o plasmídeo linearizado tam- bém foi digerido por Sall, seguido por purificação em gel. O gene de ANT preparado e o pMON57253 foram ligados e clones selecionados e verifica- dos usando procedimentos padrão como descrito nos exemplos acima. EXEMPLO 17 CONSTRUÇÃO DE pMON57933 pMON57933 é um vetor binário com gene de ANT sozinho dire- cionado pelo promotor de RB7 para expressão raiz-específica. Procedimen- tos idênticos foram usados para a construção como aqueles para o exemplo 16, exceto que o fragmento de ANT foi preparado como descrito no Exemplo 15. EXEMPLO 18 CONSTRUÇÃO DE pMON47934 pMON57934 é um vetor binário em que a seqüência de codifica- ção de polipeptídeo de OsANTI de arroz foi marcada na extremidade 3' com a seqüência de epitopo de Flag e é direcionado pelo promotor de e35S para expressão de planta constitutiva. O cDNA de OsANTI de comprimento total foi clonado primeiro em um vetor de TA por RT-PCR, como descrito no Exemplo 3. O plasmídeo resultante foi depois cortado com EcoRI para liberar a seqüência de codificação de OsANTI, seguido peia purificação do gene de OsANTI através de eletroforese em gel. O pMON23450 de vetor binário foi cortado com EcoRI e depois desfosforilado através de tratamento de CIAP (New England Biolabs, MA), seguido por ligação ao gene de OsANTI prepa- rado e propagação em E. coli usando procedimentos padrão como descrito acima. A líder HSP 70 de petúnia usado neste constructo é descrito na Pa- tente US 5.659.122. EXEMPLO 19 CONSTRUÇÃO DE pMON57988 PMON57988 é um vetor binário para a expressão constitutiva do gene de ANT de Arabidopsis em milho. O promotor é o promotor de actina de arroz, P-ract1, de pMON25455. A construção de pMON57988 tomou du- as etapas: a primeira etapa envolveu a síntese do cassete de expressão de ANT em um vetor intermediário, a segunda a construção do vetor de expres- são binário. Para construir o cassete de expressão, pMON57914, que con- tém o gene de ANT e foi descrito no Exemplo 8, foi digerido primeiro com Smal e EcoRI, seguido por tratamento de Klenow para cegar a extremidade pegajosa gerada por EcoRI. O fragmento de 2330 pb resultante, que incluiu a seqüência de codificação de ANT inteira e o terminador de 3' de E9, foi purificado em gel. Para construir o cassete de expressão de ANT em um vetor intermediário, pMON25455, que contém o promotor de R-act1, ele foi digerido com Smal e Ncol, seguido por tratamento de Klenow para cegar a extremidade gerada por Ncol. O fragmento de vetor resultante, tendo o gene de GUS agora removido, foi purificado em gel e ligado ao fragmento conten- do ANT preparado acima, seguido pela propagação em E. coli. Uma vez que a inserção de ANT poderia ocorrer em ambas as orientações, plasmídeos com a orientação correta onde P-ractl em frente da ANT foram determinados através de mapeamento de restrição. O plasmídeo identificado foi nomeado pMON57989. Para pôr o cassete de expressão de ANT em um vetor binário, o cassete foi liberado de pMON57989 digerindo com Notl, seguido por purifi- cação em gel; a parte binária de pMON36176 também foi gerada digerindo o plasmídeo com Notl, seguido por desfosforilação com CIAP e purificação em gel. O cassete de ANT preparado e o vetor de pMON36176 foram então li- gados e propagados em E. coli. Os plasmídeos foram preparados de colôni- as individuais para análise de restrição, e um clone com configuração de cabeça a cabeça (P-ract1/ΑΛ/Τ. vs. P-35S/Kan) foi selecionado como pMON57988. Este plasmídeo contém sítios de lox que podem ser usados para submeter à excisão o marcador selecionável usando o sistema de cre/lox. EXEMPLO 20 CONSTRUÇÃO DE pMON57991 pMON57991 foi um vetor binário em que o gene de ANT de Ara- bidopsis foi direcionado pelo promotor de POX1 de trigo (também denomi- nado pox1) para expressão intensificada de raiz em plantas. Semelhante- mente como no Exemplo 19, a construção tomou duas etapas: a primeira etapa envolveu a síntese do cassete de expressão de ANT com o promotor de POX1 em um vetor intermediário, a segunda a mobilização do cassete em um vetor binário. Para construir o cassete de expressão, um fragmento de 2330 pb incluindo a seqüência de codificação de ANT inteira e o termina- dor de 3' de E9 foi preparado de pMON57914, como descrito no Exemplo 19. O promotor POX1 foi obtido digerindo pMON36304 com Smal e Ndel, seguido consecutivamente por desfosforilação de enchimento de Klenow, CIAP (fosfotase alcalina intestinal de bezerro) e purificação em gel. Ligação dos fragmentos acima preparados gerou plasmídeo pMON57996, na discri- minação daqueles com uma orientação errada como descrito no Exemplo 19. O cassete de expressão de ANT deste plasmídeo intermediário foi então mobilizado para o de vetor binário pMON36176 usando o mesmo procedi- mento como descrito no Exemplo 19, resultando na construção de pMON57991. EXEMPLO 21 O RNA armazenado usando reagente de Trizol de Life Techno- logies é purificado (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland U.

S. A.), essencialmente como recomendado pelo fabricante. Poli A+ RNA (mRNA) é purificado usando contas de oligo dT magnéticas essencialmente como recomendado pelo fabricante (Dynabeads, Dynal Corporation, Lake Success, Nova Iorque U. S. A.).

Construção de bibliotecas de cDNA de planta é bem conhecida na técnica e várias estratégias de clonagem existem. Vários kits de constru- ção de biblioteca de cDNA estão comercialmente disponíveis. O Su- persSript® Plasmid System for cDNA synthesis and Plasmid Cloning (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland U. S. A.) é usado, seguindo as condições sugeridas pelo fabricante. EXEMPLO 22 Para preparação de RNA, o tecido de algodão armazenado é moído completamente em nitrogênio líquido e depois incubado com uma i solução de SDS alta (cerca de 2,5% em peso de SDS, 0,1 M Tris-HCI (pH

7,5), 2,5 M perclorato de sódio, 0,1% b-mercaptoetanol em volume) e PVPP insolúvel (cerca de 8,5% em peso) durante cerca de 30 minutos em tempe- ratura ambiente. Ácidos nucléicos são depois precipitados após a filtração. O RNA total é isolado do reagente de Trizol usando precipitado de Life Te- * chnologies (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland U. S. A.), essencialmente como recomendado pelo fabricante. Poli A+ RNA (mRNA) é purificado usando contas de oligo dT magnéticas essencialmente como re- comendado pelo fabricante (Dynabeads, Dynal Corporation, Lake Success, Nova Iorque U. S. A.). ) Construção de bibliotecas de cDNA de planta é bem conhecida na técnica e várias estratégias de clonagem existem. Vários kits de constru- ção de biblioteca de cDNA estão comercialmente disponíveis. O Su- persSript® Plasmid System for cDNA synthesis and Plasmid Cloning (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland U. S. A.) é usado, seguindo as condições sugeridas pelo fabricante. EXEMPLO 23 Este exemplo ilustra como biblioteca de BAC de arroz é cons- truída e como são obtidos contíguos de BAC. A biblioteca de BAC de arroz pode ser construída no vetor de pBeloBACH ou semelhante. Vetor de BAC, pBeloBACH, é derivado do plasmídeo de fator F de E. coli endógeno contendo os genes para coniroie rigoroso de número de cópia e origem unidirecional de replicação de DNA.

Adicionalmente, pBeloBAC11 tem três sítios de enzima de restrição únicos (Hind III, Bam Hl e Sph I) situado dentro do gene de LacZ que pode ser usa- do como sítios de clonagem para DNA de planta de tamanho de megabase. índigo, outro vetor de BAC contém sítios de clonagem de Hind III e Eco RI.

Este vetor também contém uma mutação fortuita no gene de LacZ que rende colônias azuis mais escuras. DNA de tamanho de megabase de qualidade alta com rompi- mento mínimo pode ser preparado usando método de protoplasto. O método de protoplasto envolve preparar folhas jovens que têm os pêlos manual- mente raspados com uma lâmina de barbear antes de serem incubadas du- rante quatro a cinco horas com enzimas de degradação de parede celular e depois isolando os protoplastos. DNA de tamanho de megabase podem também ser preparados usando o método nucléico universal desenvolvido por Zhange et al. (PlantJ. 7:175-184 (1995), aqui incorporado por referência na sua íntegra). No método de grãos universais, o tecido fresco ou congela- do é homogeneizado com um misturador ou almofariz e mão de almofariz e depois os grãos são isolados. Uma vez os protoplastos ou grãos são produ- zidos, eles são embebidos em uma matriz de agarose como tampões ou mi- crocontas. A agarose fornece uma matriz de suporte para impedir cisalha- mento do DNA ao mesmo tempo permitindo as enzimas e tampões difundi- rem-se no DNA. O DNA é purificado e manipulado na agarose e permanece estável por mais de um ano a 4°C.

Uma vez o DNA de peso molecular alto foi preparado, ele é fragmentado na faixa de tamanho desejada através de digestão enzima de restrição parcial (por exemplo, Eco RI ou outras enzimas). A vantagem de digestão de enzima de restrição parcial é que nenhuma modificação enzimá- tica adicional das extremidades dos fragmentos de restrição é necessária.

Quatro técnicas comuns que podem ser usadas para alcançar digestão par- cial reprodutível de DNA de tamanho megabase são 1) variar a concentra- ção da enzima de restrição, 2) variar o tempo de incubação com a enzima de restrição, 3) variar a concentração de um cofator de enzima (por exempio, Mg2+) e 4) variar a razão de endonuclease para metilase.

Após DNA de digestão parcial de tamanho de megabase, o DNA é passado em um gel de campo pulsado, e o DNA em uma faixa de tamanho de 100-500 kb é submetido à excisão do gel. Este DNA é ligado ao vetor de BAC ou submetido a uma segunda seleção de tamanho em um gel de cam- po pulsado sob condições atuais diferentes. Estudos previamente informa- ram que duas rodadas de seleção de tamanho podem eliminar fragmentos de DNA pequenos que co-migram com a faixa selecionada no primeiro fraci- onamento de campo de pulso. Uma tal estratégia resulta em um aumento nos tamanhos de inserção e uma distribuição de tamanho de inserção mais uniforme. Um método prático para executar as seleções de tamanho é pri- meiro testar o número de clones/microlitro de ligação e tamanho de inserção do primeiro tamanho selecionado por material. Se os números forem bons (500 a 2000 colônias brancas/microlitro de ligação) e a faixa de tamanho também for boa (50 a 300 kb) então uma segunda seleção de tamanho é prática. Quando executar uma segunda seleção de tamanho espera-se uma diminuição de 80 a 95% no número de clones recombinantes por transfor- mação.

Vinte a duzentos nanogramas do DNA selecionado de tamanho são ligados ao vetor de BAC desfosforilado (razão molar de 10 a 1 em ex- cesso de vetor BAC). A maioria das bibliotecas de BAC usa uma razão molar de 5 a 15:1 (vetor de DNA:BAC selecionado de tamanho).

Transformação é realizada por eletroporação e a eficiência da transformação por BACs é cerca de 40 a 1.500 transformantes de um micro- litro de produto de ligação ou 20 a 1000 transformantes/ng de DNA. A qualidade de uma biblioteca de BAC pode ser avaliada deter- minando a cobertura de genoma de um tamanho de inserção médio de bibli- oteca de BAC, número médio de clones que hibridam com sondas de cópia simples, e teor de DNA de cloroplasto. A determinação do tamanho de inserção médio da biblioteca é avaliada de dois modos. Primeiro, durante a construção da biblioteca cada ligação é testada para determinar o tamanho de inserção médio analisando clones de 20-50 BAC por ligação. O DNA é isolado de clones recombinantes usando um protocolo de mini preparação padrão, digerido com Not I para livrar da inserção do vetor de BAC e então classificado segundo o tamanho usando eletroforese em gel de campo pulsado (Maule, Molecular Biote- chnology 9:107-126 (1998), aqui incorporado por referência na sua íntegra).

Para determinar a cobertura de genoma da biblioteca, ela é tría- da com marcadores de RFLP de cópia simples distribuídos fortuitamente ao longo do genoma por hibridização. Placas de microtitulação contendo clones de BAC são manchadas sobre membranas de Hybond. Bactérias de 48 ou 72 placas são duas vezes manchadas sobre uma membrana resultando em 18.000 a 27.648 clones únicos em cada membrana em ou na orientação 4X4 ou 5X5. Considerando que cada clone está duas vezes presente, falsos po- sitivos são facilmente eliminados e verdadeiros positivos são facilmente re- conhecidos e identificados.

Finalmente, o teor de DNA de cloroplasto na biblioteca de BAC é calculado hibridando três genes de cloroplasto espaçados uniformemente pelo genoma de cloroplasto com a biblioteca em filtros de hibridização de densidade alta. Várias técnicas de seqüenciação são conhecidas na técnica, incluindo metodologias de seqüenciação com base em fluorescência. Estes métodos têm a capacidade de detecção, automatização e de instrumentação necessária para a análise de grandes volumes de dados de seqüência. Atu- almente, o 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div., Foster City, CA) permite a eletroforese e coleta de dados mais rápidos.

Com estes tipos de sistemas automatizados, produtos de reação de seqüên- cia marcados com tinturas fluorescentes são detectados e os dados introdu- zidos diretamente no computador, produzindo um cromatograma que é sub- seqüentemente visto, armazenado e analisado usando os programas de software correspondentes. Estes métodos são conhecidos àqueles versados na técnica e foram descritos e revisados (Birren et al., Genome Analysis: Analysing DNA, 1, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1999), a totalidade deste é aqui incorporada por referência). PHRED é usado para chamar as bases dos arquivos de traços de seqüência. Phred foi desenvolvido na Universidade de Washington e pode ser encontrado visitando o website da universidade, e pesquisando "phred." Citando de seu website, "Phred lê os dados de traço do seqüencia- dor de DNA, chama bases, designa valores de qualidade para as base e es- creve as chamadas de bases e valores de qualidade para arquivos de saída.

Phred pode ler dados de traço de arquivos de SCF e arquivos cromáticos do seqüenciador 373 e 377 do modelo de ABI, detectando automaticamente o formato de arquivo. Após chamar as bases, phred escreve as seqüências em arquivos ou no formato FASTA, no formato adequado para XBAP, for- mato PHD, ou no formato SCF. Os valores de qualidade para as bases são escritos em arquivos de formato FASTA ou o arquivo PHD que pode ser usado pelo programa de montagem de seqüência phrap para aumentar a precisão da seqüência montada." Phred usa métodos de Fourier para exa- minar os quatro traços de base na região circundando cada ponto no con- junto de dados para prognosticar uma série de locais prognosticados unifor- memente espaçados. Ou seja, ele determina onde os picos seriam centra- dos se não houvesse compressões, quedas ou outros fatores que alteram os picos "verdadeiros". Em seguida, PHRED examina cada traço para encontrar os centros dos picos reais ou observados e as áreas destes picos relativas aos seus vizinhos. Os picos são detectados independentemente ao longo de cada um dos quatro traços que tantos picos sobrepõem. Um algoritmo de programação dinâmico é usado para emparelhar os picos observados de- tectados na segunda etapa com os locais de pico prognosticados encontra- dos na primeira etapa.

Após a chamada de base ser concluída, seqüências de contami- nação (E. coli, seqüências de vetor de BAC > 50 bases e vetor de sub- clonagem são removidas e compressões são feitas para o montador. Os contíguos são montados usando CAP3 (Huang, et al., Genomics 46: 37-45 (1997) a totalidade deste é aqui incorporada por referência). EXEMPLO 24 Este exemplo ilustra como são transformadas as céiuias de Agrobacterium e como as células transformadas são cultivadas.

TRANSFORMAÇÃO 1. Submeter à eletroporação 2 μΙ de constructo de DNA em 20 μΙ de células competentes ABI; 2. Pipetar células transformadas diretamente sobre as placas de LB conten- do Espectinomicina (75 pg/ml), Canamicina (50 pg/ml), Cloranfenicol (25 pg/ml). Adicionar 50 μΙ de meio de SOC à placa e esparramar; 3. Incube transformação nas placas a 28°C durante 2 dias (ou pode crescer durante o fim de semana). CULTURA DE CÉLULA ABI: 1. Colher 3 colônias por placa de ABI e cultivar cada uma em 4 ml de meio de LB contendo Espectinomicina (75 pg/ml), Canamicina (50 pg/ml), Clo- ranfenicol (25 pg/ml); 2. Incubar culturas de 4 ml a 28°C, agitar durante 2 dias. (tubos de cultura devem estar em um ângulo). MATÉRIAS-PRIMAS DE GLICEROL & PREPARAÇÕES DE DNA: 1. Produzir três 1 ml de matérias-primas de glicerol de ABI por cultura de 4 ml, usando 500 μΙ de cultura e 500 μΙ de glicerol a 40%. Congelar e armaze- nar a -80°C. 2. Minipreparar a cultura restante (cerca de 2,5 ml), usando um kit e proto- colo de minipreparação de Qiagen (Qiagen Genomics, Inc., Seattle, WA), assegurando adicionar etapa de lavagem de tampão de PB e tampão de EB (10 mM Tris-CI, pH 8,5) a 70°C antes de eluir o DNA de coluna. O volume resultante por amostra de minipreparação deve ser 50 μΙ. CONFIRMAÇÃO DE DIGESTÃO: 1. Usar os mapas de Pollux e de constructo, determinar se os plasmídeos transformaram nas bactérias são, na realidade, os plasmídeos transforma- dos. As enzimas de restrição são selecionadas que as permite encontrar as enzimas apropriadas que cortaram tanto na inserção como no plasmídeo e permitem a discriminação deste plasmídeo específico de alguns ou todos os outros. 2. Digerir 17 μΙ de DNA de minipreparação por digestão, resuitando em um volume de digestão final de 20 μΙ; 3. Passar 20 μΙ de cada digestão em 1% de gel de agarose versus. 1 Kb la- dderde DNA; e 4. Para 2 de 3 clones confirmados, passar placas de LB contendo Especti- nomicina (75 pg/ml), Canamicina (50 pg/ml), Cloranfenicol (25 μg/ml) de matérias-primas de glicerol de ABI e permitir para desenvolver a 28°C du- rante 2 dias (ou pode desenvolver durante o fim de semana). SEQUENCIAÇÃO PARA VERIFICAÇÃO DE INSERÇÃO (COMO UMA AL- TERNATIVA, OU ADIÇÃO, CONFIRMAÇÃO DE DIGESTÃO): 1. Além da confirmação de digestão acima, pode ser possível confirmar a integridade e tipo de inserção através de seqüenciação de DNA. 2. Um iniciador de DNA podem ser selecionado 50-500 pares de base da junção entre o DNA de plasmídeo (cadeia principal) e o DNA de inserção. A dita extremidade 3’ do iniciador pode facear em direção da inserção. 3. Uma reação de seqüenciação de DNA apropriada e leitura em gel de poli- acrilamida ou outra coluna podem ser usadas para determinar a seqüência do DNA. 4. Pode-se especificamente buscar pela seqüência de DNA na junção para determinar se dita seqüência foi apropriada e determinar se a seqüência da dita inserção foi como o investigador esperava. EXEMPLO 25 Plantas de Arabidopsis podem ser transformadas por qualquer um de muitos métodos disponíveis. Por exemplo, as plantas de Arabidopsis podem ser transformadas usando método de transformação In planta atra- vés de infiltração a vácuo (ver, Bechtold et al., In planta Agrobacterium me- diated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR

Acad. Sei. Paris Sciences de Ia vie/life Sciences 316: 1194-1199 (1993), aqui incorporado por referência na sua íntegra). Este exemplo ilustra como são transformadas as plantas de Arabidopsis.

MATERIAL DE PLANTA COMO MATÉRIA-PRIMA E CONDIÇÕES DE

DESENVOLVIMENTO

Preparar os vasos de 6,35 cm (2,5 polegadas) com terra e os cobrir com uma peneira de malha, tendo certeza que a terra não está muito firmemente acumulada e a malha entra em contato com a superfície da terra (isto assegura que as mudas germinantes serão capazes de desenvolver pela malha). Semear as sementes e cobrir com uma cúpula de germinação.

Vernalizar as sementes durante 3-4 dias. Cultivar as plantas sob condições de 16 horas claro / 8 horas escuro a 20-22°C, 70% de umidade. Aguar duas vezes semanalmente, e fertilizar debaixo com 1/2 X (metade da força reco- mendada pelo fabricante) fertilizante de Peters 20-20-20 (de Hummert Inter- national, Earthy City, MO). Adicionar micronutrientes (Elementos de Traço de grão de Dyna de Hummert) (por força total recomendada pelo fabricante) a cada duas semanas. Após cerca de 1-2 semanas, remover a cúpula e des- bastar os vasos a uma ou duas plantas por vaso. Aparar a muda primária, quando desenvolver, para encorajar a formação de muda mais secundária.

Nos 5-7 dias as plantas estarão prontas para infiltração.

PREPARAÇÃO DE Agrobacterium (CULTURAS DE ESCALA PEQUENA E ESCALA GRANDE): Cepa de Agrobacterium ABI é passada sobre uma placa de LB contendo Espectinomicina 100 mg/L, Estreptomicina 100 mg/L, Cloranfenicol 25 mg/L e Canamicina 50 mg/L (denominado SSCK). Dois dias antes da in- filtração, um laço de Agrobacterium é colocado em um tubo contendo 10 ml LB/SSCK e colocado em um agitador na escuridão a 28°C para se desen- volver durante a noite. O dia seguinte, o Agrobacterium é diluído 1:50 entre 400 ml YEP/SSCK e colocado em um agitador a 28°C para desenvolver du- rante 16-20 horas. (Nota: descobriu-se que a taxa de transformação é signi- ficativamente melhor quando LB for usado para o primeiro desenvolvimento durante a noite e YEP for usado para a cultura noturna de escala grande).

INFILTRAÇÃO

Colher as células de Agrobacterium vertendo em uma garrafa de centrífuga de 500 ml e girando a 3500 rpm durante 20-25 minutos. Decantar o sobrenadante. Secar o pélete e depois ressuspender em 25 ml de Meio de Infiltração (MS Basal Salts 0,5%, Vitaminas de B-5 de Gamborg 1%, Sacaro- se 5%, MES 0,5 g/L, pH 5,7) com 0,44 nM de benzilaminopurina (BAP) (10 μΙ de uma matéria-prima de 1,0 mg/L em DMSO por litro) e 0,02% Vac-ln- Stuff (Silwet L-77) de Sementes de Lehle (Round Rock, TX). Os BAP e Si- Iwet L-77 são adicionados frescos no dia de infiltração. Adicionar 200 μΙ de Silwet L-77 e 20 μΙ de BAP (0,5 mg/L de matéria-prima). Usando Meio de Infiltração como sua extinção, tirar o OD6oo de uma diluição 1:10 das sus- pensões de Agrobacterium. Calcular o volume necessário para 400 ml de meio de suspensão/infiltração de Agrobacterium, Οϋβοο = 0,6, para a infiltra- ção a vácuo.

Equação: (volume finaO * (ODmn finaO = Volume necessário para OD6oo final de 0,6 Οϋβοο Colocar a cultura ressuspendida em um recipiente de Rubber- maid dentro de um dessecador a vácuo. Inverter os vasos contendo plantas para ser infiltrado dentro da solução de forma que a planta inteira esteja co- berta, incluindo a roseta, mas não muito da terra seja submersa. Saturar as plantas com água a cada pelo menos 30 min. antes da infiltração. (Isto mantém a terra intumescida na suspensão de Agrobacterium).

Extrair um vácuo de ~ 23-27 em Hg durante 10 min. Liberar de- pressa o vácuo. Brevemente drenar os vasos, colocá-los nos seus lados em uma bandeja forrada com lenço, cobrir a bandeja com uma cúpula para manter a umidade, e retornar para a câmara de desenvolvimento. O dia se- guinte, descobrir os vasos, colocá-los na vertical e remover o lenço. Não ágüe as plantas durante ~ 5 dias. Após os 5 dias terem terminado, deixar as plantas ser aguadas e continuar desenvolver sob as mesmas condições como antes. (As folhas que foram infiltradas podem se degenerar mas a planta deve sobreviver até que a florescência tiver acabado).

COLHEITA E ESTERIZAÇÃO DA SEMENTE

Colocar as plantas em cones, individualmente, usando o Lehle Aracons (Lehle Seeds, Round Rock, TX) cerca de 2 semanas após infiltra- ção. Após toda a semente ter amadurecido e estabelecido (~ 4 semanas pós-infiltração), remover as plantas da água para secar as sementes. Apro- ximadamente 2 semanas mais tarde colher as sementes cortando os ramos abaixo do cone. Limpar a semente usando uma peneira para colher a síliqua e o material de ramificação e deixar a semente passar. Colocar a semente em um envelope ou em tubos cônicos de 15 ml.

Transferir a quantidade desejada das sementes em tubos côni- cos de 15 ml antes da esterilização. Soltar a tampa dos cones e colocá-los de lado em um dessecador a vácuo com um béquer contendo 400 ml de al- vejante Clorox (Clorox Company, Oakland, CA) e 4 ml de Ácido Hidroclórico. (Acrescentar o HCI ao Clorox em uma tampa fumê). Puxar um vácuo apenas para vedar o dessecador, e fechar a sucção (isto é, de modo que o desse- cador esteja ainda sob um vácuo mas o vácuo não esteja ainda sendo dire- tamente puxado) durante 16 h. Após esterilização, liberar o vácuo e colocar os tubos contendo semente em uma tampa estéril (manter as tampas supe- riores soltas de forma que o gás ainda seja liberado).

Colocar em placa ("polvilhar") a semente na placa de seleção contendo MS Basal Salts 4,3 g/L, Gamborg'a B-5 (500 X) 2,0 g/L, Sacarose 10 g/L, MES 0,5 g/L, e 8 g/L Fitagar (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) com Carbenicilina 250 mg/L, Cefotaxima 100 mg/L. Níveis de seleção ou serão Canamicina 60 mg/L, Glifosato 60 μΜ ou Bialafos 10 mg/L.

Uma quantidade muito pequena de semente pode ser tirada da chapa primeiro para conferir contaminação. Se houver contaminação, as sementes re-esterilizadas por ~ 4 horas mais e conferir novamente contami- nação. A segunda esterilização não é usualmente necessária, mas às vezes a semente abriga um contaminante fúngico e são necessárias esterilizações repetidas. (A duração da esterilização em geral é mais curta que 16 horas por causa das taxas de germinação significativamente diminuídas começan- do em 24 h de duração de esterilização). Vedar as placas com película e colocar em um quarto frio para vernalizar durante ~ 2-4 dias. Após as se- mentes serem vernalizadas, colocar em percival com lâmpadas brancas fria.

TRANSFERIR PARA A TERRA

Após 5-10 dias a -26°C e um ciclo de luz 16/8, os transformantes serão visíveis como plantas verdes. Após outras 1-2 semanas, as plantas terão pelo menos um grupo de verdadeiras folhas. Transferir as plantas para a terra, cobrir com uma cúpula de germinação, e mover para uma câmara de desenvolvimento com condições normais de desenvolvimento de Arabidop- sis. Manter coberto até que desenvolvimento novo seja aparente (usual- mente 5-7 dias). EXEMPLO 26 Este exemplo ilustra como a biomassa de broto de plantas de Arabidopsis pode ser aumentada ecotopicamente expressando os genes semelhantes a ANT de colheita em plantas de Arabidopsis transgênicas.

Os genes semelhantes a ANT, GmANTI e Grr\ANT2 que foram identificados e clonados de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1, foram construídos em um vetor binário para expressão transgênica sob o controle do promotor de CaMV e35S, como descrito nos Exemplos 9 e 10, respectivamente. O gene semelhante a ANT de arroz, OsΑΛ/7Ί que foi iden- tificado e clonado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2, foi construído em um vetor binário para expressão transgênica sob o controle do promotor de CaMV e35S, como descrito no Exemplo 18. O gene de ANT de Arabidopsis foi clonado e construído em um vetor binário para a transfor- mação mediada por Agrobacterium e expressão constitutiva de ANT em planta de Arabidopsis sob o controle do promotor de CaMV e35S, como descrito nos Exemplos 7 e 8. Transformação de Agrobacterium com os veto- res construídos acima foi realizada de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 24. Transformação de Arabidopsis e geração subseqüente foram executas de plantas transgênicas como descrito no Exemplo 25.

Sementes de T1 das plantas transgênicas foram semeadas na terra em vaso junto com plantas do tipo selvagem (controle), e foram vernali- zadas durante três dias antes de transferir para uma câmara de desenvolvi- mento. As plantas foram desenvolvidas sob as condições a seguir: a 22°C, 24 horas de luz constante com intensidade clara de 170-200 μηη Einstein m'2s'\ e uma umidade de 70%. As plantas também foram desenvolvidas sob condições de dia curto, com 10 horas de período de luz. As plantas foram esterilizadas duas vezes por semana usando fertilizante Peters 20-20-20 (pela metade da força) de Hummert International, Earth City, MO). As plan- tas foram monitoradas para desenvolvimento vegetativo e reprodutivo. Sob condições de dia longo e dia curto, as plantas transgênicas expressando o ANT de Arabidopsis tiveram vigor vegetativo acima do chão como as plantas de controle do tipo selvagem. Porém, as plantas transgênicas expressando os genes semelhantes a ANT de colheita tiveram desenvolvimento de broto mais vigoroso. Por exemplo, sob condições de desenvolvimento de dia curto, a área da folha das plantas transgênicas expressando o OsANT1 de arroz foi aumentada em 40% no dia 42. EXEMPLO 27 Este exemplo ilustra que a expressão ectópica de ANT de Arabi- dopsis e os genes semelhantes a ANT de colheita em plantas transgênicas de Arabidopsis resultaram em aumento no desenvolvimento e biomassa das raízes.

Estudos anteriores sugeriram que a expressão ectópica do ANT de Arabidopsis não tiveram nenhum efeito no desenvolvimento das raízes das plantas transgênicas (Krizek, Developmental Genetics 25: 224-236 (1999); Y Mizukami e R L Fischer, Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 942-947 (2000); ambos desta são aqui incorporadas por referência na sua íntegra). O dados incluídos aqui sugerem que a expressão ectópica do ANT de Arabidopsis como também outros genes semelhantes a ANT de colheita podem causar aumento no desenvolvimento das raízes.

As plantas transgênicas expressando o ANT de Arabidopsis e aquelas expressando o OsANTI de arroz, ambos direcionados pelo promo- tor de e35S, foram produzidas como descrito no Exemplo 26. Além disso, também foram produzidas plantas transgênicas expressando o ANT direcio- nado pelo promotor raiz-específico, Rb7, como descrito nos Exemplos 16, 24 e 25. As sementes foram colhidas para plantio e análise transgênica adicio- nal. Para preparar as placas para germinação, 3,54 gramas do meio de cul- tura de planta MS (Sigma, St Louis, MO) e 0,5 grama de sacarose foram dis- solvidos em um litro de água deionizada, pH ajustado para 5,8 com KOH, 8 gramas Phytagar (GIBCO) adicionado antes de submeter à autoclave du- rante 21 min, seguido por distribuição das piacas de disco de petri de 9x9 cm quadrados, com 35 ml por placa. Para semear as sementes sobre a placa, as sementes foram esterilizadas em 70% de etanol durante 2 min e depois em 30% de alvejante comercial, 0,01% Triton X-100 durante 3 minutos, se- guido por 4 lavagens em água estéril. As sementes esterilizadas foram pos- tas sobre a placa que foi vernalizada a 4°C durante 3 dias antes de transferir para a câmara de desenvolvimento como descrito no Exemplo 26. As placas foram postas em posição vertical, e a raiz e a taxa de desenvolvimento do broto foram monitoradas diariamente na germinação. Comparação das mu- das transgênicas com o tipo selvagem demonstra que as raízes das plantas transgênicas eram mais longas e maiores, e as folhas aparentemente mais verdes. Por exemplo, no quarto dia após germinação, as raízes das linha- gens transgênicas eram cerca de 20-40% mais longas que o controle do tipo selvagem na mesma placa.

TABELA 5. COMPRIMENTO DA RAIZ DE PLANTAS TRANSGÊNICAS E NORMAIS. ______________________________________________ EXEMPLO 28 .

Este exemplo ilustra que a expressão ectópica de ANT e genes semelhantes a ANT em plantas de Arabidopsis transgênicas pode resultar em tamanho de órgão de flores aumentado.

Plantas transgênicas expressando a ANT de Arabidopsis, como também aquelas expressando a soja GmA/VT1 e GmANT2, tudo direcionado pelo promotor de CaMV e35S, foram produzidos de acordo com os procedi- mentos como descrito no Exemplo 26. Além disso, plantas transgênicas ex- pressando ANT dirigidas pelo promotor de SSU1A também foram produzidas como descrito nos Exemplos 14, 24 e 25. As sementes foram colhidas para avanço da linhagem e análise transgênica adicional. O tamanho dos órgãos florais foi medido e comparado com os das plantas do tipo selvagem. Os resultados mostraram que as plantas transgênicas tinham órgãos florais maiores que as plantas do tipo selvagem. Por exemplo, o tamanho da pétala de plantas transgênicas expressando o GmANTI de soja direcionado pelo promotor de CaMV e35S foi aumentado em até 100% comparado com o das plantas do tipo selvagem, enquanto o tamanho da pétala das plantas trans- gênicas expressando ANT direcionado pelo promotor de SSU1A foi aumen- tado em das 75%. O tamanho dos órgãos florais aumentado pode ser útil na indús- tria de flor, para produzir flores maiores em rosas e outras flores comercial- mente importantes. O tamanho dos órgãos florais aumentado também pode ser importante como flores maiores em algumas plantas leva a sementes e/ou frutos maiores.

TABELA 6. TAMANHO DA PÉTALA EM PLANTAS TRANSGÊNICAS E NORMAIS.

Tamanho da pétala (U) % de aumento WT 13328+/-730 0 GmANTI 27429+/-889 106 EXEMPLO 29 Este exemplo ilustra que a expressão condicional de ANT e a expressão ectópica dos genes semelhantes a ANT de colheita podem re- sultar em tamanho de sementes aumentado.

Plantas transgênicas expressando ANT sob o controle do pro- motor de e35S e o promotor de SSU1A foram produzidas como descrito no Exemplo 28; plantas transgênicas expressando o GmANTI e GmANT2 fo- ram produzidas como descrito no Exemplo 28; plantas transgênicas expres- sando o OsANTI de arroz foram produzidas conforme descrito no Exemplo 26. Em todos os casos, plantas transgênicas com sementes maiores que as do tipo selvagem foram obtidas. Além disso, o fenótipo de semente grande foi transmitido para a próxima geração, pelo menos para as plantas transgê- nicas expressando ANT do promotor de SSU1A que testou-se. Por exemplo, o tamanho de sementes V3 de plantas transgênicas expressando ANT de SSU1A foi aumentado em 27%.

Tamanho de semente aumentado conduz a maior rendimento em muitas plantas de colheita economicamente importantes. O tamanho de semente aumentado é assim um objetivo de engenharia genética e seleção.

TABELA 7. TAMANHO DE SEMENTE EM PLANTAS TRANSGÊNICAS E NORMAIS. EXEMPLO 30 Este exemplo ilustra que a expressão condicional de ANT e os genes semelhantes a ANT de colheita pode aumentar o teor de óleo de se- mente.

As plantas transgênicas expressando a ANT do promotor de Na- pin semente-específico foram produzidas como descrito nos Exemplos 13, 24 e 25. Análise bioquímica das sementes das plantas transgênicas mostrou que o teor de óleo de semente foi aumentado comparado com o controle do tipo selvagem. Por exemplo, o teor de óleo de sementes V3 testado foi au- mentado em 16% quando comparado com o controle do tipo selvagem. O teor de óleo aumentado também é uma medida de rendimento em muitos plantas economicamente importantes. Óleo de soja, milho, canola e de outras plantas são economicamente importantes assim aumentando a quantidade de óleo por semente é vantajoso.

TABELA 8. PORCENTAGEM DE ÓLEO EM SEMENTE DE PLANTAS

TRANSGÊNICA E NORMAL EXEMPLO 31 Este exemplo ilustra que a expressão condicional de ANT e os genes semelhantes a ANT de colheita podem aumentar o rendimento de semente.

Plantas transgênicas expressando o gene de ANT do promotor de Napin semente-específico foram produzidas como descrito nos Exemplos 13, 24 e 25. As plantas transgênicas foram desenvolvidas em condições controladas junto com plantas do tipo selvagem, como descrito no Exemplo 26. As sementes de plantas individuais foram colhidas na maturidade. Análi- se mostra que o peso da semente por planta foi aumentado comparado ao controle do tipo selvagem. Por exemplo, o peso da semente da linhagem de 1A2_V4 foi aumentada em 35% quando comparado ao controle do tipo sel- vagem.

Peso das sementes é uma característica importante da semente em plantas de colheita, uma vez que as plantas que produzem mais se- mente são mais desejáveis que aquelas que produzem menos semente.

TABELA 9. AUMENTO DE RENDIMENTO DA SEMENTE POR ANT DE

TRANSGENE DIRICIONADO PELO PROMOTOR DE NAPIN EXEMPLO 32 Para determinar como a expressão de genes de ANT pode afe- tar as características do milho, o milho foi transformado com o gene de ANT contendo constructos direcionados pelos promotores de actina de arroz e pox-1. O constructo contendo o promotor de actina de arroz era rACT1-ANT é pMON57988 (ver Exemplo 19). O constructo contendo pox1-ANT foi pMON57991 (ver Exemplo 20). Foram produzidas plantas de milho transgê- nicas - por um método de transformação mediada por Agrobacterium. Veto- res abrigando cepas C58 de Agrobacterium desarmadas (ABI) da presente invenção foram usados para todas as experiências. O constructo de DNA é transferido para o Agrobacterium por um método de combinação triparental (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 77:7347-7351). ABI de Agrobacterium em matéria-prima de glicerol é passado no meio de LB sólido suplementado com antibióticos Canamicina (50 mg/L), espectinomicina (100 mg/L), estreptomicina (100 mg/L) e cloranfenicol (25 mg/L) e incubado a 28 °C durante 2 dias. Dois dias antes da inoculação de Agrobacterium, uma colônia da placa de Agrobacterium é apanhada e ino- culada em 25 mL de meio de LB líquido completados com 100 mg/L de cada um de espectinomicina e Canamicina em um frasco de 250 mL. O frasco é colocado durante a noite em um agitador a aproximadamente 150 rpm e 27°C. A cultura de Agrobacterium é então diluída (1 a 5) no mesmo meio líquido e recolocada no agitador. Várias horas depois no final da tarde um dia antes da inoculação, as células de Agrobacterium são giradas a 3500 rpm durante 15 min. O pélete de célula de bactéria é ressuspensa em meio de indução com 200 μΜ de acetosiringona e 50 mg/L de espectinomicina e 25 mg/L de Canamicina e a densidade da célula é ajustada a 0,2 a O.D.66o· A cultura da célula de bactéria (50 mL em cada frasco de 250 mL) é então recolocada no agitador e desenvolvida durante a noite. Na manhã do dia da inoculação, as células de bactéria são giradas e lavadas com meio 1/2MS VI líquido (Tabela 1) suplementado com 200 μΜ de acetosiringona. Após uma rotação a mais, o pélete da célula de bactéria é ressuspensa em Vz meio de MS PL (Tabela 1) com 200 μΜ de acetosiringona (Tabela 1), e a densidade da célula é ajustada em 1,0 a O.D66o para inoculação. Após ressuspensão, o Agrobacterium pode ser armazenado a 4°C durante até 27 dias e usado como desejado.

Os reagentes estão comercialmente disponíveis e podem ser comprados de vários fornecedores (ver, por exemplo Sigma Chemical Cia.

St. Louis, MO).

Os embriões imaturos (1,5-2,0 mm) de LH172 foram isolados de espigas esterilizadas e imergidos na suspensão de células de Agrobacterium em tubos de microcentrifugação de 1,5 mL continuamente durante 15 minu- tos. O tubo é depois repousado durante 5 minutos. Após a suspensão de Agrobacterium ser removida usando uma pipeta de transferência com ponta fina, os embriões são transferidos para o meio de co-cultura padrão (Tabela 1). Os embriões são colocados com o lado de escutelo virado para cima. Os embriões são cultivados em uma incubadora Percival ajustada em 23°C e escuridão aproximadamente de 24 h. SELEÇÃO E REGENERAÇÃO E DESENVOLVIMENTO: Após o co-cultivo, os embriões são transferidos das placas de co-cultura para o meio de indução de calo, LH172 MS (tabela 1) com 50 mg/L de carbenicilina e 100 ou 200 mg/L de paramomicina. As placas são mantidas em um quarto de cultura escuro a 27°C durante aproximadamente 2 semanas. Duas semanas mais tarde, quase todas as partes de calo des- envolvidas individualmente são transferidas para o MS6BAP (Tabela 1) com 250 mg/L de carbenicilina e 100 ou 200 mg/L de paramomicina. As placas são mantidas em um quarto de cultura com 16 h de luz a 27°C durante 5-7 dias. Então, as partes de calo são transferidas para MSOD (Tabela 1) com 250 mg/L de carbenicilina e 100 ou 200 mg/L de paramomicina. Em outras 2 semanas, todas as partes com brotos ou tecido sobrevivente são transferi- das para o mesmo meio em fita-bandejas para desenvolvimento adicional.

Quando as plantinhas alcançam a tampa e têm poucas raízes, elas são transferidas para a terra em vasos de relva em uma câmara de desenvolvimento. Em 7 a 10 dias, elas são transplantadas em vasos 30,48 cm (12 polegadas) e transferidas para a estufa com condições para desen- volvimento normal de planta de milho. EXEMPLO 33 A EXPRESSÃO DE UM GENE DE ANT DE ARABIDOPSIS EXÓGENO EM

PLANTAS DE MILHO

Para expressão de ANT em milho, dois promotores foram usa- dos. Um foi o promotor de actina de arroz largamente constitutivo (patente US 5.641.876), e o outro o promotor de pox-1 de raiz aumentada (Hertig, et al., Plant Molecular Biology 16:171). Ambas os constructos incluíram se- qüência de terminação 3' do gene de E9. O constructo contendo rACT1-ANT é pMON57988 (ver Exemplo 19). O constructo contendo pox1-ANT é pMON57991 (ver Exemplo 20). DNA de cada plasmídeo foram introduzidas em uma cepa de Agrobacterium (ABI) através de eletroporação. As plantas contendo rACT1-ANT (pMON57988) foram nomeadas Abby, e as plantas foram nomeadas com o constructo de pox1-ANT Anny (pMON57991).

Expressão do gene de ANT em folhas de plantas de R0 (estágio V6 - V8) foi analisada usando Taqman para determinar níveis de mRNA. Ta- qman é um sistema de detecção de seqüência em tempo real fornecido por Applied Biosystems. Taqman permite a determinação quantitativa em tempo real de níveis de produto de PCR presente. Neste caso específico usou-se iniciadores para detectar a região de terminação de E9 para determinar os níveis de expressão. Os iniciadores específicos usados foram: iniciador dianteiro = CAACGTTCGTCAAGTTCAATGC (SEQ ID NO: 20) iniciador reverso = TGCCATAATACTCGAACTCAGTAGGA (SEQ ID NO: 21) sonda = 6FAM-TCAGTTTCATTGCGCACACACCAGAA-TAMRA. (SEQ ID NO: 22) O FAM e TAMRA são tinturas com base fluorescente. O FAM é a tintura repórter e o TAMRA é o extintor. Detalhes adicionais do ensaio de Taqman estão disponíveis do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Os níveis de expressão em plantas transgênicas foi comparado àqueles em um controle de tipo selvagem. A expressão relativa comum comparada ao tipo selvagem para eventos de Abby selecionados para estu- do adicional variou de 1558 a 42.027, e para Anny variou de 739 a 6002. A expressão mais baixa em Anny foi esperada como nestes eventos o gene de ANT é direcionado pelo promotor intensificado em raiz (e tecido da folha foi analisado). Para Abby, foram selecionadas 26 linhagens transgênicas de 37 linhagens. Para Anny, 19 transgênicos foram selecionados de 33 linhagens de RO. As plantas de RO foram uniformizadas para gerar a semente de R1, e também cruzada com um tipo selvagem LH172 (uma linhagem inata espe- cífica de milho disponível de Holden) gerar semente de F1.

Semente de R1 destes eventos foi plantada em um campo perto de Jerseryville, IL em maio de 2001. Porém, as plantas foram perdidas em uma ventania. Portanto, a semente foi plantada em um campo no Kihei, Hl em agosto de 2001 para observação e avanço para a próxima geração. A disponibilidade da semente reduziu o número de eventos plantado em 19 para Abby e 11 para Anny. A semente usada foi de uma cruza em que o transgene foi segregando a alguma descendência, mas não toda, assim 24 plantas por fileira foram marcadas, e tecido da folha foi colhido, DNA produ- zido e PCR foi feita para determinar a presença ou ausência do gene por PCR da extremidade 3' de E9 (até certo ponto semelhante ao protocolo de Taqman acima, usando os mesmos iniciadores). A altura de plantas na hora de identificação foi medida (distância de terra para o colar da folha marcada) (ver exemplo 34).

Outras observações são planejadas. Os traços específicos da semente e espiga incluem número de fileira, peso de 100 grãos (grãos leva- dos do meio da espiga de milho) e comprimento de espiga de milho. Todas as medidas serão correlacionadas com a presença ou ausência do gene de ANT. Os eventos que demonstram uma segregação 1:1 do transgene serão avançados para a próxima geração.

As próximas etapas para estes eventos são determinar os efei- tos do gene de ANT sobre o crescimento da planta e desenvolvimento. Para os eventos de pox1-ANT, a semente de F1 será germinada na escuridão em papel de mata-borrão enrolado a 25°C durante 5 a 7 dias. O comprimento da raiz será medido, e as amostras serão levadas para análise de PCR do transgene. Esperou-se que plantas que expressam o ANT de Arabidopsis sob um promotor raiz-específico tenham raízes mais longas.

Para o promotor de rACT1 constitutivo, planejou-se gerar linha- gens homozigóticas antes de conduzir análise de fenótipo adicional. Espigas de F2 PCR-positivas (2 por evento) serão selecionadas para avanço, e a semente será plantada no Havaí em dezembro de 2001. O DNA Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA) será usado para determinar a zigosi- dade das plantas na fileira (24 plantas por evento). Todas as plantas serão reconhecidas. Serão selecionadas linhagens positivas homozigóticas e ne- gativas homozigóticas para estudo adicional. O promotor constitutivo será usado para determinar o efeito de ANT no tamanho dos órgãos vegetativos e reprodutivos. A produção de se- mentes maiores pode aumentar o rendimento. Alternativamente, a produção de folhas maiores pode aumentar o rendimento fornecendo mais capacidade de fonte, e estímulo de desenvolvimento da raiz pode fornecer mais nutrien- tes minerais ou água para aumentar a produção de grãos. O promotor inten- sificado em raiz foi usado para determinar se o gene de ANT pode promover a produção de raízes maiores que permitiríam a planta obter nutrientes mine- rais e água mais rapidamente. Quando linhagens homozigóticas estiverem disponíveis, 12 plantas por seleção serão plantadas em uma estufa, e as medidas a seguir serão tiradas: - Altura será medida cada semana até ornar com borlas (ver exemplo 34 e 26). - Comprimento da folhas selecionadas será medido (ver exemplo 26). - Tempo de florescimento será registrado (ver exemplo 28). - Estruturas reprodutivas femininas e masculinos das plantas serão exami- nadas (ver exemplo 28).

Serão feitas comparações entre as plantas contendo o(s) dito(s) transgene(s) e as isolinas negativas.

Comprimento da raiz destas seleções será medido cultivando as plantas no papel de mata-borrão enrolado, como descrito para as plantas de pox1-ANT (ver exemplo 27 das plantas de RB7-ANT).

Esperou-se todas das características acima podem ser afetadas em uma direção de intensificação de rendimento positiva pela expressão do(s) gene(s) de ANT, como foram as plantas de Arabidopsis nos exemplos anteriores. EXEMPLO 34 EXPRESSÃO DE AINTEGUMENTA EM MILHO.

Os nomes de linhagens transgênicas específicas podem ser de- finidos em outro lugar (isto é, Abby e Anny são definidos no Exemplo 33.).

As plantas de F1 contendo construções de ANT foram analisa- das em altura final da planta, e retorno de semente. Não foi possível medir outro grão e características de espiga por causa da taxa altamente variável do conjunto de sementes em todas as espigas inatas do berçário. Nenhum efeito do gene de ANT na altura da planta final foi observado (dados não mostrados). Porém, um efeito na fertilidade foi visto com expressão constitu- tiva de ANT (Abby). Plantas que continham a constructo de ANT constitutiva não produziu semente tão freqüentemente quanto os segregantes negativos.

Como resultado, a proporção de plantas com este constructo (Abby) que continha o transgene foi reduzida na população que produziu semente, com- parada às plantas originais na fileira (Tabela 11). Em contraste, a proporção de plantas com o transgene foi a mesma nestas duas populações para plantas transformadas com outros constructos, incluindo expressão intensifi- cada em raiz de ANT (Anny), e construções contendo outro transgenes.

Estes dados sugerem que a expressão do gene de ANT em ór- gãos reprodutivos teve um efeito negativo na fertilidade. Este resultado é consistente com o relatório que a maioria das plantas de Arabidopsis com um transgene 35S::ANT era estéril (Mizukami e Fischer, 2000), e sugere que o gene de ANT de Arabidopsis está tendo um efeito semelhante em milho como em Arabidopsis. Este gene pode ser útil para aumentar o potencial de penetração em milho, usando promotores que alvejam dividir células de en- dosperma, mas que evitam a expressão em certos tecidos reprodutivos. As plantas de Anny serão úteis para determinar o efeito de ANT no desenvolvi- mento de raiz em milho. Um exemplo de desenvolvimento de raiz em Arabi- dopsis é visto no Exemplo 27. TABELA 11. PROPORÇÃO DE PLANTAS QUE CONTINHAM O TRANS- GENE É REDUZIDA EM POPULAÇÃO DE ABBY QUE PRODUZIU A SE- MENTE, COMPARADA A TODAS AS PLANTAS DE ABBY NA FILEIRA. ABBY, RACTL-ANT; ANNY, POX1-ANT. EXEMPLO 35 Além dos métodos acima e abaixo mencionados, os constructos de DNA recombinantes elaboradas para a expressão de ANT pode ser transformadas em milho ou colheitas de outras. Vários métodos que permiti- ríam isto existem. Um constructo de DNA é transformado em uma colheita alvo de interesse por um sistema de liberação apropriado como um método de transformação mediada por Agrobacterium (ver patente U. S. N.° 5.569.834 aqui incorporada por referência na sua íntegra, Patente U. S. N.° 5.416.011 aqui incorporada por referência na sua íntegra, Patente U. S. N.°. 5.631.152 aqui incorporada por referência na sua íntegra, Patente U. S. N.°. 5.159.135 aqui incorporada por referência na sua íntegra, Patente U. S. N.°. 5.004.863 aqui incorporada por referência na sua íntegra e Pedido de Pa- tente U. S. Provisório N° 60/111795 aqui incorporado por referência na sua íntegra. Alternativamente, um método de bombardeio de partícula pode ser usado (ver Pedidos de Patente por exemplo, WO 92/15675. WO 97/48814 e Pedido de Patente Europeu 586.355 e Patentes U. S. Nos 5.120.657, 5.503.998, 5.830.728 e 5.015.580 todas estas são aqui incorporadas por referência na sua íntegra).

Um número grande de sistemas e métodos de transformação e regeneração está disponível e é bem conhecido àqueles versados na técni- ca. As plantas e progênie estavelmente transformadas são subseqüente- mente analisadas para expressão do gene em tecidos de interesse por qual- quer número de métodos molecular, imunodiagnóstico, bioquímico e/ou de avaliação de campo conhecidos àqueles de habilidade na técnica, incluindo, mas não limitado a pesquisar por qualquer de um número grande de traços fenotípicos e fisiológicos (como nos exemplos acima; também perfilarão de transcrição; perfilarão metabólica e outros) em plantas transformadas e as comparando com plantas transformadas com diferentes genes ou plantas não-transformadas.

Por exemplo, um gene de ANT de arroz (ou outro monocotiledô- neo) sob um promotor de planta pode ser transformado em milho, ou outra planta de colheita, para visar os efeitos dos genes de ANT monocotiledôneo em outros monocotiledôneos, ou gene de ANT dicotiledôneo em outros dico- tiledôneos, ou genes monocotiledôneos em dicotiledôneos, ou vice-versa.

Os plasmídeos contendo estas seqüências de codificação de ANT, 5' de um promotor e 3’ de um terminador podem ser construídos de uma maneira si- milar àquela descrita para a construção de outros plasmídeos aqui. Qualquer número de promotores pode ser visado, de promotores tecido-específicos, para promotores constitutivos, para promotores intensificados em tecido, para outros miríades dentro ou foram de um destes grupos. EXEMPLO 36 CONSTRUCTO DE pMON71250. pMON71250 (Figura 19) é um constructo de bombardeio com o gene de ANT1 de arroz (OsANTI) sob o controle do promotor de Zea mays L3 (oleosina) (Lee WS. et al., Proceedings of the National Academy of Sci- ence (USA) 88:6181, 1991; Lee K. et al., Plant Molecular Biology, 26:1981, 1994; Qu et al., Plant Science 72:223, 1990) para expressão tecido- específica em germe de milho e aleurona. O gene de OsANTI foi ampliada com PCR usando iniciadores OsANTF (GGCGCGCCACAATGGCCA- GCGGCGGCGGCAG SEQ ID NO: 32) e OsANTR (CCTGCAGGTCA- GGCATCTGTCCAGGCTGCAA SEQ ID NO: 33) contendo Asc\ e Sse83871, respectivamente. A amplificação de PCR incluiu uma etapa de desnaturação inicial de 94°C durante 2 min seguidos por 30 ciclos a 94°C durante 30 se- gundos, 58°C durante 15 segundos, 72°C durante 1 mim. O produto de PCR foi clonado, seqüenciação confirmada e subclonada para os sítios de Ascl e Sse8387l do vetor de expressão de L3 pMON71050 (ver em anexo mapa de Pollux). O constructo resultante de pMON71250 foi confirmado por mapea- mento de restrição e seqüenciação de junção. O fragmento Mlul contendo o cassete de OsANTI foi purificado para transformação de milho por meio de bombardeio dentro da linhagem de milho de LH59. EXEMPLO 37 MÉTODOS DE BOMBARDEIO DE MICROPROJETIL

Aproximadamente quatro horas antes do bombardeio de micro- projetil, embriões imaturos de LH59 foram transferidos para o meio 211SV (sais de N6 com 12% de sacarose a pH 5,8, 1 mg de 2,4-D, 17 mg de Ag- NO.sub.3, 1 mg de HCI de tiamina, 690 mg de prolina, 900 mg de asparagi- na, 100 mg de casaminoácidos, 500 mg de MES). Foram preferivelmente colocados vinte e cinco embriões imaturos em um disco de petri de 60 x 15 mm, dispostos em uma grade 5x5 com a extremidade coleoptilar do escu- telo levemente apertada para dentro do meio de cultura em um ângulo de 20 graus. O tecido foi mantido no escuro ante do bombardeio.

Antes do bombardeio de microprojetil, uma suspensão de partí- culas de ouro foi preparada na qual o DNA desejado foi precipitado. Dez mi- ligramas de 0,6 μίτι de partículas de ouro (BioRad) foram suspensos em 50 μΙ_ de tampão (150 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0). Vinte e cinco μ!_ de uma solução a 2,4 nM do DNA desejado foram adicionados à suspensão de partículas de ouro e gentilmente submetida à vórtice durante cerca de cinco segundos. Setenta e cinco ML de 0,1 M de espermidina foram adicionados e a solução foi submetida a vóctice suavemente durante cinco segundos. Se- tenta e cinco μί de uma solução a 25% de polietileno glicol (3000-4000 peso molecular, American Type Culture Collection) foram adicionados e a solução foi suavemente submetida a vórtice durante cinco segundos. Setenta cinco μί de CaCI2 a 2,5 M foram adicionados e a solução foi submetida a vórtice durante cinco segundos.

Seguindo a adição de CaCl2, a solução foi incubada em tempe- ratura ambiente durante 10 a 15 minutos. A suspensão foi subseqüente- mente centrifugada durante 20 segundos a 12.000 rpm (centrífuga Sorval MC-12V) e o sobrenadante descartado. O pélete de partícula/DNA de ouro foi lavada duas vezes com 100% de etanol e ressuspendido em 10 mL de etanol a 100%. A preparação da partícula/DNA de ouro foi armazenada a - 20°C por até duas semanas. DNA foi introduzido nas células de milho usando o dispositivo de liberação de gene de aceleração de partícula de descarga elétrica (Patente U. S. N° 5.015.580). A suspensão de partícula/DNA de ouro foi coberta em folhas de Mylar (película de poliéster de Du Pont Mylar tipo SMMC2, alumí- nio revestido em um lado, em sobre revestido com co-polímero de PVDC em ambos os lados, corte de 18 mm quadrados) por dispersão de 310 a 320 μί da suspensão de partícula/DNA de ouro em uma folha. Após a suspensão de partícula de ouro repousou durante um a três minutos, excesso de etanol foi removido e as folhas foram secadas ao ar. Bombardeio de microprojetil de tecido de milho foi conduzido como descrito na Patente de EUA N° 5.015.580. A voltagem AC pode ser variada no dispositivo de liberação de partícula de descarga elétrica. Para o bombardeio de microprojetil de embri- ões imaturos pré-cultivados de LH59, 35% a 45% da voltagem máxima fo- ram preferivelmente usados. Seguindo o bombardeio microprojetil, tecido foi cultivado na escuridão a 27°C.

SELEÇÃO DE CÉLULAS TRANSFORMADAS

Os transformantes foram selecionados em meio de cultura com- preendendo paramomicina, com base na expressão de um gene transgênico de neomicina fosfotransferase II (npfll). Vinte quatro horas após liberação do DNA, o tecido foi transferido para o meio 211V contendo 25 mg/L de para- momicina (meio 211HV). Após três semanas de incubação na escuridão a 27°C, o tecido foi transferido para o meio 211 contendo 50 mg/L de para- momicina (meio 211G). Tecido foi transferido para o meio 211 contendo 75 mg/L de paramomicina (meio 211XX) após três semanas. Transformantes foram isolados seguindo 9 semanas de seleção.

REGENERAÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS FÉRTEIS

Plantas transgênicas férteis foram produzidas de células de mi- lho transformadas. Calo transformado foi transferido para o meio 217 (sais de N6, 1 mg/L de tiamina-HCL, 0,5 mg/L de niacina, 3,52 mg/L de benzilami- nopurina, 0,91 mg/L de monoidrato de L-asparagina, 100 mg/L de mio- inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCl2-6H20, 100 mg/L de hidrolisado de caseína, 0,69 g/L de L-prolina, 20 g/L de sacarose, 2 g/L de GELGRO®, pH 5,8) durante cinco a sete dias na escuridão a 27°C. Embriões somáticos ma- duros e regeneração de broto iniciou no meio 217. O tecido foi transferido para o meio 127T (sais de MS, 0,65 mg/L de niacina, 0,125 mg/L de piridoxi- na-HCI, 0,125 mg/L de tiamina-HCI, 0,125 mg/L de pantotenato de Ca, 150 mg/L de L-asparagina, 100 mg/L de mio-inositol, 10 g/L de glicose, 20 g/L de L-maltose, 100 mg/L de paramomicina, 5,5 g de PHYTAGAR®, pH 5,8) para desenvolvimento do broto. Tecido no meio 127T foi cultivado na luz em 400- 600 lux a 26°C. As plantinhas são transferidas para a terra, preferivelmente vasos de 7,62 cm (3 polegadas), cerca de quatro a 6 semanas após a transferência para o meio 127T quando as plantinhas estiverem cerca de 7,62 cm (3 polegadas) de altura e tiverem raízes. As plantas foram mantidas durante duas semanas em uma câmara de desenvolvimento a 26°C, seguiu por duas semanas em um banco de pulverização em uma estufa antes de transplantar para os vasos de 5 galões para desenvolvimento em estufa. As plantas foram desenvolvidas na estufa até a maturidade e polinizações recí- procas foram feitas com o LH59 inato. Semente foi colhida de plantas e usa- das para outras atividades de procriação e ensaio futuro.

EXPERIÊNCIAS FUTURAS PLANEJADAS

Dados de milho transgênicos da primeira semente de geração para pMON71250 é esperada pelo segundo trimestre de 2002 e segundos dados de geração é esperado pelo final de 2002. Semente da primeira gera- ção e partes dissecadas (germe e endosperma) serão analisadas por NMR de banca de topo e grãos abrigando o transgene serão identificados por PCR. Massa de germe será determinada como parte desta análise. Diferen- ças no% de óleo do grão,% de óleo de germe,% de óleo de endosperma, massa de germe e endosperma serão determinados em uma comparação entres os grãos abrigando o transgene (identificado por PCR) e segregantes nulos (faltando o transgene). Análise por teor de proteína e de amido tam- bém pode ser empreendida. Serão analisados grãos transgênicos para dife- renças morfológicas brutas, e grãos de diferentes estágios desenvolventes podem ser colocados em seção (manualmente ou opticamente) para detec- tar as alterações morfológicas.

Claims (5)

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende, na direção 5’ a 3’: (a) um primeiro polinucleotídeo de DNA que compreende um promotor que funciona em plantas, operavelmente liga- do; (b) um segundo polinucleotídeo de DNA compreendendo a SEQ ID NO:5, o qual codifica uma proteína ANT tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, operavelmente ligado; e (c) um polinucleotídeo de DNA de terminação da transcrição 3’, em que o referido primeiro polinucleotídeo de DNA é heterólogo ao referido segundo polinucleotídeo de DNA.

2. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a proteína codificada pelo segundo polinucleotídeo de DNA compreende ainda SEQ ID NO: 26 como uma sub- sequência, em que a SEQ ID NO: 26 está localizada no C-terminal aos dois domínios de ligação de DNA AP2.

3. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a proteína codificada pelo segundo polinucleotídeo de DNA compreende ainda SEQ ID NO: 30 como uma sub- sequência, em que a SEQ ID NO: 30 está localizada no C-terminal aos dois domínios de ligação de DNA AP2.

4. Método de produzir uma planta que tem tamanho de órgão aumentado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) inserir no genoma de uma célula vegetal uma molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1; b) obter uma célula vegetal transformada; c) regenerar uma planta a partir da referida célula vegetal; e d) selecionar a referida planta com tamanho de órgão aumenta- do em comparação a uma planta controle.

5. Método acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína codificada pelo segundo polinucleotídeo de DNA compre- ende ainda SEQ ID NO: 30 como uma subsequência, em que a SEQ ID NO: 30 está localizada no C-terminal aos dois domínios de ligação de DNA AP2.