ES2346863T3 - Procedimiento para aumentar el peso de las semillas de plantas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aumentar el peso de las semillas de una planta que comprende las etapas de: (a)transformar dicha planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que actúa en plantas, unido de manera operativa a una molécula de ADN que codifica una proteína que comprende ID. SEC. Nº 2, en el que dicha construcción de ADN está unida de manera operativa a una región de terminación 3'; y (b)seleccionar una planta de una población de plantas transformadas que contienen dicha construcción de ADN; en el que dicha planta exhibe peso aumentado de las semillas comparado con una planta de la misma especie no transformada para contener dicha construcción de ADN.

Description

Procedimiento para aumentar el peso de las semillas de plantas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la biología molecular de las plantas. En particular, esta invención se refiere a las plantas transgénicas que tienen tamaños aumentados o mejorados de las semillas y de los órganos.

Antecedentes de la invención

Los recientes avances en ingeniería genética han proporcionado las herramientas esenciales para transformar las plantas para que contengan genes extraños (con frecuencia denominados "heterogéneos o heterólogos") o genes endógenos mejorados. La introducción de tales genes en una planta puede dar lugar de manera deseable a una mejora de una vía ya existente en los tejidos de la planta o a la introducción de una vía nueva para modificar los niveles del producto deseado, para aumentar la eficacia metabólica y/o para ahorrar el gasto de energía de la célula. Ya se han producido plantas con características y rasgos fisiológicos y bioquímicos únicos, tales como la resistencia a herbicidas y la resistencia a insectos. La capacidad para crear rasgos que desempeñen una función esencial en el crecimiento y el desarrollo de las plantas, el potencial y la estabilidad del rendimiento de la cosecha y la calidad y composición del cultivo son dianas particularmente deseables para la mejora de las plantas de cultivo.

Normalmente, una planta pasa por un ciclo de desarrollo, que incluye la germinación de la semilla, la maduración de la planta, la reproducción y, finalmente, la senescencia que da lugar a la muerte de una planta. Varios procesos biológicos son comunes a las diferentes etapas del desarrollo de la planta. Los efectos deseados tales como el crecimiento de los órganos de tejidos se consiguen en la naturaleza por medio del ajuste fino del metabolismo del organismo. La fase final del crecimiento es la senescencia, que es un proceso activo altamente regulado, controlado genéticamente (Thomas H., and Stoddart J. L., Ann. Rev. Plant Physiol (31) 83-111, 1980). La senescencia se ha estudiado sobre todo en las hojas de las plantas y se ha considerado como una serie de acontecimientos relacionados con la desorganización celular y la movilización del material liberado a otras partes de la planta tales como las semillas, los órganos de almacenamiento o las hojas y las flores en desarrollo (Nooden L. D. in Senescence and Aging in Plants, Academic press, 391-439, 1988). La senescencia de las hojas puede estar iniciada por el desarrollo de la semilla en determinadas especies de plantas. Esto se ha demostrado en la soja eliminando quirúrgicamente las flores o restringiendo físicamente el crecimiento de los botones para observar el retardo en la senescencia de la hoja (Nooden L. D. in Senescence and Aging in Plants, Academic press, 330-368.1988; Miceli F, Crafts-Brandner S. J., Egli D. B. Crop Sci. (35), 1080-1085, 1995). Durante la senescencia, el reparto de recursos entre el desarrollo vegetativo y el reproductivo implica una compleja interacción de procesos generativos y degenerativos, que requiere la expresión diferencial de genes.

Los genes que se expresan de manera diferencial durante la senescencia se denominan usualmente "genes asociados a la senescencia" o SAG (Hensel L. L, Grbic V., Baumgarten D. A., Bleecker A. B., The Plant Cell (5) 553-564, 1993). Probablemente no todos los genes SAG estén relacionados funcionalmente, pero todos ellos están implicados en procesos fisiológicos similares. En el pasado, los estudios de senescencia estaban dirigidos a entender los procesos para mejorar los conocimientos en general y para aplicar esta información relacionada con la senescencia en la agricultura para mejorar el rendimiento y para reducir las pérdidas posteriores de la cosecha (Hensel L. L, Grbic V., Baumgarten D. A., Bleecker A. B., The Plant Cell (5) 553-564, 1993; Gan S., Amasino R. M., Science, (270) 1986-1988, 1995; Gan S., Amasino R. M., Plant Physiol., (113) 313-319, 1997; Guarente L., Ruvkun G., Amasino R. M., Proc. Natl. Acad. Sci USA (95) 1034-1036, 1998; Patente de EEUU Nº 5 68 9042; documentos PCT/US00/03494; y PCT/US00/18364, julio de 2000).

El gen SAG 13 fue el primero descrito por Lohman y col. en 1994 (Lohman K. M., Gan S., John M. C., Amasino R. M., Physiologia Plantaruma (92) 322-328, 1994) y posteriormente por Weaver y col. en 1998 (Weaver L. M. Gan S., Quirino B, Amasino R. M., Plant Mol. Biol. 455-469, 1998) como uno de los genes asociados con la senescencia. Los genes SAG por definición se regulan positivamente durante la senescencia mediada por el envejecimiento. Se observó que SAG 13 se induce fuertemente poco antes de la senescencia visible marcada por el amarillamiento de las hojas verdes.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a las plantas transgénicas con tamaños aumentados de los órganos cuando se comparan con una planta no transformada de la misma especie. En una forma de realización de preferencia, la presente invención proporciona una planta transgénica con peso aumentado de la semilla cuando se compara con una planta no transformada de la misma especie.

Una forma de realización de la invención proporciona un procedimiento para aumentar el peso de la semilla de una planta que comprende las etapas de:

(a)

transformar dicha planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que actúa en plantas, unido de manera operativa a una molécula de ADN que codifica una proteína que comprende ID. SEC. Nº 2, en el que dicha construcción de ADN está unida de manera operativa a una región de terminación 3'; y

(b)

seleccionar una planta de una población de plantas transformadas que contienen dicha construcción de ADN, en el que dicha planta exhibe peso aumentado de la semilla comparado con una planta de la misma especie, no transformada para contener dicha construcción de ADN.

Otro aspecto de la invención proporciona una planta transgénica con peso aumentado de la semilla comparado con una planta no transformada de la misma especie de planta o una de sus progenies, comprendiendo dicha planta transgénica y dicha planta progenie:

(i)

una construcción de ADN que codifica un polipéptido que comprende ID. SEC. Nº 2; o

(ii)

un polipéptido de ID. SEC. Nº 2.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación de plantas pMON 23435 con sus elementos.

La figura 2 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación de plantas pMON 57521 con sus elementos.

La figura 3 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación de plantas pMON 54955 con sus elementos.

La figura 4 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación de plantas pMON 73955 con sus elementos.

La figura 5 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación de plantas pMON 73963 con sus elementos.

La figura 6 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación bacteriana pMON 63132 con sus elementos.

La figura 7 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación bacteriana pMON 63133 con sus elementos.

La figura 8 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación bacteriana pMON 6134 con sus elementos.

La figura 9 muestra un mapa del plásmido para el vector de transformación bacteriana pMON 6135 con sus elementos.

La figura 10 muestra los cebadores utilizados para la amplificación del gen y para la secuenciación de los amplicones.

La figura 11 muestra los productos putativos de la actividad reductasa de esteroides.

La figura 12 muestra una potencial reacción de la reductasa de esteroides.

Descripción detallada de la invención Moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención

La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar el peso de las semillas de una planta por medio de la transformación de la planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que actúa en las plantas, unido de manera operativa a una molécula de ADN que codifica una proteína, en el que dicha molécula de ADN tiene ID. SEC. Nº 1 y en el que dicho promotor es heterólogo a dicha molécula de ADN.

La frase "molécula de ácido nucleico", según se utiliza en el presente documento, significa una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) o una molécula de ácido ribonucleico (ARN). Tanto las moléculas de ADN como las de ARN están construidas a partir de nucleótidos unidos por sus extremos, en las que cada uno de los nucleótidos contiene un grupo fosfato; un resto azúcar y una base purina o pirimidina. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser polímeros monocatenarios o bicatenarios de nucleótidos que se leen del extremo 5' al extremo 3'. Las moléculas de ácido nucleico pueden también contener opcionalmente bases de nucleótidos sintéticos, no naturales o alterados que permitan la correcta lectura por una polimerasa y que no alteren la expresión de un polipéptido codificado por esa molécula de ácido nucleico.

La frase "una molécula de ácido nucleico aislada", según se utiliza en el presente documento, significa una molécula de ácido nucleico que ya no está acompañada por algunos de los materiales con los que está asociada en su estado natural o una molécula de ácido nucleico cuya estructura no es idéntica a la de ninguna de las moléculas de ácido nucleico que se presentan en la naturaleza. Los ejemplos de una molécula de ácido nucleico aislada incluyen: (1) los ADN que tienen la secuencia de parte de una molécula de ADN genómico natural pero que no están flanqueados por dos secuencias codificadoras que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el que se presenta naturalmente; (2) una molécula de ácido nucleico incorporada en un vector o dentro del ADN genómico de un procariota o de un eucariota de forma tal que la molécula resultante no sea idéntica a ningún vector o ADN genómico que se presente en la naturaleza; (3) una molécula separada tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un fragmento de restricción; (4) ADN recombinantes; y (5) ADN sintéticos. Una molécula de ácido nucleico aislada puede también comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

También está contemplado por los autores de la presente invención que las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención incluyan además tipos de modificaciones conocidas, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la técnica, metilación, "remates", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo. Otras modificaciones conocidas incluyen las modificaciones internucleótidos, por ejemplo, las que tienen enlaces sin carga (metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos) y las que tienen enlaces con carga (fosforotioatos, fosforoditioatos), las que contienen restos pendientes, tales como proteínas (incluidas las nucleasas, toxinas, los anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), las que tienen intercaladores (acridina, psoraleno), las que contienen quelantes (metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes), las que contienen alquiladores, y las que tienen enlaces modificados.

La frase "secuencia de nucleótidos", según se utiliza en el presente documento, significa el orden contiguo de la molécula de ácido nucleico tanto de la hebra sentido como de la hebra antisentido, o como hebra doble. Incluye, pero no está limitada a, plásmidos autorreplicantes, polinucleótidos sintéticos, secuencias cromosómicas, y polímeros infecciosos de ADN o de ARN.

Se dice que una secuencia de nucleótidos es el "complemento" de otra secuencia de nucleótidos si ambas exhiben complementariedad total. Como se utiliza en el presente documento, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad total" cuando cada nucleótido de una de las secuencias es complementario a un nucleótido de la otra.

Según se utiliza en el presente documento, las frases "una secuencia codificadora" y "una secuencia de nucleótidos estructural" significan una secuencia de nucleótidos, que se traduce en un polipéptido, por lo general vía ARNm, cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de inicio de la traducción en el extremo 5' y un codón de parada de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no está limitada a, ADN genómico, ADNc y secuencias de nucleótidos recombinantes.

Los polipéptidos de la invención, como otros polipéptidos, tienen diferentes dominios que realizan diferentes funciones. Por consiguiente, no es necesario que las secuencias codificadoras sean de longitud completa, a condición de que se exprese el dominio funcional deseado del polipéptido. Las características distintivas de los polipéptidos de la presente invención se analizan en detalle en los Ejemplos.

La frase "ADN recombinantes", según se utiliza en el presente documento, significa moléculas de ADN que contienen una modificación diseñada genéticamente a través de la manipulación vía mutagénesis, enzimas de restricción y similares.

La frase "ADN sintéticos", según se utiliza en el presente documento, significa moléculas de ADN organizadas a partir de unidades estructurales de oligonucleótidos que se sintetizan químicamente usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estas unidades estructurales se unen e hibridan para formar segmentos de ADN, que a continuación se organizan enzimáticamente para construir el ADN completo. "Sintetizado químicamente", con respecto a una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos que la componen fueron organizados in vitro. La síntesis química manual de ADN puede llevarse a cabo usando procedimientos bien establecidos, o la síntesis química automatizada puede llevarse a cabo usando una serie de máquinas disponibles en el comercio.

Los términos "polipéptido" y "proteína", según se utilizan en el presente documento, significan un polímero compuesto de aminoácidos conectados por enlaces peptídicos. Una unidad de aminoácido en un polipéptido (o proteína) se denomina residuo. Los términos "polipéptido" y "proteína" también se aplican a cualquier polímero de aminoácidos en el que uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a cualquier polímero de aminoácidos que se presenta en la naturaleza. La naturaleza esencial de tales análogos de aminoácidos naturales es que, cuando están incorporados en un polipéptido, ese polipéptido es específicamente reactivo a los anticuerpos provocados para el mismo polipéptido pero que está constituido enteramente por aminoácidos naturales. Es bien sabido en la técnica que las proteínas o los polipéptidos pueden experimentar modificación, que incluye pero no se limita a, formación de enlaces disulfuro, gamma carboxilación de los residuos de ácido glutámico, glicosilación, unión de lípidos, fosforilación, oligomerización, hidroxilación y ADP ribosilación. Modificaciones de ejemplo se describen en la mayoría de los textos básicos, tales como, por ejemplo, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2ª edición, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993). Hay numerosas revisiones detalladas disponibles sobre este tema, tales como, por ejemplo, las proporcionadas por Wold, F., Post-translational Protein Modifications. Perspectives and Prospects, páginas 1-12 en Post-translational Covalent Modifications of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York (1983); Seifter y col., Meth. Enzymol. 182: 626-M (1990) y Rattan y col., Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad Sci. 663: 48-62 (1992).

Las modificaciones pueden producirse en cualquier sitio en un polipéptido, incluida la estructura peptídica principal, las cadenas laterales de aminoácidos y en los extremos amino o carboxilo terminales. De hecho, el bloqueo del grupo amino o del grupo carboxilo en un polipéptido, o ambos, por una modificación covalente, es común en los polipéptidos naturales y sintéticos y tales modificaciones pueden estar presentes también en los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, el residuo amino terminal de los polipéptidos producidos en E. coli u otras células, antes del tratamiento proteolítico, será casi invariablemente N-formilmetionina. Durante la modificación postraduccional del polipéptido, puede suprimirse un residuo metionina en el extremo NH_{2} terminal. Por consiguiente, esta invención contempla el uso de ambas variantes amino terminales del polipéptido de la invención, la que contiene metionina y que carece de metionina. Por consiguiente, según se utiliza en el presente documento, los términos "proteína" y "polipéptido" incluyen cualquier proteína o polipéptido que esté modificado por cualquier proceso biológico o no biológico.

Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los aminoácidos que se presentan en la naturaleza y, a menos que se limite de otra manera, a los análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden actuar de una manera similar a los aminoácidos naturales. Esta definición pretende incluir la norleucina, la ornitina, la homocisteína y la homoserina.

El término "secuencia de aminoácidos" significa la secuencia de aminoácidos en un polipéptido (o proteína) que se escribe comenzando con el residuo amino terminal (N terminal) y que finaliza con el residuo carboxilo terminal (C terminal).

La frase "una subsecuencia de aminoácidos" significa una porción de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Una subsecuencia de aminoácidos tiene por lo general una longitud de 3 a 50 residuos de aminoácidos.

Las frases "polipéptido sustancialmente purificado" y "proteína sustancialmente purificada", según se utilizan en el presente documento, significan un polipéptido o una proteína que están separados sustancialmente de todas las otras moléculas con las que están normalmente asociados en su estado nativo y son las especies predominantes presentes en una preparación. Una molécula sustancialmente purificada puede estar más del 60% libre, de preferencia 75% libre, de más preferencia 90% libre, y de mayor preferencia 95% libre de las otras moléculas (exclusivas del disolvente) presentes en la mezcla natural.

El porcentaje de identidad de secuencia se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima sobre una ventana de comparación, en la que la porción del polinucleótido o de la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios de separación) con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las se que presentan las bases de ácido nucleico o los residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de las secuencias.

El término "identidad" se refiere a secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos que, cuando se comparan usando el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (T. F. Smith and M. S. Waterman, J. Mol. Biol. (147) 195-197 (1981), en los programas informáticos SSEARCH3 3.0t75 (W. R. Pearson, Genomics (11) 635-650 (1991) o BLAST 2.2.1 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Molinero, and David J. Lipman, Nucleic Acids Res. (25) 3389-3402 (1997), son exactamente iguales.

El término "similitud" se refiere a dos aminoácidos, que son similares según se define por la matriz de similitud BLOSSUM62 (S. Henikoff and J. G. Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (89) 10915-10919 (1992) que se utiliza en BLAST 2.2.1 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Molinero, and David J. Lipman, Nucleic Acids Res. (25) 3389-3402 (1997). El programa BLAST usa el alias "positivo" para similitud. Estos dos términos, similitud y positividad, son intercambiables.

La frase "porcentaje de identidad" para un par de secuencias de proteínas se refiere al número de residuos de aminoácidos idénticos en una alineación de dos secuencias informado por BLAST, dividido por el número total de residuos de aminoácidos en la misma alineación, expresado en porcentaje.

El término "porcentaje de similitud" para un par de secuencias de proteínas se refiere al número de residuos de aminoácidos similares ("Positivos" en los datos de salida de BLAST) en una alineación de dos secuencias informado por BLAST, dividido por el número total de residuos de aminoácidos en la misma alineación, expresado en porcentaje.

Las frases "sustancialmente idénticos" e "identidad sustancial", como referencia a dos secuencias de aminoácidos o a dos secuencias de nucleótidos, significan que una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos tiene al menos 50% de identidad de secuencia comparada con la otra secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos como secuencia de referencia usando el programa Gap en el PAQUETE WISCONSIN versión 10.0-UNIX de Genetics Computer Group, Inc. basado en el método de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), usando la serie de parámetros por defecto la comparación por parejas (para la comparación de secuencias de aminoácidos: penalización de creación del espacio de separación = 8, penalización de extensión del espacio de separación = 2; para la comparación de secuencias de nucleótidos: Penalización de creación del espacio de separación = 50; Penalización de extensión del espacio de separación = 3).

Los polipéptidos, que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como se indicó anteriormente excepto que las posiciones de los residuos que no son idénticas pueden diferir por cambios conservadores de aminoácidos. Sustituciones conservadoras de aminoácidos se refiere a la capacidad de intercambio de los residuos que tienen cadenas laterales similares. "Sustituciones conservadoras de aminoácidos" significa sustituciones de uno o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos nativa con otro(s) aminoácido(s) que tiene(n) cadenas laterales similares, dando como resultado un cambio silencioso. Los sustitutos conservados para un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos nativa pueden seleccionarse de otros miembros del grupo al que pertenece el aminoácido natural. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas con hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales con azufre es cisteína y metionina. Los grupos de aminoácidos de sustitución conservadora de preferencia son: valina-leucina, valina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutámico, y asparagina-glutamina.

Un experto en la técnica reconocerá que los valores de identidad sustancial anterior de las secuencias de nucleótidos pueden ajustarse de manera adecuada para determinar la identidad de secuencia correspondiente de dos secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención considerando la degeneración de codones, sustituciones conservadoras de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares. Para estos fines, identidad sustancial de las secuencias de nucleótidos, significa normalmente identidad de secuencia de al menos 35%.

La frase "degeneración de codón" significa la divergencia en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El experto en la técnica es consciente de la "parcialidad de codones" exhibida por una célula huésped específica en el uso de los codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por consiguiente, cuando se sintetiza un gen para expresión ectópica en una célula huésped, resulta deseable diseñar el gen tal que su frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia de uso de codones preferidos de la célula huésped.

Las condiciones de hibridación dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Según se utiliza en el presente documento, las "condiciones rigurosas" se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferiores al punto térmico de fusión (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH determinados. El "punto térmico de fusión" es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) en la que el 50% de una molécula diana hibrida a una molécula totalmente complementaria. Las condiciones rigurosas adecuadas que promueven la hibridación del ADN, por ejemplo, 6,0 X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por un lavado de 2,0 X SSC a 50ºC, son conocidas por los expertos en la técnica o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, incorporado en su totalidad en el presente documento por referencia. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse de una condición rigurosa baja de aproximadamente 2,0 X SSC a 50ºC a una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2 X SSC a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde las condiciones rigurosas bajas a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, hasta las condiciones rigurosas altas a aproximadamente 65ºC. Tanto la temperatura como la concentración de sal pueden variarse, o la temperatura o la concentración de sal pueden mantenerse constante mientras se cambia la otra variable. Para los fines de esta divulgación, las condiciones rigurosas incluyen al menos un lavado en 2,0 X SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50ºC durante 20 minutos, o condiciones equivalentes.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden combinarse con otras secuencias no nativas, o "heterólogas" en una diversidad de formas. Por secuencias "heterólogas" se entiende cualquier secuencia que no se encuentra en la naturaleza unida a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, combinaciones de secuencias de nucleótidos de la misma planta que no se encuentran naturalmente unidas juntas, o las dos secuencias proceden de dos especies diferentes.

El término "homólogo" se refiere a dos o más genes que proceden de un único gen en un antepasado común. El término "homología" se atribuye a la descendencia de un antepasado común. (J. J. Doyle and B. S. Gaut, Plant Molecular Biology (42) 1-23, 2000).

El término "ortólogo" se refiere a diferentes secuencias homólogas en diferentes especies que surgieron de un gen ancestral común durante la evolución de las especies; pueden ser o no responsables de una función similar.

El término parálogo se refiere a secuencias homólogas dentro de una única especie que surgieron por la duplicación de genes.

El término "dominio" se refiere a una porción discreta de una proteína que se asume que se pliega independientemente del resto de la proteína y que posee su propia función. También se utiliza dominio para referirse a una porción discreta de nucleótidos que cuando se traduce proporciona una porción de proteína que se asume que se pliega independientemente del resto de la secuencia de nucleótidos traducida y que posee su propia función.

El término "motivo" se refiere a una región conservada corta en una proteína o una secuencia de nucleótidos. Los motivos son con frecuencia partes de dominios altamente conservadas.

El término "genoma" según se aplica a las células de plantas abarca no sólo el ADN cromosómico que se encuentra dentro del núcleo, sino también el ADN de los orgánulos que se encuentra dentro de los componentes subcelulares de la célula. Los ADN de la presente invención introducidos en las células de plantas pueden estar, por consiguiente, integrados en los cromosomas o localizado en orgánulos.

La frase "unido de manera operativa", según se utiliza en referencia a una secuencia reguladora y a una secuencia de nucleótidos estructural, significa que la secuencia reguladora causa la expresión regulada de la secuencia de nucleótidos estructural unida de manera operativa. "Expresión" significa la transcripción y la acumulación estable del ARNm sentido o antisentido procedente de la molécula de ácido nucleico de la presente invención. La expresión puede también referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido. ARN "sentido" significa un transcripto del RNA que incluye el ARNm y de ese modo puede ser traducido en el polipéptido o la proteína por la célula. "ARN antisentido" significa un transcripto del ARN que es complementario a todo o a una parte de un transcripto diana primario o un ARNm que bloquea la expresión de un gen diana (Patente de EEUU Nº 5.107.065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte de la transcripción del gen específico, es decir, en la secuencia 5' no codificadora, en la secuencia 3' no traducida, los intrones, o la secuencia codificadora. "Transcripto del ARN" significa el producto resultante de la transcripción catalizada por la ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcripto del ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia del ADN, se denomina transcripto primario o puede ser una secuencia de ARN procedente del tratamiento postranscripcional del transcripto primario y se denomina ARN maduro.

El término "sobreexpresión" significa la expresión de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico exógeno introducida en una célula huésped, en la que dicho polipéptido no está normalmente presente en la célula huésped, o en la que dicho polipéptido está presente en dicha célula huésped en un nivel más alto que el normalmente expresado a partir del gen endógeno que codifica dicho polipéptido.

Por "expresión ectópica" se entiende la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido en un tipo de célula diferente de un tipo de célula en el que la molécula de ácido nucleico se expresa normalmente, en un momento diferente del momento en que la molécula de ácido nucleico se expresa normalmente o en un nivel de expresión diferente del nivel en el que la molécula de ácido nucleico se expresa normalmente.

"Inhibición antisentido" significa la producción de transcriptos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión del polipéptido diana. "Cosupresión" significa la producción de transcriptos de ARN sentido capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (Patente de EEUU Nº 5.231.020).

La frase "un gen" significa el segmento de ADN que está implicado en la producción de un polipéptido. Tal segmento de ADN incluye las secuencias reguladoras precedentes (secuencias 5' no codificadoras) y posteriores (secuencias 3' no codificadoras) a la región codificadora así como las secuencias intervinientes (intrones) entre los segmentos codificadores individuales (exones). Un "gen nativo" significa un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" significa cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender las secuencias reguladoras y las secuencias codificadoras procedentes de diferentes fuentes, o las secuencias reguladoras y las secuencias codificadoras procedentes de la misma fuente, pero organizadas de manera diferente de la que se encuentra en la naturaleza. "Gen endógeno" o "molécula de ADN endógeno" significa un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un "gen extraño" significa un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia del gen. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que ha sido introducido en el genoma por un procedimiento de transformación.

"Secuencias reguladoras" significa secuencias de nucleótidos localizadas secuencia arriba (secuencias 5' no codificadoras), dentro, o secuencia abajo (secuencias 3' no traducidas) de una secuencia de nucleótidos estructural, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o en la traducción de la secuencia de nucleótidos estructural asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

La frase "secuencia promotora" significa una secuencia de nucleótidos que, cuando está localizada en posición cis a una secuencia de nucleótidos estructural que codifica un polipéptido, es capaz de actuar de un modo que dirige la expresión de una o más moléculas de ARNm que codifican el polipéptido. Tales regiones promotoras se encuentran típicamente secuencia arriba de la secuencia de trinucleótidos ATG en el sitio de inicio de una región codificadora del polipéptido. Las secuencias promotoras pueden incluir también las secuencias a partir de las cuales se inicia la transcripción de las secuencias de ARN de transferencia (ARNt) o de ARN ribosomal (ARNr). La transcripción implica la síntesis de una cadena de ARN que representa una hebra de un dúplex de ADN. Por "que representa" se entiende que el ARN es idéntico en secuencia con una hebra del ADN; es complementario con la otra hebra del ADN, que proporciona el molde para su síntesis. La transcripción tiene lugar por el proceso usual de apareamiento de las bases complementarias, catalizado y examinado por la enzima ARN polimerasa. La reacción puede dividirse en tres etapas descritas como iniciación, elongación y terminación. La iniciación comienza con la unión de la ARN polimerasa al ADN bicatenario (DS o ds). La secuencia de ADN necesaria para la reacción de iniciación define el promotor. El sitio en el que se incorpora el primer nucleótido se denomina sitio de inicio o punto de inicio de la transcripción. La elongación describe la fase durante la que la enzima se mueve a lo largo del ADN y extiende la cadena de ARN en desarrollo. La elongación implica la interrupción de la estructura bicatenaria del ADN en la que existe una región desenrollada transitoriamente como un dúplex híbrido de ARN-ADN y cadena sencilla del ADN desplazada. La terminación implica el reconocimiento del punto en el que no deben añadirse otras bases a la cadena. Para finalizar la transcripción, debe cesar la formación de enlaces fosfodiéster y debe separarse el complejo de transcripción. Cuando se añade la última base a la cadena del ARN, el híbrido ARN-ADN se rompe, el ADN vuelve a tomar la forma de estado dúplex y la enzima ARN polimerasa y la molécula de ARN se liberan del ADN. La secuencia de ADN necesaria para la reacción de terminación se denomina terminador.

La secuencia promotora está constituida por elementos proximales y elementos más distales secuencia arriba, los últimos elementos se denominan frecuentemente potenciadores. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento natural del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o la especificidad de tejido de un promotor. Los promotores pueden proceder en su totalidad de un gen nativo, o pueden estar compuestos de diferentes elementos procedentes de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso pueden comprender segmentos de ADN sintéticos. Los expertos en la técnica saben que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales.

Los promotores, que se sabe o que se descubre que causan la transcripción del ADN en las células de plantas, pueden utilizarse en la presente invención. Tales promotores pueden obtenerse de una diversidad de fuentes tales como plantas y virus de plantas. En la bibliografía se han descrito una serie de promotores, incluidos promotores constitutivos, promotores inducibles y promotores específicos de tejido, que son activos en células de plantas. Además de los promotores que se sabe que causan la transcripción del ADN en células de plantas, pueden identificarse otros promotores para uso en la presente invención cribando una biblioteca de ADNc de plantas para los genes que se expresan selectivamente o de preferencia en los tejidos diana y a continuación determinando las regiones promotoras.

La frase "promotor constitutivo" significa una secuencia reguladora que causa la expresión de una secuencia de nucleótidos estructural en la mayoría de las células o tejidos la mayoría de las veces. Los promotores constitutivos son activos en prácticamente todas las condiciones ambientales y estados de desarrollo o de diferenciación celular. En la técnica se conoce una diversidad de promotores constitutivos. Los ejemplos de promotores constitutivos que son activos en células de plantas incluyen, pero no están limitados a los promotores de nopalina sintasa (NOS); promotores de virus de ADN de plantas que incluyen, pero no están limitados a los promotores del caulimovirus por ejemplo, los promotores del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 19S y 35S y los promotores del virus del mosaico del figwort; el promotor del virus baciliforme, por ejemplo el virus baciliforme de la caña de azúcar, el virus baciliforme del tungro del arroz, entre otros; promotores de la actina de plantas, tales como el promotor del gen de la actina de Arabidopsis y del arroz (véase, por ejemplo, Huang y col., Plant Mol. Biol. 33: 125-139 (1997), Patente de EEUU Nº 5.641.876). Estos promotores, cuando se utilizan en una construcción de ADN, son heterólogos a la secuencia genética unida cuando proceden de un organismo diferente, de especies de plantas diferentes, o de un gen diferente.

La frase "promotor inducible" significa una secuencia reguladora que causa la expresión condicional de una secuencia de nucleótidos estructural bajo la influencia de condiciones ambientales o condiciones de desarrollo cambiantes. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no están limitados al promotor inducido por senescencia para el gen asociado a la senescencia, SAG12, (Gan and Amasino, Science 270: 1986-1988 (1995); el promotor inducible por la luz de la subunidad pequeña de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO); el promotor inducible por la sequía del maíz (Busk y col., Plant J. 11: 1285-1295 (1997)); el promotor inducible por el frío, la sequía y la concentración salina alta de la patata (Kirch, Plant Mol. Biol. 33: 897-909 (1997)); un promotor inducible por nitrato procedente del gen de la nitrito reductasa de la espinaca (Back y col., Plant Mol. Biol. 17: 9 (1991)); el promotor inducible por el ácido salicílico (Uknes y col., Plant Cell 5: 159-169 (1993); Bi y col., Plant J. 8: 235-245 (1995)); el fragmento promotor de los elementos E1 de respuesta a la auxina (AuxREs) en la soja (Glycine max L.) (Liu y col., Plant Physiol. 115: 397-407 (1997)); el promotor GST6 de Arabidopsis sensible a la auxina (también sensible al ácido salicílico y al peróxido de hidrógeno) (Chen y col., Plant J. 10: 955-966 (1996)); el promotor parC inducible por auxina del tabaco (Sakai y col., Plant Cell Physiol. 37: 906-913 (1996)); un elemento de respuesta a la biotina de las plantas (Streit y col., Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-937 (1997)); el promotor sensible a la hormona del estrés ácido abscísico (Sheen y col., Science 274: 1900-1902 (1996)); el promotor In2-2 del maíz activado por los antídotos protectores del herbicida bencenosulfonamida (De Veylder y col., Plan Cell Physiol. 38: 568-577 (1997)); un promotor inducible por tetraciclina, tal como el promotor para el gen de la arginina descarboxilasa de la Avena sativa L. (avena) (Masgrau y col., Plant J. 11: 465-473 (1997)); y un elemento sensible al ácido salicílico (Strange y col., Planta J. 11: 1315-1324 (1997)).

La frase "promotor específico de tejido" o "promotor potenciado de órgano" significa una secuencia reguladora que causa transcripciones o transcripciones potenciadas del ADN en células o tejidos específicos en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en los tejidos vegetativos o en los tejidos reproductores. Los ejemplos de promotores específicos de tejido bajo control de desarrollo incluyen los promotores que inician la transcripción solamente (o solo principalmente) en determinados tejidos, tales como los tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces, hojas o tallos, o en tejidos reproductores, tales como frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores, o cualquier tejido embrionario. Los promotores específicos de tejidos reproductores pueden ser, por ejemplo, específicos de óvulo, específicos de embrión, específicos de endosperma, específicos de integumento, específicos de recubrimiento de semilla, específicos de polen, específicos de pétalo, específicos de sépalo, o alguna de sus combinaciones. Un experto en la técnica reconocerá que un promotor específico de tejido puede dirigir la expresión de secuencias unidas de manera operativa en tejidos diferentes del tejido diana. Por consiguiente, según se utiliza en el presente documento, un promotor específico de tejido es uno que dirige la expresión de manera preferente en el tejido diana, pero puede también dar lugar a cierta expresión en otros tejidos también.

Puede usarse una diversidad de promotores específicamente activos en tejidos vegetativos, tales como hojas, tallos, raíces y tubérculos, para expresar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Los ejemplos de promotores específicos de tubérculo incluyen, pero no están limitados a los promotores de clase I y II de patatina (Bevan y col., EMBO J. 8: 1899-1906 (1986); Koster-Topfer y col., Mol Gen Genet. 219: 390-396 (1989); Mignery y col., Gene. 62: 27-44 (1988); Jefferson y col., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990)), el promotor para los genes ADPGPP del tubérculo de la patata, tanto la subunidad grande como la pequeña; el promotor de la sacarosa sintasa (Salanoubat and Belliard, Gene. 60: 47-56 (1987), Salanoubat and Belliard, Gene. 84: 181-185 (1989)); y el promotor para las proteínas principales del tubérculo incluidos los complejos de proteínas de 22 kd y los inhibidores de proteinasa (Hannapel, Plant Physiol. 101: 703-704 (1993)). Los ejemplos de promotores específicos de hoja incluyen, pero no están limitados a los promotores de la ribulosa bifosfato carboxilasa (RBCS o RuBISCO) (véase, por ejemplo, Matsuoka y col., Plant J. 6: 311-319 (1994)); el promotor del gen de la proteína de unión a la clorofila a/b de captación de luz (véase, por ejemplo, Shiina y col., Plant Physiol. 115: 477-483 (1997); Casal y col., Plant Physiol. 116: 1533-1538 (1998)); y el promotor del gen relacionado a myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5) (Li y col., FEBS Lett. 379: 117-121 (1996)). Los ejemplos de promotor específico de raíz incluyen, pero no están limitados al promotor para el gen de quitinasa ácida (Samac y col., Plant Mol. Biol. 25: 587-596 (1994)); los subdominios específicos de raíz del promotor de CaMV35S que se han identificado (Lam y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 7890-7894 (1989)); el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes que exhibe alta actividad en las raíces (Hansen y col., Mol. Gen. Genet. 254: 337-343 (1997)); el promotor para el gen específico de raíz del tabaco TobRB7 (Yamamoto y col., Plant Cell 3: 371-382 (1991)); y los promotores específicos de células de la raíz informados por Conkling y col. (Conkling y col., Plant Physiol. 93: 1203-1211 (1990)).

Otra clase de promotores específicos de tejidos vegetativos útiles son los promotores meristemáticos (punta de la raíz y ápice del brote). Por ejemplo, pueden usarse los promotores "SHOOTMERISTEMLESS" y "SCARECROW", que son activos en el desarrollo de meristemas del brote o de la raíz apical (Di Laurenzio y col., Cell 86: 423- 433 (1996); Long, Nature 379: 66-69 (1996)). Otro ejemplo de un promotor útil es el que controla la expresión del gen de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa HMG2, cuya expresión está restringida a tejidos meristemáticos y de las flores (zona secretora del estigma, granos de polen maduros, tejido vascular del gineceo y óvulos fertilizados) (véase, por ejemplo, Enjuto y col., Plant Cell. 7: 517-527 (1995)). También otro ejemplo de un promotor útil es el que controla la expresión de genes relacionados con knl del maíz y de otras especies que muestran expresión específica de meristema (véase, por ejemplo, Granger y col., Plant Mol Biol. 31: 373-378 (1996); Kerstetter y col., Plant Cell 6: 1877-1887 (1994); Hake y col., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350: 45-51 (1995)).

Otro ejemplo de promotor meristemático es el promotor KNAT1 de Arabidopsis thaliana. En el ápice del brote, la transcripción de KNAT1 se localiza principalmente hacia el meristema apical del brote; la expresión de KNAT1 en el meristema del brote disminuye durante la transición floral y está restringido a la corteza del tallo de la inflorescencia (véase, por ejemplo, Lincoln y col., Plant Cell 6: 1859-1876 (1994)).

Los promotores específicos de semilla adecuados pueden obtenerse de los siguientes genes: MAC1 del maíz (Sheridan y col., Genetics 142: 1009-1020 (1996)); Cat3 del maíz (número de GenBank L05934, Abler y col., Plant Mol. Biol. 22: 10131-10138 (1993)); vivparous-1 de Arabidopsis (número de Genbank. U93215); Atimyc1 de Arabidopsis (Urao y col., Plant Mol. Biol. 32: 571-57 (1996); Conceicao y col., Plant 5: 493-505 (1994)); napA de Brassica napus (número de GenBank. J02798); la familia del gen de napina de Brassica napus (Sjodahl y col., Planta 197: 264-271 (1995)).

También puede usarse el promotor específico de óvulo para el gen BEL1 (Reiser y col. Cell 83: 735-742 (1995), número de GenBank U39944; Ray y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5761-5765 (1994)). Los promotores MEA (FIS1) y FIS2 específicos del huevo y de las células centrales son también promotores específicos de tejido reproductor útiles (Luo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 10637-10642 (2000); Vielle-Calzada, y col., Genes Dev. 13: 2971-2982 (1999)).

En el maíz se ha identificado a un promotor específico del polen del maíz (Guerrero y col., Mol. Gen. Genet. 224: 161-168 (1990)). También se han descrito otros genes expresados específicamente en el polen (véase, por ejemplo, Wakeley y col., Plant Mol. Biol. 37: 187-192 (1998); Ficker y col., Mol. Gen. Genet. 257: 132-142 (1998); Kulikauskas y col., Plant Mol. Biol. 34: 809-814 (1997); Treacy y col., Plant Mol. Biol. 34: 603-661 (1997)).

También pueden usarse promotores procedentes de genes que codifican las proteínas embrionarias de almacenamiento, que incluyen el gen que codifica la proteína de almacenamiento de 2S de Brassica napus (Dasgupta y otros, gen 133: 301-302 (1993)); la familia del gen de la proteína del almacenamiento de la semilla 2S del Arabidopsis; el gen que codifica la oleosina de 20 kD de Brassica napus (número de GenBank M63985); los genes que codifican la oleosina A (número de GenBank U09118) y la oleosina B (número de GenBank U09119) de la soja; el gen que codifica la oleosina de Arabidopsis (número de GenBank Z17657); el gen que codifica la oleosina de 18 kD del maíz (número de GenBank J05212, Lee, Plant Mol. Biol. 26: 1981-1987 (1994)); y el gen que codifica la proteína rica en azufre de bajo peso molecular de la soja (Choi y col., Mol. Gen. Genet. 246: 266-268 (1995).

También pueden usarse promotores procedentes de los genes que codifican la zeína (que incluyen los genes de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD y gamma) (Pedersen y col., Cell 29: 1015-1026 (1982)). Las zeínas son un grupo de proteínas de almacenamiento que se encuentran en el endosperma del maíz.

Otros promotores que se sabe que actúan, por ejemplo, en el maíz, incluyen los promotores para los siguientes genes: waxy, Brittle, Shrunken 2, enzimas de ramificación I y II, sintasas de almidón, enzimas de desramificación, oleosinas, glutelinas y sintasas de sacarosa. Un promotor particularmente de preferencia para la expresión de endosperma del maíz es el promotor para el gen de glutelina del arroz, más particularmente el promotor Osgt-1 (Zheng y col., Mol. Cell Biol. 13: 5829-5842 (1993)).

Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en el trigo incluyen los promotores para las subunidades de la ADPglucosa pirofosforilasa (ADPGPP), las sintasas unidas a gránulos y otras sintasas de almidón, las enzimas de ramificación y desramificación, las proteínas abundantes de embriogénesis, las gliadinas y las gluteninas. Los ejemplos de tales promotores en el arroz incluyen los promotores para las subunidades de ADPGPP, las sintasas unidas a gránulos y otras sintasas de almidón, las enzimas de ramificación, las enzimas de desramificación, las sintasas de sacarosa y las glutelinas. Un promotor particularmente de preferencia es el promotor para la glutelina del arroz, Osgt-1. Los ejemplos de tales promotores para la cebada incluyen aquellos para las subunidades de ADPGPP, las sintasas unidas a gránulos y otras sintasas de almidón, las enzimas de ramificación, las enzimas de desramificación, las sintasas de sacarosa, las hordeínas, las globulinas del embrión y las proteínas específicas de aleurona.

Puede usarse un promotor del tomate activo durante la maduración, la senescencia y la abscisión de las hojas y, en menor grado, de las flores (Blume y col., Plant J. 12: 731-746 (1997)).

Otros promotores de ejemplo incluyen a promotor específico del pistilo en el gen SK2 de la patata (Solarium tuberosum L.), que codifica una endoquitinasa básica específica de pistilo (Ficker y col., Plant Mol. Biol. 35: 425-431 (1997)); el gen Blec4 del guisante (Pisum sativum cv. Alaska), activo en el tejido epidérmico de los ápices de los brotes vegetativos y florales de la alfalfa transgénica. Esto le convierte en una herramienta útil para dirigir la expresión de genes extraños hacia la capa epidérmica de brotes en crecimiento activo. El promotor E8 específico de tejido del tomate es también útil para dirigir la expresión de genes en frutas. Se reconoce que otros promotores que pueden utilizarse están descritos, por ejemplo, en las Patentes de EEUU Nº 5.378.619, 5.391.725, 5.428.147, 5.447.858, 5.608.144, 5.608.144, 5.614.399, 5.633.441, 5.633.435 y 4.633.436).

Además, puede utilizarse un potenciador específico de tejido (Fromm y col., The Plant Cell 1: 977-984 (1989)). Se reconoce también que, puesto que en la mayoría de los casos no se han definido totalmente los límites exactos de las secuencias reguladoras, fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad de promotor idéntica.

La "secuencia líder de la traducción" significa una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificadora. La secuencia líder de la traducción está presente en el ARNm totalmente procesado secuencia arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia líder de la traducción puede afectar al procesamiento de la transcripción primaria al ARNm, a la estabilidad del ARNm o a la eficacia de traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias líderes de la traducción (Patente de EEUU Nº 5.659.122 y Turner and Foster, Molecular Biotechnology 3: 225 (1995)).

Las "secuencias 3' no traducidas" significa secuencias de ADN localizadas secuencia abajo de una secuencia de nucleótidos estructural e incluyen las secuencias que codifican poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión del gen. Las señales de poliadenilación funcionan en las plantas provocando la adición de nucleótidos poliadenilato al extremo 3' del precursor del ARNm. La secuencia de poliadenilación puede proceder del gen natural, de una diversidad de genes de plantas, o de T-DNA. Un ejemplo de secuencia de poliadenilación es la secuencia 3' de la nopalina sintasa (NOS 3'; Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807 (1983)). El uso de diferentes secuencias 3' no traducidas es mostrado como ejemplo por Ingelbrecht y col., Plant Cell 1: 671-680 (1989)).

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden también incluir intrones. Por lo general, la expresión óptima en plantas monocotiledóneas y algunas dicotiledóneas se obtiene cuando se inserta una secuencia de intrón entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural u, opcionalmente, puede insertarse en la secuencia codificadora estructural para proporcionar una secuencia codificadora interrumpida. Un ejemplo de tal secuencia de intrón es el intrón HSP 70 descrito en el documento WO 93/19189.

Los procedimientos de laboratorio en tecnología de ADN recombinante usados en el presente documento son muy conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Las técnicas convencionales se utilizan para la clonación, el aislamiento, la amplificación y purificación de ADN y ARN. Las reacciones enzimáticas que implican generalmente ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción y similares se realizan según las especificaciones del fabricante. Estas técnicas y otras diversas técnicas se realizan por lo general según Sambrook y col., Molecular
Cloning - A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

El aislamiento y la identificación de las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la presente invención de la soja, del maíz, del arroz y de otras especies se describen en detalle en los Ejemplos. Todas o un parte sustancial de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden utilizarse para aislar los ADNc y las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos homólogos de las mismas o de otras especies de plantas.

Una "parte sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende una parte suficiente de la secuencia para dar la identificación y/o el aislamiento específico de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia. Las secuencias de nucleótidos pueden ser evaluadas manualmente por el experto en la técnica, o usando herramientas computerizadas de comparación y de identificación de secuencias que utilizan algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y col. J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1993). Por lo general, es necesaria una secuencia de treinta o más nucleótidos contiguos para identificar de manera supuesta una secuencia de nucleótidos como homóloga a un gen. Por otra parte, con respecto a las secuencias de nucleótidos, pueden utilizarse sondas de oligonucleótido específicas de gen que comprenden 30 o más nucleótidos contiguos en procedimientos de identificación de genes dependientes de secuencias (por ejemplo, hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófagos). Además, pueden usarse oligonucleótidos cortos de 12 o más nucleótidos como cebadores de amplificación en PCR para obtener una molécula de ácido nucleico particular que comprenda los cebadores. El técnico experto, con la ventaja de las secuencias según se informan en el presente documento, puede usar ahora toda o una parte sustancial de las secuencias dadas a conocer para los fines conocidos por los expertos en esta técnica. Por consiguiente, la presente invención comprende las secuencias completas según se informan en el Listado de Secuencias adjunto, así como partes sustanciales de esas secuencias como se definió anteriormente.

El aislamiento de las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos homólogos usando protocolos dependientes de la secuencia se conoce bien en la técnica. Los ejemplos de protocolos dependientes de la secuencia incluyen, pero no están limitados a, los procedimientos de hibridación de moléculas de ácido nucleico y los procedimientos de amplificación de ADN y ARN según se da como ejemplo por medio de diversos usos de las tecnologías de amplificación de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa).

Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico estructural que codifican otros polipéptidos de la presente invención, como ADNc o ADN genómicos, podrán aislarse directamente usando todas o una parte sustancial de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención como sondas de hibridación de ADN para cribar bibliotecas genómicas o de ADNc de cualquier planta deseada utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos para formar tales bibliotecas son muy conocidos en la técnica. Las sondas de oligonucleótidos específicas basadas en las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden diseñarse y sintetizarse por medio de procedimientos muy conocidos en la técnica. Por otra parte, pueden usarse las secuencias completas de las moléculas de ácido nucleico directamente para sintetizar sondas de ADN por medio de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica tales como la marcación aleatoria de ADN con cebadores, técnicas de traducción de mellas o de marcación de extremos, o sondas de ARN usando sistemas disponibles de transcripción in vitro. Además, pueden diseñarse cebadores específicos y utilizarse para amplificar una parte o la totalidad de las secuencias. Los productos de amplificación resultantes pueden marcarse directamente durante las reacciones de amplificación o pueden marcarse después de las reacciones de amplificación, y utilizarse como sondas para aislar el ADNc integral o ADN genómicos bajo condiciones de rigurosidad adecuadas.

Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico de interés pueden amplificarse a partir de muestras de ácido nucleico usando técnicas de amplificación. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico dadas a conocer pueden utilizarse para definir un par de cebadores que pueden utilizarse con la reacción en cadena de la polimerasa (Mullis, y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich y col., documentos EP 50.424; EP 84.796, EP 258.017, EP 237.362; Mullis, documento EP 201.184; Mullis y col., Patente de EEUU Nº 4.683.202; Erlich, Patente de EEUU Nº 4.582.788; y Saiki, R. y col., Patente de EEUU Nº 4.683.194) para amplificar y para obtener cualquier molécula de ácido nucleico deseada directamente a partir del ARNm, del ADNc, de las bibliotecas genómicas o de las bibliotecas de ADNc. La PCR y otros procedimientos de amplificación in vitro pueden también ser útiles, por ejemplo, para clonar las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos a expresar, para producir las moléculas de ácido nucleico a usar como sondas para la detección de la presencia del ARNm deseado en las muestras, para la secuenciación de ácidos nucleicos, o para otros fines. Además, pueden usarse dos segmentos cortos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en protocolos de reacción en cadena de la polimerasa para amplificar moléculas de ácido nucleico más largas que codifican homólogos de un polipéptido de la presente invención a partir de ADN o de ARN. Por ejemplo, el técnico experto puede seguir el protocolo de RACE (Frohman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998 (1988)) para generar los ADNc usando PCR para amplificar copias de la región entre un punto único en el transcripto y el extremo 3' ó 5'. A partir de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden diseñarse cebadores orientados en dirección 3' y 5'. Usando los sistemas 3' RACE o 5' RACE disponibles en el comercio (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EEUU), pueden aislarse fragmentos de ADNc específicos 3' ó 5' (Ohara y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5673 (1989); Loh y col., Science 243: 217 (1989)). Los productos generados por los procedimientos 3' y 5' RACE pueden combinarse para generar ADNc de longitud total (Frohman and Martin, Techniques 1: 165 (1989)).

Las moléculas de ácido nucleico de interés pueden también sintetizarse, totalmente o en parte, en especial en los casos en que es deseable proporcionar secuencias preferidas de plantas, por medio de técnicas bien conocidas como se describe en la literatura técnica. Véase, por ejemplo, Carruthers y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418 (1982), y Adams y col., J. Am. Chem. Soc. 105: 661 (1983).

Por consiguiente, todas o una porción de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden sintetizarse usando los codones de preferencia por medio de una planta huésped seleccionada. Los codones preferidos de las plantas pueden determinarse, por ejemplo, a partir de los codones utilizados con más frecuencia en las proteínas expresadas en una especie de planta huésped particular. Otras modificaciones de las secuencias genéticas pueden dar lugar a mutantes que tienen actividad ligeramente alterada.

La disponibilidad de las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido de la presente invención facilita el cribado inmunológico de las bibliotecas de expresión de ADNc. Pueden sintetizarse polipéptidos sintéticos que representan porciones de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención. Estos polipéptidos pueden utilizarse para inmunizar animales para producir anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad para los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos. Estos anticuerpos pueden utilizarse a continuación para cribar las bibliotecas de expresión de ADNc para aislar los clones de ADNc de longitud total de interés (Lemer, Adv. Immunol. 36: 1 (1984); Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor. (1989)). Se entiende que la persona experta en la técnica está familiarizada con los recursos convencionales que describen las condiciones específicas y los procedimientos para la construcción, manipulación y el aislamiento de anticuerpos (véase, por ejemplo, Harlow and Lane, en Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988)).

Todas o un parte sustancial de las moléculas de ácido nucleico definidas anteriormente pueden también utilizarse como sondas para obtener el mapa genético y físico de los genes de los que son parte, y como marcadores para las características ligadas a esos genes. Tal información puede ser útil en la generación de plantas para desarrollar líneas con fenotipos deseados. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden utilizarse como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Las transferencias Southern (Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)) del ADN genómico de plantas tratado con enzimas de restricción puede sondarse con los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención. Los patrones de bandas resultantes pueden someterse a continuación a análisis genético usando programas de ordenador tales como MapMaker (Lander y col., Genomics 1: 174-181 (1987)), para construir un mapa genético. Además, los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden utilizarse para sondar las transferencias Southern que contienen ADN genómicos tratados con endonucleasas de restricción de una serie de individuos que representan la población parental y la progenie de un cruce genético definido. Se observa la segregación de los polimorfismos del ADN y se utiliza para calcular la posición de la secuencia de nucleótidos de la presente invención en el mapa genético obtenido previamente usando esta población (Botstein y col., Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331 (1980)).

La producción y el uso de las sondas procedentes de genes de plantas para uso en la obtención del mapa genético se describe en Bernatzky and Tanksley, Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41 (1986).

Numerosas publicaciones describen la obtención de mapas genéticos de clones de ADNc específicos usando los procedimientos anteriormente descritos o variaciones de los mismos. Por ejemplo, pueden utilizarse poblaciones de entrecruzamiento F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones acopladas aleatoriamente, líneas isogénicas próximas, germoplasmas exóticos y otras series de individuos para la obtención del mapa genético. Tales procedimientos son muy conocidos por los expertos en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico procedentes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden también utilizarse para la obtención del mapa físico (es decir, la colocación de las secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel y col., en: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, páginas 319-346, y referencias citadas en el mismo).

También se dan a conocer sondas de ácido nucleico procedentes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que pueden utilizarse en la obtención de mapas de hibridación in situ por fluorescencia directa (FISH) (Trask, Trends Genet. 7: 149-154 (1991)).

Aunque los procedimientos actuales de obtención de mapas por FISH favorecen el uso de grandes clones (de varios cientos de KB; véase Laan y col., Genome Res. 5: 13-20 (1995)), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la obtención de mapas por FISH usando sondas más cortas.

Pueden llevarse a cabo una diversidad de procedimientos de obtención de mapas genéticos y físicos basados en la amplificación de ácidos nucleicos usando las moléculas de nucleótidos de la presente invención. Los ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian y col., J. Lab. Clin. Med. 11: 95-96 (1989)), el polimorfismo de los fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield y col., Genomics 16: 325-332 (1993)), la unión específica de alelos (Landegren y col., Science 241: 1077-1080 (1988)), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov y col., Nucleic Acid Res. 18: 3671 (1990)), la obtención de mapas híbridos de radiación (Walter y col., Nat. Genet. 7: 22-28 (1997)) y Happy Mapping (Dear and Cook, Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807 (1989)).

Para estos procedimientos, se utiliza la secuencia de un fragmento de ácido nucleico para diseñar y producir las parejas de cebadores para uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión del cebador. El diseño de tales cebadores es muy conocido por los expertos en la técnica. En los procedimientos que utilizan la obtención de mapa genético basada en PCR, puede ser necesario identificar diferencias de la secuencia de ADN entre los parentales del cruce de mapas en la región correspondiente a la secuencia de nucleótidos. Esto, sin embargo, por lo general no es necesario para los procedimientos de obtención de mapas.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden encontrar utilidad en la identificación de fenotipos mutantes con pérdida de función de una planta, por una mutación en uno o más genes endógenos que codifican los polipéptidos de la presente invención. Esto puede conseguirse usando protocolos de interrupción dirigida de genes o identificando los mutantes específicos para estos genes contenidos en una población de plantas que llevan las mutaciones en todos los genes posibles (Ballinger and Benzer, Proc. Natl. Acad Sci USA 86: 9402-9406 (1989); Koes y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8149-8153 (1995); Bensen y col., Plant Cell 7: 75-84 (1995)).

El último enfoque puede conseguirse se dos maneras. Primero, pueden usarse segmentos cortos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en protocolos de la reacción en cadena de la polimerasa conjuntamente con un cebador de la secuencia de la mutación marcadora en ADN preparados a partir de una población de plantas en las que se han introducido transposones de mutación o algún otro elemento de ADN que cause mutación. La amplificación de un fragmento de ADN específico con estos cebadores indica la inserción del elemento marcador de la mutación dentro o en proximidad del gen de la planta que codifica el(los) polipéptido(s) de la presente invención. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden utilizarse como sonda de hibridación frente a los productos de amplificación de PCR generados a partir de la población de la mutación usando el cebador de la secuencia del marcador de la mutación conjuntamente con un cebador del sitio genómico arbitrario, tal como el correspondiente a un adaptador sintético anclado al sitio de la enzima de restricción. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden mutarse por una diversidad de procedimientos muy conocidos en la técnica (Shortle D. y col., Annu. Rev. Genet. 15: 265.1981; Itakura K. y col., Ann Rev. Biochem 53: 323, 1984; Botstein D. & Shortle D., Science 229: 1193, 1985; Smith M., Ann. Rev. Genet. 19: 423, 1985; y Sambrook y col., en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989).

Estas mutaciones también pueden introducirse provocando mutación puntual o mutagénesis dirigida al sitio usando kits disponibles en el comercio tales como QuickChange^{TM} de Stratagene (11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037). Por ejemplo, las mutaciones dirigidas al sitio pueden incluir, pero no están limitadas a, truncamientos, sustituciones, adiciones, terminaciones, fusiones de polipéptidos o ácido nucleico. Con cualquier procedimiento, puede identificarse y obtenerse una planta que contenga una mutación en los genes endógeno que codifican los polipéptidos de la presente invención. Tales plantas también pueden obtenerse por mutagénesis dirigida al sitio in situ. Esta planta mutante puede usarse posteriormente para determinar o para confirmar la función natural de los polipéptidos de la presente invención dados a conocer en el presente documento.

Los procedimientos para introducir mutaciones genéticas en los genes de plantas son muy conocidos. Por ejemplo, las semillas u otros materiales de las plantas pueden tratarse con una sustancia química mutagénica, según las técnicas convencionales. Tales sustancias químicas incluyen, pero no están limitadas a, las siguientes: sulfato de dietilo, etilenimina, metanosulfonato de etilo y N-nitroso-N-etilurea. Como alternativa, puede usarse radiación ionizante de fuentes tales como, por ejemplo, rayos X o rayos gamma. Los mutantes deseados se seleccionan realizando ensayos de aumento de la masa de las semillas, del contenido de aceite y de otras propiedades.

"Región C terminal" se refiere a la región de un péptido, polipéptido o cadena de proteína desde su mitad hasta el extremo que lleva el aminoácido que tiene un grupo carboxilo libre.

"Región N terminal" se refiere a la región de un péptido, polipéptido o cadena de proteína desde el aminoácido que tiene un grupo amino libre hasta la mitad de la cadena.

Construcciones de ADN recombinante de plantas y plantas transformadas

La frase "planta transgénica" significa una planta que contiene un ácido nucleico exógeno, que puede proceder de la misma especie de planta o de una especie diferente. Por "exógeno" se entiende que una molécula de ácido nucleico se origina fuera de la planta en la que se introduce la molécula de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico exógeno puede tener una secuencia de nucleótidos natural o no natural. Un experto en la técnica sabe que una molécula de ácido nucleico exógeno puede ser una molécula de ácido nucleico heterólogo procedente de una especie de planta diferente de la planta en la que se introduce la molécula de ácido nucleico o puede ser una molécula de ácido nucleico procedente de la misma especie de planta que la planta en la que se introduce.

El término "genoma" según se aplica a las células de plantas abarca no sólo el ADN cromosómico que se encuentra dentro del núcleo, sino también el ADN de los orgánulos que se encuentra dentro de los componentes subcelulares de la célula. Los ADN de la presente invención introducidos en las células de plantas pueden, por consiguiente, estar integrados en los cromosomas o localizados en los orgánulos. El término "genoma" según se aplica a las bacterias abarca el cromosoma y los plásmidos dentro de una célula huésped bacteriana. Los ADN codificadores de la presente invención, introducidos en las células huésped bacterianas pueden estar, por consiguiente, integrados en el cromosoma o localizados en los plásmidos.

Las moléculas de ácido nucleico exógeno pueden transferirse a una célula de planta por medio del uso de una construcción de ADN recombinante (o un vector) diseñado para tal fin. La presente invención también proporciona una construcción de ADN recombinante de planta (o un vector) para producir plantas transgénicas, en la que la construcción de ADN recombinante de planta (o el vector) comprende un oligonucleótido o un polinucleótido sentido o un oligonucleótido o un polinucleótido complementario o antisentido. Pueden usarse procedimientos que son muy conocidos por los expertos en la técnica para preparar la construcción de ADN recombinante de planta (o el vector) de la presente invención. Estos procedimientos incluyen las técnicas in vitro de ADN recombinante, las técnicas sintéticas y la recombinación genética in vivo. Tales técnicas están descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y. (1989); y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y. (1989).

Una construcción de ADN recombinante de planta (o un vector) de la presente invención contiene un oligonucleótido o un polinucleótido sentido o un oligonucleótido o un polinucleótido antisentido y secuencias reguladoras o elementos de control unidos de manera operativa. Las secuencias reguladoras de ejemplo incluyen, pero no están limitadas a, promotores, secuencias líderes de la traducción, intrones, secuencias 3' no traducidas. Los promotores pueden ser promotores constitutivos, inducibles o de preferencia específicos de tejido.

Una construcción de ADN recombinante de planta (vector) de la presente invención comprenderá típicamente a marcador seleccionable que confiere un fenotipo seleccionable a las células de las plantas. Los marcadores seleccionables pueden utilizarse también para seleccionar las plantas o las células de las plantas que contienen las moléculas de ácido nucleico exógeno de la presente invención. El marcador puede codificar la resistencia a biocidas, resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, bleomicina G418, higromicina, etc.), o resistencia a herbicidas (por ejemplo, glifosato, etc.). Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no están limitados a, un gen neo (Potrykus y col., Mol. Gen. Genet. 199: 183-188 (1985)) que codifica la resistencia a la kanamicina y que puede seleccionarse para usar kanamicina, G418; un gen bar que codifica la resistencia a bialafos; un gen mutante de EPSP sintasa (Hinchee y col., Bio/Technology 6: 915-922 (1988)) que codifica la resistencia al glifosato; un gen de nitrilasa que confiere resistencia al bromoxinilo (Stalker y col., J. Biol. Chem. 263: 6310-6314 (1988)); un gen mutante de la acetolactato sintasa (ALS) que confiere resistencia a la imidazolinona o a la sulfonilurea (Solicitud de Patente Europea 154.204 (11 de septiembre de 1985)); y un gen DHFR resistente al metotrexato (Thillet y col., J. Biol. Chem. 263 : 12500-12508 (1988)).

Una construcción de ADN recombinante de planta (vector) de la presente invención puede también incluir un marcador identificable. Los marcadores identificables pueden utilizarse para controlar la expresión. Los marcadores identificables de ejemplo incluyen un gen de \beta-glucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5: 387-405 (1987); Jefferson y col., EMBO J. 6: 3901-3907 (1987)); un gen R-locus, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en los tejidos de las plantas (Dellaporta y col., Stadler Symposium 11: 263-282 (1988)); un gen de \beta-lactamasa (Sutcliffe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 75: 3737-3741 (1978)), un gen que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow y col., Science 234: 856-859 (1986)) un gen xylE (Zukowsky y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80: 1101-1105 (1983)) que codifica una dioxigenasa de catecol que puede convertir los catecoles cromogénicos; un gen de \alpha-amilasa (Ikatu y col., Bio/Technol. 8: 241-242 (1990)); un gen de tirosinasa (Katz y col., J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714 (1983)) que codifica una enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa a melanina; una \alpha-galactosidasa, que convertirá un sustrato cromogénico de \alpha-
galactosa.

Dentro la frase "genes de marcadores seleccionables o identificables" también están incluidos los genes que codifican un marcador secretable cuya secreción puede detectarse como medio para identificar o seleccionar las células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que puede identificarse por interacción con un anticuerpo, o incluso enzimas secretables que pueden detectarse catalíticamente. Las proteínas secretables entran en una serie de clases, que incluyen las proteínas pequeñas, que pueden difundir, detectables, por ejemplo, por ELISA, enzimas activas pequeñas detectables en disolución extracelular (por ejemplo, \alpha-amilasa, \beta-lactamasa, fosfinotricina transferasa), o proteínas que están insertadas o atrapadas en la pared celular (tales como las proteínas que incluyen una secuencia líder tal como la que se encuentra en la unidad de expresión de extensión o del tabaco PR-S). Otros posibles genes de marcadores seleccionables y/o identificables resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Además de un marcador seleccionable, puede ser deseable usar un gen informador. En algunos casos puede usarse un gen informador con o sin un marcador seleccionable. Los genes informadores son genes que no están típicamente presentes en el organismo o tejido receptor y que codifican típicamente proteínas que dan como resultado cierto cambio fenotípico o propiedad enzimática. Los ejemplos de tales genes se proporcionan en K. Wising y col. Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988).

Los genes informadores preferidos incluyen la beta glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de la cloranfenicol acetil transferasa de Tn9 de E. coli, la proteína fluorescente verde de las medusas bioluminescentes Aequorea victoria, y los genes de luciferasa de la luciérnaga Photinus pyralis. A continuación puede realizarse un ensayo para detectar la expresión del gen informador en un momento adecuado después de la introducción de dicho gen en las células receptoras. Uno de tales ensayos de preferencia implica el uso del gen que codifica la beta-glucuronidasa (GUS) del locus de E. coli como está descrito por Jefferson y col., (Biochem. Soc. Trans. 15, 17-19 (1987)) para identificar las células transformadas. (B) un oligonucleótido o polinucleótido antisentido o un oligonucleótido o polinucleótido sentido de la presente invención; que está unido de manera operativa a (C) una secuencia 3' no traducida que actúa en dicha célula provocando la terminación de la transcripción.

Las plantas transgénicas de la presente invención de preferencia han incorporado en su genoma o transformado en sus genomas de cloroplastos o de plastidios una molécula de ácido nucleico exógeno (o "transgén") que comprende un oligonucleótido o un polinucleótido sentido o un oligonucleótido o un polinucleótido antisentido. Se supone que las plantas transgénicas también comprenden la progenie (descendientes, vástago, etc.) de cualquier generación de tal planta transgénica. Una semilla de cualquier generación de todas esas plantas transgénicas en la que dicha semilla comprende un oligonucleótido o un polinucleótido sentido o un oligonucleótido o un polinucleótido antisentido de la presente invención es también un aspecto importante de la invención.

Las construcciones de ADN de la presente invención pueden introducirse en el genoma de una planta huésped deseada por una diversidad de técnicas de transformación convencionales, que son muy conocidas por los expertos en la técnica. Los procedimientos de transformación de células o de tejidos de plantas de preferencia son el procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium y el procedimiento de transformación biolística o mediado por pistola de partículas. Los vectores adecuados de transformación de plantas para el objetivo de la transformación mediada por Agrobacterium incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como los que dados a conocer, por ejemplo, por Herrera-Estrella y col., Nature 303: 209 (1983); Bevan, Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721 (1984); Klee y col., Bio-Technology 3(7): 637-642 (1985); y la publicación EPO 120.516. Además de los vectores de transformación de plantas derivados de los plásmidos Ti o inductor de raíz (Ri) de Agrobacterium, pueden utilizarse procedimientos alternativos para insertar las construcciones de ADN de la presente invención en las células de plantas. Tales procedimientos pueden implicar, pero no están limitados al uso de, por ejemplo, liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, la administración de ADN libre a través del bombardeo de microproyectiles y la transformación usando virus o
polen.

Un vector de expresión de plásmidos adecuado para la introducción de un oligonucleótido o un polinucleótido antisentido o un oligonucleótido o un polinucleótido sentido en monocotiledóneas usando electroporación o transformación mediada por pistola de partículas está compuesto de lo siguiente: un promotor que es inducible, constitutivo o específico de tejido; un intrón que proporciona un sitio de empalme para facilitar la expresión del gen, tal como el intrón Hsp70 (Patente de EEUU Nº 5.859.347); y una secuencia de poliadenilación 3' tal como la secuencia de la nopalina sintasa 3' (NOS 3'; Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807 (1983)). Esta casete de expresión puede organizarse en replicones de copia alta adecuados para la producción de grandes cantidades de
ADN.

Un ejemplo de vector de casete del plásmido Ti útil para la transformación de plantas está descrito la Patente de EEUU Nº 6.147.278 incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad, y que contiene un gen que codifica una enzima EPSPS que confiere resistencia al glifosato (denominado aroA; CP4), que es un excelente gen de marcador de selección para numerosas plantas. El gen se fusiona al péptido de tránsito de EPSPS del cloroplasto (CTP2) de Arabidopsis y se expresa a partir del promotor del FMV como está descrito en la misma.

Cuando se obtiene una cantidad adecuada de células (o protoplastos) que contienen un oligonucleótido o un polinucleótido antisentido o un oligonucleótido o un polinucleótido sentido de la presente invención, las células (o protoplastos) pueden cultivarse para regenerar plantas enteras. Tales técnicas de regeneración se basan en la manipulación de determinadas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejidos, típicamente basado en un marcador de un biocida y/o un herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La elección de los procedimientos para la etapa de regeneración no es crítica, habiendo disponibles protocolos adecuados para huéspedes de leguminosas (alfalfa, soja, trébol, etc.), Umbelliferae (zanahoria, apio, pastinaca), Cruciferae (col, rábano, canola/colza), Cucurbitaceae (melones y pepino), Gramineae (trigo, cebada, arroz, maíz), Solanaceae (patata, tabaco, tomate, pimientos), diversos cultivos florales, tales como el girasol, y árboles productores de frutos secos, tales como almendras, anacardos, nueces y pacanas. Véase, por ejemplo, Ammirato y col., Handbook of Plant Cell
Culture - Crop Species. Macmillan Publ. Co. (1984); Shimamoto y col., Nature 338: 274-276 (1989); Fromm, UCLA Symposium on Molecular Strategies for Crop Improvement, 16 al 11 de abril de 1990. Keystone, CO (1990); Vasil y col., Bio/Technology 8: 429-434 (1990); Vasil y col., Bio/Technology 10: 667-674 (1992); Hayashimoto, Plant Physiol. 93: 857-863 (1990); y Datta y col., Biotechnology 8: 736-740 (1990). La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados está descrita en Evans y col., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nueva York, 1983; y Binding Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también puede obtenerse a partir de callos, explantes, órganos de plantas, o de sus partes. Tales técnicas de regeneración están descritas en general en Klee y col., Ann. Rev. Plant Phys. 38: 467-486 (1987).

Una planta transgénica formada usando procedimientos de transformación de Agrobacterium contiene típicamente un único gen exógeno en un cromosoma. Puede decirse que estas plantas transgénicas son heterocigotas para el gen exógeno añadido. Resulta de más preferencia una planta transgénica que sea homocigota para el gen exógeno añadido; es decir, una planta transgénica que contenga dos genes exógenos añadidos, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Puede obtenerse una planta transgénica homocigota por unión sexual (autofecundación) de una planta transgénica segregante independiente que contiene un único gen añadido, germinando algunas de las semillas producidas y analizando la presencia de la actividad del gen exógeno de interés en las plantas resultantes producidas.

El desarrollo o la regeneración de plantas transgénicas que contienen la molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de interés es muy conocida en la técnica. De preferencia, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas, como se analizó anteriormente. De otro modo, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con las plantas obtenidas a partir de semillas de líneas agronómicas importantes. Por el contrario, el polen de las plantas de estas líneas importantes se utiliza para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene los polipéptidos deseados de la presente invención se cultiva usando procedimientos muy conocidos por los expertos en la técnica.

Las plantas que pueden producirse para que tengan mayor tamaño de órganos poniendo en práctica la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, la Acacia, la alfalfa, el eneldo, la manzana, el albaricoque, la alcachofa, la arugula, el espárrago, el aguacate, la banana, la cebada, las judías, la remolacha, la zarzamora, el arándano, el brócoli, las coles de bruselas, la col, la canola, el cantalupo, la zanahoria, la mandioca, la coliflor, el apio, la cereza, el cilantro, los cítricos, las clementinas, el café, el maíz, el algodón, el pepino, el abeto de Douglas, la berenjena, la endibia, la escarola, el eucalipto, el hinojo, los higos, la calabaza, la uva, el pomelo, el rocío de miel, la jicama, el kiwi, la lechuga, el puerro, el limón, la lima, el pino taeda, el mango, el melón, la seta, la nuez, la avena, el quingombó, la cebolla, la naranja, una planta ornamental, la papaya, el perejil, el guisante, el melocotón, el cacahuete, la pera, la pimienta, el caqui, el pino, la piña, el plátano, el ciruelo, la granada, el álamo, la patata, la calabaza, el membrillo, el pino radiata, la achicoria roja, el rábano, la frambuesa, el arroz, el centeno, el sorgo, el pino meridional, la soja, la espinaca, la calabaza, la fresa, la remolacha azucarera, la caña de azúcar, el girasol, la batata, el liquidambar, la mandarina, el té, el tabaco, el tomate, el césped, la vid, la sandía, el trigo, el ñames y el
calabacín.

También se dan a conocer células de plantas transgénicas de la presente invención que podrían utilizarse para regenerar una planta o cualquier órgano de la planta con la presente invención.

También se da a conocer un procedimiento para alterar un órgano u órganos específicos en una planta para generar una planta más pequeña u órganos de la planta más pequeños, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) introducir en el genoma de la planta una molécula de ácido nucleico exógeno que comprende en dirección 5' a 3' i) un promotor que actúe en las células de dicha planta, dicho promotor unido de manera operativa a; ii) un oligonucleótido o un polinucleótido antisentido o un oligonucleótido o un polinucleótido sentido de la presente invención, dicho oligonucleótido o polinucleótido antisentido unido de manera operativa a; iii) una secuencia de nucleótidos 3' no traducida que actúa en dichas células de dicha planta provocando la terminación transcripcional; b) obtener células de plantas transformadas que contienen la molécula de ácido nucleico exógeno de la etapa (a); y c) regenerar a partir de dichas células de plantas transformadas una planta transformada en la que está suprimida o inhibida la expresión de un gen endógeno de la presente invención.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para dilucidar mejor la práctica de la presente invención y no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.

En los siguientes ejemplos se hace referencia a bases de datos patentadas y bibliotecas patentadas, por ejemplo, de clones de ADN, disponibles para los autores de la invención de Monsanto Company. Los ejemplos no abarcados por las reivindicaciones se mantuvieron para fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Población de plantas y condiciones de cultivo

Las semillas de Arabidopsis thaliana variedad Columbia se obtuvieron de semillas Lehle (LEHLE SEEDS 1102 South Industrial Blvd., Suite D, Round Rock TX 78681 EEUU). Para desarrollar las plantas a partir de las semillas, se prepararon tiestos de 6,35 cm (2,5 pulgadas) con tierra cubiertos con un velo o una malla de tamizado, cerciorándose de que la tierra no estuviera demasiado apretada y que la malla estuviera en contacto con la superficie de la tierra (esto asegura que las plantas del semillero germinadas serán capaces de atravesar la malla). Se sembraron las semillas y se cubrieron con una cúpula de germinación. Las semillas se vernalizaron durante 3 a 4 días. Las plantas se cultivaron bajo condiciones de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 20-22ºC y humedad del 70%. Se regaron dos veces por semana y se fertilizaron desde la base con 1/2 X (la mitad de la concentración recomendada por el fabricante) fertilizante Peters 20-20-20 (de Hummert International, Earth City, MO). Se añadieron micronutrientes (Hummert's Dyna-grain Soluble Trace Elements) (en la concentración completa recomendada por el fabricante) semana por medio. Tras aproximadamente 1 a 2 semanas, se retiró la cúpula y los tiestos se dividieron en una o dos plantas por tiesto. Cuando se desarrolló el brote primario, se podó para promover la formación de más brotes secundarios. En 5 a 7 días las plantas estuvieron listas para la infiltración.

Aislamiento del gen y su modificación

Se retiraron las hojas senescentes de las plantas cultivadas como se indicó en el Ejemplo 1 anterior. Las hojas senescentes se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido hasta que estuvieron listas para el aislamiento del ARN. Se preparó el ARN a partir de hojas senescentes de Arabidopsis mediante el método de Trizol (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland EEUU) esencialmente según la recomendación del fabricante. Se aisló el ADNc de SAG13 por medio de transcripción inversa a partir del ARN de hojas senescentes anterior usando el kit Superscript II (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EEUU) según las indicaciones del fabricante. Para aislar las moléculas de ADN de la presente invención, se diseñaron dos cebadores específicos del gen, MF16 5'SAG13 y MF17 3'SAG13, en base a la información de la secuencia de SAG 13 (AF192276) de Genbank y se sintetizaron de manera convencional por Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EEUU. La secuencia de MF16 5'SAG13 es ATA TTT AAC AAG CCA TGG CAA AGG A, y la de MF17 3'SAG13 es ATA TGT GTT TGA ATT CAT AGT CTT GAA identificadas como ID. SEC. Nº 55 e ID. SEC. Nº 56 respectivamente en la lista de secuencias, que hibridaron en el gen SAG 13 para introducir el sitio de Nco 1 en el extremo 5' y el sitio de Eco R1 en el extremo 3' del gen. A continuación se llevó a cabo la PCR para amplificar el ADNc de SAG-13 usando el ADNc preparado anteriormente como molde y MF16 5'SAG13 y MF17 3'SAG13 como cebadores. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: 94ºC, 40 segundos, seguido por 30 ciclos de 94ºC, 25 segundos; 55ºC, 30 segundos y 68ºC, 2 minutos y 30 segundos (Todos los reactivos y equipos para PCR pueden obtenerse de Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404, EEUU). El ADNc amplificado se purificó por medio de electroforesis en gel para obtener el gen identificado como ID. SEC.
Nº 1.

Todas las demás secuencias mostradas en la tabla del Ejemplo 8 se aislaron a partir de diferentes especies de plantas mediante el diseño de los cebadores de PCR adecuados basándose en la información de las secuencias proporcionada en la tabla del Ejemplo 8. Para aislar estas secuencias, se aisló el ARN total del cultivo adecuado y de otras especies de plantas combinando tejidos de distintas etapas de desarrollo tanto de órganos vegetales como reproductores. Las secuencias pueden clonarse a partir del ARN total por medio de los procedimientos mostrados en el párrafo anterior. Con el fin de aislar los genes de la invención de microorganismos, se aísla el ADN del microorganismo deseado. El aislamiento del ADN de los microorganismos se conoce bien en la técnica (Sambrook, y col., En: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989). Este ADN junto con los cebadores de oligonucleótidos de PCR pueden ser usados en una reacción en cadena de polimerasa por un experto en la técnica para aislar los genes de la invención.

Cuando se secuenció el producto amplificado ID. SEC. Nº 1, se descubrió que tenía una "T" extra entre las posiciones 622 y 628, comparado con ID. SEC. Nº 3. La adición de una "T" extra en el producto amplificado provocó la generación del codón de terminación en la posición 211 de ID. SEC. Nº 4 y un cambio de aminoácido en la posición 210 de ácido aspártico (D) a arginina (R). Se sabe en la técnica que la reacción en cadena de la polimerasa puede provocar mutaciones puntuales (Cline J, Braman JC, Hogrefe HH; Nucleic Acids Res.; 24 (18): 3546-3551, 1996) como se mostró entre ID. SEC. Nº 1 e ID. SEC. Nº 3. Sin embargo, tal mutación puede crearse en una molécula de ácido nucleico aislado en la posición deseada por una serie de procedimientos conocidos en la técnica (Shortle D. y col., Annu. Rev. Genet. 15: 265, 1981; Itakura K. y col., Ann Rev. Biochem 53: 323, 1984; Botstein D. & Shortle D., Science 229: 1193, 1985; Smith M., Ann. Rev. Genet. 19: 423, 1985; y Sambrook, y col., En: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989). Estas mutaciones también pueden introducirse provocando una mutación puntual o mutagénesis dirigida al sitio en la secuencia de nucleótidos ID. SEC. Nº 3 usando kits disponibles en el comercio tales como el kit Site Directed Mutagenesis QuickChange^{TM} de Stratagene (11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 90% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 241 \pm 3, o para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 80% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 214 \pm 3, o para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 70% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 188 \pm 3, o para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 60% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 161 \pm 3, o para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 50% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 134 \pm 3 del marco de lectura. Estas mutaciones también pueden introducirse in situ provocando mutación puntual o mutagénesis dirigida al sitio en la secuencia de nucleótidos ID. SEC. Nº 3 usando tecnología de mutagénesis dirigida al sitio in situ proporcionada por Valigen Inc. (Newtown PA, EEUU) (Patente de EEUU Número 6.211.351; Patente de EEUU Número 6.271.360, documento WO 01/24615 A1 y documento WO 01/25460 A2) para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 90% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 241 \pm 3, o para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 80% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 214 \pm 3, o para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 70% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 188 \pm 3, o para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 60% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 161 \pm 3, o para dar como resultado un péptido con aproximadamente el 50% del extremo N terminal de ID. SEC. Nº 4 al alterar una secuencia de nucleótidos para codificar un codón de terminación en la posición del aminoácido 134 \pm 3 del marco de lectura. Pueden introducirse otras mutaciones para proporcionar un producto de traducción que sea más largo o más corto que ID. SEC. Nº 1. Puede determinarse que estas secuencias de polinucleótidos modificadas proporcionarán un fenotipo deseado sin
excesiva experimentación.

Ejemplo 2

Elementos genéticos del vector de clonación para expresar proteínas en plantas (Figura 1 y 4)

Las construcciones de ADN usadas son construcciones de transformación de plantas de doble borde que contienen segmentos de ADN que proporcionan la función de replicación y selección de antibióticos en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación de E. coli tal como ori322, un origen de replicación de un amplio espectro de huéspedes tal como oriV u oriRi, y una región codificadora para un marcador seleccionable tal como Spc/Str que codifica Tn7 aminoglicósido adeniltransferasa (aadA) que confiere resistencia a espectinomicina o estreptomicina, o a un marcador seleccionable gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de las plantas, la cepa bacteriana huésped es Agrobacterium tumefaciens ABI o LBA4404.

Los elementos genéticos de las construcciones de ADN se organizaron para tener unido de manera operativa un promotor que actúe en plantas. Además, se incluyó en la construcción del ADN una casete marcadora de antibiótico o de herbicida, una marcador de epítopo (Por ejemplo, número de catálogo de péptidos Flag® F-3290, SIGMA, P.O. Box 14508 St. Louis, MO 63178 EEUU) en la región de terminación 3' del gen de interés. El sitio de clonación múltiple en esta construcción de ADN codifica BglII, NcoI, EcoRI, SalI y XhoI. La región del marcador de epítopo estaba codificada con los sitios de restricción SalI y XhoI para la opcional eliminación del marcador de epítopo. El sitio NcoI codifica una secuencia Kozak para la traducción eficaz de los productos proteicos. Las construcciones de ADN usadas en el procedimiento de la presente invención comprenden cualquier promotor conocido que se sepa que actúa provocando la transcripción en células de plantas y cualquier secuencia de polinucleótidos que codifique tolerancia a antibióticos que se sepa que confiere tolerancia al antibiótico a las células de las plantas. Las secuencias de polinucleótidos de tolerancia a antibióticos incluyen, pero no están limitadas a, secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a antibióticos para la kanamicina, neomicina, higromicina y otros antibióticos conocidos en la técnica. El gen de tolerancia a antibióticos en tal vector puede reemplazarse por uno de tolerancia a herbicidas que codifique la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS, descrito en las Patentes de EEUU Números 5.627.061 y 5.633.435, Padgette y col. (1996) Herbicide Resistant Crops, Lewis Publishers, 53-85, y en Penaloza-Vazquez, y col. (1995) Plant Cell Reports 14: 482-487) y aroA (Patente de EEUU Número 5.094.945) para la tolerancia al glifosato, bromoxinilo nitrilasa (Bxn) para la tolerancia al Bromoxinilo (Patente de EEUU Número 4.810.648), fitoeno desaturasa (crtI (Misawa y col., (1993) Plant Journal 4: 833-840 y (1994) Plant Jour 6: 481-489) para la tolerancia a norflurazona, ácido acetohidroxi sintasa (AHAS, Sathasiivan y col. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 2188-2193) y el gen bar para la tolerancia al glufosinato (DeBlock, y col. (1987) EMBO J. 6: 2513-2519. Los herbicidas para los que se ha demostrado que las plantas transgénicas exhiben tolerancia y que pueden aplicarse en el procedimiento de la presente invención incluyen, pero no están limitados a: glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinilo, delapona, ciclohexanodiona, inhibidores de protoporfirionógeno oxidasa y herbicidas de isoxaflutol.

Los elementos genéticos de construcciones de ADN de transgenes usados para la transformación de plantas y la expresión de transgenes en plantas incluyen, pero no están limitados a: el promotor P-E35S (Patente de EEUU Número 5.539.142, 5.196.525, 5.322.938 y 5.164.316 incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad). El promotor P-E35S puede reemplazarse por el promotor P-CaMV.35S (Patente de EEUU Número 5.858.742), o por P-CaMV.35S potenciado del virus del mosaico de la coliflor que contiene una duplicación de la región -90-300 como está descrito en la Patente de EEUU Número 5.424.200, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad; o el promotor del virus del mosaico de Figwort, P-FMV, como está descrito en la Patente de EEUU Número 5.378.619, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad; o el P-AtEF1a (P-AtEF1 o EF1a) una región del promotor del gen del factor de elongación 1a de Arabidopsis thaliana; el motivo Gbox10 y Gbox11 (Fumiharu y col., (1999) Plant J. 18: 443-448); o la región del promotor DC3 de la zanahoria (Seffens y col., Develop. Genet. 11: 65-76); o el promotor TP12 (número de referencia de GenBank U68483); moléculas de ADN que codifican péptidos de tránsito de plastidios, por ejemplo, el péptido de tránsito del cloroplasto EPSPS de Arabidopsis, At.CTP2 como está descrito en la Patente de EEUU Número 5.633.435, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad. El procedimiento de la presente invención permite a un experto en la técnica de biología molecular de plantas diseñar y organizar las casetes de expresión de plantas que contienen promotores de funciones conocidas y no conocidas. Los elementos genéticos de la construcción de ADN además comprenden los polinucleótidos líderes 5' por ejemplo, la secuencia líder no traducida Hsp70 de Petunia hybrida como está descrita en la Patente de EEUU Número 5.362.865, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad. Los elementos genéticos comprenden además genes de tolerancia a herbicidas que incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, la región codificadora de aroA:CP4 para la enzima EPSPS resistente al glifosato aislada de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) como está descrito en la Patente de EEUU Nº 5.633.435. Los elementos genéticos de la construcción de ADN además comprenden las regiones de terminación 3' que incluyen, pero no están limitadas a, la región de terminación 3' de E9 del gen RbcS del guisante que actúa como una señal de poliadenilación; el nos es el extremo 3' del gen de la nopalina sintasa que actúa como una señal de poliadenilación. Los elementos genéticos de la construcción de ADN además comprenden el borde derecho (BD) y el borde izquierdo (BI) del plásmido Ti de las cepas octopina y nopalina de Agrobacterium tumefaciens.

Ejemplo 3

Clonación de la molécula de ADN aislada

Se digirió el producto amplificado y purificado de ID. SEC. Nº 1 del Ejemplo 1 por medio de las enzimas de restricción Nco1 y EcoR1 (BRL/Life Technologies, Inc., Gainthersburg, MD). El producto digerido se purificó nuevamente por medio de electroforesis antes de unirlo al vector binario pMON23435 que se había linealizado por medio de Nco 1 and Eco R1 y la ligasa de ADN T4 (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). La reacción de unión se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. El plásmido resultante se confirmó por medio de la obtención del mapa de restricción y por secuenciación. Tras la reacción de unión del fragmento Nco-EcoR1 de ID. SEC. Nº 1 en el vector pMON23435, la nueva construcción se denominó construcción pMON57521. La construcción pMON57521 se transformó en plantas de Arabidopsis por medio del procedimiento de transformación mediado por
Agrobacterium.

Un experto en la técnica puede clonar el producto de ID. SEC. Nº 1 amplificado y purificado también en la orientación antisentido en sitios de clonación apropiados del vector pMON23435 para expresar la hebra opuesta de ID. SEC. Nº 1.

Ejemplo 4

Clonación de las moléculas de ADN de la presente invención

Este ejemplo ilustra cómo se aíslan todas las otras moléculas de ADN que se muestran en la tabla del Ejemplo 9 de diferentes especies de plantas diseñando los cebadores de PCR adecuados basándose en la información de las secuencias de ADN proporcionadas en la tabla del Ejemplo 8. Para aislar estas moléculas de ADN, un experto en la técnica aislará el ARN total de un cultivo o de otra especie de planta deseada por medio de la combinación de tejidos de diferentes etapas de desarrollo tanto de órganos vegetativos como reproductores. Las moléculas de ADN se clonan a partir del ARN total por medio de los procedimientos que se muestran en el Ejemplo 2. Para aislar los genes de la invención de microorganismos, se deberá aislar el ADN del microorganismo deseado. El aislamiento del ADN de microorganismos es bien conocido en la técnica (Sambrook, y col., In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989). Este ADN junto con los cebadores de oligonucleótidos de PCR pueden ser usados en una reacción en cadena de la polimerasa por un experto en la técnica para aislar los genes de la invención.

El diseño de los cebadores y las condiciones de reacción se determinaron como se describe en la técnica. (PCR Strategies, Editado por Michael A. Innis; David H. Gelfand; John J. Sninsky; Academic Press 1995 y PCR Protocols, A Guide to Method and Applications, Editado por Michael A. Innis; David H. Gelfand; John Sninsky; y Thomas J. White, Academic Press 1990). Todos los reactivos para aislar las secuencias de la invención pueden obtenerse de Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EEUU. Las secuencias de moléculas de ADN aisladas pueden clonarse en sitios de clonación adecuados, en orientación sentido o antisentido, de un vector de expresión de plantas que se muestran en el Ejemplo 3 o en un vector similar capaz de expresar de manera ectópica el gen de interés de la presente invención en orientación sentido o antisentido, como se conoce en la técnica.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra cómo se transforman las células de Agrobacterium y cómo se cultivan las células transformadas.

Transformación

1. Se sometieron 20 \mul de células ABI competentes a electroporación con 2 \mul de la construcción de ADN;

2. Se tomaron las células transformadas por medio de una pipeta y se colocaron directamente en las placas de LB que contenían Espectinomicina (75 \mug/ml), Kanamicina (50 \mug/ml), Cloranfenicol (25 \mug/ml). Se añadieron 50 \mul de medio SOC a la placa y se extendieron;

3. Se incubó la transformación en las placas a 28ºC durante 2 días (o puede cultivarse durante un fin de
semana).

Cultivo de células ABI

1. Se tomaron 3 colonias por placa de ABI y se cultivaron cada una en 4 ml de medio LB que contenía Espectinomicina (75 \mug/ml), Kanamicina (50 \mug/ml), Cloranfenicol (25 \mug/ml);

2. Se incubaron 4 ml de los cultivos a 28ºC, agitando durante 2 días. (Los tubos de cultivo deben estar incli-
nados).

Solución madre de glicerol y preparaciones de ADN

1. Se prepararon tres soluciones madre de glicerol ABI de 1 ml por 4 ml de cultivo, usando 500 \mul de cultivo y 500 \mul de glicerol al 40%. Se congelaron y se almacenaron a -80ºC.

2. El cultivo restante (aproximadamente 2,5 ml) se sometió a Miniprep, usando un kit y el protocolo de miniprep de Qiagen (Qiagen Genomics, Inc., Seattle, WA), asegurándose de añadir la etapa de lavado con tampón PB y tampón EB (Tris-Cl 10 mM, pH 8,5) a 70ºC antes de eluir el ADN de la columna. El volumen resultante por muestra de miniprep deber ser de 50 \mul.

Confirmación de la digestión

1. Usando los mapas de Pollux y de la construcción, se eligieron dos digestos para realizar: uno para verificar la integridad del inserto, uno para verificar la integridad del vector (será necesario referirse a los mapas de
plásmidos);

2. Se digirieron 17 \mul de ADN de miniprep por digesto, dando como resultado un volumen final del digesto de 20 \mul;

3. Se procesaron 20 \mul de cada digesto en gel de agarosa al 1% frente al marcador de peso molecular (DNA ladder) de 1 Kb; y

4. Para 2 de 3 clones confirmados, se realizó la siembra en estrías de las placas de LB que contenían Espectinomicina (75 \mug/ml), Kanamicina (50 \mug/ml), Cloranfenicol (25 \mug/ml) a partir de las soluciones madre de glicerol y ABI y se dejó en cultivo a 28ºC durante 2 días (o pueden cultivarse durante un fin de semana).

Todos los demás reactivos usados en el ejemplo 4 pueden obtenerse de Sigma Chemical Company. Saint Louis, MO, EEUU.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra cómo transformar las plantas de Arabidopsis con construcciones de genes de la presente invención. Las plantas de Arabidopsis pueden ser transformadas por uno cualquiera de muchos procedimientos disponibles. Por ejemplo, las plantas de Arabidopsis pueden ser transformadas usando el procedimiento de transformación in planta por medio por infiltración en vacío (véase, Bechtold y col., In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sci. Paris Sciences de la vie/Life Sciences 316: 1194-1199 (1993)). Las plantas pueden crecer cultivarse como se describió en el Ejemplo 1.

Preparación de Agrobacterium (cultivos a pequeña y a gran escala)

Se realiza la siembra en estrías de la cepa ABI de Agrobacterium en una placa de LB que contiene Espectinomicina 100 mg/l, Estreptomicina 100 mg/l, Cloranfenicol 25 mg/l y Kanamicina 50 mg/l (denominado SSCK). Dos días antes de la infiltración, con un ansa se coloca Agrobacterium en un tubo que contiene 10 ml de LB/SSCK y se coloca en un agitador en la oscuridad a 28ºC para que se desarrolle durante la noche. Al día siguiente, se diluye el Agrobacterium 1:50 en 400 ml de medio de cultivo bacteriano tal como SSCK y se coloca en un agitador a 28ºC para que se desarrolle durante 16-20 horas.

Infiltración

Se recogieron las células de Agrobacterium vertiendo en un frasco de centrifugación de 500 ml y se centrifugó a 3500 rpm durante 20-25 minutos. Se eliminó el sobrenadante por vertido. Se secó el sedimento y a continuación se resuspendió en 25 ml de medio de infiltración (Sales base de MS al 0,5%, Vitamina B-5 de Gamborg al 1%, Sacarosa al 5%, MES 0,5 g/l, pH 5,7) con bencilaminopurina 0,44 nM (BAP) (10 \mul de una disolución madre 1,0 mg/l en DMSO por litro) y Vac-In-Stuff al 0,02% (Silwet L-77) de Lehle Seeds (Round Rock, TX). Se añadieron BAP y Silwet L-77 recién preparados el día de la infiltración. Se añadieron 200 \mul de Silwet L-77 y 20 \mul de BAP (solución madre 0,5 mg/l). Usando el medio de infiltración como blanco, se tomó la DO_{600} de una dilución 1:10 de las suspensiones de Agrobacterium. Se calculó el volumen necesario para 400 ml de medio de suspensión/infiltración de Agrobacterium, DO_{600} = 0,6, para la infiltración en vacío.

Ecuación: \frac{(volumen\ final) * (DO_{600} final)}{DO_{600}} = Volumen\ necesario\ para\ DO_{600}\ final\ de\ 0.6

Se colocó el cultivo resuspendido en un contenedor Rubbermaid dentro de un desecador de vacío. Se invirtieron los tiestos que contenían las plantas para que se infiltren en la disolución de manera que quedó cubierta planta completa, incluida la roseta foliar, pero no se sumergió demasiada tierra. Se empaparon las plantas con agua durante al menos 30 minutos antes de la infiltración. (Esto evita que la tierra absorba la suspensión de Agrobacterium).

\newpage

Se generó un vacío de aproximadamente 584-686 mm de Hg (23-27 pulgadas de Hg) durante 10 minutos. Se liberó rápidamente el vacío. Se drenaron ligeramente los tiestos, se colocaron de lado en una bandeja recubierta con absorbente, se cubrió la bandeja con una cúpula para mantener la humedad y se volvió a colocar en la cámara de cultivo. Al día siguiente, se descubrieron los tiestos, se colocaron en posición vertical y se retiró el absorbente. No se regaron las plantas durante aproximadamente 5 días. Una vez pasados los 5 días, se permitió el riego de las plantas y se siguió el cultivo bajo las mismas condiciones que anteriormente. (Las hojas que se infiltraron pueden degenerar pero la planta deber sobrevivir hasta la culminación de la floración).

Recogida y esterilización de las semillas

Se dió forma de cono a las plantas, individualmente, usando el Lehle Aracons (Lehle Seeds, Round Rock, TX) aproximadamente 2 semanas tras la infiltración. Una vez que toda la semilla había madurado y se había establecido (aproximadamente 4 semanas después de la infiltración), se retiraron las plantas del agua para secar las semillas. Aproximadamente 2 semanas más tarde se recogieron las semillas cortando las ramas por debajo del cono. Se limpió la semilla usando un tamiz para retirar la silicua y el material de las ramas y se dejó pasar las semillas. Se colocaron las semillas en sobres o en tubos cónicos de 15 ml.

Se transfirió la cantidad deseada de semillas a tubos cónicos de 15 ml antes de la esterilización. Se aflojaron las tapas de los tubos cónicos y se colocaron de lado en un desecador de vacío con un vaso de precipitados que contenía 400 ml de lejía Clorox (Clorox Company, Oakland, CA) y 4 ml de ácido clorhídrico. (Se añade el HCl al Clorox en una campana de humos). Se realizó un vacío suficiente para sellar el desecador, y se cerró la succión (es decir, de manera que el desecador siguiera estando bajo vacío pero sin generar vacío directamente) durante aproximadamente 16 horas. Tras la esterilización, se liberó el vacío y se colocaron los tubos que contenían las semillas en una campana estéril (se mantienen las tapas sin apretar para que el gas pueda seguir liberán-
dose).

Se colocaron ("espolvorearon") las semillas en placas de selección que contenían sales base de MS 4,3 g/l, B-5 de Gamborg (500 X) 2,0 g/l, sacarosa 10 g/l, MES 0,5 g/l y Phytagar 8 g/l (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) con Carbenicilina 250 mg/l y Cefotaxima 100 mg/l. Los niveles de selección fueron de kanamicina 60 mg/l, Glifosato 60 \muM o Bialafos 10 mg/l.

En primer lugar podía retirarse de la placa una cantidad muy pequeña de semillas para verificar la contaminación. Si existía contaminación, se volvió a esterilizar las semillas durante aproximadamente otras 4 horas y se verificó nuevamente la contaminación. Por lo general no es necesaria la segunda esterilización, pero a veces la semilla alberga un contaminante fúngico y son necesarias reiteradas esterilizaciones. (La duración de la esterilización es por lo general inferior a 16 horas debido a las tasas de germinación significativamente disminuidas que comienzan a aparecer con una esterilización superior a 24 horas). Se sellaron las placas con parafilm y se colocaron en una habitación fría para vernalizar durante aproximadamente 2-4 días). Después que las semillas se hubieron vernalizado, se colocaron en una cámara percival con lámparas blancas frías.

Transferencia a la tierra

Tras 5-10 días aproximadamente a 26ºC y un ciclo de luz-oscuridad de 16/8, los transformantes resultaron visibles como plántulas verdes. Tras otras 1-2 semanas, las plantas tuvieron al menos un juego de hojas verdaderas. Se transfirieron las plantas a la tierra, se cubrieron con una cúpula de germinación y se llevaron a una cámara de crecimiento bajo condiciones normales de crecimiento de Arabidopsis. Se mantuvo cubierta hasta que resultó evidente nuevo crecimiento (usualmente 5-7 días).

Ejemplo 7

Se usaron las subsecciones del Ejemplo 7 para describir los cambios fenotípicos tras la transformación y el crecimiento de las plantas de Arabidopsis como se describe en el Ejemplo 6. Se seleccionaron tres sucesos diferentes obtenidos a partir de la transformación de pMON57521 (Figura 2) en Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia y se cultivaron intercaladas con plantas de tipo natural. Las condiciones de cultivo fueron de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad, 21 grados Centígrados y humedad relativa del 70%. Las plantas se observaron en todas las etapas de crecimiento y se fotografiaron usando una cámara Olympus C-2500 L (Olympus America Inc., 2 Corporate Center Drive, Melville, NY 11747) según está descrito por el fabricante. Se tomaron imágenes microscópicas de los órganos de las plantas tras una adecuada disección en un microscopio estereoscópico Nikon SMZ 1500 (NIKON, 1300 Walt Whitman Road, Melville, NY 11747) equipado con sistema de obtención de imágenes MagnaFire Digital. La cuantificación de las imágenes se realizó según las instrucciones del fabricante usando los programas informáticos Pro^{TM} o Lucis^{TM} del sistemas de obtención de imágenes Magna Fire Digital (Optronics, 175 Cremona Drive, Goleta, CA 93117). Los tres sucesos mostraron alta coherencia fenotípica en los experimentos preliminares y por consiguiente se eligieron sólo dos sucesos para seguir adelante con el proceso.

Se mostró que las plantas transformadas con la construcción pMON57521 mostraban flores y órganos florales, tales como estambres y pistilos, de 2 a 3 veces más grandes comparadas con las plantas de tipo natural, no transformadas, de la misma especie. También se observó que las plantas transgénicas tenían al menos 2 veces más raíces laterales y los tallos eran de 2 a 3 veces más gruesos comparado con las raíces laterales y los tallos de las plantas de tipo natural, no transformadas, de la misma especie. También se observó que la cantidad y distribución de tricomas era de aproximadamente el doble. La sobreexpresión del polipéptido codificado por la secuencia en la construcción pMON57521 de la presente invención en las plantas transformadas, dio plantas que mostraron un aumento del 100% en el tamaño y peso individual de las semillas. También se observó un aumento de aproximadamente el 20% en el rendimiento de semillas/planta para las plantas transformadas con pMON57521 comparado con el rendimiento de semillas/planta de las plantas de tipo natural, no transformadas, de la misma especie. Las líneas se siguieron hasta 6 generaciones tras la transformación y parecieron ser altamente constantes en el mantenimiento de los cambios fenotípicos
observados.

(A) Tamaño de las semillas

Las semillas de las plantas transformadas mostraron un aumento del tamaño, las semillas resultaron aproximadamente dos veces más grandes que las semillas de las plantas de tipo natural como se muestra en la siguiente tabla. Los tamaños de las imágenes se determinaron mediante el programa informático Pro^{TM} o Lucis^{TM} (Optronics, 175 Cremona Drive, Goleta, CA 93117) basándose en el valor de píxeles de la imagen de la semilla de las plantas de tipo natural y de de las plantas transformadas bajo la misma resolución. Las líneas de plantas 8752-1, 8752-2, 8752-6 y 8752-7 en la Tabla 1 corresponden a diferentes líneas de plantas transgénicas producidas por transformación de las plantas naturales de Arabidopsis con pMON57521.

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TABLA 1 Tamaño de las semillas

1

TABLA 1 (continuación)

2

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(B) Peso de las semillas

Se encontró también que las semillas de las plantas que contienen las líneas pMON57521 eran más pesadas que las semillas de tipo natural. El peso de las semillas se midió de 2 líneas producidas del suceso 8752 (8752-1 y 8752-6) y 2 líneas del suceso 8748 (8748-2 y 8748-7) y se comparó con el tipo natural. A continuación se muestra un análisis del peso representativo de las semillas. Para cada línea, se midieron 3 repeticiones (es decir, se contaron 50 semillas y se midieron cada vez). Este análisis se repitió con diferentes conteos de semillas (es decir, con 100 semillas ó 150 semillas) y se encontró que era altamente reproducible. Por ejemplo, el peso por 100 semillas es similarmente alto, de aproximadamente 0,0025 gramos para las semillas de las plantas de tipo natural y 0,0046 gramos para las semillas de las plantas transformadas con las secuencias de la presente invención. Los datos también fueron altamente reproducibles dentro de una línea dada y a través de las líneas. Se extrapoló el peso promedio de una semilla única de una línea transformada con la secuencia de la presente invención para que fuera aproximadamente 0,048 mg a diferencia de los 0,026 mg para una semilla de tipo natural. Las líneas de plantas 8752-1, 8752-6, 8748-2 y 8748-7 en la Tabla 2 corresponden a diferentes líneas de plantas transgénicas producidas por transformación de plantas naturales de Arabidopsis con pMON57521.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Peso de las semillas

3

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(C) Cantidad de semillas

Se encontró que las líneas que sobreexpresan la secuencia de la presente invención tenían menos semillas por silicua en comparación con las plantas de tipo natural. La cantidad promedio de semillas/silicua de madurez equivalente fue de 34 para las plantas transgénicas de la presente invención en comparación con las 52 para las plantas de tipo natural. El análisis se repitió tres veces con resultados altamente reproducibles dentro de y entre los sucesos.

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TABLA 3 Cantidad de semillas

4

TABLA 3 (continuación)

5

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(D) Rendimiento de semillas

Hubo un aumento del rendimiento de semillas > 20% en las plantas transgénicas de la presente invención. El rendimiento de semillas se midió en términos de peso de semillas totales por planta.

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TABLA 4 Rendimiento de semillas

6

TABLA 4 (continuación)

7

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Ejemplo 8

Este ejemplo describe los cambios en el patrón de ramificación tras la transformación y el cultivo de las plantas de Arabidopsis según se describe en Ejemplo 6.

Las plantas de Arabidopsis que sobreexpresan las moléculas del polipéptido correspondientes a ID. SEC. Nº 2 parecen tener más ramas que las plantas de tipo natural. Esto da como resultado un aumento neto en la cantidad de silicua. Aunque cada silicua transgénica parece tener menos semillas que una silicua equivalente de tipo natural, el aumento en la ramificación parece compensar, dando como resultado un aumento neto del rendimiento total de semillas. Se comparó el patrón de ramificación de las líneas de Arabidopsis que sobreexpresan el polipéptido de la presente invención con las plantas de tipo natural y se mostró que las plantas transgénicas tenían más ramas que las plantas de tipo natural. Todas las mediciones se tomaron en la etapa de crecimiento 6,5 que corresponde a una etapa de crecimiento de Arabidopsis en la que la planta todavía está creciendo activamente (media floración). En la etapa de crecimiento 6,9 las plantas habían comenzado la senescencia y la producción de flores se había interrumpido con < 5 flores abiertas. Por consiguiente, la etapa de crecimiento 6,5 da una estimación bastante precisa de la tasa de crecimiento de la planta antes de la senescencia. En la siguiente tabla se muestra un promedio del número de silicuas en la etapa de crecimiento 6,5 estimado para ambas plantas, las de tipo natural y las transgénicas y el número total de silicuas. Esto indica nuevamente que la cantidad de silicuas fue al menos un 28% mayor en las líneas que sobreexpresan las moléculas de polipéptido correspondiente a ID. SEC. Nº 2 (líneas transformadas) comparadas con las líneas de tipo natural en la misma etapa de crecimiento. A medida que la planta se acerca a la senescencia, el aumento relativo parece mantenerse constante y, junto con el aumento en el peso de las semillas en las plantas transgénicas, contribuye al aumento total del rendimiento de semillas por planta. La estimación de la etapa de crecimiento se basó en "Growth stage- based phenotypic analysis of Arabidopsis: A model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13 (7): 1499, 2001".

TABLA 5 Número de silicuas. TN es planta de tipo natural y Línea transformada es una línea de planta transgénica que expresa las moléculas del polipéptido correspondiente a ID. SEC. Nº 2

8

Ejemplo 9

Este ejemplo describe el aumento de semillas en plantas de soja transgénica que expresan la molécula de polipéptido correspondiente a ID. SEC. Nº 2.

Las plantas de soja se transformaron con pMON73955 (Figura 7) para expresar de manera constitutiva ID. SEC. Nº 2. La transformación de la soja se realizó esencialmente como se describe en el documento WO 00/42207, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad. Se desarrollaron 10 de 44 sucesos de la semilla R1 en Puerto Rico (PR) en base al número de copias del gen en las plantas. La transformación de la soja se realizó esencialmente como se describe en el documento WO 00/42207.

Los datos preliminares indican que 1 de cada 10 sucesos en PR mostró un fenotipo similar al observado para la sobreexpresión de ID. SEC. Nº 2 en Arabidopsis (pMON 57521, Figura 2), es decir, más vainas y más ramas así como vainas gruesas y cortas con menos semillas. Se observaron más vainas con dos semillas y la semilla era más grande que la semilla de las plantas de tipo natural y de las plantas negativas (pero el tamaño de la semilla no se duplicó como se observó en Arabidopsis). Además, las plantas positivas (líneas transgénicas que expresan los genes de interés) de este suceso "A" produjeron más semillas que las negativas (líneas transgénicas que NO expresan los genes de interés) como se muestra en la Tabla 7. La Tabla 6 muestra el peso de las semillas de plantas individuales (sucesos) de la generación R1 y el peso de las semillas en la generación R2. El peso de las semillas R2 en esta tabla es un promedio del peso de las semillas de todas las líneas del suceso R1 original. Todas las cantidades se expresan como un porcentaje del tipo natural (TN). En la Tabla 7 se muestra el peso detallado de las semillas R2 y los datos de cantidad de semillas de líneas únicas (positivas frente a negativas) del mejor suceso "A" se muestra en la Tabla 7. En general, se observa una buena correlación entre positivas y negativas para el tamaño de las semillas y el rendimiento de semillas.

TABLA 6 Pesos de las semillas R1 y R2 de 10 sucesos transgénicos de soja independientes que expresan ID. SEC. Nº 2. Los valores se expresan como un porcentaje del tipo natural donde TN = 100%

9

TABLA 6 (continuación)

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TABLA 7 Pesos de las semillas R2 de líneas individuales del suceso transgénico "A" con semillas más grandes que expresan ID. SEC. Nº 2

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Ejemplo 10

Este ejemplo describe la sobreexpresión de la proteína en células bacterianas para la purificación de la proteína para cribar por actividad de las moléculas de polipéptido.

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(A) Clonación de las moléculas de nucleótidos de la presente invención para la expresión de los péptidos correspondientes

pMON57521 (Figura 2), pMON73963 (Figura 3) o el ADN genómico de Nostoc punctiforme (Nostoc) se usa como fuente de molde de ADN para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN para la clonación en células bacterianas para expresar la proteína de Arabidopsis thaliana correspondiente a ID. SEC. Nº 2, ID. SEC. Nº 4, o la proteína de Nostoc correspondiente a ID. SEC. Nº 50. El diseño de los cebadores y las condiciones de reacción de PCR se determinan como se describe en el artículo PCR Strategies, editado por Michael A. Innis; David H. Gelfand; & Johm J. Sninsky; Academic Press 1995 y PCR Protocols, A Guide to Method and Applications, Editado por Michael A. Innis; David H. Gelfand; Johm J. Sninsky; & Thomas J. White Academic Press 1990. Todos los reactivos para llevar a cabo la reacción de PCR pueden obtenerse de Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EEUU. El termociclador necesario para llevar a cabo la reacción de PCR se obtuvo de Applied Biosystems (Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div., Foster City, CA). La secuencia de polinucleótidos del amplicón producido a partir de Arabidopsis se muestra en ID. SEC. Nº 1 e ID. SEC. Nº 3. Los pares de cebadores de PCR ID. SEC. Nº 57 e ID. SEC. Nº 58 se usaron para llevar a cabo la reacción para obtener el amplicón de Arabidopsis. Los amplicones de Arabidopsis se subclonaron en un vector pET-28b (vector de expresión de E coli, Novagen, Madison, WI, EEUU) y se secuenciaron usando los cebadores de secuenciación ID. SEC. Nº 59 e ID. SEC. Nº 60 para confirmar la secuencia de la molécula de polinucleótidos clonada. De manera similar se generaron los amplicones de Nostoc usando el ADN genómico de Nostoc como molde con los pares de cebadores ID. SEC. Nº 61 e ID. SEC. Nº 63 o ID. SEC. Nº 62 e ID. SEC. Nº 63. Los amplicones de Nostoc también se subclonaron en el vector pET-28b y se secuenciaron usando los cebadores de secuenciación ID. SEC. Nº 64 e ID. SEC. Nº 65 para confirmar la secuencia de polinucleótidos de la molécula de polinucléotidos clonada. Las secuencias de los cebadores para la amplificación y la secuenciación de las moléculas de la invención a partir de Arabidopsis y Nostoc se muestran en la Figura 10. Estas construcciones contenían un candidato de ID. SEC. Nº 3 de Arabidopsis y el homólogo de ID. SEC. Nº 49 más próximo de Nostoc, ambos con y sin marcador His-tag en el extremo N terminal. Se eligió un His-tag N terminal basándose en las estructuras cristalinas (Nakajima y col. PNAS 95, 4876, 1998) de las proteínas relacionadas (tropinona reductasas) que sugirieron que el extremo N terminal no ejercerá interferencia con el dominio de dimerización. Los vectores resultantes pMON 63132 (Figura 4, Histag de Nostoc), pMON 63133 (Figura 5, A. thaliana), pMON 63134 (Figura 6, Histag de A. thaliana) y pMON 63135 Figura 7 Nostoc) se usaron en los siguientes ejemplos para la expresión de las moléculas de proteínas. Según se describe en el presente documento, cualquier molécula de la presente invención puede clonarse para la expresión de su molécula de péptido o proteína correspon-
diente.

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(B) Sobreexpresión/purificación de moléculas de proteínas de la presente invención

Se identificaron los clones adecuados (según se muestra en las Figuras 4-7) que expresan las cuatro versiones de las proteínas mencionadas anteriormente en E. coli mediante la selección de antibióticos adecuados como está descrito por el fabricante (Novagen 441 Charmany Drive Madison, WI, 53719, EEUU). Se identificaron las bandas de proteínas expresadas de los tamaños predichos por medio de electroforesis analítica en gel de poliacrilamida con SDS (Laemmli, U. K., Nature, 227, 680, 1970) para confirmar la expresión de la proteína deseada. Un gel con las proteínas marcadas con His y sin marcar para las cuatro proteínas muestra claramente las diferencias de tamaño. Se eligió la proteína obtenida a partir del plásmido pMON63134 (Figura 6) para el ensayo que se describe a continuación. Se prepararon los extractos de proteínas por medio de congelación y descongelación y tratamiento con ultrasonido como describieron Cull y McHenry (Cull M and McHenry C.S. Methods in Enzymology 182, 147-153, 1990). Se resuspendieron los sedimentos en un volumen adecuado de tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 250 mM y EDTA 500 \muM con CHAPS al 0,05% y ABESF 1 mM o KH_{2}PO_{4} 50 mM pH-7,2, NaCl 250 mM y EDTA 250 \muM con CHAPS al 0,05% y ABESF 1 mM. Se aplicaron los extractos brutos que contenían la proteína marcadas con His a las columnas His-Trap equilibradas (Pharmacia Piscataway, NJ) y se purificaron por medio de procedimientos convencionales como según están descritos por el fabricante de las columnas. Las etapas incluyeron una elución con imidazol 10 mM/lavado y elución en imidazol 250 mM. Como resultado, la proteína marcada de Arabidopsis se purificó parcialmente (aproximadamente al 85-90% por medio de SDS-PAGE con tinción de Azul de Coomasie). Las muestras purificadas se filtraron en gel en KH_{2}PO_{4} 50 mM pH-7,2, NaCl 250 mM y EDTA 250 \muM, glicerol al 10% y se almacenaron a - 80ºC hasta su uso. Las concentraciones de proteína fueron de 1,5 a 1,7 mg/ml, en base al método de Bradford (Bradford M, Anal Biochem, 72, 248, 1976 y Bio-Rad Laboratories Procedure bulletin 1123) con patrón de BSA (el reactivo de Bradford y la BSA eran de Bio-Rad Laboratories Headquarters 1000 Alfred Nobel Drive Hercules, CA 94547). Los ensayos que se describen a continuación usaron 10 ó 15 ul de esta disolución (15 a 22 \mug por
reacción).

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(C) Determinación de la actividad catalítica o enzimática de las moléculas de péptidos/proteínas de la presente invención

Se usaron ensayos espectrofotométricos para la determinación de las actividades enzimáticas de las proteínas purificadas. Los ensayos se basaron en procedimientos descritos con anterioridad (Portsteffen y col. Phyochemistry, 37, 391, 1994). Se observó el consumo o la producción de NADPH a 340 nm. Los ensayos se realizaron en un espectrofotómetro Cary 50 Bio de Varian (Varian Instruments Inc. AA, ICP, UV, Fluorescence Products 679 Springvale Road Mulgrave, Victoria 3170 Australia). Todos los ensayos se realizaron a 30ºC durante 10 a 30 minutos en volúmenes de 1 ml usando KH_{2}PO_{4} 100 mM pH 6,5, EDTA 250 \muM o KH_{2}PO_{4} 50 mM pH 7,2, NaCl 250 mM y EDTA 250 \muM como tampón de reacción. Si se añadían metales se suplementaban a las reacciones en cubetas de soluciones madre de 100 mM de ZnCl_{2} y o MgCl_{2}. Los sustratos incluyeron los que se encuentran en la tabla 8. Todos los ensayos contenían de 3 a 30 \mug de proteína, NADPH o NADP de 200 a 400 \muM y sustrato 100 \muM a 10 mM (acetona 60 mM). Los controles no contenían sustrato para determinar la tasa de consumo de fondo y la degradación de NADPH. Las disoluciones de NADPH se prepararon nuevas y se controló la degradación por medio de UV-visible. Las disoluciones de enzimas se suplementaron con MgCl_{2} 1 mM y ZnCl_{2} 1 mM que tenían concentraciones de 1,5 a 1,7 mg/ml. Estos ensayos usaron 10 ó 15 \mul de esta disolución (ca. de 15 a 22 \mug por reacción). Las disoluciones patrón de los sustratos (20 a 500 mM) se realizaron en un tampón de reacción o como estaba indicado. Las disoluciones de esteroides se realizaron en EtOH al 100%. A partir de estas disoluciones patrón se realizaron las adiciones directamente a los ensayos. Se observó precipitación de los esteroides. Por consiguiente, la concentración soluble de esteroides en la mezcla de reacción no se conoce con exactitud en cada caso. Sin embargo, una buena estimación de la concentración del sustrato (esterol) sería de 100 a 200 \muM para una disolución saturada bajo estas condiciones. Hubo una clara diferencia en la tasa observada al cambiar la concentración de 26 \muM a 260 \muM que indica que la saturación puede estar entre los dos puntos, tanto para la actividad enzimática como para la solubilidad del sustrato. A estas concentraciones la precipitación no tuvo efecto en los cambios de la absorbancia a 340 nm como se probó por los controles que contenían sustrato y NADPH. Además del control del extracto celular, también se utilizó un control de sustrato porque las disoluciones de algunos de los sustratos probados pueden tener un pH más bajo en las condiciones de ensayo descritas que pueden afectar las tasas de degradación de NADPH y la actividad enzimática bajo las condiciones de ensayo. Los resultados de los sustratos probados pueden encontrarse en la Tabla 10, a
continuación.

Estos resultados (Tabla 8 a 10) muestran que la molécula de la proteína ID. SEC. Nº 4 de A. thaliana tiene significativa actividad de reductasa de esteroides. Combinados con otros datos biológicos, estos resultados sugieren que ID. SEC. Nº 4 es probablemente una reductasa de esteroides con sustratos verdaderos que son más probablemente brassino esteroides. Estos resultados no excluyen la posibilidad de que otra clase de compuestos pueda actuar como sustrato pero sugieren que el sustrato es un resto cetona potencialmente en un sistema de anillo este-
roide.

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TABLA 8 La Tabla de resultados de orden cero usando acetona como sustrato (60 mM) muestra pruebas de actividad reductasa. Se observa recambio (consumo de NADPH) en la dirección reductora. Las pendientes (para acetona, líneas 1 y 2) indican que la diferencia del control es de 10 veces. Los controles (líneas 3 y 4) fueron idénticos excepto para la omisión de la acetona

12

TABLA 9 Tabla de resultados de orden cero. Esta tabla muestra los datos elegidos para 5\alpha-androstano-3,17-diona en un ensayo de reductasa. Este ejemplo muestra los resultados de tres reacciones con acetona, tres reacciones con 5\alpha-androstano-3,17-diona y dos controles. La Tabla 8 muestra las tasas iniciales según se estimaron por medio de ajuste lineal entre 0 y 5 minutos. Los resultados para 5\alpha-androstano-3,17-diona mostrados en la tabla son los mejores de todos los sustratos en la misma concentración (aproximadamente 200 \muM). 4-androsteno-3,17-diona es el siguiente mejor sustrato con una tasa del orden de 2,5 a 4 veces más baja que este bajo las mismas condiciones (no se muestra). Los resultados de la acetona en concentraciones similares (la Tabla 7 muestra los resultados a altas concentraciones de acetona) son del orden de 10 a 20 veces más bajos y son próximos a los niveles de fondo. Se han obtenido resultados similares con múltiples lotes de enzima y sustrato

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TABLA 10 Sustratos probados

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TABLA 10 (continuación)

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TABLA 10 (continuación)

16

TABLA 10 (continuación)

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17

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Ejemplo 11

En el siguiente ejemplo se buscó entre una gran cantidad de secuencias de ADN usando BlastA (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman, Nucleic Acids Res. (25) 3389-3402 (1997)) para encontrar diversos homólogos, parálogos u ortólogos del gen de la presente invención. Estas secuencias se determinan a partir de las bibliotecas de ADNc preparadas de una diversidad de especies y tejidos de plantas.

Para la construcción de las bibliotecas de ADNc, se recoge el tejido, se congela inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacena a -80ºC hasta la extracción del ARN total. El ARN total se purifica a partir del tejido usando el reactivo Trizol de Life Technologies (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EEUU), según las recomendaciones del fabricante. El ARN Poly A+ (ARNm) se purifica usando perlas magnéticas de oligo dT esencialmente según la recomendación del fabricante (Dynabeads, Dynal Corporation, Lake Success, Nueva York,
EEUU).

La construcción de las bibliotecas de ADNc de plantas es muy conocida en la técnica y existe una serie de estrategias de clonación. En el comercio están disponibles una serie de kits de construcción de bibliotecas de ADNc. Se utiliza el sistema Plasmid System Superscript^{TM} para la síntesis de ADNc y Plasmid Cloning (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EEUU), siguiendo las condiciones sugeridas por el fabricante.

Las bibliotecas de ADNc se colocan en placas de agar LB que contienen los antibióticos adecuados para la selección y se incuban a 37ºC durante el tiempo suficiente para que se produzca el crecimiento de colonias individuales. Se colocan colonias únicas de los medios selectivos individualmente en cada pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos que contiene medio LB líquido que incluye los antibióticos para la selección. Las placas se incuban durante la noche aproximadamente a 37ºC con agitación suave para promover el crecimiento de los
cultivos.

Se aísla el ADN plasmídico de cada clon usando los kits de aislamiento de plásmidos Qiaprep, usando las condiciones recomendadas por el fabricante (Qiagen Inc., Santa Clara, California, EEUU).

Los clones de ADN de los plásmidos molde se usan para la posterior secuenciación. Para secuenciar las bibliotecas de ADNc, se usa un kit de secuenciación disponible en el comercio, tal como el kit dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction de ABI PRISM con DNA Polimerasa AmpliTaq®, FS, bajo las condiciones recomendadas por el fabricante (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los ADNc de la presente invención se generan por medio de secuenciación iniciada desde el extremo 5' o 3' de cada clon de ADNc. Se secuencian los insertos completos o sólo parte de los insertos (EST o marcadores secuenciados expresados).

Se conoce una serie de técnicas de secuenciación de ADN en la técnica, incluidos los procedimientos de secuenciación basados en fluorescencia. Estos procedimientos tienen la capacidad de detección, automatización e instrumentación necesaria para analizar grandes volúmenes de datos de secuencias. Actualmente, los Secuenciadores de ADN 377 y 3700 (Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div., Foster City, CA) permiten realizar la electroforesis y la recogida de datos más rápida. Con estos tipos de sistemas automatizados, se detectan los productos de reacción de secuencias marcadas con colorantes fluorescentes y los datos se ingresan directamente en el ordenador, produciendo un cromatograma que posteriormente se visualiza, se almacena y se analiza usando los programas informáticos correspondientes. Estos procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica y se han descrito y revisado (Birren y col., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Los EST generados (que incluyen cualquier inserto de ADNc de longitud total o secuencias codificadoras completas) se combinan con los EST y las secuencias de ADNc de longitud total en la bases de datos públicas como GenBank. Se eliminan las secuencias duplicadas y se reemplazan los números de identificación de secuencias duplicadas. A continuación se agrupa la serie de datos combinados y se organizan usando la herramienta de Pangea Systems identificada como CAT v.3.2. En primer lugar, se criban y se filtran las secuencias EST, por ejemplo se enmascaran las palabras de alta frecuencia para evitar agrupamientos falsos; se enmascaran las secuencia comunes a contaminantes conocidos tales como bacterias de clonación; se enmascaran las secuencias con alta frecuencia de repetición y las secuencias simples; se eliminan las secuencias que no enmascaradas de menos de 100 pb. Los EST cribados y filtrados se combinan y se someten a un algoritmo de agrupamiento basado en palabras que calcula las distancias entre pares de secuencias basándose en las frecuencias de las palabras y usa un procedimiento único de unión para agrupar secuencias semejantes en grupos de más de una secuencia, según sea apropiado. Las secuencias agrupadas se organizan individualmente usando un procedimiento iterativo basado en PHRAP/CRAW/MAP que proporciona una o más secuencias de consenso intrínsecamente coherentes y secuencias incoherentes únicas. Se controla la completitud de los archivos de secuencias agrupadas organizadas y se analizan los fragmentos para crear datos que representen cada secuencia de consenso contigua (cóntigo), las secuencias EST iniciales y la posición relativa de cada EST en un cóntigo respectivo. Se identifica la secuencia del clon más 5' de cada cóntigo. Las secuencias iniciales que no están incluidas en un cóntigo se
extraen.

Se consultaron las bases de datos descritas anteriormente con secuencias de nucleótidos y péptidos, con las secuencias de la presente invención para obtener los siguientes homólogos, ortólogos o parálogos según se muestran en la siguiente tabla. Se usó el programa informático BLAST 2.2.1 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman, Nucleic Acids Res. (25) 3389-3402 (1997)), con matriz BLOSUM62 y "sin opciones de filtro" en las consultas. Cuando resultó necesario, se detectaron cambios de marco en las secuencias de ADN de los homólogos alineando la secuencia de ADN del homólogo en cuestión con la secuencia de la proteína de la presente invención usando el programa "frame+_n2p" con parámetros por defecto en el paquete de programas GenCore (Compugen Inc., 1998). Tales cambios de marco se corrigieron conceptualmente dando los marcos de lectura abiertos. Se usó el programa "translate" con parámetros por defecto en el mismo paquete para traducir los marcos de lectura abiertos para las secuencias de péptidos correspondientes basándose en los códigos genéticos convencionales.

ID. SEC. Nº: 1 exhibe un porcentaje de identidad del 52,857% con su gen funcional más próximo conocido, identificado usando el programa informático BLAST 2.2.1 con matriz BLOSUM62 y "sin opciones de filtro" (Número de referencia de Genbank gil 1717752lsplP50162lTRN1_DATST). ID. SEC. Nº 1 exhibe identidad de 111 residuos de aminoácidos en toda su longitud de 210 aminoácidos con tropionona reductasa de Datura stramonium (Número de referencia de Genbank gil717752lsplP50162TRN1_DATST). Debido a esta relación, es posible que las enzimas con actividades similares puedan también funcionar en la presente invención, también son un aspecto de la presente invención las moléculas de ADN que codifican proteínas que están estrechamente relacionadas a la tropionona
reductasa.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 11

18

TABLA 11 (continuación)

19

TABLA 11 (continuación)

20

<110> Fernandes, Mary Xie, Zhidong

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<120> Procedimiento para aumentar el tamaño de los órganos y las semillas en una planta

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<130> 11899.0234.00PC00 (MOBT:234P)

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<150> 60/381.100

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 15-05-2002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.2

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 812

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

22

\hskip0,6cm

23

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 810

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\hskip0,8cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 789

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

28

\hskip0,8cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\hskip0,8cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip0,8cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip0,8cm

34

\hskip0,8cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

37

\hskip0,8cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 935

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\hskip0,8cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip0,8cm

43

\hskip0,8cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 789

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 789

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 810

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

52

\hskip0,8cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 969

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip0,8cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

55

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1003

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

58

\hskip0,8cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1040

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip0,8cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip0,8cm

61

\hskip0,8cm

62

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 970

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip0,8cm

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\hskip0,8cm

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 943

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip0,8cm

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

\hskip0,8cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1002

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

70

\hskip0,8cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1084

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\hskip0,8cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\hskip0,8cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

79

\hskip0,8cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

82

\hskip0,8cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1366

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip0,8cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

\hskip0,8cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip0,8cm

88

\hskip0,8cm

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1259

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

91

\hskip0,8cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 804

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp. PCC 7120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp. PCC 7120

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 777

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xanthomonas campestris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xanthomonas campestris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

96

\hskip0,8cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 777

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xylella fastidiosa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xylella fastidiosa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

99

\hskip0,8cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatttaaca agccatggca aagga

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatgtgttt gaattcatag tcttgaa

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaagatatc atatggcaaa ggaaggg

\hfill

27

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgaattc tcgagtcata gtcttgaagg aaaaac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctacaaat ctcgagtcag c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgactcga gatttgtagc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp. PCC 7120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaagatatc atatgagtga tgcctacggt g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp. PCC 7120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaagatctg ccaccatggg tgatgcctac ggtg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp. PCC 7120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagaagcttctcgagttaaa aaccgaaagcc

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp. PCC 7120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctctactgc aaaataggg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp. PCC 7120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctamtg cagtagagg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 901

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

102

\hskip0,8cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 810

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nostoc sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

105

\hskip0,8cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1253

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

108

\hskip0,8cm

109

Claims (8)

1. Un procedimiento para aumentar el peso de las semillas de una planta que comprende las etapas de:

(a)

transformar dicha planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que actúa en plantas, unido de manera operativa a una molécula de ADN que codifica una proteína que comprende ID. SEC. Nº 2, en el que dicha construcción de ADN está unida de manera operativa a una región de terminación 3'; y

(b)

seleccionar una planta de una población de plantas transformadas que contienen dicha construcción de ADN; en el que dicha planta exhibe peso aumentado de las semillas comparado con una planta de la misma especie no transformada para contener dicha construcción de ADN.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la construcción de ADN comprende un promotor que actúa en plantas, unido de manera operativa a una molécula de ADN que codifica una proteína, en el que dicha molécula de ADN comprende ID. SEC. Nº 1 unida de manera operativa a una región de terminación 3'.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho promotor es un promotor de caulimovirus.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho promotor comprende un promotor constitutivo de planta heteróloga.

5. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho promotor es un promotor específico de tejido o un promotor potenciado de órgano.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas especies de plantas se seleccionan de la Acacia, la alfalfa, el eneldo, la manzana, el albaricoque, la alcachofa, la arugula, el espárrago, el aguacate, la banana, la cebada, las judías, la remolacha, la zarzamora, el arándano, el brócoli, las coles de bruselas, la col, la canola, el cantalupo, la zanahoria, la mandioca, la coliflor, el apio, la cereza, el cilantro, los cítricos, las clementinas, el café, el maíz, el algodón, el pepino, el abeto de Douglas, la berenjena, la endibia, la escarola, el eucalipto, el hinojo, los higos, la calabaza, la uva, el pomelo, el rocío de miel, la jicama, el kiwi, la lechuga, el puerro, el limón, la lima, el pino taeda, el mango, el melón, la seta, la nuez, la avena, el quingombó, la cebolla, la naranja, una planta ornamental, la papaya, el perejil, el guisante, el melocotón, el cacahuete, la pera, la pimienta, el caqui, el pino, la piña, el plátano, el ciruelo, la granada, el álamo, la patata, la calabaza, el membrillo, el pino radiata, la achicoria roja, el rábano, la frambuesa, el arroz, el centeno, el sorgo, el pino meridional, la soja, la espinaca, la calabaza, la fresa, la remolacha azucarera, la caña de azúcar, el girasol, la batata, el liquidambar, la mandarina, el té, el tabaco, el tomate, el césped, la vid, la sandía, el trigo, el ñames y el calabacín.

7. Una planta transgénica con peso aumentado de las semillas comparado con una planta no transformada de la misma especie o una de sus progenies, comprendiendo dicha planta transgénica y dicha planta progenie:

(i)

una construcción de ADN que codifica un polipéptido que comprende ID. SEC. Nº 2, o

(ii)

un polipéptido de ID. SEC. Nº 2.

8. La planta transgénica de la reivindicación 7, en la que dicha planta se selecciona de la Acacia, la alfalfa, el eneldo, la manzana, el albaricoque, la alcachofa, la arugula, el espárrago, el aguacate, la banana, la cebada, las judías, la remolacha, la zarzamora, el arándano, el brócoli, las coles de bruselas, la col, la canola, el cantalupo, la zanahoria, la mandioca, la coliflor, el apio, la cereza, el cilantro, los cítricos, las clementinas, el café, el maíz, el algodón, el pepino, el abeto de Douglas, la berenjena, la endibia, la escarola, el eucalipto, el hinojo, los higos, la calabaza, la uva, el pomelo, el rocío de miel, la jicama, el kiwi, la lechuga, el puerro, el limón, la lima, el pino taeda, el mango, el melón, la seta, la nuez, la avena, el quingombó, la cebolla, la naranja, una planta ornamental, la papaya, el perejil, el guisante, el melocotón, el cacahuete, la pera, la pimienta, el caqui, el pino, la piña, el plátano, el ciruelo, la granada, el álamo, la patata, la calabaza, el membrillo, el pino radiata, la achicoria roja, el rábano, la frambuesa, el arroz, el centeno, el sorgo, el pino meridional, la soja, la espinaca, la calabaza, la fresa, la remolacha azucarera, la caña de azúcar, el girasol, la batata, el liquidambar, la mandarina, el té, el tabaco, el tomate, el césped, la vid, la sandía, el trigo, el ñames y el calabacín.