BR102019003430A2 - Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada e seu uso - Google Patents

Abstract

a presente invenção compreende uma levedura, saccharomyces cerevisiae, e seu uso como um biossensor para detecção de metais pesados, preferencialmente cádmio. a referida levedura saccharomyces cerevisiae foi geneticamente modificada através do plasmídeo psf-pvsr2-betagal-ura3, compreendendo o promotor pvsr2 de phaseolus vulgaris fusionado com o gene repórter lacz, que codifica a enzima ß- galactosidade.

Description

SACCHAROMYCES CEREVISIAE GENETICAMENTE MODIFICADA E SEU USO CAMPO DE APLICAÇÃO

[0001] A presente invenção aplica-se ao campo de métodos para biorremediação voltados para metais pesados.

[0002] A presente invenção descreve uma levedura, Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada e seu uso como biossensor capaz de detectar cádmio em amostras.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] O cádmio é um metal pesado, além de ser classificado como um dos metais mais tóxicos e é encontrado, normalmente, em minas de zinco. A sua maior aplicação industrial é para a fabricação de pilhas.

[0004] A relação entre as exposições ocupacionais e o aparecimento de doenças devido à exposição a ambientes insalubres sempre foi motivo de preocupação na sociedade. A exposição ao cádmio pode causar osteoporose, excesso de cálcio expelido pela urina e alteração na síntese de proteínas.

[0005] Por não existir tratamento para intoxicações crônicas por cádmio, é de grande importância o monitoramento da exposição a esse metal, de maneira a garantir a segurança, uma vez que a exposição a médio e longo prazo pode acarretar em danos maiores.

[0006] Biossensores são dispositivos que integram um sistema do tipo receptor-transdutor, capazes de fornecer informações analíticas, que podem ser qualitativas ou quantitativas, utilizando um elemento biológico.

[0007] Muitos desses biossensores utilizam microorganismos geneticamente modificados com um sistema promotor-gene repórter específico para um determinado analito.

[0008] A presente invenção usa a levedura Saccharomyces cerevisiae, através de um biossensor, para detectar metais pesados e remediar os ambientes contaminados, modificando os seus genes envolvidos na homeostase intracelular de metais, o que culmina em uma levedura capaz de remover o cádmio de um ambiente contaminado.

[0009] A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura elíptica, mede cerca de 6 a 8 μm de comprimento e 5 μm de largura. É um micro-organismo facultativo, possuindo habilidade de se ajustar metabolicamente, tanto em condições de aerobiose, quanto em condições de anaerobiose.

[00010] A levedura Saccharomyces cerevisiae já é uma antiga conhecida em processos fermentativos diversos. Já na antiguidade era utilidade para fermentação de pães e bebidas alcóolicas.

[00011] A referida levedura é a mais explorada comercialmente, já que a mesma apresenta fácil isolamento e manutenção, além de pouca exigência nutricional, bom crescimento em meios constituídos por resíduos industriais e possui amplo uso em diversos processos.

[00012] Apesar de já existirem técnicas e métodos para detecção de cádmio, o biossensor aqui apresentado se caracteriza pelo baixo custo e pela facilidade de manuseio.

[00013] Deste modo, a presente invenção está relacionada com um monitoramento simples de cádmio em ambientes contaminados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[00014] O documento americano US 6,406,856 descreve biossensor baseado em Saccharomyces cerevisiae modificada, capaz de expressar luciferase e monitorar alterações na mesma. O referido biossensor apresenta princípio de detecção distinto do aqui apresentado, uma vez que se baseia na expressão de genes que conferem luminescência ao micro-organismo.

[00015] O documento japonês JPH0572135A descreve um biossensor baseado em Saccharomyces cerevisiae para detecção de glicose. O referido biossensor se baseia na geração de etanol proveniente da levedura, em um meio contendo glicose, uma reação fotocrômica é gerada, com a presença de óxido metálico. O referido biossensor só apresenta a mesma plataforma biológica que a invenção aqui apresentada, diferindo-se em todas as outras características.

[00016] O documento CN103627665 compreende um biossensor para detecção de concentração de cádmio a partir da utilização de Escherichia coli e Pseudomonas putida, utilizando o mecanismo de regulação da transcrição de uma proteína. O referido documento utiliza dois microorganismos patógenos oportunistas, caracterizando, portanto, uma plataforma biológica distinta da presente invenção.

[00017] O documento KR20120047636 descreve um biossensor para detecção de cádmio que compreende promotor DR_2626 oriundo do Deinococcus radiodurans e gene repórter lacZ. A modificação é realizada no hospedeiro Deenocorca radiodurans. Apesar do referido documento possuir o objetivo de detecção de cádmio, o promotor e micro-organismo hospedeiro são distintos dos apresentados na invenção aqui descrita.

[00018] Já o documento DE19710287 descreve um biossensor baseado em Saccharomyces cerevisiae modificada para a detecção de metais pesados, além de um transdutor físico. O referido documento apresenta, como transdutor físico, um eletrodo de oxigênio, de maneira que encarece o método de detecção e inviabiliza o manuseio de um leigo, que é a proposta da presente invenção.

[00019] Apesar de os documentos acima também estarem no âmbito da detecção de metais pesados, incluindo cádmio, a presente invenção difere-se dos documentos aqui analisados, pois apresenta um biossensor de baixo custo e com manuseio facilitado, utilizando um micro-organismo não patogênico de fácil cultivo. Adicionalmente, o biossensor da presente invenção possibilita a detecção in situ, sem que seja necessário o transporte de amostra para um laboratório, se caracterizando como uma ferramenta analítica mais acessível que as tradicionais.

SÚMARIO DA INVENÇÃO

[00020] A presente invenção compreende uma levedura, Saccharomyces cerevisiae, e seu uso como um biossensor para detecção de metais pesados, preferencialmente cádmio.

[00021] A referida levedura Saccharomyces cerevisiae foi geneticamente modificada através do plasmídeo pSF-PvSR2-BetaGal-URA3, compreendendo o promotor PvSR2 de Phaseolus vulgaris fusionado com o gene repórter lacZ, que codifica a enzima β- galactosidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00022] A presente invenção poderá ser mais bem compreendida por meio da breve descrição das figuras a seguir:

[00023] A Figura 1 representa o esquema de funcionamento do biossensor em uma análise da amostra de interesse.

[00024] A Figura 2 representa o mapa (desenho) do plasmídeo desenvolvido (pSF-PvSR2-BetaGal-URA3) e a estratégia de construção.

[00025] A Figura 3 ilustra a região do promotor PvSR2 utilizada como biossensor.

[00026] A Figura 4 ilustra a atividade β-galactosidase do biossensor BY-PVSR2 em diferentes concentrações de Cd2+.

[00027] A figura 5 mostra a relação entre a atividade β-galactosidase do biossensor BY-PVSR2 e a concentração de íons Hg2+.

[00028] A Figura 6 mostra a relação entre a atividade β-galactosidase da cepa BY-PVSR2 e a concentração de íons Cu2+.

[00029] A Figura 7 ilustra a relação entre a atividade β-galactosidase da cepa BY-PVSR2 e a concentração de íons Zn2+.

[00030] A Figura 8 mostra a atividade β-galactosidase do biossensor BY-PVSR2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00031] A presente invenção descreve a Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada e seu uso como um biossensor para detecção de metais pesados, preferencialmente cádmio, através do uso da Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada.

[00032] O referido biossensor compreende preferencialmente um suporte sólido, podendo ser papel de filtro, nitrocelulose, nylon ou poliestireno, com a levedura geneticamente modificada imobilizada com o plasmídeo pSF-PvSR2-BetaGal-URA3, identificado pela SEQ. ID No. 1 , no respectivo suporte. Em uma modalidade preferencial, o suporte da invenção é o papel de filtro, pela praticidade e baixo custo.

[00033] A levedura Saccharomyces cerevisiae foi geneticamente modificada através da transformação com o plasmídeo pSF-PvSR2-BetaGal-URA3. O referido plasmídeo contém um trecho do promotor PvSR2 de Phaseolus vulgaris, cuja sequência possui 735 bases, fusionado ao gene repórter lacZ, que codifica a enzima β-Galactosidade. Esse trecho foi selecionado por tratar-se da região necessária para a resposta desejada ao cádmio, conferindo portanto uma maior especificidade na detecção deste metal. O referido plasmídeo pSF-PvSR2-BetaGal-URA3 foi construído a partir do plasmídeo comercial pSF-TEFI-TPI1-BetaGal-URA3 (OG544, Oxford Genetics). A construção envolveu as seguintes etapas: 1. Retirada e substituição dos promotores TEF1 e TPI1 do plasmídeo OG544, através de PCR inverso; 2. Substituição dos promotores acima citados pela inserção (ligação) do fragmento do promotor PvSR2, obtido por síntese química, desta forma fusionado ao gene repórter lacZ, originalmente presente no plasmídeo pSF-TEFI-TPI1-BetaGal-URA; 3. A Figura 3 ilustra a estratégia dessa construção molecular e o mapeamento dos componentes plasmidiais que constituem o pSF-PvSR2-BetaGal-URA3(SEQ. ID No. 1).

[00034] A linhagem de S. cerevisiae biossensora BY-PvSR2 foi produzida de acordo com as seguintes etapas: o referido plasmídeo foi introduzido por transformação em células de S. cerevisiae BY4741, que foram inicialmente inoculadas em 25 mL de meio YPD e crescidas overnight. Foram então coletados 200 μL de suspensão celular e centrifugados a 3000 xg. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em uma mistura reacional contendo tampão One Step (0,2 M de acetato de lítio; 40% m/v de polietilenoglicol 4000; 100 mM de ditiotreitol), 5 μL de carreador de DNA e 500 ng de DNA plasmidial, totalizando 100 μL de volume final. A suspensão foi incubada por uma hora a 45 °C e então 100 μL foram semeados em placas contendo meio SD com o requerimento nutricional adequado, exceto uracila.

[00035] A análise utilizando o biossensor compreende incubar o referido biossensor em uma solução da amostra por certo período de tempo, podendo se estender até 24 horas. Após o período de incubação, é adicionado um substrato que provoca uma alteração na cor do referido biossensor, no caso de presença do metal pesado de interesse. Em uma modalidade preferencial, o substrato é o 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-GAL), um substrato cromogênico para a β-Galactosidase, que dá origem a um precipitado de coloração azul intensa e muito estável, que proporciona uma detecção rápida e confiável.

[00036] A detecção de metais pesados ocorre pelo mecanismo de regulação gênica da referida levedura que, em contato com um amostra contaminada, dispara uma cascata de sinalização, culminando na expressão do gene lacZ sob a regulação do promotor PvSR2, de modo que ocorre a síntese da proteína β-Galactosidade.

[00037] A referida proteína catalisa a hidrólise de substrato do tipo galactopiranosídeo, de maneira que gera um composto colorido, que acusa a presença do metal pesado de interesse.

[00038] O biossensor aqui descrito possui uma faixa de detecção de 10 a 50 μM de cádmio. Sendo cerca de 5 vezes mais sensível ao referido metal e, portanto, é adequado preferencialmente para o mesmo.

[00039] Para a obtenção da Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, primeiramente foi realizado o cultivo da referida levedura, utilizando o meio yeast extract- peptone- dextrose (YPD) sem uracila, onde as células foram centrifugadas, ressuspendidas juntamente com carreador de DNA e DNA plasmidial, sendo posteriormente incubadas e semeadas em placas com meio nutricional adequado para seu crescimento.

[00040] O plasmídeo utilizado na transformação da levedura foi o pSF-PvSR2-BetaGal-URA3, obtido a partir da modificação de um plasmídeo comercial (OG544), conforme mostra a figura 2, em que houve a inserção do promotor PvSR2 (fragmento de 735 pb)fusionado ao gene lacZ, estando o mesmo identificado pela SEQ. ID No. 1.

[00041] Na figura 3 está descrita a região do promotor PvSR2 utilizada, cujas regiões funcionais estão destacadas: vermelho - elemento de choque térmico (HSE); verde -elemento de resposta a metais (MRE); azul - CAAT box; amarelo - elemento de resposta ao Zn (ZRE).

[00042] Em uma modalidade preferencial da invenção o biossensor é obtido a partir da cepa Saccharomyces cerevisiae que está armazenada na "Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM)" com o número de acesso RGM 2639.

[00043] As células foram submetidas à indução por metais pesados, onde as mesmas foram expostas às soluções concentradas dos sais análogos aos metais pesados de interesse por 24 horas.

[00044] Atividade β-galactosidase - ensaio qualitativo em papel de filtro,conforme demonstrado na Figura 1.

[00045] O biossensor, cultivado em meio YPD (menos uracila), foi transferido para papel de filtro Whatman 3MM (Whatman, Kent, UK) e em seguida imerso na amostra a ser testada para a presença de cádmio por 60 minutos. Em seguida, imerso em nitrogênio líquido por 5 minutos, retirado e equilibrado à temperatura ambiente. O filtro com biossensor foi tratado com tampão X-Gal [tampão PBS, pH 7.4, 0.5% agarose, 0.01% (w/v) X-gal] e incubado à temperatura ambiente por 60 minutos. As amostras positivas para cádmio produzem uma coloração azul no biossensor, conforme ilustrado na Figura 1.Atividade β-galactosidase -ensaios quantitativos de resposta ao cádmio e outros metais.

[00046] A indução das células por metais pesados foi feita a partir de soluções concentradas, de 50 mM ou menos. As soluções concentradas foram preparadas a partir dos sais HgCl2, ZnSO4.7H2O, CdSO4.3 H2O e CuSO4.5H2O. As células do biossensor S. cerevisiae foram inoculadas até atingir a fase estacionária. Nessa fase, foram submetidas a diferentes concentrações de soluções de metais para indução por 24 horas. Então, aproximadamente 50 mg de células foram coletadas por centrifugação a 3000 xg e ressuspensas em 500 μL de tampão Z (60 mM de Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM de KCl e 1 mM de MgSO4). Para a dosagem da atividade β-galactosidase, primeiramente foi feito um extrato celular com pérolas de vidro em vórtex e banho de gelo, alternando em 3 ciclos de 1 minuto em cada etapa. As pérolas foram lavadas com mais 400 μL de tampão Z e a suspensão foi centrifugada a 13.900 xg para obtenção do extrato. Em segundo lugar foi dosado o teor de proteína do extrato pelo método do biureto adaptado por Stickland (1951) . Após a dosagem foi preparada uma mistura reacional de volume final de 800 μL contendo tampão Z com β-mercaptaetanol, 50 μg de proteínas totais do extrato e o substrato o-nitrofenil-β-Ό-galactopiranosídeo(ONPG), que foi incubada por uma hora a 30 °C. Em seguida, a reação foi interrompida pela adição de 400 μL de uma solução de carbonato de sódio 1M, centrifugada a 16.900 xg e 1 mL do sobrenadante foi lido no espectrofotômetro em 420 nm. A atividade (U) foi definida como nmol de ONPG convertido min-1 e a atividade específica foi obtida normalizando U pela massa de proteína utilizada no ensaio em miligrama (U/mg de proteína). O cálculo da atividade específica foi obtido pela equação A =1,4 x OD420 / t x 0,0045 x [ptn] x Vext, onde:

[00047] A - atividade específica

[00048] 1,4 - correção do volume final da reação de 1,4 mL

[00049] 0,0045 - absorvância máxima de uma solução 1 _M de ONPG

[00050] OD420 - densidade ótica em 420 nm

[00051] t - tempo da reação

[00052] [ptn] - concentração de proteína do extrato

[00053] Vext - volume de extrato utilizado na reação

[00054] Resposta ao cádmio(II)

[00055] Células de BY-PvSR2 em fase estacionária foram submetidas a crescentes concentrações de Cd2+ por 24 horas. Foi quantificada a atividade β-galactosidase do biossensor para diferentes concentrações de cádmio. Na relação mostrada na Figura 4 é possível verificar que a cepa transformante possui atividade β-galactosidase basal mesmo na ausência de íons Cd2+. Para concentrações de 0 até 9 μΜ, os resultados de atividade são estatisticamente iguais, porém são diferentes da atividade obtida para 10 μΜ. Dessa forma, como a atividade nesta concentração também é estatisticamente diferente da obtida em 20 μΜ, pode-se dizer que a menor concentração detectável por esta cepa é 10 μΜ. O valor máximo de atividade β-galactosidase foi obtido para a concentração de 50 μΜ de Cd2+. Acima deste valor, a atividade começa a cair, sugerindo que o efeito tóxico do Cd se sobrepõe ao efeito indutivo. Essa variação de resposta enzimática perante as diferentes concentrações do metal caracteriza um comportamento típico de biossensor. O cádmio raramente interage diretamente com o DNA. Portanto, o sinal observado deve ser oriundo da sinalização disparada quando a célula entra em contato com os íons desse metal. Conforme é possível observar também na figura 4, os resultados com a mesma letra (a-e) são estatisticamente idênticos.

[00056] Resposta ao Mercúrio (II)

[00057] Diferentemente do efeito observado com o Cd , conforme figura 4, para o caso da indução com Hg2+ houve redução da atividade β-galactosidase, como verificado na Figura 5. Esse resultado sugere que por promover uma redução dos níveis basais de expressão, o Hg2+ não é capaz de induzir a expressão do gene lacZ sob controle do promotor PvSR2. Apesar do PvSR2 ser um promotor eucariótico, com sequências regulatórias conservadas, quando inserido em S. cerevisiae esse sistema fica sujeito a uma maquinaria regulatória completamente diferente. Dessa forma, o Hg2+ em S. cerevisiae não seria então capaz de induzir a expressão de fatores transcricionais que atuem no promotor PvSR2 de modo a promover a expressão do gene lacZ, o que corrobora com a possibilidade de diferentes repostas regulatórias mostradas por Westwater et al. (2002). Conforme é possível observar na figura 5, os resultados com a mesma letra (a-d) são estatisticamente idênticos.

[00058] Respostas ao cobre (II) e ao zinco (II)

[00059] O Cu e Zn foram selecionados para testes, pois estes além de metais pesados, são micronutrientes essenciais para muitos organismos. Por conta disso, precisam ser repostos em solos agricultáveis sempre que necessário. A relação entre a atividade β-galactosidase e as concentrações de Cu2+ e Zn2+ podem ser verificadas nas Figuras 6 e 7, respectivamente.

[00060] As concentrações de Cu2+ e de Zn2+ usadas no teste de atividade foram selecionadas com base em concentrações de Cu e Zn comumente presentes em amostras de solos agricultáveis (ca. 789 μΜ para Cu2+ e 2.293 μΜ para Zn2+). Também foram escolhidas uma concentração intermediária (500 μΜ) e a concentração de 50 μΜ, para comparar com o valor máximo de atividade β-galactosidase obtida na indução por Cd2+. Essas concentrações são características de solos superfertilizados, com uma concentração de micronutrientes acima do necessário. As concentrações de Cu2+ e Zn2+ encontradas nesses tipos de solo são interessantes para a comparação, pois são os mais suscetíveis à contaminação por Cd2+. De acordo com a resolução no 420 (CONAMA, 2009) os valores de interferência (Vi) de Cd, Cu e Zn para solos agricultáveis são respectivamente 3, 200 e 450 mg kg-1. Analisando-se os resultados das Figuras 5, 6 e 7 , foi observado que para a concentração de 50 μΜ, íons de Cu2+ e Zn2+ não foram capazes de promover a mesma indução que Cd2+, uma vez que este último apresentou valores de atividade quase 3 vezes maior. Tal fato mostra que este sistema é mais sensível ao íons de Cd2+. Para avaliar se o biossensor BY-PvSR2 teria capacidade de detectar o Cd na presença dos micronutrientes Zn e Cu, foi feito uma indução simultânea. Para isso, as concentrações de Cu2+ e Zn2+ foram mantidas fixas em 789 μΜ e 2.293 μΜ, respectivamente, e as concentrações de Cd2+ variaram entre 0, 25 e 50 μΜ. A relação entre a atividade β-galactosidase e as induções simultâneas pode ser verificada na Figura 8. Ao analisar a Figura 8, é possível observar um aumento expressivo da atividade β-galactosidase, mesmo na ausência de íons Cd2+. Quando comparada com a indução por Zn2+ e Cu2+ nas mesmas concentrações separadamente, foi verificado um aumento de aproximadamente 5 vezes da atividade β-galactosidase. Já quando o Cd2+ é introduzido, a atividade β-galactosidase aumenta ainda mais, chegando a ser cerca de 7 vezes maior que a atividade obtida com a indução promovida pelos metais separadamente. Como esse sistema depende de regulação transcricional, é provável que a indução com todos os metais simultaneamente tenha ou aumentado os níveis de fatores transcricionais ou liberado elementos de repressão atuantes no promotor PvSR2, o que justificaria o grande aumento de atividade observado. Os valores de atividade β-galactosidase na presença de Cd2+ são estatisticamente diferentes dos valores na ausência deste íon, sugerindo que mesmo em meio a uma mistura desses cátions, este biossensor é capaz de detectar a presença de Cd2+, embora perca alguma sensibilidade quanto à resposta às diferentes concentrações do mesmo.

[00061] A cepa BY-PvSR2 é responsiva ao Cd2+, possuindo limite de detecção na ordem de μΜ e atividade β-galactosidase máxima a uma concentração de 50 μΜ. Também é responsiva a íons Zn2+ e Cu2+, embora tenha se mostrado significativamente mais sensível à presença de Cd2+. Em uma mistura de cátions Zn2 + , Cu2+ e Cd2 + , a cepa BY-PvSR2 foi capaz de distinguir a presença de Cd2+, embora perdesse a sensibilidade em relação às diferentes concentrações deste metal. A cepa BY-PvSR2 apresenta um grande potencial como um biossensor para íons Cd2+. Íons Hg2+ não foram capazes de induzir o sistema PvSR2-lacZ em S. cerevisiae.

[00062] O biossensor é usado, preferencialmente para amostras líquidas, onde a aplicação seria imediata, de maneira que a referida amostra líquida coletada pode ser prontamente utilizada para a incubação do micro-organismo.

[00063] Para amostras sólidas, é necessária uma etapa prévia de extração dos metais. A referida extração dos metais pode ser realizada de várias formas, dependendo do tipo de amostra sólida em questão.

[00064] Comumente, é realizada uma extração da fração solúvel em ácido pode ser realizada por lavagem com solução de HCl 1,00 M por 2 horas à temperatura ambiente.

[00065] O funcionamento do biossensor compreende expor o mesmo a uma amostra de interesse em um período entre 30 minutos e 4 horas, de maneira que ocorre uma alteração de cor caso a amostra possua o metal pesado.

[00066] Esse funcionamento se dá através do mecanismo de regulação gênica da própria Saccharomyces cerevisiae que, em contato com a amostra contaminada, o gene lacZ é expresso sob a regulação do promotor PvSR2, culminando na síntese da proteína β-galactosidade.

[00067] A proteína β-galactosidade produzida realiza a catálise da reação de hidrólise de substrato do tipo galactopiranosídeo. Tal reação produz um composto colorido, cujo qual é responsável pela resposta positiva da análise em relação à presença do metal pesado de interesse.

[00068] A presente invenção foi revelada neste relatório descritivo em termos de sua modalidade preferida. Entretanto, outras modificações e variações são possíveis a partir da presente descrição, estando ainda inseridas no escopo da invenção aqui revelada.

Claims (11)

1. Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada CARACTERIZADO pelo fato de compreender a modificação através do plasmídeo pSF-PvSR2-BetaGal-URA3, conforme identificado pela SEQ. ID N° 1.
2. Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o plasmídeo conter o promotor PvSR2 de Phaseolus vulgaris.
3. Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de o promotor possuir 735 bases, fusionado ao gene repórter lacZ, que codifica a enzima β-Galactosidade.
4. Uso da Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, conforme definida nas reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de ser para aplicação em um biossensor.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o referido biossensor ser para a detecção de metais pesados.
6. Uso, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de o metal pesado detectado ser cádmio.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de o referido biossensor compreender um suporte a ser escolhido de um grupo entre: papel de filtro, nitrocelulose, nylon ou poliestireno.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de o referido suporte ser, preferencialmente, papel de filtro.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o referido biossensor ser utilizado para amostras líquidas e sólidas.
10. Uso da Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o referido biossensor possuir a faixa de detecção entre 10μΜ e 50μΜ de cádmio.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a exposição do biossensor à amostra por um período entre 30 minutos e 240 minutos, com posterior adição de substrato que altera a cor do referido biossensor na presença do metal pesado.

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