WO2010134506A1

WO2010134506A1 - 爆発物検出用の免疫センサおよびその製造方法

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Publication number: WO2010134506A1
Application number: PCT/JP2010/058320
Authority: WO
Inventors: 達松本
Original assignee: 日本電気株式会社
Priority date: 2009-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2010-11-25

Abstract

　対象となる過酸化物誘導体型の爆薬に対する結合能を有する抗体を新たに創製し、創製された抗体を利用して、抗原抗体反応を応用して、対象の過酸化物誘導体型の爆薬を検出可能な免疫センサと、その作製方法を提供する。対象となる過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、トリアセトントリペルオキシドに対する結合能を有する抗体として、該過酸化物誘導体と類似する構造を有する3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸に対するモノクローナル抗体のうち、該過酸化物誘導体型の爆薬に対する交叉反応性を示すものを選択し、抗原抗体反応を介して、対象の過酸化物誘導体を選択的に検出する免疫センサを製造する。

Description

爆発物検出用の免疫センサおよびその製造方法

　本発明は、爆薬として使用される、過酸化物誘導体に対する結合能を有するモノクローナル抗体を利用して、該過酸化物誘導体の検出を行う免疫センサ、ならびに、該免疫センサの製造方法に関する。

　爆薬として使用される有機化合物、例えば、TNT（2,4,6-トリニトロトルエン）、RDX（ヘキソーゲン；1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジナン）、ペンスリット（四硝酸ペンタエリスリット：C(CH₂ONO₂)₄）は、その分子内にニトロ基を有している。これら爆薬に利用される、各種のニトロ化合物の検出には、前記特徴を利用して、ニトロ基形状の窒素を検出する手法が採用されている。各種のニトロ化合物を対象とする、爆発物検出用スキャナーは、前記の測定原理を応用している。

　一方、分子内にニトロ基を有していない、有機過酸化物型の爆薬も知られている。例えば、過酸化アセトン、特には、三量体型のＴＡＴＰ（Ｃ_９Ｈ_１８Ｏ_６：トリアセトントリペルオキシド）、あるいは、ヘキサメチレントリペルオキシドジアミン(HMTD)など、分子内にジオキシ結合（－Ｏ－Ｏ－）を具えている、過酸化物誘導体が、古くから知られている。これら有機過酸化物型の爆薬は、その分子内にニトロ基を有していないため、各種のニトロ化合物を対象とする、爆発物検出用スキャナーでは検出できない。

　なかでも、過酸化アセトン、特には、下記の式（Ｉ）に示す構造を有する、三量体型のＴＡＴＰ（Ｃ_９Ｈ_１８Ｏ_６：トリアセトントリペルオキシド）は、比較的に入手が容易な原料、アセトンと過酸化水素水、ならびに、酸触媒として利用する、硫酸、塩酸を使用して、実験室的規模で合成ができる。また、結晶性がよく、融点９１℃の白色結晶として、単離、精製ができる。

　上記の特徴が災いして、三量体型のＴＡＴＰ（Ｃ_９Ｈ_１８Ｏ_６：トリアセトントリペルオキシド）を初めとする、有機過酸化物型の爆薬は、過去に、爆発物テロ事件において、爆薬として使用されている。

Analytical　Chemistry,　Vol.　75,　No.4,　p.731-735　(2003) Chemistry　Letters,　Vol.35,　No.10,　p.1126-1127(2006) Organic　&　Biomolecular　Chemistry　Vol.4,　p.4431-4436　(2006)

　有機過酸化物型の爆薬を使用する、爆発物テロを未然に防止するためには、上記の有機過酸化物型の爆薬を検知し、有機過酸化物型の爆薬を使用する、爆発物を見つけ出すことは必要である。有機過酸化物型の爆薬、例えば、過酸化アセトンは、Ｃ，Ｈ，Ｏで構成される低分子化合物である。そのため、従来、その検知技術として、ＵＶ照射とフロロセンス検出を合わせた高速液体クロマトグラフィー法が用いられてきた(非特許文献１：Analytical　Chemistry,　Vol.　75,　No.4,　p.731-735　(2003))。しかしながら、対象物質は、爆薬であるため、測定時の安全性を考慮した、適正な濃度範囲へと濃度調整する操作を始めとして、測定操作が複雑であることから、誰にでも簡便に利用可能な測定手段ではなかった、その上、一回あたりの測定コストが高く、測定時間も１０分以上を必要とし、多数の試料について、測定を行う上での、課題となっている。

　有機過酸化物型の爆薬についても、各種のニトロ化合物を対象とする、爆発物検出用スキャナーと同程度の簡便さで、多数の試料について、選択的に検出を行うことが可能な爆発物検出用センサの開発が望まれている。

　溶液試料中に含まれる、低分子化合物を検出する方法として、対象の低分子化合物に対する結合能を有する抗体を利用して、抗原抗体反応を応用して、対象の低分子化合物の濃度を測定する免疫測定法が、一部の低分子化合物では成功している。例えば、式（Ｉ）に示す構造を有する、三量体型のＴＡＴＰを初めとする、有機過酸化物型の爆薬化合物自体は、免疫原性を示さないため、該有機過酸化物型の爆薬化合物に特異的な抗体は、これまで報告されていない。仮に、該有機過酸化物型の爆薬化合物に対して選択的な結合能を有する抗体が入手できれば、この選択的な結合能を有する抗体を利用する、免疫測定法は、該有機過酸化物型の爆薬化合物検出用センサの開発に利用できる可能性が高い。

　本発明は、前記の課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、対象となる過酸化物誘導体型の爆薬に対する結合能を有する抗体を新たに創製し、創製された抗体を利用して、抗原抗体反応を応用して、対象の過酸化物誘導体型の爆薬を検出可能な免疫センサと、その作製方法を提供することにある。

　本発明の目的は、例えば、対象の過酸化物誘導体型の爆薬として、過酸化アセトン、特には、下記の式（Ｉ）に示す構造を有する、三量体型のＴＡＴＰ（Ｃ_９Ｈ_１８Ｏ_６：トリアセトントリペルオキシド）に対する結合能を有する抗体を新たに創製し、創製された抗体を利用して、抗原抗体反応を応用して、該式（Ｉ）に示す過酸化物誘導体型の爆薬を検出可能な免疫センサと、その作製方法を提供することにある。

　ＴＡＴＰ（3,3,6,6,9,9-hexamethyl-1,2,4,5,7,6-hexaoxacyclononane）:

　本発明者らは、上記の課題を解決すべく、先ず、対象の過酸化物誘導体型の爆薬に対する結合能を有する抗体を新たに創製する手法を検討した。

　対象の過酸化物誘導体型の爆薬自体は免疫原性を示さないことは、既に判明している。一方、免疫原性を持たない低分子量化合物であっても、キャリア・タンパク質上に該低分子量化合物を結合させ、該低分子量化合物により修飾された修飾タンパク質とすると、免疫原として機能する場合がある（非特許文献１：Chemistry　Letters,　Vol.35,　No.10,　p.1126-1127(2006)）。この手法を利用して、免疫原性を持たない低分子量化合物に対して特異的な反応性を示す抗体を作製した事例は少なくないが、全ての低分子量化合物に対して有効というものではない。すなわち、修飾タンパク質において、該低分子量化合物が結合されている部位が、実際に、免疫原性を示すか否かは、その部位の立体構造に依存するため、全ての低分子量化合物に対して有効というものではない。

　但し、例えば、式（Ｉ）に示す構造を有する、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）自体は、キャリア・タンパク質上に結合させ、修飾タンパク質を作製する際に利用可能な官能基を有してなく、前記の手法を適用できない。

　さらに、本発明者らは、抗原抗体反応においては、抗体は、本来の抗原と類似する構造を有する物質に対しても反応性を示す現象、所謂、交叉反応性を示す場合があることに着目した。すなわち、対象の低分子量化合物に代えて、該低分子量化合物と類似する構造を有する抗原に対する特異的な抗体を多数種創製すると、この多数種の抗体群のうちに、対象の低分子量化合物に対して、交叉反応性を示す抗体が存在する可能性があることに想到した。

　本発明者らは、実際に、式（Ｉ）に示す構造を有する、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）において、特徴的な構造は、その環構造であり、該環構造と構造的な類似性を有する低分子量化合物多数種のうち、キャリア・タンパク質上に結合された際、得られる修飾タンパク質が免疫原性を示すものを探索した。次いで、探索された、修飾タンパク質を免疫原として、マウスを免疫することで創製される抗体多数種のうち、式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対して、交叉反応性を示す抗体が存在するか、否かについて、探索を行った。上記の二段回の探索過程を実施したところ、幸運にも、下記の式（II）に示す化合物が、キャリア・タンパク質上に結合された際、得られる修飾タンパク質が免疫原性を示し、該修飾タンパク質を免疫原として、マウスを免疫することで創製される抗体多数種のうちに、交叉反応性を示す抗体が存在することが見出された。

　3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸（3-[12-(2-carboxyethyl)-9,12-dimethyl-7,8,10,11,13,14-hexaoxa-spiro-[5.8]tetradec-9-yl]-propanoic　acid）

　具体的には、式（II）に示すジカルボン酸化合物をキャリア・タンパク質上に結合させて得られる修飾タンパク質を免疫原として、マウスを免疫することで創製された、式（II）に示す化合物に対する抗体を産生する、一群のハイブリドーマ細胞株を作製し、この一群のハイブリドーマ細胞株から、式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対して、交叉反応性を示す抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株数種を選別することができた。

　この選別されたハイブリドーマ細胞株数種が産生するモノクローナル抗体は、少なくとも、免疫動物として利用したマウスの内因性物質とは、交叉反応性を示さないが、式（II）に示すジカルボン酸化合物と、式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する反応性を具えていることが確認された。

　以上の一連の知見に加えて、本発明者らは、該選別されたハイブリドーマ細胞株数種が産生するモノクローナル抗体を固定化した上で、式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）と抗原抗体反応を行わせた際、該モノクローナル抗体に結合される式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の量は、試料溶液中の式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の濃度と、比例しており、定量的な検出に利用できることも確認した。

　特に、該選別されたハイブリドーマ細胞株数種が産生するモノクローナル抗体に結合された、式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）は、周囲の溶液中に含有される式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の濃度を零とすると、すなわち、洗浄処理を施すと、凡そ、１分間のうちに、実質的に結合されていた式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の解離が完了することも確認した。すわなち、抗原抗体反応を利用する免疫センサに応用した際、該選別されたハイブリドーマ細胞株数種が産生するモノクローナル抗体に一旦結合された式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）を、洗浄処理によって、解離する際、その処理時間として、１分間を選択することができることが確認された。換言すると、抗原抗体反応を利用する免疫センサに応用した際、前記の処理時間の洗浄処理を行うことで、該免疫センサの再利用が可能であることの確認がなされた。

　実際に、抗原抗体反応を利用する免疫センサの定量性を検証する上では、該免疫センサの抗体に結合されている抗原物質の量を別途に測定する必要がある。その際、前記の処理時間の洗浄処理を行うことで、該免疫センサのモノクローナル抗体に結合されていた式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）について、実質的に全量を解離させ、回収することができる。回収された式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の量を別途定量することで、該抗原抗体反応を利用する免疫センサの定量性を検証することが可能となる。

　以上の一連の検証を行うことで、該選別されたハイブリドーマ細胞株数種が産生するモノクローナル抗体は、式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の定量的な検出に利用可能な、抗原抗体反応を利用する免疫センサに好適に使用することが可能であることを確認した。

　さらに、本発明者らは、上記の式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）と、該式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）における特徴的構造と類似性を具えた構造を持つ式（II）に示すジカルボン酸化合物に対するモノクローナル抗体の組み合わせのみならず、対象の過酸化物誘導体型の爆薬自体は免疫原性を示さない場合、該過酸化物誘導体型の爆薬における特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対するモノクノーナル抗体を同様の手法で創製することが可能であることも見出した。その際、該過酸化物誘導体型の爆薬における特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対するモノクノーナル抗体多数種のうち、対象の過酸化物誘導体型の爆薬に対して交叉反応性を示す抗体を選別することが可能であり、選別される交叉反応性を示す抗体は、上記の抗原抗体反応を利用する免疫センサの作製に必要な特質を具えていることも見出した。

　本発明者らは、上述する一連の知見、ならびに、検証結果に基づき、本発明を完成させた。

　すなわち、本発明にかかる免疫センサは、
　過酸化物誘導体型の爆薬である、下記の式（Ｉ）の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ：3,3,6,6,9,9-hexamethyl-1,2,4,5,7,6-hexaoxacyclononane）を、抗原抗体反応を利用して検出する免疫センサであって、

　該免疫センサは、少なくとも、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、
　前記作用極に対する対極と、
　前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する機能を具えた測定部とを具えてなり、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して結合能を有するモノクローナル抗体である
ことを特徴とする免疫センサである。

　特には、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して結合能を有するモノクローナル抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対するモノクローナル抗体であり、該式（Ｉ）の過酸化アセトン過酸化物に対して交叉反応性を有することが好ましい。

　その際、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物は、下記の式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物：3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸（3-[12-(2-carboxyethyl)-9,12-dimethyl-7,8,10,11,13,14-hexaoxa-spiro-[5.8]tetradec-9-yl]-propanoic　acid）であることが好ましい。

　上記の構成を有する本発明にかかる免疫センサにおいては、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対する結合能を有するモノクローナル抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質を免疫原として、ヒト以外の哺乳動物を免疫することで創製される、該低分子化合物に対するモノクローナル抗体であり、
　該式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して交叉反応性を有する抗体であることが好ましい。

　その際、前記ヒト以外の哺乳動物は、マウスであることが好ましい。

　また、前記低分子化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質において、該キャリア・タンパク質として、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）を選択することが好ましい。

　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物として、その分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物を選択し、
　該分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質は、該カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と前記キャリア・タンパク質上のアミノ基（－ＮＨ_２）との間でアミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）を介して、前記分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物の結合がなされていることが好ましい。

　例えば、該カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と前記キャリア・タンパク質上のアミノ基（－ＮＨ_２）との間でアミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）の形成は、カルボジイミド法を利用してなされていることが好ましい。

　さらには、前記抗原抗体反応に利用される抗体として、
ハイブリドーマ細胞株：NECP-C57Z　3B-7E（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１２５）が産生する、前記式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物に対するモノクローナル抗体を用いる形態とすることができる。

　上記の構成を有する本発明にかかる免疫センサにおいては、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、前記作用極に対する対極は、同一の絶縁基板上に形成されていることが好ましい。

　前記抗原抗体反応に利用される抗体をその表面に固定化する電極材料は、カーボン材料であることが好ましい。

　その際、前記抗原抗体反応に利用される抗体をカーボン材料の表面に固定化している作用極に対して、前記対極として、白金電極を選択することが好ましい。

　さらには、前記抗原抗体反応に利用される抗体をカーボン材料の表面に固定化している作用極、前記作用極に対する対極として利用する白金電極に加えて、参照電極として機能する銀／塩化銀電極を具える構成を選択することができる。

　一方、本発明にかかる免疫センサの製造方法は、
　過酸化物誘導体型の爆薬である、下記の式（Ｉ）の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ：3,3,6,6,9,9-hexamethyl-1,2,4,5,7,6-hexaoxacyclononane）を、抗原抗体反応を利用して検出する免疫センサを製造する方法であって、

　該免疫センサは、少なくとも、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、
　前記作用極に対する対極と、
　前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する機能を具えた測定部とを具えてなり、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して結合能を有するモノクローナル抗体であり、
　該免疫センサを製造する方法は、少なくとも、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極を形成する工程と、
　前記作用極に対する対極を形成する工程と、
　前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する機能を具えた測定部を設ける工程とを具えている
ことを特徴とする免疫センサの製造方法である。

　特には、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対する結合能を有するモノクローナル抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対するモノクローナル抗体であり、該式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して交叉反応性を有することが好ましい。

　上記の構成を有する本発明にかかる免疫センサの製造方法においては、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対する結合能を有するモノクローナル抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質を免疫原として、ヒト以外の哺乳動物を免疫することで創製される、該低分子化合物に対するモノクローナル抗体であり、
　該式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して交叉反応性を有する抗体であることが好ましい。

　さらには、前記抗原抗体反応に利用される抗体として、
ハイブリドーマ細胞株：NECP-C57Z　3B-7E（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１２５）が産生する、前記式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物に対するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。

　上記の構成を有する本発明にかかる免疫センサの製造方法においては、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、前記作用極に対する対極は、同一の絶縁基板上に形成されていることが好ましい。

　本発明にかかる過酸化物誘導体型の爆薬検出用の免疫センサでは、過酸化物誘導体型の爆薬における特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対するモノクローナル抗体を利用しており、該モノクローナル抗体の該過酸化物誘導体型の爆薬に対する交叉反応性によって、抗原抗体反応を介して、対象の過酸化物誘導体型の爆薬を選択的に検出することが可能である。例えば、対象の過酸化物誘導体型の爆薬が、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）である際には、該三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物：3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸（3-[12-(2-carboxyethyl)-9,12-dimethyl-7,8,10,11,13,14-hexaoxa-spiro-[5.8]tetradec-9-yl]-propanoic　acid）に対するモノクローナル抗体を利用しており、該モノクローナル抗体の該過酸化物誘導体型の爆薬に対する交叉反応性によって、抗原抗体反応を介して、対象の過酸化物誘導体型の爆薬を選択的に検出することが可能である。特には、本発明にかかる過酸化物誘導体型の爆薬検出用の免疫センサを応用することによって、溶液試料中に含有される、対象の過酸化物誘導体型の爆薬の検出を簡便に行うことが可能となる。

図１は、本発明にかかる過酸化物誘導体型の爆薬検出用の免疫センサにおいて、検出対象の過酸化物誘導体型の爆薬を、抗原抗体反応を利用して検出するために使用される、モノクローナル抗体を電極材料の表面に固定化している作用極の一形態を模式的に示す図である。図２は、本発明の第一の実施形態にかかる免疫センサにおいて利用可能な、3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸（3-[12-(2-carboxyethyl)-9,12-dimethyl-7,8,10,11,13,14-hexaoxa-spiro-[5.8]tetradec-9-yl]-propanoic　acid）に対するモノクローナル抗体の、対象の過酸化物誘導体型の爆薬、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性をＥＬＩＳＡ法により評価した結果を示すグラフである。図３は、モノクノーナル抗体：ｍＡｂ－Ｔ００３を利用する、本発明の第一の実施態様にかかる免疫センサを用いて、溶液試料中に含まれる、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の検出を行った結果の一例を示すグラフである。図４は、モノクノーナル抗体：ｍＡｂ－Ｔ００３を利用する、本発明の第一の実施態様にかかる免疫センサを用いて、第二の実施態様に記載する測定手法を応用して、溶液試料中に含まれる、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の検出を行った結果の一例を示すグラフである。

　（符号の説明）
　図１中に示す符号は、下記の意味を有する。
１　絶縁基板
２　カーボン電極
３　モノクローナル抗体

　以下に、本発明にかかる過酸化物誘導体型の爆薬検出用の免疫センサと、その製造方法に関して、詳細に説明する。

　まず、本発明にかかる過酸化物誘導体型の爆薬の免疫センサの作製に利用される、過酸化物誘導体型の爆薬に対する結合能を有する抗体と、その製造方法に関して、より詳しく説明する。

　低分子量の有機化合物に対する抗体を創製する手段として、対象の低分子量の有機化合物自体は免疫原性を示さない場合、キャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、得られる修飾キャリア・タンパク質を免疫原に利用する手法がある（非特許文献１：Chemistry　Letters,　Vol.35,　No.10,　p.1126-1127(2006)）。

　具体的には、低分子量の有機化合物が反応性の官能基、例えば、アミノ基（－ＮＨ_２）、ヒドロキシル基（－ＯＨ）、スルファニル基（－ＳＨ）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を具えている場合、該反応性の官能基を利用して、他の反応性官能基を有する有機化合物を共有結合的に連結することが可能である。キャリア・タンパク質は、複数のアミノ酸残基が連結されてなるペプチド鎖で構成される、三次元構造を有しているが、その表面には、側鎖上に反応性官能基を有するアミノ酸残基が複数個存在している。従って、三次元構造を有している、キャリア・タンパク質の表面に存在する、アミノ酸残基の側鎖上の反応性官能基を利用して、反応性の官能基を具えている、低分子量の有機化合物を結合させることが可能である。この表面に低分子量の有機化合物に因る修飾が施された、修飾キャリア・タンパク質は、非天然型タンパク質分子であり、哺乳動物自体の内因性タンパク質分子と相違する、異質な物質として、認識される頻度が高い。特に、低分子量の有機化合物に因る修飾が施された部位は、免疫原性を発揮する頻度が高い。修飾キャリア・タンパク質表面の、低分子量の有機化合物に因る修飾が施された部位が、免疫原性を発揮する場合、該修飾キャリア・タンパク質を用いて、哺乳動物を免疫すると、該修飾キャリア・タンパク質に対する、特異的な抗体が創製される。

　該修飾キャリア・タンパク質の表面において、免疫原性を発揮する部位（抗原決定基）が複数存在する可能性がある。その場合、前記複数の免疫原性を発揮する部位（抗原決定基）のそれぞれに特異的な抗体複数種が創製される。創製された、修飾キャリア・タンパク質に特異的な抗体複数種のうちには、その修飾に利用した低分子量の有機化合物自体を、免疫原性を発揮する部位（抗原決定基）とする抗体が存在する頻度が高い。修飾に利用した低分子量の有機化合物自体に対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、修飾に利用した低分子量の有機化合物自体を、免疫原性を発揮する部位（抗原決定基）とする抗体を選別することが可能である。

　但し、修飾キャリア・タンパク質の表面に存在する抗原決定基に対して、高い交叉反応性を示す抗体を、免疫対象の哺乳動物が既に保持している場合には、この交叉反応性を示す抗原決定基に対する、新たな抗体の創製は起こらない。すなわち、免疫対象の哺乳動物が既に保持している抗体が示す高い交叉反応性を利用して、該修飾キャリア・タンパク質に対する免疫反応が可能である場合、この交叉反応性を示す抗原決定基に対する、新たな抗体の創製は起こらない。

　さらには、修飾が施された部位が、免疫原性を発揮する部位（抗原決定基）として機能する場合であっても、該抗原決定基に特異的な抗体は、修飾に利用した低分子量の有機化合物自体に対する結合能は高くない場合も、少なくない。

　すなわち、前記のキャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、得られる修飾キャリア・タンパク質を免疫原に利用する手法を利用して、修飾に利用した低分子量の有機化合物自体に特異的な抗体を創製できる、否かは、下記の要因に依存している。具体的には、対象の低分子量の有機化合物自体の立体構造、利用するキャリア・タンパク質との組み合わせ、ならびに、該キャリア・タンパク質上への結合形態、その修飾部位の選択、以上４つの要因に依存している。

　実際には、対象の低分子量の有機化合物自体の立体構造は既に決定されているため、残る３つの要因に関して、適切な組み合わせを選択できるか、否かは、多分に偶然性に依存したものである。すなわち、キャリア・タンパク質上への結合形態、その修飾部位は、利用するキャリア・タンパク質の種類に依存しており、また、対象の低分子量の有機化合物が有する反応性官能基の種類によって、制限される。対象の低分子量の有機化合物自体の立体構造によっては、残る３つの要因に関して、適切な組み合わせが選択できない場合もある。

　一方、過酸化物誘導体型の爆薬自体が、その分子内に反応性官能基を保持していない場合には、上記の前記のキャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、得られる修飾キャリア・タンパク質を免疫原に利用する手法を適用できない。勿論、過酸化物誘導体型の爆薬は、低分子量の有機化合物であり、それ自体は免疫原性を示さない。

　そのため、本発明では、対象の過酸化物誘導体型の爆薬における特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対する抗体多数を創製し、その類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対する抗体多数のうち、対象の過酸化物誘導体型の爆薬に対して交叉反応性を有する抗体を選別する方法を採用している。

　以下に、対象の過酸化物誘導体型の爆薬として、下記の式（Ｉ）に示す構造を有する三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ：3,3,6,6,9,9-hexamethyl-1,2,4,5,7,6-hexaoxacyclononane）を例に採り、本発明で利用される抗体の作製方法をより具体的に説明する。

　式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の構造的特徴は、その環構造そのものである。この環構造の特徴を具え、分子内に反応性官能基を有する、低分子量の過酸化物型化合物のうち、哺乳動物自体に対する毒性は高くなく、また、キャリア・タンパク質上に結合させる際、その環構造を保持可能なものを探索した。

　その探索の結果、毒性が低い抗マラリア薬剤としての利用が検討されている、低分子量の過酸化物型化合物の一群のうち、下記の式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物：3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸（3-[12-(2-carboxyethyl)-9,12-dimethyl-7,8,10,11,13,14-hexaoxa-spiro-[5.8]tetradec-9-yl]-propanoic　acid）が前記の要件を満足する候補として、選択された。

　本発明では、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物の分子内に存在する反応性官能基である、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を利用して、キャリア・タンパク質表面に存在する反応性官能基、特に、アミノ基（－ＮＨ_２）との間で、アミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）を形成させることで、キャリア・タンパク質の表面に結合させる形態を選択することが好ましい。

　その際、キャリア・タンパク質は、上記のキャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、得られる修飾キャリア・タンパク質を免疫原に利用する手法（非特許文献１：Chemistry　Letters,　Vol.35,　No.10,　p.1126-1127(2006)）において、既に利用されている、各種のキャリア・タンパク質を利用することができる。キャリア・タンパク質として、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）などが好適に利用できる。

　キャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、得られる修飾キャリア・タンパク質を免疫原に利用する場合、免疫操作を施した哺乳動物中では、該修飾キャリア・タンパク質に対する特異的な抗体が創製される。その際、利用するキャリア・タンパク質自体も、一般に、免疫原性を具えているため、該修飾キャリア・タンパク質中の修飾部位に特異的な抗体以外に、キャリア・タンパク質自体の抗原決定基に特異的な抗体の創製もなされる。

　その点を考慮すると、免疫操作に利用される、修飾キャリア・タンパク質に対して、未修飾のキャリア・タンパク質の混入比率が低いことが好ましい。勿論、未修飾のキャリア・タンパク質の混入が無い、修飾キャリア・タンパク質を使用することがより好ましい。

　一方、利用されるキャリア・タンパク質上には、対象の低分子量の有機化合物を結合させ、修飾を行うことが可能な部位（修飾可能部位）が、一般に、複数箇所存在している。この修飾可能部位は、それぞれ、反応性官能基が存在しているが、その反応性には、一般に、差違が存在している。従って、反応性の高い修飾可能部位から優先的に、対象の低分子量の有機化合物の結合が進行し、対象の低分子量の有機化合物が消費されるため、反応性の低い修飾可能部位に対して、対象の低分子量の有機化合物の結合が達成される効率は一層低下する傾向がある。キャリア・タンパク質上に存在する、複数の修飾可能部位の全てに、対象の低分子量の有機化合物の結合を達成させるためには、反応に使用する対象の低分子量の有機化合物の量は、複数の修飾可能部位の合計に対して、相当に過剰な量に選択することが望ましい。例えば、キャリア・タンパク質上に存在する、修飾可能部位がＮ箇所である場合、反応に使用する対象の低分子量の有機化合物の量は、キャリア・タンパク質１分子当たり、最低限、Ｎ分子が必要であるが、少なくとも、少なくとも、５０分子以上、好ましくは、６０分子以上に選択することが望ましい。

　免疫操作は、該対象の低分子量の有機化合物を結合させた、修飾キャリア・タンパク質の免疫有効量を含む溶液を、例えば、免疫対象の哺乳動物に対して、注射により投与することにより行うことが望ましい。その注射による投与の形態では、皮下注射、皮内注射、静脈注射、または腹腔内投与の形態が利用可能である。通常、皮下注射によって、前記溶液を投与する。その際、前記修飾キャリア・タンパク質の免疫有効量を含む溶液に、各種のアジュバンドを添加することが好ましい。通常、該アジュバンドとしては、従来から免疫操作に利用されているアジュバンドが利用できる。利用可能なアジュバントとしては、フロイント完全アジュバントや水中油中水型乳剤、水中油乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバンドがある。フロイント完全アジュバンドは、汎用されており、本発明でも、好適に利用できる。例えば、初回の免疫操作（感作）時には、該アジュバンドとして、フロイント完全アジュバントを利用することが好ましい。

　また、免疫操作では、初回の免疫操作（感作）後、所定の期間が経過した時点で、追加免疫を行う。この追加免疫においても、修飾キャリア・タンパク質の免疫有効量を含む溶液に、各種のアジュバンドを添加することが好ましい。例えば、追加免疫時にも、該アジュバンドとして、フロイント完全アジュバントを利用することが好ましいが、フロイント不完全アジュバントを利用することでも、相当の効果が得られる。

　初回の免疫操作（感作）後、実施される追加免疫は、複数回行うことが望ましい。その間隔は、前回の免疫操作（感作）に対する免疫反応に伴う、血液中の抗体濃度が極大を示し、抗体濃度の減少期となった時点で、追加免疫を行うことが望ましい。前回の免疫操作（感作）後、血液中の抗体濃度が極大に達するまでの日数は、通常、用いる免疫原の体内での代謝速度に依存する。従って、追加免疫の間隔は、用いる免疫原の種類、対象の免疫動物の種類、その健康状態に依存する。マウスなどの小動物を免疫動物に利用する際には、初回の免疫操作（感作）後、例えば、２週間、４週間、６週間、８週間後に、追加免疫を実施する形態を選択できる。

　科学的には、免疫対象の哺乳動物の種類は問わないが、倫理的な観点から、ヒト以外の哺乳動物から選択する。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を創製する場合、免疫対象の哺乳動物に利用可能な、ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、ヤギなどを選択することができる。

　免疫対象の哺乳動物としては、該修飾キャリア・タンパク質に対して、交叉反応性を示す抗体を既に保持している哺乳動物は好ましくない。すなわち、当該免疫対象の哺乳動物は、後天的に獲得した免疫が無い個体であることが、一般に好ましい。前記の要件を考慮すると、各種の免疫原性物質に曝される機会が本質的にない環境下において、出産後、生育された哺乳動物を利用することが好ましい。あるいは、出産後、免疫操作を施すことが可能な程度に生育するまでの期間が短い哺乳動物を利用することが好ましい。これらの条件を考慮すると、医学的な研究に利用される、血統的に確立されている小型の哺乳動物を利用することがより好ましい。具体的には、各種の新規な抗体の創製に利用されている、マウス、ラット、ラビットなどが好ましく、特には、マウスまたはラット、更には、マウスを利用することがより好ましい。

　免疫操作に先立ち、免疫動物として利用される、ヒト以外の哺乳動物において、該修飾キャリア・タンパク質の作製に利用される、キャリア・タンパク質自体の免疫原性と、該キャリア・タンパク質に対する特異的な抗体が創製される免疫条件を予め調査することが望ましい。上記のキャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、得られる修飾キャリア・タンパク質を免疫原に利用する手法（非特許文献１：Chemistry　Letters,　Vol.35,　No.10,　p.1126-1127(2006)）において、既に利用されている、各種のキャリア・タンパク質に関しては、各種の新規な抗体の創製に利用されている、マウス、ラット、ラビットなどについて、前記の事項は、既に調査されており、その報告が利用できる。

　また、上記のキャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、得られる修飾キャリア・タンパク質を免疫原に利用する手法（非特許文献１：Chemistry　Letters,　Vol.35,　No.10,　p.1126-1127(2006)）において、既に報告されている成功例を参照して、各種の新規な抗体の創製に利用されている、マウス、ラット、ラビットなどについて、修飾キャリア・タンパク質の免疫有効量を相当の確度で推定することも可能である。

　各種の新規な抗体の創製に利用されている、マウス、ラット、ラビットなどに対する、免疫操作の手順は、既に報告されている成功例で利用された手順に沿って、選択することが望ましい。

　免疫対象の哺乳動物として、マウスまたはラットを選択する場合、初回の免疫操作（感作）を実施する齢は、その後の追加免疫の回数、その間隔を考慮して、選択される。具体的には、複数回の追加免疫を終了した後、当該免疫動物の血液中に、免疫原に特異的な抗体が存在することを検証する必要がある。従って、複数回の追加免疫を終了する時点で、当該免疫動物が抗体を生産する能力が低下する齢に達しないように、初回の免疫操作（感作）を実施する齢を選択することが好ましい。初回の免疫操作（感作）後、複数回の追加免疫を終了するまでの期間を、８週間程度に選択する場合、マウスまたはラットでは、初回の免疫操作（感作）を実施する齢は、１０～１５週齢の範囲に選択することが好ましく、通常、１２週齢程度に選択することがより好ましい。マウスまたはラットでは、１２週齢程度に達すると、十分な抗体を生産する能力を有しており、新規な抗体を創製する能力が最も高くなることが知られている。

　式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物は、公知の化合物であり、その合成方法は、文献に既に報告されている（非特許文献２：Organic　&　Biomolecular　Chemistry　Vol.4,　p.4431-4436　(2006)）。該式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物は、室温において、固体であるため、キャリア・タンパク質上に該化合物を結合させる反応は、該化合物を溶解可能な反応溶媒を利用して実施する必要がある。一方、利用されるキャリア・タンパク質は、溶媒の種類によっては、変性を受ける場合がある。従って、利用されるキャリア・タンパク質の変性を引き起こさず、同時に、該化合物を溶解可能な反応溶媒を選択する必要がある。

　従来、キャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、修飾キャリア・タンパク質を調製する際に利用された、各種の反応溶媒中から、前記の式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物を溶解可能な反応溶媒を選択することが好ましい。実際に、前記の反応溶媒の選択を進めたところ、特に、好ましい反応溶媒として、ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ：（ＣＨ_３）_２ＳＯ）とホウ酸緩衝液が選択された。

　ジメチルスルホン（ＤＭＳＯ：（ＣＨ_３）_２ＳＯ）は、非水溶媒であるが、キャリア・タンパク質を変性させずに溶解可能であり、また、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物を相当に高濃度で溶解可能な溶媒である。

　また、ホウ酸緩衝液は、その緩衝作用が発揮できるｐＨ領域は、６．８～９．２の範囲であるが、上記の式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物を溶解可能な溶媒系としては、通常、ｐＨを８．２～８．７の範囲に選択する組成、特には、ｐＨを、８．５前後に調整可能な組成を選択することが好ましい。

　式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物の分子内に存在する反応性官能基である、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を利用して、キャリア・タンパク質表面に存在する反応性官能基、特に、アミノ基（－ＮＨ_２）との間で、アミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）を形成させる場合、カルボジイミドを利用するアミド結合形成法を利用することが好ましい。カルボジイミドを利用するアミド結合形成では、結合剤カルボジイミドとして、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ－［３-（ジメチルアミノ）プロピル］－Ｎ’－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－［３-（ジメチルアミノ）プロピル］－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）などを利用することができる。該結合剤カルボジイミドの量は、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物１分子当たり、５分子～２０分子の範囲に選択することが好ましい。

　一方、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物の使用量は、キャリア・タンパク質の表面に露呈する、アミノ基（－ＮＨ_２）の総数に基づき、決定する。その際、キャリア・タンパク質１分子の表面に露呈する、アミノ基（－ＮＨ_２）の総数がＮ個である場合、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物の使用量を、該キャリア・タンパク質１分子当たり、Ｎ×３分子～Ｎ×１０分子の範囲に選択することが好ましい。その結果として、該キャリア・タンパク質１分子当たり、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物が、1/2×Ｎ分子～Ｎ分子の範囲で、結合している、修飾キャリア・タンパク質を調製することが望ましい。

　本発明では、上記の免疫操作に利用する、免疫原として、キャリア・タンパク質上に対象の低分子量の有機化合物を結合させ、得られる修飾キャリア・タンパク質を利用している。免疫操作によって、新たに創製される、該修飾キャリア・タンパク質に特異的な抗体複数種のうちに、利用したキャリア・タンパク質上に結合していない、該低分子量の有機化合物自体に対しても高い反応性を示す抗体が実際に存在することを、先ず検証する。

　上記の最終回の追加免疫を終了した後、免疫原として利用する、該修飾キャリア・タンパク質に特異的な抗体の血液中濃度の有意な上昇が見出される時点で、当該免疫動物から採血し、採取した血液から、抗血清を調製する。この抗血清中に含まれる、該修飾キャリア・タンパク質に特異的な抗体複数種のうちに、利用したキャリア・タンパク質上に結合していない、該低分子量の有機化合物自体に対しても高い反応性を示す抗体が実際に存在することを、検証する。

　すなわち、該低分子量の有機化合物自体を抗原決定基とする、ポリクローナル抗体の有無を検証する。複数種の抗体を含有している抗血清中に、特定の抗原決定基に特異的に結合する抗体が存在することを検証する手段としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が好適に利用される。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）は、特定の抗原決定基に対する抗体の特異的な反応性を利用するため、選択性が高く、特に、抗血清中に含有されている、特定の抗原決定基に対する抗体の濃度が不明な場合に、その抗体価を簡便に評価することが可能である。

　本発明では、利用したキャリア・タンパク質上に結合していない、該低分子量の有機化合物自体に対しても高い反応性を示す抗体の検出を行うため、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で利用する抗原として、該低分子量の有機化合物を、別種のキャリア・タンパク質の表面に結合させた、別種の修飾キャリア・タンパク質を利用する。勿論、その別種のキャリア・タンパク質自体は、該修飾キャリア・タンパク質に特異的な抗体複数種と反応しないことが必要である。

　免疫原の作製に利用されるキャリア・タンパク質と、前記の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で利用する抗原の作製に利用される別種のキャリア・タンパク質を、免疫原の作製に好適に利用されるキャリア・タンパク質の群から、互いに相違する二種のキャリア・タンパク質の組み合わせを選択することが好ましい。

　前記のキャリア・タンパク質の組み合わせでは、該キャリア・タンパク質自体の抗原決定基は、通常、相違しており、該修飾キャリア・タンパク質に特異的な抗体複数種が、前記別種のキャリア・タンパク質自体に反応性を示す可能性を排除できる。また、前記の互いに相違する二種のキャリア・タンパク質の組み合わせでは、該低分子量の有機化合物を結合可能な部位の局所的な構造（部分アミノ酸配列）が実質的に一致する可能性も極めて低い。従って、前記の組み合わせでは、免疫原の修飾キャリア・タンパク質に特異的な抗体複数種のうち、該低分子量の有機化合物を、別種のキャリア・タンパク質の表面に結合させた、別種の修飾キャリア・タンパク質に対して結合能を示す抗体は、該低分子量の有機化合物自体に結合する抗体と見做すことができる。

　特に、前記の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で利用する抗原の作製に利用される別種のキャリア・タンパク質として、ブロッキング用タンパク質として、汎用されるウシ血清アルブミンを選択し、一方、免疫原の作製に利用されるキャリア・タンパク質として、ウシ血清アルブミン以外の汎用のキャリア・タンパク質、例えば、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）を選択することがより好ましい。前記の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で利用する、修飾キャリア・タンパク質型の抗原の作製に利用される別種のキャリア・タンパク質として、ウシ血清アルブミンを選択すると、その修飾キャリア・タンパク質型の抗原の、ウシ血清アルブミン部分に非選択的に抗体分子が結合する現象も排除される。さらに、ウシ血清アルブミンをキャリア・タンパク質とする、該修飾キャリア・タンパク質型の抗原は、ＥＬＩＳＡプレート上に、高密度で固定することが可能である。

　取得された抗血清中に、免疫原の作製に利用している、該低分子量の有機化合物自体に対する反応性を有する抗体が存在することを検証した後、該低分子量の有機化合物自体に対する反応性を有するポリクローナル抗体が、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す構造を有する三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）自体に対して、交叉反応性を示すか否かを検証する。

　本発明において、前記抗体の交叉反応性の検証は、二種の抗原の抗体に対する競合反応を利用することが好ましい。

　目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す構造を有する三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）自体は、低分子量の有機化合物であり、抗体との抗原抗体反応を行う際、その結合は、抗体分子の相補性決定部位の一つにより達成されると考えられる。また、上記の免疫操作に利用される、修飾キャリア・タンパク質の作製に利用される、類似の構造を有する低分子量の有機化合物も、抗体との抗原抗体反応を行う際、その結合は、抗体分子の相補性決定部位の一つにより達成されると考えられる。

　従って、抗体が交叉反応性を有する場合、免疫原の修飾キャリア・タンパク質の作製に利用される、類似の構造を有する低分子量の有機化合物との結合に関与する、該抗体分子の相補性決定部位と、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）自体の結合に関与する、該抗体分子の相補性決定部位とは一致する可能性が極めて高い。その場合、該抗体分子の相補性決定部位に、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）が結合すると、免疫原の修飾キャリア・タンパク質の作製に利用される、類似の構造を有する低分子量の有機化合物の結合を阻害する。この競争阻害の現象を利用することで、当該抗体分子の特定の相補性決定部位に対して、交叉反応性を示すか否かを検証することができる。

　具体的には、上記の免疫原の修飾キャリア・タンパク質の作製に利用される、類似の構造を有する低分子量の有機化合物自体に対する反応性に検証に利用した、該類似の構造を有する低分子量の有機化合物を、別種のキャリア・タンパク質の表面に結合させた、別種の修飾キャリア・タンパク質を、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化する。一方、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）は、該ＥＬＩＳＡ法において、抗原抗体反応を行わせる反応液中に、ポリクローナル抗体の含む抗血清とともに溶解させる。

　上記の競合反応が進行すると、前記反応液中に存在する、交叉反応性を示す抗体は、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）と抗原抗体反応する結果、プレート上に固定化されている、修飾キャリア・タンパク質型の抗原との抗原抗体反応を介して、固定化される抗体分子の量が減少する。この競合反応に起因する、プレート上に固定化されている、修飾キャリア・タンパク質型の抗原との抗原抗体反応を介して、固定化される抗体分子量の減少を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を応用して検出する。

　この手法を利用することで、抗血清中に含有される、上記の免疫原の修飾キャリア・タンパク質の作製に利用される、類似の構造を有する低分子量の有機化合物自体に対するポリクローナル抗体中、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）と交叉反応性を示す抗体が含まれることを検証することができる。

　換言すると、前記の検証がなされた抗血清は、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する結合能を有するポリクローナル抗体を含むものである。

　前記の目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）と交叉反応性を示す抗体を産生していることの検証がなされた免疫動物の抗体産生細胞群を採取し、この抗体産生細胞群と、骨髄腫由来の細胞株の細胞とを細胞融合させ、一群のハイブリドーマ細胞を作製する。

　通常、前記の検証がなされた免疫動物から、その脾臓を摘出して、脾臓細胞群を調製する。この脾臓細胞群と、骨髄腫由来の細胞株の細胞とを細胞融合させ、一群のハイブリドーマ細胞を作製する。

　前記の細胞融合に利用される、骨髄腫由来の細胞株は、融合対象である、免疫動物由来の脾臓細胞と適合性を有することが必要である。また、細胞融合で創製されるハイブリドーマ細胞の増殖能は、細胞融合に利用される、骨髄腫由来の細胞株に依っており、増殖能力の優れた骨髄腫由来の細胞株を利用することが好ましい。

　例えば、免疫動物として、マウスを選択する場合、細胞融合に利用される、骨髄腫由来の細胞株として、マウスの骨髄腫由来の細胞株である、Ｐ３Ｘ６３　Ａｇ８．６５３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ、Ｓｐ２／Ｏ　Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０　ＢＵ．１等が好適に使用される。特に、細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕの利用は、創製されるハイブリドーマ細胞の増殖能が高く、また、該ハイブリドーマ細胞の産生する抗体分子は、適正な組み立てがなされた全抗体であり、組み立ての完了していない抗体分子の断片を含まないので、より好ましい。

　例えば、免疫動物として、ラットを選択する場合、細胞融合に利用される、骨髄腫由来の細胞株として、ラットの骨髄腫由来の細胞株、２１０、ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３、ＹＢ２／０などが挙げられる。

　上記のハイブリドーマ細胞を創製するための細胞融合の手法として、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などが挙げられる。ポリエチレングリコール法は、細胞毒性が少なく、融合操作も容易であり、特に、再現性が高いので、本発明により適している。すなわち、本発明では、免疫原の修飾キャリア・タンパク質に対する特異的なモノクローナル抗体を産生する、一群のハイブリドーマ細胞のうち、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選別する必要がある。創製される、一群のハイブリドーマ細胞のうち、前記の交叉反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が含まれる頻度は、決して高く無いので、スクリーニング対象の一群のハイブリドーマ細胞の細胞株数（母数）を大きくする必要がある。従って、より再現性の高い細胞融合手法を選択することが好ましく、ポリエチレングリコール法は、前記の要請に適合している。

　創製された、一群のハイブリドーマ細胞は、分散した上で、マイクロプレートに分注して、利用した骨髄腫由来の細胞株に応じて、適宜選択される公知の培養条件で増殖させる。上記の培養により確立される、一群のハイブリドーマ細胞の細胞株について、各ハイブリドーマ細胞の細胞株が産生するモノクローナル抗体について、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）と交叉反応性を示す抗体か否かを検証する。

　培養により確立される、一群のハイブリドーマ細胞の細胞株について、各ハイブリドーマ細胞の細胞株の培養上清を採取する。各ハイブリドーマ細胞の細胞株の培養上清は、該細胞株の産生するモノクローナル抗体を含んでいる。

　各ハイブリドーマ細胞の細胞株の培養上清に含まれるモノクローナル抗体が、免疫操作に利用される、修飾キャリア・タンパク質の作製に利用される、類似の構造を有する低分子量の有機化合物自体に対する反応性を有するか、否かを先ず検証する。

　その検証には、該類似の構造を有する低分子量の有機化合物を、別種のキャリア・タンパク質の表面に結合させた、別種の修飾キャリア・タンパク質を抗原とする、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）による検証手法が利用できる。その具体的な測定法は、上記の抗血清中に含まれるポリクローナル抗体の反応性に関する検証と、原理的には同じである。

　この検証によって、一群のハイブリドーマ細胞の細胞株中から、免疫操作に利用される、修飾キャリア・タンパク質の作製に利用される、類似の構造を有する低分子量の有機化合物自体に対する反応性を有するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞の細胞株が選別される。この一次スクリーニングで選別される、ハイブリドーマ細胞の細胞株の群について、該ハイブリドーマ細胞の細胞株の産生するモノクローナル抗体は、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、すなわち、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示す抗体か否かを検証する。

　この交叉反応性に関する検証は、上記の抗血清中に含まれるポリクローナル抗体の交叉反応性に関する検証と、原理的には同じ手法を適用することで行うが可能である。

　前記目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、すなわち、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性の検証（二次スクリーニング）によって、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、すなわち、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞の細胞株が選別される。なお、選択されるモノクローナル抗体のタイプは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）に利用される、抗Ｉｇ抗体の示す抗体タイプ特異性に依存する。

　この二次スクリーニングによって、選別されるハイブリドーマ細胞の細胞株を使用して、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する結合能を有するモノクローナル抗体を生産することができる。

　選別されたハイブリドーマ細胞の細胞株のｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞培養を行い、その培養上清を回収し、含有されるモノクローナル抗体を精製することができる。また、選別されたハイブリドーマ細胞の細胞株を、免疫に利用したヒト以外の哺乳動物の腹腔内に接種すると、該腹腔内で増殖し、腹水内に産生されたモノクローナル抗体が蓄積される。その後、該腹水を採取して、含有されるモノクローナル抗体を精製することができる。

　腹水または培養上清中に含まれる、モノクローナル抗体の精製は、例えば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法，エタノール分画法などを、適宜組み合わせ、目的の純度まで精製を施す。望ましい純度は、９５％以上、より好ましくは９８％以上である。例えば、目的とする過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する結合能を有するモノクローナル抗体を、当該過酸化物誘導体型の爆薬の検出装置、あるいは、濃度の測定装置に利用する際には、夾雑物に対する反応性を具える抗体が混入すると、その確度を低減させる要因となる。その点を考慮すると、前記の純度まで精製を行うことが望ましい。

　（受託番号）
　なお、
　本発明に利用される、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する結合能を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞として、
ハイブリドーマ細胞株：NECP-C57Z　3B-7Eが、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国　茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６、郵便番号３０５－８５６６）に、国際寄託（平成２１年　５月１２日付け）がなされている。

　上記のハイブリドーマ細胞株は、後述する第一の実施態様に開示する手順によって、創製され、選別されたハイブリドーマ細胞株である。なお、ハイブリドーマ細胞株：NECP-C57Z　3B-7Eは、後述のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３を産生するハイブリドーマ細胞株である。

　本発明においては、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する結合能を有するモノクローナル抗体を利用することで、下記の構成を有する免疫センサを作製することが好ましい。

　本発明にかかる免疫センサでは、
　検出対象の過酸化物誘導体型の爆薬を、抗原抗体反応を利用して、作用極上に固定して、該作用極と、対極との間にバイアス電圧を印加して、固定されている検出対象の過酸化物誘導体型の爆薬に起因する応答電流を測定する形態を採用する。そのため、
　該免疫センサは、少なくとも、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、
　前記作用極に対する対極と、
　前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する機能を具えた測定部とを具えている。

　まず、前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極の構成と、前記作用極に対する対極を説明する。

　本発明にかかる免疫センサでは、前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する、電気化学センサの構造を採用している。そのため、作用極と、対極を構成する電極材料として、作用極自体は、カーボン電極であり、前記作用極に対する対極は、白金対極である組み合わせを選択することが好ましい。

　該カーボン電極は、絶縁基板上に、各種の導電性カーボン材料を利用して作製される。その際、前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極は、図１に例示する構成とすることが好ましい。

　具体的には、絶縁基板上１にカーボン電極２を製作し、このカーボン電極２上にモノクローナル抗体３を固定化する。

　絶縁基板上１は、ガラス、石英、透明なプラスチックスなど、抗原抗体反応を行わせる反応液中においても、化学的な安定性を有する絶縁材料からなる基板であれば、特に限定されない。通常、絶縁基板上１には、強度と透明性の高いガラス基板が、好適に利用される。

　カーボン電極２の作製に利用される、導電性カーボン材料として、カーボンペーパー、グラファイトカーボン、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン、カーボン粉末などが利用できる。これら導電性カーボン材料を、適宜バインダー等を用いて、絶縁基板１上に、固着させ、カーボン電極２を形成する。

　該カーボン電極２の表面に、利用されるモノクローナル抗体３を、該抗体分子の重鎖の定常領域を利用して、固定化する。該カーボン電極２の表面に固定化される、モノクローナル抗体３の密度は、検出対象の抗原物質の濃度範囲に依存して選択される。すなわち、抗原抗体反応を行わせる反応液中に含有される、検出対象の抗原物質の濃度範囲の上限においても、該カーボン電極２の表面に固定化される、モノクローナル抗体の全てが、抗原物質と反応してしまう、所謂、飽和状態に達しないことが望ましい。具体的には、反応液中に含有される、検出対象の抗原物質の濃度範囲内では、該カーボン電極２の表面に固定化される、モノクローナル抗体のうち、該抗原物質を結合している比率は、該検出対象の抗原物質の濃度と比例するように、固定化される、モノクローナル抗体３の密度を選択することが望ましい。

　一般に、抗原抗体反応を利用する免疫センサにおいて、カーボン電極２の表面にモノクローナル抗体３を固定化する手法として、下記の手法が利用可能である。

　モノクローナル抗体３を固定化する、カーボン電極２の表面に、予め固定化タンパク質の処理を施しておき、続いて、モノクローナル抗体を含む溶液を接触させればよい。該固定化タンパク質は、モノクローナル抗体３をカーボン電極２の表面に固定化するための機能を有する。具体的な固定化タンパク質としては、電気化学的に活性なアミノ酸であるトリプトファンやチロシンを含むタンパク質を用いればよく、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ等が好適に利用されている。また、測定対象物質（抗原物質）に前述の電気化学的に活性なアミノ酸が含まれていれば、固定化タンパク質にこれらのアミノ酸が含まれなくてもよいことはいうまでもない。また、測定対象物質（抗原物質）および固定化タンパク質の両者に含まれなくても、測定時に用いる溶液中に、電気化学的に活性なアミノ酸が含まれていてもよい。これらの選択は適宜、測定対象物質（抗原物質）に依って変えることが可能である。

　また、必要に応じて、モノクローナル抗体３をカーボン電極２の表面に固定化した後、ポリビニルアルコール等の高分子材料で被覆し、モノクローナル抗体３の保持力を向上させても良い。なお、モノクローナル抗体３を覆うように形成される、該ポリビニルアルコール等の高分子材料からなる被覆膜の膜厚は、通常、０．１μｍ～５μｍの範囲、好ましくは、０．５μｍ～２μｍの範囲に選択することが望ましい。

　続いて、モノクローナル抗体３の固定化を終えた、カーボン電極２は、配線が施されたフレキシブル基板に実装し、該配線とカーボン電極２との間を結線する。該結線部分は、抗原抗体反応を行う反応液と直接接しないように、絶縁性樹脂により被覆を施す。

　前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する機能を具えた測定部は、通常、電気化学測定装置に配置されている。従って、前記作用極と対極を、電気化学測定装置に接続して、実際の測定を行う。

　該免疫センサを利用する測定では、その電気化学的測定は、測定感度の高い方形波ボルタンメトリ法により、実施されることが望ましい。該方形波ボルタンメトリ法による測定を行う場合、通常。前記作用極と対極に加えて、参照極を具える、三極構成の免疫センサを構成する。

　なお、該免疫センサを利用する測定では、検出対象の抗原物質を含まない溶液を利用して、モノクローナル抗体に抗原物質が結合していない状態で、ベース電流を測定する。一方、検出対象の抗原物質を含有する試料溶液を利用して、モノクローナル抗体に抗原物質が結合している状態で、応答電流を測定する。該応答電流と、ベース電流との差違が、モノクローナル抗体に結合された抗原物質に起因する応答電流成分に相当している。

　このモノクローナル抗体に結合された抗原物質に起因する応答電流成分に基づき、検出対象の抗原物質を含有する試料溶液中の、検出対象の抗原物質濃度を決定することができる。

　なお、上記の電気化学的測定では、次の反応を利用することができる。前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加すると、カーボン電極２に固定されている、モノクローナル抗体３においては、含まれているチロシン残基のヒドロキシル基（－ＯＨ）が酸化を受け、酸化電流が発生する。その際、抗原抗体反応によって、抗原が結合している場合、前記のモノクローナル抗体３中に含まれるチロシン残基のヒドロキシル基（－ＯＨ）に対する酸化が促進される。その結果、抗原物質を結合している、モノクローナル抗体３の量に比例した、酸化電流の増加が観測される。

　さらには、別の測定原理を応用した電気化学的測定とすることもできる。測定する溶液中に、固定化されているモノクローナル抗体３の密度と比較して、高濃度でチロシンを添加すると、カーボン電極２上に固定化されているモノクローナル抗体３中に含まれるチロシンと、溶液中に含有されているチロシンとを比較すると、カーボン電極の近傍に存在する比率は、溶液中に含有されているチロシンが格段に高い状況となる。その状況では、実際に測定される電流は、カーボン電極２の極く近傍に存在する溶液中に含有されているチロシンの酸化電流に相当している。

　カーボン電極２上に固定化されているモノクローナル抗体３に抗原が結合していない場合、該モノクローナル抗体３に含まれるチロシンの酸化は、促進されてない。一方、溶液中に含有されているチロシンの濃度は、高濃度であり、その状態では、カーボン電極表面の極く近傍に存在する溶液中に含まれるチロシンの量は、モノクローナル抗体３に含まれるチロシンの量と比較して、格段に多くなっている。すなわち、測定されるベース電流は、カーボン電極表面の極く近傍に存在する溶液中に含有される、該高濃度のチロシンに起因する酸化電流に相当している。

　カーボン電極２上に固定化されているモノクローナル抗体３に抗原が結合している場合、該抗原を結合しているモノクローナル抗体３に含まれるチロシンの酸化は、促進される。その際、モノクローナル抗体３に抗原が結合した複合体のサイズは、モノクローナル抗体３自体のサイズよりも有意に大きくなっており、少なくとも、表面を被覆するポリビニルアルコール膜中に閉める体積比率が増加している。それに付随して、表面を被覆するポリビニルアルコール膜を透過し、カーボン電極表面の極く近傍まで浸潤可能なチロシンの量は、相対的に減少を示す。カーボン電極２上に固定化されているモノクローナル抗体３中、抗原を結合している、抗原・抗体の複合体の占める比率が増すと、カーボン電極２表面の極く近傍まで浸潤可能なチロシンの量の減少比率も増す。その状態でも、カーボン電極２表面の極く近傍に浸潤している、チロシンの量は、抗原・抗体の複合体中に存在するチロシンの量と比較すると、格段に多い水準である。すなわち、測定される応答電流は、カーボン電極２表面の極く近傍に浸潤している、チロシンに起因する酸化電流に相当している。

　結果的に、測定されるベース電流と比較して、測定される応答電流は、減少するが、その減少量は、カーボン電極２上に固定化されているモノクローナル抗体３中、抗原を結合している、抗原・抗体の複合体の占める比率に比例する。

　前記の測定原理を応用する際、抗体分子固定カーボン電極の表面は、ポリビニルアルコール膜により被覆されている形態とすることが望ましい。表面を被覆するポリビニルアルコール膜の膜厚は、０．５μｍ～２μｍの範囲に選択し、モノクローナル抗体３は、該ポリビニルアルコール膜により覆われた状態とすることが好ましい。また、該抗体分子固定カーボン電極の表面に固定化されている、抗体分子の密度は、０．２μｇ／ｍｍ^２～１．０μｇ／ｍｍ^２の範囲に選択することが好ましい。

　一方、測定対象の溶液中に添加されるチロシンの濃度は、高濃度の条件を満足するように、測定時の液温度、溶液を構成する水性溶媒中において、その飽和濃度の２／３～飽和濃度の範囲に選択することが好ましい。

　本発明にかかる過酸化物誘導体型の爆薬検出用の免疫センサの第一の実施態様、第二の実施態様を例に挙げ、本発明をより具体的に説明する。

　以下に例示する第一の実施態様、第二の実施態様の具体例は、本発明の最良の実施形態の一例であるが、本発明の技術的範囲は、該具体例に例示する形態に限定されるものではない。

　（第一の実施態様）
　以下に説明する、本発明の第一の実施態様にかかる過酸化物誘導体型の爆薬検出用の免疫センサでは、検出対象の過酸化物誘導体型の爆薬として、下記の式（Ｉ）に示す構造を有する、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ：3,3,6,6,9,9-hexamethyl-1,2,4,5,7,6-hexaoxacyclononane）を選択している。

　（i）　式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物の合成
　前記式（Ｉ）の三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）における特徴的な環構造と類似性を具えた環構造を内在している、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物：3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸（3-[12-(2-carboxyethyl)-9,12-dimethyl-7,8,10,11,13,14-hexaoxa-spiro-[5.8]tetradec-9-yl]-propanoic　acid）の合成法を説明する。以下、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物をＴＡＴＰ３と略称する。

　式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）の合成法は、文献に既に報告されている（非特許文献２：Organic　&　Biomolecular　Chemistry　Vol.4,　p.4431-4436　(2006)）。合成される式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）の精製手法と、その純度の評価方法も、該文献に開示されている。

　式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）において、そのスピロ環構造：7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデカンの環上の９位の炭素原子と、１２位の炭素原子は、ともに、不斉中心（キラル中心）となっている。該９位の炭素原子と、１２位の炭素原子の立体配置に関して、（９Ｒ、１２Ｓ）と表記可能なメソ体型のジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）は、二回回転対称性を有する立体構造を具えている。該９位の炭素原子と、１２位の炭素原子の立体配置に関して、（９Ｒ、１２Ｒ）と表記可能なシス体型のジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）は、対称面を有する立体構造を具えている。

　本第一の実施態様では、前記二種の立体異性体が混合したものを利用している。なお、式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体は、免疫原性を示さない。

　（ii）　キャリア・タンパク質上への式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）の固定
　キャリア・タンパク質として、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）を選択している。

　該キャリア・タンパク質上に、カルボジイミド法により、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）を結合させ、修飾キャリア・タンパク質の調製を行った。本第一の実施態様では、下記の二種の修飾キャリア・タンパク質を調製し、免疫操作に利用する免疫原とした。

　(ii-a)　修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ＤＭＳＯ免疫原）の調製
　反応溶媒として、ＤＭＳＯ（（ＣＨ_３）_２ＳＯ：和光純薬工業社製）を用いて、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）上に式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）をカルボジイミド法によって結合させ、修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ＤＭＳＯ免疫原）を調製する。該カルボジイミド法による結合形成では、結合剤カルボジイミドとして、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl）（和光純薬工業社製）を利用している。

　ＤＭＳＯに溶解したＴＡＴＰ３、１０ｍｇ／０．３ｍｌと、ＤＭＳＯに溶解したキーホールリンペツトヘモシアニン(シグマアルドリッチジャパン社製)、１０ｍｇ／１．７ｍｌとを混合する。混合した後、ＤＭＳＯに溶解した、前記結合剤カルボジイミド、５０ｍｇ／０．５ｍｌを添加する。

　該ＤＭＳＯを反応溶媒とする反応液を、室温に２時間放置し、引き続き、４℃で１２時間放置し、反応を行った。ｐＨを８に調整した、１Ｍのグリシン緩衝液(和光純薬工業社製)０．１ｍｌを添加し、反応を停止させた。そして、該液中に含まれる、修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ＤＭＳＯ免疫原）と、未反応のキャリア・タンパク質は、ＰＢＳ（和光純薬工業社製）透析を行って、精製した。調製された修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ＤＭＳＯ免疫原）と、未反応のキャリア・タンパク質を含む、タンパク質溶液を、ＴＡＴＰ３－ＤＭＳＯ（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ＤＭＳＯ免疫原）溶液とした。

　上記の結合剤カルボジイミドを利用する反応条件では、キャリア・タンパク質の表面に露呈するアミノ基（－ＮＨ_２）に対して、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を利用して、アミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）を形成することで、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）が結合される。

　なお、上記の反応条件で調製された修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ＤＭＳＯ免疫原）上には、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）が、平均して、１５０～２００箇所結合している。すなわち、キャリア・タンパク質ＫＬＨ表面のリジン残基側鎖のアミノ基に対して、ＴＡＴＰ３が結合されている状態に相当する。

　(ii-b)　修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ホウ酸バッファー免疫原）の調製
　反応溶媒として、ｐＨ８．５のホウ酸バッファーを用いて、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）上に式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）をカルボジイミド法によって結合させ、修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ホウ酸バッファー免疫原）を調製する。該カルボジイミド法による結合形成では、結合剤カルボジイミドとして、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl）（和光純薬工業社製）を利用している。ｐＨ８．５のホウ酸バッファーは、０．９９２ｇのホウ酸(和光純薬工業社製)、１．９０６ｇのホウ砂(和光純薬工業社製)、および２．６２８ｇのＮａＣｌ(和光純薬工業社製)を１８０ｍｌの純水に溶解させ、ＮａＯＨを加えて、ｐＨを８．５に調整した緩衝溶液である。

　ホウ酸バッファーとＤＭＳＯの混合液に溶解したＴＡＴＰ３、１０ｍｇ／（０．３ｍｌＤＭＯＳ＋０．２ｍｌホウ酸バッファー）と、ホウ酸バッファーに溶解したキーホールリンペツトヘモシアニン、１０ｍｇ／１．５ｍｌとを混合する。混合した後、ホウ酸バッファーに溶解した、前記結合剤カルボジイミド、５０ｍｇ／０．５ｍｌを添加する。

　該ホウ酸バッファーを反応溶媒とする反応液を、室温に２時間放置し、引き続き、４℃で１２時間放置し、反応を行った。ｐＨを８に調整した、１Ｍのグリシン緩衝液(和光純薬工業社製)０．１ｍｌを添加し、反応を停止させた。そして、該液中に含まれる、修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ＤＭＳＯ免疫原）と、未反応のキャリア・タンパク質は、ＰＢＳ（和光純薬工業社製）透析を行って、精製した。調製された修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ホウ酸バッファー免疫原）と、未反応のキャリア・タンパク質を含む、タンパク質溶液を、ＴＡＴＰ３－ホウ酸バッファー（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ホウ酸バッファー免疫原）溶液とした。

　なお、上記の反応条件で調製された修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ホウ酸バッファー免疫原）上には、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）が、平均して、１５０～２００箇所結合している。

　（iii）　式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）により修飾された、抗原用修飾キャリア・タンパク質の調製
　キャリア・タンパク質として、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を選択している。

　該キャリア・タンパク質上に、カルボジイミド法により、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）を結合させ、修飾キャリア・タンパク質の調製を行った。本第一の実施態様では、下記の修飾キャリア・タンパク質を調製し、抗体の反応性の確認に利用する抗原とした。

　抗原用修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）の調製
　反応溶媒として、ｐＨ８．５のホウ酸バッファーを用いて、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）上に式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）をカルボジイミド法によって結合させ、修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）を調製する。該カルボジイミド法による結合形成では、結合剤カルボジイミドとして、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl）（和光純薬工業社製）を利用している。ｐＨ８．５のホウ酸バッファーは、０．９９２ｇのホウ酸(和光純薬工業社製)、１．９０６ｇのホウ砂(和光純薬工業社製)、および２．６２８ｇのＮａＣｌ(和光純薬工業社製)を１８０ｍｌの純水に溶解させ、ＮａＯＨを加えて、ｐＨを８．５に調整した緩衝溶液である。

　ＤＭＳＯに溶解したＴＡＴＰ３、１０ｍｇ／０．１ｍｌと、純水に溶解した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、３０ｍｇ／１．５ｍｌと、ホウ酸バッファー０．９ｍｌを混合する。混合した後、ホウ酸バッファーに溶解した、前記結合剤カルボジイミド、５０ｍｇ／０．２５ｍｌを添加する。

　該ホウ酸バッファーを反応溶媒とする反応液を、室温に５時間放置し、反応を行った。ｐＨを８に調整した、１Ｍのグリシン緩衝液(和光純薬工業社製)０．３ｍｌを添加し、反応を停止させた。そして、該液中に含まれる、修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）と、未反応のキャリア・タンパク質は、ＰＢＳ（和光純薬工業社製）透析を行って、精製した。調製された修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）と、未反応のキャリア・タンパク質を含む、タンパク質溶液を、ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）溶液とした。

　（iv）　免疫原用修飾キャリア・タンパク質を用いる免疫操作
　対象のヒト以外の哺乳動物に対して、上記の二種の免疫原用修飾キャリア・タンパク質を用いて、感作を行う。本第一の実施態様では、免疫操作を施す、ヒト以外の哺乳動物として、マウス（ＳＬＣ：Ｃ５７ＢＬ／６）を選択している。

　また、免疫には、上記の二種の免疫原用修飾キャリア・タンパク質を混合し、フロイント完全アジュバント（フナコシ社製）を添加した溶液を用いる。該溶液の組成は、０．０１ｍｌのＴＡＴＰ３－ＤＭＳＯ（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ＤＭＳＯ免疫原）溶液、０．０１ｍｌのＴＡＴＰ３－ホウ酸バッファー（ＴＡＴＰ３－ＫＬＨ－ホウ酸バッファー免疫原）溶液、０．０７ｍｌのＰＢＳ、およびは０．０１ｍｌのフロイント完全アジュバント(フナコシ社製)を均一に混合したものである。

　感作（免疫操作）は、前記溶液１．０ｍｌを、１２週齢のマウス（ＳＬＣ：Ｃ５７ＢＬ／６）に皮下注射を行うことで行った。初回感作（初日）後、２２日目、３５日目、および４９日目に、それぞれ、前記溶液１．０ｍｌを皮下注射し、追加免疫を実施した。

　初回感作（初日）後、６６日目に、該免疫したマウスから採血を行った。採血された血液から、抗血清を調製した。

　（ｖ）　取得された抗血清中に含まれるポリクローナル抗体の交叉反応性の検証
　取得された抗血清中に含まれるポリクローナル抗体が、式（Ｉ）で示される三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すことを、競合ＥＬＩＳＡ法を利用して検証する。

　取得された抗血清中に含まれるポリクローナル抗体は、免疫操作に利用した、上記二種の免疫原用修飾キャリア・タンパク質に特異的な抗体複数種が混在していると推定される。該ポリクローナル抗体中に、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に特異的な反応性を示す抗体が存在することを先ず検証する。

　具体的には、キャリア・タンパク質として、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）に代えて、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて作製した、前記抗原用修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に対する反応性を有する抗体が存在することを、ＥＬＩＳＡ法を利用して検証する。

　１０００倍に希釈したＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）溶液を用い、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートに自然吸着法で、該ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）を固定化する。未吸着のタンパク質を洗浄、除去した後、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートに、ＰＢＳを５０μｌ加える。次いで、取得された抗血清を、ＰＢＳで１００倍に希釈した液、５０μｌを加える。室温で２時間放置し、該ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に抗体を反応させる。

　反応終了後、ＥＬＩＳＡ測定用のプレート上の液を除去し、各ＰＢＳ１００μｌを用いて、３回洗浄する。前記洗浄後、プレート上に、２０００倍に希釈した抗マウスＩｇＧ－ＰＯＤ標識抗体（フナコシ社製）液、５０μｌを加える。室温で１時間放置し、プレート上の抗原用修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）と反応した抗体に、抗マウスＩｇＧ－ＰＯＤ標識抗体を反応させる。

　反応終了後、ＥＬＩＳＡ測定用のプレート上の液を除去し、各ＰＢＳ１００μｌを用いて、４回洗浄する。前記洗浄後、プレート上に、ＥＬＩＳＡ用ペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢＺ，フナコシ社製）液、５０μｌを加える。抗マウスＩｇＧ－ＰＯＤ標識抗体の標識酵素ペルオキシダーゼによる、酵素反応を６０分間行った後、１Ｎの硫酸（和光純薬工業社製）５０μｌを添加し、反応を停止させる。前記酵素反応による反応産物の濃度を、４５０ｎｍの吸光度を測定することで決定する。図１中に、「バッファー」と表記する測定結果は、ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に対して、反応した抗体の量に相当している。

　上記のＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に対する反応性を有する抗体は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）上に結合されている、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に反応している抗体である。従って、取得された抗血清中に含まれるポリクローナル抗体中に、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に特異的な反応性を示す抗体が存在することが検証された。

　次に、取得された抗血清のポリクローナル抗体中に含まれる、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に反応性を示す抗体複数種のうちに、式（Ｉ）で示される三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示す抗体が存在することを、競合ＥＬＩＳＡ法を利用して検証する。

　１０００倍に希釈したＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）溶液を用い、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートに自然吸着法で、該ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）を固定化する。未吸着のタンパク質を洗浄、除去した後、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートに、終濃度が１００ｐｐｍとなるように、ＴＡＴＰ（アキュースタンダード社製）ＰＢＳ溶液を５０μｌ加える。次いで、取得された抗血清を、ＰＢＳで１００倍に希釈した液、５０μｌを加える。室温で２時間放置し、該ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に抗体を反応させる。なお、反応液中に含まれるＴＡＴＰ（分子量２２２．４）の終濃度１００ｐｐｍは、０．４５ｍＭに相当している。

　前記の反応時、プレート上の液中に、添加されている、ＴＡＴＰと抗体との間で抗原抗体反応が進行すると、プレート上に固定化されている、ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）との抗原抗体反応と、競合が生じる。結果的に、プレート上に固定化されている、ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）との抗原抗体反応を介して、プレート上に固定化される抗体の量が減少する。

　反応終了後、ＥＬＩＳＡ測定用のプレート上の液を除去し、各ＰＢＳ１００μｌを用いて、４回洗浄する。前記洗浄後、プレート上に、ＥＬＩＳＡ用ペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢＺ，フナコシ社製）液、５０μｌを加える。抗マウスＩｇＧ－ＰＯＤ標識抗体の標識酵素ペルオキシダーゼによる、酵素反応を６０分間行った後、１Ｎの硫酸（和光純薬工業社製）５０μｌを添加し、反応を停止させる。前記酵素反応による反応産物の濃度を、４５０ｎｍの吸光度を測定することで決定する。

　また、ＴＡＴＰのＰＢＳ溶液に代えて、ＰＢＳを加えて、同様に反応を行う。

　ＴＡＴＰのＰＢＳ溶液を添加した際に測定される、４５０ｎｍの吸光度と、ＰＢＳを添加した際に測定される、４５０ｎｍの吸光度とを比較する。その結果、ＰＢＳを添加した場合と比較して、ＴＡＴＰのＰＢＳ溶液を添加した際、４５０ｎｍの吸光度の低下が生じていることが確認された。すなわち、取得された抗血清中には、ＴＡＴＰに対する交叉反応性を有する抗体が存在していることが確認された。

　従って、取得された抗血清のポリクローナル抗体中には、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示す抗体が存在していることが検証された。

　また、前記抗マウスＩｇＧ－ＰＯＤ標識抗体は、マウスＩｇＧ１型抗体に特異性を有しており、前記式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示す抗体のタイプは、ＩｇＧ１型であることが確認された。

　（vi）　式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）に対するモノクノーナル抗体の創製
　取得された抗血清のポリクローナル抗体中には、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示す抗体が存在していることが検証された、マウスの抗体生産細胞群を利用して、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の作製を行っている。

　この検証がなされた、初回感作（初日）後、６６日目のマウスから、脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製する。

　調製されたマウスの脾臓細胞と、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕマウスミエローマ細胞とを、細胞数５：１の比率で、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）中、重合度１５００の５０％ポリエチレングリコール（和光純薬工業社製）存在下で、３７℃、２分間混合し、細胞融合させる。前記細胞融合処理後、得られるハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地（２０％牛胎児血清）に懸濁した後、マイクロプレートに分注する。該マイクロプレートに分注した、ハイブリドーマ細胞を、炭酸ガスインキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養する。前記培養中、４日に１回の割合で、培地の半量を、新しいＨＴ培地（１０％牛胎児血清）に交換する。

　ＨＡＴ培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＨＡＴサプリメント（インビトロジェン社製）を適量添加したものである。本第一の実施態様では、ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌ当たり、ＨＡＴサプリメント２０μｌを添加している。

　ＨＴ培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＨＴサプリメント（インビトロジェン社製）を適量添加したものである。本第一の実施態様では、ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌ当たり、ＨＴサプリメント２０μｌを添加している。

　上記の培養条件で、マイクロプレートに分注した、ハイブリドーマ細胞を、２週間培養して、それぞれハイブリドーマ細胞株を確立した。

　次に、各ハイブリドーマ細胞株の培養上清中に産生されているモノクローナル抗体が、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体であるか、否かの確認を行った。さらに、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体であることの検証がなされたもののうち、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示す抗体の選別を行った。

　(vi-a)　式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体であるか、否かの検証
　具体的には、各ハイブリドーマ細胞株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体が、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて作製した、前記抗原用修飾キャリア・タンパク質（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に対する反応性を有するモノクローナル抗体であるか、否かを、ＥＬＩＳＡ法を利用して検証する。

　１０００倍に希釈したＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）溶液を用い、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートに自然吸着法で、該ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）を固定化する。未吸着のタンパク質を洗浄、除去した後、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートに、ＰＢＳを５０μｌ加える。次いで、各ハイブリドーマ細胞株の培養上清を、ＰＢＳで１００倍に希釈した液、５０μｌを加える。室温で２時間放置し、該ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に、モノクローナル抗体を反応させる。

　上記のＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に対する反応性を有するモノクローナル抗体は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）上に結合されている、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に反応しているモノクローナル抗体である。

　このスクリーニング手順に従って、各ハイブリドーマ細胞株の培養上清中に式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体が存在するか、否かの検証を行った。その結果、ハイブリドーマ細胞株合計１３クローン中、１３クローンが式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に反応しているモノクローナル抗体を産生していることが確認された。

　(vi-b)　式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体の選別
　前記（vi-ａ）の一次スクリーニングで選別された、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に反応性を示すモノクローナル抗体複数種から、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体を、競合ＥＬＩＳＡ法を利用して選別する。

　１０００倍に希釈したＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）溶液を用い、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートに自然吸着法で、該ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）を固定化する。未吸着のタンパク質を洗浄、除去した後、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートに、終濃度が１００ｐｐｍとなるように、ＴＡＴＰのＰＢＳ溶液を５０μｌ加える。次いで、選別された各ハイブリドーマ細胞株の培養上清を、ＰＢＳで１００倍に希釈した液、５０μｌを加える。室温で２時間放置し、該ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に抗体を反応させる。なお、反応液中に含まれるＴＡＴＰの終濃度１００ｐｐｍは、０．４５ｍＭに相当している。

　抗原抗体反応時に、プレート上の液中に、ＴＡＴＰを添加していない場合と比較し、ＴＡＴＰを添加した際に、前記酵素反応による反応産物の濃度が減少を示す結果が得られると、ＴＡＴＰを添加した際に、競合が生じていると判断される。すなわち、かかる競合が生じている場合、そのハイブリドーマ細胞株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体は、ＴＡＴＰに対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体と判断できる。

　このスクリーニング手順に従って、（vi-ａ）の一次スクリーニングで選別された、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に反応性を示すモノクローナル抗体複数種から、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体の選別を行った。

　その結果、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体が複数種選別された。図２に、この二次スクリーニングにより、選別されたモノクローナル抗体複数種のうち、４種のモノクローナル抗体：ｍＡｂ－Ｔ００１～ｍＡｂ－Ｔ００４について、測定結果を一例として、示す。

　図２中に、「Ｂｏｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ」と表記する測定結果は、上記（vi-ａ）の一次スクリーニングにおけるＥＬＩＳＡ法による測定結果、すなわち、ＴＡＴＰが存在していない状況において、ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に対して、反応したモノクローナル抗体の量に相当している。図２中に、「１００ｐｐｍ　ＴＡＴＰ」と表記する測定結果は、上記のＴＡＴＰが共存している状況において、ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）に対して、反応したモノクローナル抗体の量に相当している。

　図２に示す結果は、前記の反応時、プレート上の液中に、添加されている、ＴＡＴＰとモノクローナル抗体との間で抗原抗体反応が進行するため、プレート上に固定化されている、ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ（ＴＡＴＰ３－ＢＳＡ抗原）との抗原抗体反応と、競合が生じていることを明確に示している。すなわち、該４種のモノクローナル抗体は、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）自体に反応性を示すモノクローナル抗体であり、さらに、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体でもあることを検証する結果である。

　従って、前記の（vi-ａ）の一次スクリーニングと、（vi-ｂ）の二次スクリーニングによって、選別されるモノクローナル抗体は、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体であることが確認された。

　なお、図２に示す結果は、抗原抗体反応を行う反応液中に、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）を終濃度０．４５ｍＭとなるように添加すると、
ｍＡｂ－Ｔ００１～ｍＡｂ－Ｔ００４では、少なくとも、その１０％程度は、ＴＡＴＰと結合している
ことを示唆する結果である。

　（vii）　式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）に対するモノクノーナル抗体を利用する免疫センサの作製
　前記の（vii）で選別された、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する交叉反応性を示すモノクローナル抗体：ｍＡｂ－Ｔ００１～ｍＡｂ－Ｔ００４のうち、モノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３を用いて、免疫センサの作製を行っている。

　免疫センサの製作方法を以下に記載する。

　（vii-a）　カーボン電極の製作
　モノクローナル抗体の固定化に利用する、カーボン電極は、下記の手順に従って作製する。

　基板として、１０×１０×０．７ｍｍのガラス基板を利用している。

　該ガラス基板の表面に付着する汚れを除去するため、該ガラス基板を硝酸－過酸化水素の溶液中で、５分間、超音波洗浄する。その後、純水でリンスし、その後、乾燥を行う。

　該基板表面と同サイズのカーボンペーパー（東レ社製，ＴＧＰ－Ｈ－１２０）を、該ガラス基板の表面に、シリコーン樹脂（東レ・ダウ・コーニング・シリコーン（株）社製のＳＥ９１８６）で貼り合わせ、カーボン電極とする。

　（vii-b）　カーボン電極上への抗体分子の固定化
　作製されたカーボン電極を、濃度１ｍｇ／０．２ｍｌのモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３の溶液中に、１時間浸漬する。次いで、表面にモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３が吸着しているカーボン電極を、３ｍＭの１，３－ジアミノベンゼン（アルドリッチ（株）社製、ＵＳＡ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液および０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む）溶液中に浸漬する。対極と該カーボン電極の間に電圧を印加し、０Ｖ→０．８Ｖを２ｍＶ／ｓで１００回掃引し、その後、５時間、０．６５Ｖで電圧を印加することで、抗体分子を固定化する。

　表面に抗体分子の固定化を行った後、該カーボン電極を、１ｗ／ｖ％のポリビニルアルコール中に１時間浸漬する。その結果、該カーボン電極の表面に固定化された抗体分子層全体を被覆する、ポリビニルアルコール膜が形成される。前記の条件で形成される、該ポリビニルアルコール膜の平均膜厚は、１～２μｍ程度である。

　なお、該ポリビニルアルコール膜は、水溶性低分子化合物に対しては、透過性であり、例えば、式（II）に示すジカルボン酸化合物（ＴＡＴＰ３）程度の分子サイズの低分子化合物は、該ポリビニルアルコール膜を透過し、固定化されている抗体分子と反応することが可能である。

　該抗体分子固定カーボン電極の表面に固定化されている、抗体分子の密度は、０．７μｇ／ｍｍ^２程度である。

　前記の抗体分子の固定化、ポリビニルアルコール膜の被覆条件によって、同じ構成の抗体分子固定カーボン電極を複数作製した。

　（vii-c）　免疫センサの構成
　該ポリビニルアルコール膜の被覆を行った、抗体分子固定カーボン電極は、配線されたフレキシブル基板に実装する。該フレキシブル基板上の配線と、該抗体分子固定カーボン電極との間は、ワイヤーボンディングで結線し、結線部分をシリコーン樹脂で封止する。

　免疫センサは、抗体分子固定カーボン電極を作用極とし、ガラス参照極と白金対極を具える、三極構造に構成されている。

　該免疫センサでは、前記三極構造を利用して、方形波ボルタンメトリ法による測定を行う。

　（viii）　免疫センサの測定条件
　作製された免疫センサを利用して、抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に反応する、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）が実際に測定可能であることを検証する。

　本第一の実施態様では、方形波ボルタンメトリ法による測定条件として、下記の条件を採用している。

　掃引範囲：０．１－１．２Ｖ；
　方形波パルスのパルス電位：４０ｍＶ；
　方形波パルスの印加周波数：４　Ｈｚ；
　各方形波パルス印加間のステップ電位：１０　ｍＶ
　まず、作製された抗体分子固定カーボン電極複数のうち、一つの電極を用いて、免疫センサの抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に抗原が結合していない状態における、ベース電流を測定する。

　該免疫センサをリン酸バッファー（０．０１Ｍ，ｐＨ６．８）中に浸漬し、数分間放置する。その後、前記条件で１回掃引し、ベース電流を測定する。

　作製された抗体分子固定カーボン電極複数のうち、他の一つの電極を用いて、免疫センサの抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に抗原が結合している状態における、応答電流を測定する。

　該リン酸バッファー中に、ＴＡＴＰを終濃度として、１０ｐｐｍ（１０μｇ/ｍｌ）となるように添加した、ＴＡＴＰのリン酸バッファー溶液をそれぞれ調製する。

　該免疫センサを前記ＴＡＴＰのリン酸バッファー溶液中に浸漬し、数分間放置する。その後、前記条件で１回掃引し、モノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３にＴＡＴＰが結合している状態における、応答電流を測定する。

　図３に、上記二つの電極を利用して測定された、抗原が結合していない状態におけるベース電流、ＴＡＴＰが結合している状態における応答電流の測定結果を示す。図３中には、ベース電流の測定値（リン酸バッファー）を１００％として、ＴＡＴＰが結合している状態における応答電流の測定値（ＴＡＴＰ）を、相対値表示している。

　応答電流の測定値（ＴＡＴＰ）と、ベース電流の測定値（リン酸バッファー）との差は、抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に結合されている、ＴＡＴＰに起因する電流増加に相当している。従って、該免疫センサにおいて、上記の測定条件を採用することで、抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に結合されている、ＴＡＴＰに起因する応答電流が明確に測定されている。換言するならば、溶液中に含有されているＴＡＴＰの濃度を、該免疫センサを使用して測定可能であることが検証された。

　（第二の実施態様）
　以下に説明する、本発明の第二の実施態様は、前記の第一の実施態様において、作製された抗体分子固定カーボン電極を利用して構成される、過酸化物誘導体型の爆薬検出用の免疫センサを、別の測定条件において、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）の測定に利用する一例である。

　（ix）　免疫センサの構成
　該第二の実施態様においても、前記の第一の実施態様で作製された抗体分子固定カーボン電極を利用して、第一の実施態様の（vii-c）に記載する免疫センサと全く同じ構成の免疫センサを利用している。

　該免疫センサでも、前記（vii-c）に記載する三極構造を利用して、方形波ボルタンメトリ法による測定を行う。

　（x）　免疫センサの測定条件
　作製された免疫センサを利用して、抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に反応する、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）が実際に測定可能であることを検証する。

　本第二の実施態様では、方形波ボルタンメトリ法による測定条件として、下記の条件を採用している。　
　掃引範囲：０．１－１．２Ｖ；
　方形波パルスのパルス電位：４０ｍＶ；
　方形波パルスの印加周波数：４　Ｈｚ；
　各方形波パルス印加間のステップ電位：１０　ｍＶ
　まず、免疫センサの抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に抗原が結合していない状態における、ベース電流を測定する。

　該免疫センサを、チロシンが飽和した（チロシン濃度　約２．１ｍＭ（２０℃））リン酸バッファー（０．０１Ｍ、ｐＨ６．８）中に浸漬し、数分間放置する。その後、該チロシン飽和溶液中において、上記条件で１回掃引し、ベース電流を測定する。前記リン酸バッファー（０．０１Ｍ、ｐＨ６．８）中おける、チロシンの溶解度（ｇ/１００ｍｌ）は、０．０３８(２０℃)であるから、該溶解度以上のチロシンが、前記リン酸バッファー中に含まれていればよい。該溶解度以上のチロシンが、前記リン酸バッファー中に含まれていればよい。実際には、測定対象の溶液中に、チロシンが１．４ｍＭ（２０℃）以上の高濃度で添加されていればよい。

　なお、チロシンの水への溶解度（ｇ/ｄｍ^３）は、０．１９６（０℃）、０．４５３（２５℃）と報告されている。

　つづいて、免疫センサの抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に抗原が結合している状態における、応答電流を測定する。

　前記チロシン飽和リン酸バッファー中に、ＴＡＴＰを終濃度として、１０ｐｐｍ（１０μｇ/ｍｌ）となるように添加した、ＴＡＴＰのチロシン飽和リン酸バッファー溶液を調製する。前記免疫センサを、該ＴＡＴＰのチロシン飽和リン酸バッファー溶液中に浸漬し、数分間放置する。その後、該ＴＡＴＰのチロシン飽和リン酸バッファー溶液中において、上記条件で１回掃引し、モノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３にＴＡＴＰが結合している状態における、応答電流を測定する。

　図４に、抗原が結合していない状態におけるベース電流、ＴＡＴＰが結合している状態における応答電流の測定結果を示す。図４中には、ベース電流の測定値（図中、リン酸バッファー）を１００％として、ＴＡＴＰが結合している状態における応答電流の測定値（図中、ＴＡＴＰ）を、相対値表示している。

　ＴＡＴＰが結合している状態における応答電流の測定値（ＴＡＴＰ）と、ベース電流の測定値（リン酸バッファー）との差は、抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に結合されている、ＴＡＴＰに起因する電流減少に相当している。従って、該免疫センサにおいて、上記の測定条件を採用することで、抗体分子固定カーボン電極のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｔ００３に結合されている、ＴＡＴＰに起因する応答電流が明確に測定されている。換言するならば、溶液中に含有されているＴＡＴＰの濃度を、該免疫センサを使用して測定可能であることが検証された。

　なお、本第二の実施形態では、該免疫センサの電気化学測定方式とし、次の反応を利用している。該免疫センサにおいては、カーボン電極の極く近傍に存在するチロシンの酸化電流を測定する。その際、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体中に含まれるチロシンと、溶液中に含有されているチロシンとを比較すると、カーボン電極の近傍に存在する比率は、溶液中に含有されているチロシンが格段に高い状況となっている。その結果、実際に測定される電流は、溶液中に含有されているチロシンの酸化電流に相当している。

　カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体分子に抗原が結合していない場合、該モノクローナル抗体分子に含まれるチロシンの酸化は、促進されてない。一方、溶液中に含有されているチロシンの濃度は、飽和濃度であり、予め、浸漬処理を施す間に、表面を被覆するポリビニルアルコール膜を透過し、カーボン電極表面の極く近傍には、該飽和濃度のチロシンが存在する状態を達成している。その状態では、カーボン電極表面の極く近傍に浸潤している、チロシンの量は、モノクローナル抗体分子に含まれるチロシンの量と比較して、格段に多くなっている。すなわち、測定されるベース電流は、カーボン電極表面の極く近傍に浸潤している、該飽和濃度のチロシンに起因する酸化電流に相当している。

　カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体分子に抗原が結合している場合、該抗原を結合しているモノクローナル抗体分子に含まれるチロシンの酸化は、促進される。一方、溶液中に含有されているチロシンの濃度は、飽和濃度であり、予め、浸漬処理を施す間に、表面を被覆するポリビニルアルコール膜を透過し、カーボン電極表面の極く近傍まで、チロシンが浸潤している。その際、モノクローナル抗体分子に抗原が結合した複合体のサイズは、モノクローナル抗体分子自体のサイズよりも有意に大きくなっており、少なくとも、表面を被覆するポリビニルアルコール膜中に閉める体積比率が増加している。それに付随して、表面を被覆するポリビニルアルコール膜を透過し、カーボン電極表面の極く近傍まで浸潤可能なチロシンの量は、相対的に減少を示す。カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体分子中、抗原を結合している、抗原・抗体の複合体の占める比率が増すと、カーボン電極表面の極く近傍まで浸潤可能なチロシンの量の減少比率も増す。その状態でも、カーボン電極表面の極く近傍に浸潤している、チロシンの量は、抗原・抗体の複合体中に存在するチロシンの量と比較すると、格段に多い水準である。すなわち、測定される応答電流は、カーボン電極表面の極く近傍に浸潤している、チロシンに起因する酸化電流に相当している。

　結果的に、測定されるベース電流と比較して、測定される応答電流は、減少するが、その減少量は、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体分子中、抗原を結合している、抗原・抗体の複合体の占める比率に比例する。

　上述の第一の実施形態で利用される測定原理では、測定されるベース電流は、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体中に含まれるチロシンの酸化電流に起因する。そのため、ベース電流の測定が完了した時点で、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体中に含まれるチロシンの相当量は、酸化されている。そのため、抗原抗体反応によって、ＴＡＴＰがモノクローナル抗体に結合した状態における応答電流の測定は、別の抗体分子固定カーボン電極を利用して行っている。

　一方、本第二の実施形態で利用される測定原理では、測定されるベース電流は、カーボン電極表面の極く近傍に浸潤している、飽和濃度のチロシンに起因する酸化電流に相当している。従って、ベース電流の測定に伴う、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体中に含まれるチロシンの酸化は、皆無では無いが、無視できる量に留まっている。従って、ベース電流の測定後、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体は、実質的にチロシンの酸化を受けてなく、抗原に対する結合能も、実質的に変化していない。そのため、ベース電流の測定に使用した、抗体分子固定カーボン電極をそのまま利用して、ＴＡＴＰがモノクローナル抗体に結合した状態における応答電流の測定を実施することが可能となっている。

　その際、測定される応答電流も、カーボン電極表面の極く近傍に浸潤している、チロシンに起因する酸化電流に相当しているが、勿論、応答電流の測定に伴う、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体中に含まれるチロシンの酸化は、ベース電流の測定時と比較すると、若干増している。

　カーボン電極表面の極く近傍に浸潤している、チロシンの量の減少量と、抗原を結合しているモノクローナル抗体分子に含まれるチロシンの量の増加量は、ともに、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体分子中、抗原を結合している、抗原・抗体の複合体の占める比率に比例している。その結果、測定されるベース電流と、測定される応答電流との差は、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体分子中、抗原を結合している、抗原・抗体の複合体の占める比率に比例する。この特徴を利用することで、本第二の実施形態で利用される測定原理は、カーボン電極上に固定化されているモノクローナル抗体分子中、抗原を結合している、抗原・抗体の複合体の占める比率の定量的な評価を可能としている。

　上述の第一の実施形態で利用される測定原理では、ベース電流の測定と、応答電流の測定は、別の抗体分子固定カーボン電極を利用して実施するため、定量的な評価を行う際、全く同じ条件で作製された、二つの抗体分子固定カーボン電極を使用する必要がある。本第二の実施形態で利用される測定原理は、一つの抗体分子固定カーボン電極を利用して、ベース電流の測定と、応答電流の測定を実施できるという利点を具えている。具体的には、測定する試料中に含有されるＴＡＴＰの濃度は、通常、低い濃度範囲となるように選択される。その場合、第一の実施形態で利用される測定原理では、使用する二つの抗体分子固定カーボン電極の特性の僅かな差、特に、固定化されているモノクローナル抗体の密度の僅かな差が、測定されたベース電流と応答電流との差に、相対的に大きな系統的な誤差を導入する要因となる。極端な場合、実際には、測定する試料中には、ＴＡＴＰが含まれていない場合でも、使用する二つの抗体分子固定カーボン電極間において、固定化されているモノクローナル抗体の密度の僅かな差があると、見かけ上、測定されたベース電流と応答電流との間に差があると判断される。

　一方、第二の実施形態で利用される測定原理は、一つの抗体分子固定カーボン電極を利用しているので、個々の抗体分子固定カーボン電極では、固定化されているモノクローナル抗体の密度の僅かな差があっても、相対的に大きな系統的な誤差を導入する要因とはならない。

　以上、実施形態（及び実施例）を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態（及び実施例）に限定されものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。

　この出願は、２００９年　５月１８日に出願された日本出願特願２００９－１１９８２６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

　本発明にかかる過酸化物誘導体型の爆薬検出用の免疫センサは、検出対象となる過酸化物誘導体型の爆薬、例えば、三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）を簡便に検出する目的に、好適に利用可能である。

　（受託番号）
　本発明に利用される、式（Ｉ）に示す三量体型の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ）に対する結合能を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞として、
ハイブリドーマ細胞株：NECP-C57Z　3B-7Eが、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国　茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６、郵便番号３０５－８５６６）に、国際寄託（平成２１年　５月１２日付け）がなされている。

Claims

　過酸化物誘導体型の爆薬である、下記の式（Ｉ）の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ：3,3,6,6,9,9-hexamethyl-1,2,4,5,7,6-hexaoxacyclononane）を、抗原抗体反応を利用して検出する免疫センサであって、

　該免疫センサは、少なくとも、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、
　前記作用極に対する対極と、
　前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する機能を具えた測定部とを具えてなり、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して結合能を有するモノクローナル抗体である
ことを特徴とする免疫センサ。
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して結合能を有するモノクローナル抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対するモノクローナル抗体であり、該式（Ｉ）の過酸化アセトン過酸化物に対して交叉反応性を有する
ことを特徴とする請求項１に記載の免疫センサ。
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物は、下記の式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物：3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸（3-[12-(2-carboxyethyl)-9,12-dimethyl-7,8,10,11,13,14-hexaoxa-spiro-[5.8]tetradec-9-yl]-propanoic　acid）である

ことを特徴とする請求項２に記載の免疫センサ。
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対する結合能を有するモノクローナル抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質を免疫原として、ヒト以外の哺乳動物を免疫することで創製される、該低分子化合物に対するモノクローナル抗体であり、
　該式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して交叉反応性を有する抗体である
ことを特徴とする請求項２または３に記載の免疫センサ。
　前記ヒト以外の哺乳動物は、マウスである
ことを特徴とする請求項４に記載の免疫センサ。
　前記低分子化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質において、該キャリア・タンパク質として、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）を選択する
ことを特徴とする請求項４または５に記載の免疫センサ。
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物として、その分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物を選択し、
　該分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質は、該カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と前記キャリア・タンパク質上のアミノ基（－ＮＨ_２）との間でアミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）を介して、前記分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物の結合がなされている
ことを特徴とする請求項４～６のいずれか一項に記載の免疫センサ。
　該カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と前記キャリア・タンパク質上のアミノ基（－ＮＨ_２）との間でアミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）の形成は、カルボジイミド法を利用してなされている
ことを特徴とする請求項７に記載の免疫センサ。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体として、
ハイブリドーマ細胞株：NECP-C57Z　3B-7E（ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１２５）が産生する、前記式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物に対するモノクローナル抗体を用いる
ことを特徴とする請求項４に記載の免疫センサ。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、前記作用極に対する対極は、同一の絶縁基板上に形成されている
ことを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫センサ。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体をその表面に固定化する電極材料は、カーボン材料である
ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫センサ。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体をカーボン材料の表面に固定化している作用極に対して、前記対極として、白金電極を選択する
ことを特徴とする請求項１１に記載の免疫センサ。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体をカーボン材料の表面に固定化している作用極、前記作用極に対する対極として利用する白金電極に加えて、参照電極として機能する銀／塩化銀電極を具える
ことを特徴とする請求項１２に記載の免疫センサ。
　過酸化物誘導体型の爆薬である、下記の式（Ｉ）の過酸化アセトン（ＴＡＴＰ：3,3,6,6,9,9-hexamethyl-1,2,4,5,7,6-hexaoxacyclononane）を、抗原抗体反応を利用して検出する免疫センサを製造する方法であって、

　該免疫センサは、少なくとも、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、
　前記作用極に対する対極と、
　前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する機能を具えた測定部とを具えてなり、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して結合能を有するモノクローナル抗体であり、
　該免疫センサを製造する方法は、少なくとも、
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極を形成する工程と、
　前記作用極に対する対極を形成する工程と、
　前記作用極と対極との間にバイアス電圧を印加し、前記作用極と対極間に流れる電流を測定する機能を具えた測定部を設ける工程とを具えている
ことを特徴とする免疫センサの製造方法。
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対する結合能を有するモノクローナル抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物に対するモノクローナル抗体であり、該式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して交叉反応性を有する
ことを特徴とする請求項１４に記載の免疫センサの製造方法。
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物は、下記の式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物：3-[12-(2-カルボキシエチル)-9,12-ジメチル-7,8,10,11,13,14-ヘキサオクサ-スピロ-[5.8]テトラデック-9-イル]-プロピオン酸（3-[12-(2-carboxyethyl)-9,12-dimethyl-7,8,10,11,13,14-hexaoxa-spiro-[5.8]tetradec-9-yl]-propanoic　acid）である

ことを特徴とする請求項１５に記載の免疫センサの製造方法。
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンに対する結合能を有するモノクローナル抗体は、
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質を免疫原として、ヒト以外の哺乳動物を免疫することで創製される、該低分子化合物に対するモノクローナル抗体であり、
　該式（Ｉ）の過酸化アセトンに対して交叉反応性を有する抗体である
ことを特徴とする請求項１５または１６に記載の免疫センサの製造方法。
　前記ヒト以外の哺乳動物は、マウスである
ことを特徴とする請求項１７に記載の免疫センサの製造方法。
　前記低分子化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質において、該キャリア・タンパク質として、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole　Limpet　Hemocyanin）を選択する
ことを特徴とする請求項１７または１８に記載の免疫センサの製造方法。
　前記式（Ｉ）の過酸化アセトンにおける特徴的な構造と類似性を具えた構造を持つ低分子化合物として、その分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物を選択し、
　該分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物を、キャリア・タンパク質上に結合させてなる修飾タンパク質は、該カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と前記キャリア・タンパク質上のアミノ基（－ＮＨ_２）との間でアミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）を介して、前記分子内にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する化合物の結合がなされている
ことを特徴とする請求項１７～１９のいずれか一項に記載の免疫センサの製造方法。
　該カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と前記キャリア・タンパク質上のアミノ基（－ＮＨ_２）との間でアミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）の形成は、カルボジイミド法を利用してなされている
ことを特徴とする請求項２０に記載の免疫センサの製造方法。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体として、
ハイブリドーマ細胞株：NECP-C57Z　3B-7E（ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１２５）が産生する、前記式（II）に示す構造を有するジカルボン酸化合物に対するモノクローナル抗体を用いる
ことを特徴とする請求項１７に記載の免疫センサの製造方法。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体を電極材料の表面に固定化している作用極と、前記作用極に対する対極は、同一の絶縁基板上に形成されている
ことを特徴とする請求項１４～２２のいずれか一項に記載の免疫センサの製造方法。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体をその表面に固定化する電極材料は、カーボン材料である
ことを特徴とする請求項１４～２３のいずれか一項に記載の免疫センサの製造方法。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体をカーボン材料の表面に固定化している作用極に対して、前記対極として、白金電極を選択する
ことを特徴とする請求項２４に記載の免疫センサの製造方法。
　前記抗原抗体反応に利用される抗体をカーボン材料の表面に固定化している作用極、前記作用極に対する対極として利用する白金電極に加えて、参照電極として機能する銀／塩化銀電極を具える
ことを特徴とする請求項２５に記載の免疫センサの製造方法。