KR20210142673A - 해충 방제 및 식물 건강을 위한 융합 단백질, 재조합 박테리아, 및 포자외막 단편 - Google Patents

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데미안 커티스
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바이엘 크롭사이언스 엘피
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Abstract

본 발명은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편, 및 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 갖는 융합 단백질이며, 여기서 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 바실루스 피르무스로부터의 것이거나 이러한 효소의 변이체인 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 및 이러한 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 포자외막 단편을 제공한다. 선충 방제를 위한 이러한 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 그로부터 유래된 포자외막 단편을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

해충 방제 및 식물 건강을 위한 융합 단백질, 재조합 박테리아, 및 포자외막 단편
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/820,773을 우선권 주장하며, 이의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 함유하는 융합 단백질에 관한 것이다. 융합 단백질은 세린 프로테아제를 추가로 포함한다. 본 발명은 추가로 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 포자외막 단편, 및 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편을 함유하는 제제에 관한 것이다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제로 처리된 식물 종자가 또한 제공된다. 본 발명은 추가로 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 사용하여 식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급
서열 목록의 공식적 사본은 2020년 3월 16일에 생성되고, 272 킬로바이트의 크기를 갖는 "BCS199002WO_ST25.txt"로 명명된 파일을 갖는 ASCII-형식 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되며, 본 명세서와 공동으로 출원된다. 이 ASCII-형식 문서에 함유된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
식물의 뿌리를 둘러싼 구역 내에 근권으로 지칭되는 영역이 있다. 근권에서, 박테리아, 진균, 및 다른 유기체는 영양분에 대해 및 식물의 뿌리 구조에의 결합에 대해 경쟁한다. 유해한 및 유익한 둘 다의 박테리아 및 진균은 근권을 점유할 수 있다. 박테리아, 진균, 및 식물의 근계는 모두 근권에서 펩티드, 효소, 및 다른 단백질의 작용에 의해 영향을 받을 수 있다. 특정한 이들 펩티드, 효소, 또는 다른 단백질로의 토양의 증강 또는 식물의 처리는 유익한 토양 박테리아 및 진균의 전체 집단에 대해 유익한 효과를 갖고, 식물 성장을 위한 보다 건강한 전체 토양 환경을 생성하며, 식물 성장을 개선시키고, 특정 박테리아 및 진균 병원체에 대한 식물의 보호를 제공할 것이다. 그러나, 펩티드, 효소, 및 다른 단백질을 토양 내로 도입하여 식물에 대한 이러한 유익한 효과를 유도하려는 시도는 토양에서의 효소, 단백질, 및 펩티드의 낮은 생존에 의해 방해받았다. 추가적으로, 토양에 자연적으로 존재하는 프로테아제의 만연은 토양에서 단백질의 열화를 초래할 수 있다. 식물의 뿌리 주위의 환경 (근권)은 박테리아, 진균, 영양분, 및 천연 토양의 그것과 상이한 질을 갖는 뿌리의 고유한 혼합물이다. 이들 유기체 사이의 공생 관계는 고유하며, 외인성 단백질의 포함으로 보다 나은 쪽으로 변경될 수 있다. 근권에서의 진균 및 박테리아의 높은 농도는 비정상적으로 높은 수준의 프로테아제 및 토양에서 단백질에 유해한 다른 요소로 인해 단백질의 훨씬 더 큰 열화를 유발한다. 또한, 토양 내로 도입된 효소 및 다른 단백질은 식물 뿌리로부터 빠르게 소멸될 수 있다.
따라서, 펩티드, 효소, 및 다른 단백질을 식물에 (예를 들어, 식물 근계에) 효과적으로 전달하고, 이러한 분자가 활성으로 잔류하는 기간을 연장시키기 위한 방법에 대한 필요가 관련 기술분야에 존재한다. 더욱이, 이러한 펩티드, 효소, 및 단백질을 근권에 및 특히 식물 잎 및 식물 뿌리에 선택적으로 표적화하는 방법에 대한 필요가 관련 기술분야에 존재한다.
발명의 간단한 요약
융합 단백질이 제공된다. 융합 단백질은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함한다. 융합 단백질은 또한 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 포함한다. 이러한 활성을 갖는 효소는
바실루스 피르무스(Bacillus firmus) 박테리아로부터의 야생형 세린 프로테아제 효소의 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 결실을 포함하는 아미노산 서열이며, 여기서 아미노산 결실은 야생형 효소의 촉매 잔기를 보유하고 동일한 조건 하에서 야생형 세린 프로테아제 효소의 세린 프로테아제 활성과 비교하여 동일하거나 증가된 세린 프로테아제 활성을 일으키는 것인 아미노산 서열;
바실루스 피르무스 효소;
서열식별번호(SEQ ID NO): 210-212 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
을 포함한다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 제공된다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 융합 단백질을 발현한다. 융합 단백질은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질일 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 전체 브로쓰 배양물이 제공된다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 발효 생성물이 제공된다.
포자외막 단편이 제공된다. 포자외막 단편은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 전체 브로쓰 또는 발효 생성물을 포함한 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원일 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
제제가 제공된다. 제제는 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 발효 생성물을 포함한 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 포함한다. 제제는 농업상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
또 다른 제제가 제공된다. 제제는 본원에 기재된 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 전체 브로쓰를 포함한 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원로부터 유래된 포자외막 단편을 포함한다. 제제는 농업상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
추가의 또 다른 제제가 제공된다. 제제는 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 제제는 융합 단백질을 발현하는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 포자외막 단편을 포함한다. 융합 단백질은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함한다. 융합 단백질은 또한 본원에 기재된 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 포함한다. 제제는 제2 효소를 추가로 포함한다.
처리된 식물 종자가 제공된다. 식물 종자는 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로 처리될 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 발현할 수 있다.
또 다른 처리된 식물 종자가 제공된다. 식물 종자는 본원에 기재된 임의의 포자외막 단편으로 처리될 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래될 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 처리된 식물 종자가 제공된다. 식물 종자는 본원에 기재된 임의의 제제로 처리될 수 있다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키는 방법이 제공된다. 방법은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함한다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 포함할 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 발현할 수 있다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키는 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 포자외막 단편을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함한다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 포자외막 단편을 포함할 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키는 추가의 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 제제를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함한다. 제제는 본원에 기재된 임의의 제제를 포함할 수 있다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키는 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함한다. 융합 단백질은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함한다. 융합 단백질은 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 추가로 포함한다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키는 추가의 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자로부터 유래된 포자외막 단편을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함한다. 융합 단백질은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함한다. 융합 단백질은 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 추가로 포함한다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키는 추가의 방법이 제공된다. 방법은 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함한다. 융합 단백질은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함한다. 융합 단백질은 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 추가로 포함한다. 방법은 제2 효소를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 추가로 포함한다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키는 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스의 포자로부터 유래된 포자외막 단편을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함한다. 융합 단백질은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함한다. 융합 단백질은 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 추가로 포함한다. 방법은 제2 효소를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 추가로 포함한다.
선충 방제 활성을 갖는 세린 프로테아제 변이체에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열식별번호: 213의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (iii) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 한 실시양태에서, 이러한 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 지정할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 그 실시양태의 한 측면에서, 프로모터는 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 대해 이종 또는 외래이며, 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 대해 천연 또는 천연 발생 프로모터가 아니다.
표현 "작동가능하게 연결된"은 핵산 분자의 요소가 그들의 기능이 조정되고 코딩 서열의 발현을 허용하는 방식으로 서로에 연결되는 것을 의미하며, 즉, 이들은 기능적으로 연결된다. 예로서, 프로모터는 그것이 이러한 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및 궁극적으로 발현을 보장할 수 있는 경우, 또 다른 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된다. 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 2개의 단백질, 예를 들어, 신호 펩티드-코딩 핵산 서열 및 세린 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이들이 제1 및 제2 단백질 또는 펩티드의 융합 단백질이 형성될 수 있도록 하는 방식으로 연결되는 경우, 서로에 기능적으로 또는 작동가능하게 연결된다.
상기-기재된 핵산 분자를 함유하는 벡터가 제공된다. "벡터"는 숙주 세포 내로의 외래 핵산 서열의 전달을 위해 디자인된 핵산 구축물, 예컨대 플라스미드를 지칭한다. 발현 벡터는 숙주 세포에서의 외래 핵산 서열의 발현을 허용하도록 구축된 벡터의 유형이다.
상기-기재된 벡터를 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포이다. 이 실시양태의 한 측면에서, 숙주 세포는 바실루스(Bacillus) 세포이다. 이 실시양태의 특정 측면에서, 숙주 세포는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이다. 이 실시양태의 또 다른 측면에서, 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포이다.
선충 방제 활성을 갖는 세린 프로테아제 변이체를 포함하는 펩티드가 제공된다. 이러한 펩티드는 (i) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; (ii) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 또는 (iii) 서열식별번호: 213에 의해 코딩되는 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 이종 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
선행하는 단락에 기재된 펩티드를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 이러한 펩티드 1 중량% 내지 99 중량%를 포함한다.
다른 목적 및 특색은 이하에서 부분적으로 명백하고 부분적으로 언급될 것이다.
정의
단수형태 "하나", 및 "상기"가 본원에 사용되는 경우, 이들은 달리 지시되지 않는 한, "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "바실루스 세레우스 패밀리 구성원"은 포자외막을 생성할 수 있는 임의의 바실루스 종을 지칭한다. 따라서, 바실루스 세레우스 패밀리의 박테리아는 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실루스 미코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 슈도미코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 사마니이(Bacillus samanii), 바실루스 가에모켄시스(Bacillus gaemokensis), 바실루스 웨이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis), 및 바실루스 토요이엔시스(Bacillus toyoiensis) 종을 포함한다. 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 또한 관련 기술분야에서 "바실루스 세레우스 센소 라토"로 지칭된다.
용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" 및 "갖는"은 포함적인 것으로 의도되며, 열거된 요소 외에 추가의 요소가 있을 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "유리 효소"는 무손상 세포가 실질적으로 없는 효소 제제를 지칭한다. 용어 "유리 효소"는 부분적으로 정제되거나, 실질적으로 정제되거나, 정제된 효소인 효소를 함유하는 조 세포 추출물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유리 효소는 임의로 효소의 제어된 방출을 허용하는 화학적 매트릭스 또는 지지체 상에 고정화될 수 있다. 효소를 매트릭스 또는 지지체 상에 고정화하는 것에 관하여 본원에 사용된 용어 "고정화하는"은 비제어된 방식으로 환경 내로 소멸되는 대신, 효소가 매트릭스 또는 지지체 상에 유지되거나 제어된 기간에 걸쳐 지지체로부터 방출되도록 매트릭스 또는 지지체에 효소를 결합시키는 것을 지칭한다. 예시적인 매트릭스 및 지지체는 숯, 바이오숯, 나노탄소, 아가로스, 알기네이트, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 실리카, 플라스틱, 스테인레스 스틸, 유리, 폴리스티렌, 세라믹, 백운석, 점토, 규조토, 활석, 중합체, 검, 수-분산성 물질, 및 임의의 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
식물에의 효소 또는 재조합 미생물의 적용에 관하여 본원에 사용된 용어 "엽면"은 효소 또는 재조합 미생물이 줄기, 잎, 과실, 꽃, 또는 식물의 다른 노출된 공중 부분을 포함한 식물의 하나 이상의 공중 부분에 적용됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 2개 이상의 별개의 단백질로부터 유래된 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. 융합 단백질은 제1 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 분자를 제2 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 분자와 함께 연결하여, 발현되는 경우, 각각의 원래 단백질로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 폴리펩티드를 생성하는 핵산 서열을 생성함으로써 생성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발아율"은 특정한 기간 동안 발아하는 종자의 수를 지칭한다. 예를 들어, 85%의 발아율은 주어진 기간 동안 100개의 종자 중 85개가 발아하는 것을 지시한다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자의 불활성화에 관하여 본원에 사용된 용어 "불활성화시키다" 또는 "불활성화"는 포자가 발아할 수 없거나, 포자가 발아할 수 있지만 발아가 살아 있는 박테리아를 생성하지 않도록 손상되는 것을 의미한다. 용어 "부분적으로 불활성화시키다" 또는 "부분적 불활성화"는 소정 백분율이 포자가 불활성화되지만, 일부 포자는 발아하는 능력을 보유하고 살아 있는 복제하는 상태로 복귀되는 것을 의미한다. 용어 "유전자 불활성화"는 포자의 완전한 또는 부분적 불활성화를 일으키는 포자의 DNA의 돌연변이에 의한 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자의 불활성화를 지칭한다. 용어 "물리적 불활성화" 및 "화학적 불활성화"는 임의의 물리적 또는 화학적 수단을 사용한, 예를 들어, 열 처리, 감마 조사, x-선 조사, UV-A 조사, UV-B 조사, 또는 용매, 예컨대 글루타르알데히드, 포름알데히드, 과산화수소, 아세트산, 표백제, 클로로포름, 페놀, 또는 이들의 임의의 조합으로의 처리에 의한 포자의 불활성화를 지칭한다.
용어 "천연 서열", "천연 아미노산 서열", "야생형 서열", 및 "야생형 아미노산 서열"은 그것이 천연 발생 단백질로 존재하는 바와 같은 아미노산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
"식물 성장 배지"는 식물의 성장을 지지할 수 있는 임의의 물질을 포함한다.
용어 "식물 성장을 촉진시키는" 및 "식물 성장을 자극시키는"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 식물의 높이, 중량, 잎 크기, 뿌리 크기, 과실 크기, 순 크기 또는 줄기 크기 중 적어도 하나를 향상시키거나 증가시키는 능력, 및/또는 식물로부터의 단백질 수율을 증가시키는, 및/또는 작물 수율을 증가시키는, 및/또는 식물 활기를 개선시키는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 이는 비처리된 식물 또는 작물에 비해 처리된 식물 또는 작물의 뿌리 및/또는 순의 증가된 길이 및/또는 신선 및/또는 건조 중량과 관련될 수 있다.
식물의, 특히 농업, 조림 및/또는 장식용 식물의 증가된 수율은 각각의 식물의 생성물의 수율이 동일한 조건 하에서 생산되지만 본원에 개시된 조성물의 적용이 없는 식물의 동일한 생성물의 수율에 비해 측정가능한 양만큼 증가되는 것을 의미한다.
개선된 식물 활기는 하기를 포함한다: (a) 식물의 개선된 활력, (b) 식물의 및/또는 식물 생성물의 개선된 품질, 예를 들어, 향상된 단백질 함량, (c) 개선된 시각적 외관, (d) 노쇠의 지연, (e) 향상된 뿌리 성장 및/또는 보다 발달된 근계 (예를 들어, 뿌리의 건조 질량에 의해 결정됨), (f) 향상된 마디화, 특히 리조븀 마디화, (g) 보다 긴 원추화, (h) 보다 큰 엽편, (i) 보다 적은 죽은 근출엽, (j) 증가된 엽록소 함량, (k) 연장된 광합성 활성 기간, (l) 증가된 또는 개선된 식물 임분 밀도, (m) 보다 적은 식물 벌스(verse) (로징(lodging)), (n) 증가된 식물 중량, (o) 증가된 식물 높이, (p) 분얼 증가, (q) 보다 강한 및/또는 보다 생산적인 분얼, (r) 보다 적은 비-생산적인 분얼, (s) 향상된 광합성 활성 및/또는 향상된 색소 함량 및 따라서 보다 녹색의 잎 색깔, (t) 보다 이른 및/또는 개선된 발아, (u) 개선된 및/또는 보다 균일한 및/또는 보다 이른 출현, (v) 증가된 순 성장, (w) 보다 이른 개화, (x) 보다 이른 결과, (y) 보다 이른 낟알 성숙, (z) 보다 적게 필요한 비료, (aa) 보다 적게 필요한 종자.
본원에 기재된 박테리아에 관하여 사용된 용어 "재조합"은 유전자 또는 유전자의 부분을 결실시키도록 변형된 박테리아 (예를 들어, 유전자의 "넉-아웃"을 갖는 박테리아), 뿐만 아니라 외인성 펩티드 또는 단백질을 발현하도록 변형된 박테리아를 포함한 동일한 유형의 야생형 박테리아와 비교하여 임의의 유전자 변형을 갖는 박테리아를 포괄한다.
용어 "근권"은 식물의 뿌리를 둘러싸고 그에 의해 영향을 받는 토양의 부분을 나타내기 위해 "뿌리 구역"과 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "상승작용적 유효량"은 제2 물질 (예를 들어, 제2 효소)과 조합으로 사용되는 경우, 단독으로 사용되는 경우 각각의 제1 및 제2 물질의 각각의 생물학적 효과의 합계보다 더 큰 생물학적 효과를 생성하는 제1 물질 (예를 들어, 제1 효소)의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "표적화 서열"은 보다 긴 폴리펩티드 또는 단백질의 일부로서 존재하는 경우, 특이적 세포이하 위치에의 보다 긴 폴리펩티드 또는 단백질의 국재화를 일으키는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 본원에 기재된 표적화 서열은 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에의 단백질의 국재화를 일으킨다.
도 1a 및 1b는 바실루스 안트라시스 스턴 균주 BclA의 아미노-말단 부분의 아미노산 서열 및 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터의 다양한 포자외막 단백질로부터의 상응하는 영역과의 정렬을 나타낸다.
도 2는 바실루스 투린기엔시스 BT013A, BT013A-pBC210, BT013A-pBC211 및 BT013A-pSuper212의 전체 브로쓰 배양물의 프로테아제 활성을 비교하는 효소 검정의 결과를 나타낸다.
도 3은 바실루스 투린기엔시스 BT013A의 포자외막에 결합된 세린 단백질 변이체 효소의 안정성을 유리 세린 프로테아제 변이체 효소와 비교하는 효소 검정의 결과를 나타낸다.
도 4는 전장 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 함유하는 포자외막 단편의 효소 활성을 나타낸다.
도 5는 전장 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 제시하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 전체 브로쓰 배양물 또는 포자외막 단편으로 처리된 대두 종자를 사용한 시험에서의 선충 방제 활성을 나타낸다.
I. 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 발현을 위한 융합 단백질
본 발명은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 융합 단백질은 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 추가로 포함한다. 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 박테리아에서 발현되는 경우, 이들 융합 단백질은 포자의 포자외막 층에 표적화되고, 세린 프로테아제가 포자의 외부에 제시되도록 물리적으로 배향된다.
이 바실루스 포자외막 제시 (BEMD) 시스템은 세린 프로테아제를 식물에 (예를 들어, 식물 옆면, 과실, 꽃, 줄기, 또는 뿌리에) 또는 식물 성장 배지, 예컨대 토양에 전달하는데 사용될 수 있다. 이 방식으로 토양 또는 또 다른 식물 성장 배지에 전달되는 효소 및 단백질은 연장된 기간 동안 토양에서 활성을 지속하고 나타낸다. 토양 또는 식물의 근권 내로의 본원에 기재된 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 박테리아의 도입은 많은 상이한 토양 조건에서 식물 성장의 유익한 향상 및/또는 해충, 예컨대 선충 방제를 일으킨다. 이들 효소를 생성하기 위한 BEMD의 사용은 이들이 식물의 생애의 최초 개월에 걸쳐 식물 및 근권에 대한 그들의 유익한 결과를 계속 발휘하게 한다.
추가로, 하기에 추가로 기재된 바와 같이, BEMD 시스템은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막이 포자로부터 제거되어 융합 단백질을 함유하는 포자외막 단편을 생성할 수 있도록 변형될 수 있다. 포자외막 단편은 또한 무세포 제제에서 세린 프로테아제를 식물에 전달하는데 사용될 수 있다.
A. 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하기 위한 표적화 서열, 포자외막 단백질, 및 포자외막 단백질 단편
참고의 편의를 위해, 효소 또는 단백질 (예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소)를 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 및 포자외막 단백질 단편에 대한 아미노산 서열의 설명은 그들의 서열식별번호와 함께 표 1에 제공된다.
표 1. 관심의 단백질 또는 펩티드를 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용되는 펩티드 및 단백질 서열
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AA = 아미노산
* 비. 미코이데스 가설 단백질 TIGR03720은 비. 미코이데스 가설 단백질 WP003189234과 100% 서열 동일성을 갖는다. 따라서, 서열식별번호: 57 및 58은 또한 각각 비. 미코이데스 가설 단백질 WP003189234의 아미노산 1-136 및 전장 비. 미코이데스 가설 단백질 WP003189234를 나타낸다.
바실루스는 간상 박테리아의 속이다. 바실루스 세레우스 패밀리의 박테리아는 포자외막을 생성할 수 있는 임의의 바실루스 종을 포함한다. 따라서, 바실루스 세레우스 패밀리의 박테리아는 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 미코이데스, 바실루스 슈도미코이데스, 바실루스 사마니이, 바실루스 가에모켄시스, 바실루스 웨이헨스테파넨시스, 및 바실루스 토요이엔시스 종을 포함한다. 스트레스가 많은 환경 조건 하에서, 바실루스 세레우스 패밀리 박테리아는 포자형성을 겪고 연장된 기간 동안 휴면 상태일 수 있는 난형 내생포자를 형성한다. 내생포자의 최외층은 포자외막으로 공지되어 있고, 털-유사 돌출부의 외부 보풀에 의해 둘러싸인 기저층을 포함한다. 털-유사 보풀 상의 필라멘트는 콜라겐-유사 당단백질 BclA에 의해 우세하게 형성되는 반면, 기저층은 다수의 상이한 단백질로 구성된다. 또 다른 콜라겐-관련 단백질, BclB는 또한 포자외막에 존재하고, 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 내생포자 상에 노출된다. 표면 보풀의 주요 구성성분인 BclA는 포자외막에 부착되는 것으로 나타났으며, 그의 아미노-말단 (N-말단)은 기저층에 위치하고, 그의 카르복시-말단 (C-말단)은 포자로부터 밖으로 연장된다.
과학 문헌은 바실루스 세레우스 "패밀리" 또는 "군"을 바실루스 속 내의 하위군으로서 기재한다. 문헌 [Priest et al., "Population Structure and Evolution of the Bacillus cereus Group," J. Bacteriology, 2004, vol. 186. no. 23, pp. 7959-7970; Peng et al., "The Regulation of Exosporium-Related Genes in Bacillus thuringiensis," Nature Scientific Reports, 2016, vol. 6, no. 19005, pp. 1-12]을 참조한다. 문헌 [Peng et al.]은 하기와 같이 언급한다.
비. 세레우스 군의 포자는 복잡한 다층 구조이다. 뉴클레오이드 함유 코어는 포자 외피에 의해 둘러싸인 펩티도글리칸 피질 내에 에워싸인다. 모든 비. 세레우스 군 종의 포자는 다른 종, 예컨대 바실루스 서브틸리스 상에 존재하지 않는 포자외막으로 지칭되는 추가의 헐거운 층에 의해 둘러싸이며, 그에 대한 외피는 성숙한 포자의 최외층을 구성한다. 포자외막은 포자의 외부 투과성 장벽으로서 작용하는 풍선-유사 층이고, 포자 생존 및 병독성에 기여한다.
BclA 및 BclB의 N-말단 영역으로부터의 특정 서열은 펩티드 또는 단백질을 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 내생포자의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있음이 이전에 밝혀졌다 (미국 특허 출원 공개 번호 2010/0233124 및 2011/0281316, 및 문헌 [Thompson et al., "Targeting of the BclA and BclB Proteins to the Bacillus anthracis Spore Surface", Molecular Microbiology 70(2):421-34 (2008)] 참조). 또한, 바실루스 안트라시스의 BetA/BAS3290 단백질은 포자외막에 국재화됨이 밝혀졌다. 융합 단백질 내로 혼입되고 관심의 펩티드 또는 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있는 추가의 표적화 서열, 뿐만 아니라 포자외막 단백질 및 포자외막 단백질의 단편은 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0031948 및 2016/0108096 (이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
특히, 바실루스 안트라시스 스턴 균주로부터의 BclA의 아미노산 20-35는 포자외막에 표적화하기에 충분한 것으로 밝혀졌다. BclA의 아미노산 1-41 (서열식별번호: 1)과 몇몇 다른 바실루스 세레우스 패밀리 포자외막 단백질의 상응하는 N-말단 영역의 서열 정렬 및 관련 서열을 갖는 바실루스 세레우스 패밀리 단백질은 도 1a 및 1b에 나타내어진다. 도 1a 및 1b로부터 볼 수 있는 바와 같이, BclA의 아미노산 20-41에 상응하는 영역에서 모든 단백질 중에서 높은 상동성의 영역이 있다. 그러나, 이들 서열에서, BclA의 아미노산 36-41에 상응하는 아미노산은 2차 구조를 함유하고, 포자외막에의 융합 단백질 국재화에 필요하지 않다. BclA의 보존된 표적화 서열 영역 (서열식별번호: 1의 아미노산 20-35)은 도 1a 및 1b에서 볼드체로 나타내어진다. 표적화 서열 내의 BclA의 아미노산 25-35에 걸치는 보다 고도로 보존된 영역은 도 1a 및 1b에서의 서열에서 밑줄쳐 있고, ExsFA/BxpB/ExsFB에 대한 인식 서열이고 상동성이며, 이는 포자외막의 표면 상에 기재된 단백질을 지정하고 어셈블리한다. 도 1a에서 서열식별번호 3, 5, 및 7의 아미노산 서열은 각각 바실루스 안트라시스 스턴 균주 BetA/BAS3290의 아미노산 1-33, 메티오닌에 이어진 바실루스 안트라시스 스턴 균주 BAS4623의 아미노산 2-43, 및 바실루스 안트라시스 스턴 균주 BclB의 아미노산 1-34이다. (BAS4623에 대해, 천연 단백질에서 위치 1에 존재하는 발린을 메티오닌으로 대체하는 것은 보다 양호한 발현을 일으킴이 밝혀졌다.) 도 1a로부터 볼 수 있는 바와 같이, 이들 서열 각각은 BclA의 아미노산 20-35에 상응하는 보존된 영역 (서열식별번호: 1; 볼드체로 나타내어짐), 및 BclA의 아미노산 25-35에 상응하는 보다 고도로 보존된 영역 (밑줄침)을 함유한다.
바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터의 추가의 단백질은 또한 보존된 표적화 영역을 함유한다. 특히, 도 1a 및 1b에서, 서열식별번호: 9는 바실루스 안트라시스 스턴 균주 BAS1882의 아미노산 1-30이고, 서열식별번호: 11은 바실루스 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 2280 유전자 생성물의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 13은 바실루스 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 3572 유전자 생성물의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 15는 바실루스 세레우스 VD200 포자외막 리더 펩티드의 아미노산 1-49이고, 서열식별번호: 17은 바실루스 세레우스 VD166 포자외막 리더 펩티드의 아미노산 1-33이고, 서열식별번호: 19는 바실루스 세레우스 VD200 가설 단백질 IKG_04663의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 21은 바실루스 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 YVTN β-프로펠러 단백질의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 23은 바실루스 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2363의 아미노산 1-30이고, 서열식별번호: 25는 바실루스 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2131의 아미노산 1-30이고, 서열식별번호: 27은 바실루스 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부 함유 콜라겐의 아미노산 1-36이고, 서열식별번호: 29는 바실루스 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyco0001_21660의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 31은 바실루스 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_22540의 아미노산 1-30이고, 서열식별번호: 33은 바실루스 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_21510의 아미노산 1-21이고, 서열식별번호: 35는 바실루스 투린기엔시스 35646 콜라겐 삼중 나선 반복 단백질의 아미노산 1-22이고, 서열식별번호: 43은 바실루스 세레우스 가설 단백질 WP_69652의 아미노산 1-35이고, 서열식별번호: 45는 바실루스 세레우스 포자외막 리더 WP016117717의 아미노산 1-41이고, 서열식별번호: 47은 바실루스 세레우스 포자외막 펩티드 WP002105192의 아미노산 1-49이고, 서열식별번호: 49는 바실루스 세레우스 가설 단백질 WP87353의 아미노산 1-38이고, 서열식별번호: 51은 바실루스 세레우스 포자외막 펩티드 02112369의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 53은 바실루스 세레우스 포자외막 단백질 WP016099770의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 55는 바실루스 투린기엔시스 가설 단백질 YP006612525의 아미노산 1-36이고, 서열식별번호: 57은 바실루스 미코이데스 가설 단백질 TIGR03720의 아미노산 1-136이고, 서열식별번호: 59는 비. 세레우스 ATCC 10987 콜라겐 삼중 나선 반복 도메인 단백질의 아미노산 1-36이고, 서열식별번호: 61은 비. 세레우스 E33L 콜라겐-유사 단백질의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 63은 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 1-41이고, 서열식별번호: 65는 비. 투린기엔시스 균주 알 하캄 가설 단백질 BALH_2230의 아미노산 1-30이고, 서열식별번호: 67은 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 1-33이고, 서열식별번호: 69는 비. 세레우스 콜라겐 삼중 나선 반복부의 아미노산 1-44이고, 서열식별번호: 71은 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 1-38이고, 서열식별번호: 73은 비. 세레우스 E33L 가설 단백질 BCZK1835의 아미노산 1-30이고, 서열식별번호: 75는 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 1-48이고, 서열식별번호: 77은 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 1-30이고, 서열식별번호: 79는 비. 세레우스 ATCC 14579 가설 단백질 BC4725의 아미노산 1-39이고, 서열식별번호: 81은 비. 세레우스 E33L 가설 단백질 BCZK4476의 아미노산 1-44이고, 서열식별번호: 83은 비. 안트라시스 균주 '에임스 안세스터' 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 1-40이고, 서열식별번호: 85는 비. 투린기엔시스 혈청형 콘쿠키안 균주 97-27 BclA 단백질의 아미노산 1-34이고, 서열식별번호: 87은 비. 세레우스 ATCC 10987 보존된 가설 단백질의 아미노산 1-34이고, 서열식별번호: 89는 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 1-34이고, 서열식별번호: 91은 비. 세레우스 포자외막 리더 펩티드 부분 서열의 아미노산 1-99이고, 서열식별번호: 93은 비. 웨이헨스테파넨시스 가설 단백질 ER45_27600의 아미노산 1-136이다. 도 1a 및 1b에 나타내어진 바와 같이, 이들 단백질의 각각의 N-말단 영역은 BclA의 아미노산 20-35를 갖는 보존된 영역 (서열식별번호: 1), 및 BclA의 아미노산 25-35에 상응하는 보다 고도로 보존된 영역을 함유한다.
비. 투린기엔시스로부터의 BclA의 아미노산 1-41 (서열식별번호: 204) 및 비. 안트라시스로부터의 BclA의 아미노산 1-41 (서열식별번호: 206)은 서열식별번호: 2와 동일하고, 따라서 도 1에 나타내지 않는다.
아미노산 20-35를 포함하는 BclA의 임의의 부분은 융합 단백질을 포자외막에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 전장 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편은 융합 단백질을 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 아미노산 20-35를 포함하는 전장 BclA 또는 BclA의 단편은 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전장 BclA (서열식별번호: 2, 204, 또는 206) 또는 카르복시-말단이 결여된 BclA의 중간크기 단편, 예컨대 서열식별번호: 95 또는 207 (BclA의 아미노산 1-196) 또는 205 (BclA의 아미노산 1-166)는 융합 단백질을 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다. 중간크기 단편, 예컨대 서열식별번호: 95, 205, 및 207의 단편은 전장 BclA보다 더 적은 2차 구조를 갖고, 표적화 서열로서 사용하기에 적합한 것으로 밝혀졌다. 표적화 서열은 또한 아미노산 20-35를 포함하는 BclA의 훨씬 더 짧은 부분, 예컨대 서열식별번호: 1 (BclA의 아미노산 1-41), 서열식별번호: 1의 아미노산 1-35, 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35, 또는 서열식별번호: 96 (BclA의 아미노산 20-35에 연결된 메티오닌 잔기)을 포함할 수 있다. 아미노산 20-35의 단지 일부만을 포함하는 BclA의 훨씬 더 짧은 단편은 또한 융합 단백질을 포자외막에 표적화하는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 22-31, 서열식별번호: 1의 아미노산 22-33, 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 20-31을 포함할 수 있다.
대안적으로, BclA의 아미노산 20-35에 상응하는 아미노산을 포함하는 BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, KBAB4 2280 유전자 생성물, KBAB4 3572 유전자 생성물, 비. 세레우스 VD200 포자외막 리더 펩티드, 비. 세레우스 VD166 포자외막 리더 펩티드, 비. 세레우스 VD200 가설 단백질 IKG_04663, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 YVTN β-프로펠러 단백질, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2363, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2131, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부 함유 콜라겐, 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyco0001_21660, 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_22540, 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_21510, 비. 투린기엔시스 35646 콜라겐 삼중 나선 반복 단백질, 비. 세레우스 가설 단백질 WP_69652, 비. 세레우스 포자외막 리더 WP016117717, 비. 세레우스 포자외막 펩티드 WP002105192, 비. 세레우스 가설 단백질 WP87353, 비. 세레우스 포자외막 펩티드 02112369, 비. 세레우스 포자외막 단백질 WP016099770, 비. 투린기엔시스 가설 단백질 YP006612525, 비. 미코이데스 가설 단백질 TIGR03720, 비. 세레우스 ATCC 10987 콜라겐 삼중 나선 반복 도메인 단백질, 비. 세레우스 E33L 콜라겐-유사 단백질, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐, 비. 투린기엔시스 균주 알 하캄 가설 단백질 BALH_2230, 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐, 비. 세레우스 콜라겐 삼중 나선 반복부, 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐, 비. 세레우스 E33L 가설 단백질 BCZK1835, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐, 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐, 비. 세레우스 ATCC 14579 가설 단백질 BC4725, 비. 세레우스 E33L 가설 단백질 BCZK4476, 비. 안트라시스 균주 '에임스 안세스터' 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐, 비. 투린기엔시스 혈청형 콘쿠키안 균주 97-27 BclA 단백질, 비. 세레우스 ATCC 10987 보존된 가설 단백질, 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐, 비. 세레우스 포자외막 리더 펩티드 부분 서열, 또는 비. 웨이헨스테파넨시스 가설 단백질 ER45_27600의 임의의 부분은 표적화 서열로서 역할을 할 수 있다.
도 1a로부터 볼 수 있는 바와 같이, BetA/BAS3290의 아미노산 12-27, BAS4623의 아미노산 23-38, BclB의 아미노산 13-28, BAS1882의 아미노산 9-24, KBAB4 2280 유전자 생성물의 아미노산 18-33, KBAB4 3572 유전자 생성물의 아미노산 18-33, 비. 세레우스 VD200 포자외막 리더 펩티드의 아미노산 28-43, 비. 세레우스 VD166 포자외막 리더 펩티드의 아미노산 12-27, 비. 세레우스 VD200 가설 단백질 IKG_04663의 아미노산 18-33, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 YVTN β-프로펠러 단백질의 아미노산 18-33, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2363의 아미노산 9-24, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2131의 아미노산 9-24, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부 함유 콜라겐의 아미노산 15-30, 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyco0001_21660의 아미노산 18-33, 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_22540의 아미노산 9-24, 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_21510의 아미노산 1-15, 비. 투린기엔시스 35646 콜라겐 삼중 나선 반복 단백질의 아미노산 1-16, 비. 세레우스 가설 단백질 WP_69652의 아미노산 14-29, 비. 세레우스 포자외막 리더 WP016117717의 아미노산 20-35, 비. 세레우스 포자외막 펩티드 WP002105192의 아미노산 28-43, 비. 세레우스 가설 단백질 WP87353의 아미노산 17-32, 비. 세레우스 포자외막 펩티드 02112369의 아미노산 18-33, 비. 세레우스 포자외막 단백질 WP016099770의 아미노산 18-33, 비. 투린기엔시스 가설 단백질 YP006612525의 아미노산 15-30, 및 비. 미코이데스 가설 단백질 TIGR03720의 아미노산 115-130은 BclA의 아미노산 20-35에 상응한다. '661 공보의 도 1b로부터 볼 수 있는 바와 같이, 비. 세레우스 ATCC 10987 콜라겐 삼중 나선 반복 도메인 단백질의 아미노산 15-30, 비. 세레우스 E33L 콜라겐-유사 단백질의 아미노산 18-33, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 20-35, 비. 투린기엔시스 균주 알 하캄 가설 단백질 BALH_2230의 아미노산 9-24, 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 12-27, 비. 세레우스 콜라겐 삼중 나선 반복부의 아미노산 23-38, 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 17-32, 비. 세레우스 E33L 가설 단백질 BCZK1835의 아미노산 9-24, 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 27-42, 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 9-24, 비. 세레우스 ATCC 14579 가설 단백질 BC4725의 아미노산 18-33, 비. 세레우스 E33L 가설 단백질 BCZK4476의 아미노산 23-38, 비. 안트라시스 균주 '에임스 안세스터' 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 19-34, 비. 투린기엔시스 혈청형 콘쿠키안 균주 97-27 BclA 단백질의 아미노산 13-28, 비. 세레우스 ATCC 10987 보존된 가설 단백질의 아미노산 13-28, 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐의 아미노산 13-28, 비. 세레우스 포자외막 리더 펩티드 부분 서열의 아미노산 78-93, 및 비. 웨이헨스테파넨시스 가설 단백질 ER45_27600의 아미노산 115-130은 BclA의 아미노산 20-35에 상응한다. 따라서, 상기-열거된 상응하는 아미노산을 포함하는 이들 단백질의 임의의 부분은 표적화 서열로서 역할을 할 수 있다.
더욱이, BclA의 아미노산 20-35를 포함하는 임의의 아미노산 서열, 또는 임의의 상기-열거된 상응하는 아미노산은 표적화 서열로서 역할을 할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 1-35, 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 96, 서열식별번호: 1의 아미노산 22-31, 서열식별번호: 1의 아미노산 22-33, 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 20-31을 포함할 수 있다. 대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 1-35, 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35, 서열식별번호: 1, 또는 서열식별번호: 96으로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 22-31, 서열식별번호: 1의 아미노산 22-33, 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 20-31로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 포자외막 단백질은 전장 BclA (서열식별번호: 2)를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질 단편은 카르복시-말단이 결여된 BclA의 중간크기 단편, 예컨대 서열식별번호: 95 (BclA의 아미노산 1-196)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 포자외막 단백질 단편은 서열식별번호: 95로 이루어질 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 2-35; 서열식별번호: 1의 아미노산 5-35; 서열식별번호: 1의 아미노산 8-35; 서열식별번호: 1의 아미노산 10-35; 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 15-35를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 3의 아미노산 1-27, 서열식별번호: 3의 아미노산 12-27, 또는 서열식별번호: 3을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 BetA/BAS3290 (서열식별번호: 4)을 포함할 수 있다. 또한, BetA/BAS3290의 아미노산 12-27에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 97을 포함할 수 있다. 대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 3의 아미노산 14-23, 서열식별번호: 3의 아미노산 14-25, 또는 서열식별번호: 3의 아미노산 12-23을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 3의 아미노산 2-27; 서열식별번호: 3의 아미노산 5-27; 서열식별번호: 3의 아미노산 8-27; 또는 서열식별번호: 3의 아미노산 10-27을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 5의 아미노산 1-38, 서열식별번호: 5의 아미노산 23-38, 서열식별번호: 5, 또는 서열식별번호: 201 (BAS4623의 아미노산 23-38에 연결된 메티오닌 잔기)을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 BAS4623 (서열식별번호: 6)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 5의 아미노산 2-38; 서열식별번호: 5의 아미노산 5-38; 서열식별번호: 5의 아미노산 8-38; 서열식별번호: 5의 아미노산 10-38; 서열식별번호: 5의 아미노산 15-38; 또는 서열식별번호: 5의 아미노산 20-38을 포함할 수 있다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 7의 아미노산 1-28, 서열식별번호: 7의 아미노산 13-28, 서열식별번호: 7, 또는 서열식별번호: 202 (BclB의 아미노산 13-28에 연결된 메티오닌 잔기)를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 BclB (서열식별번호: 8)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 7의 아미노산 2-28; 서열식별번호: 7의 아미노산 5-28; 서열식별번호: 7의 아미노산 8-28; 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 10-28을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 9의 아미노산 1-24, 서열식별번호: 9의 아미노산 9-24, 또는 서열식별번호: 9를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 BAS1882 (서열식별번호: 10)를 포함할 수 있다. BAS1882의 아미노산 9-24에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 105를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 9의 아미노산 2-24; 서열식별번호: 9의 아미노산 5-24; 또는 서열식별번호: 9의 아미노산 8-24를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 11의 아미노산 1-33, 서열식별번호: 11의 아미노산 18-33, 또는 서열식별번호: 11을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 2280 유전자 생성물 (서열식별번호: 12)을 포함할 수 있다. 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 2280 유전자 생성물의 아미노산 18-33에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 98을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 11의 아미노산 2-33; 서열식별번호: 11의 아미노산 5-33; 서열식별번호: 11의 아미노산 8-33; 서열식별번호: 11의 아미노산 10-33; 또는 서열식별번호: 11의 아미노산 15-33을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 13의 아미노산 1-33, 서열식별번호: 13의 아미노산 18-33, 또는 서열식별번호: 13을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 3572 유전자 생성물 (서열식별번호: 14)을 포함할 수 있다. 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 3572 유전자 생성물의 아미노산 18-33에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 99를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 13의 아미노산 2-33; 서열식별번호: 13의 아미노산 5-33; 서열식별번호: 13의 아미노산 8-33; 서열식별번호: 13의 아미노산 10-33; 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 15-33을 포함할 수 있다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 15의 아미노산 1-43, 서열식별번호: 15의 아미노산 28-43, 또는 서열식별번호: 15를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 VD200 포자외막 리더 펩티드 (서열식별번호: 16)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 15의 아미노산 2-43; 서열식별번호: 15의 아미노산 5-43; 서열식별번호: 15의 아미노산 8-43; 서열식별번호: 15의 아미노산 10-43; 서열식별번호: 15의 아미노산 15-43; 서열식별번호: 15의 아미노산 20-43; 또는 서열식별번호: 15의 아미노산 25-43을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 17의 아미노산 1-27, 서열식별번호: 17의 아미노산 12-27, 또는 서열식별번호: 17을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 VD166 포자외막 리더 펩티드 (서열식별번호: 18)를 포함할 수 있다. 비. 세레우스 VD166 포자외막 리더 펩티드의 아미노산 12-27에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 100을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 17의 아미노산 2-27; 서열식별번호: 17의 아미노산 5-27; 서열식별번호: 17의 아미노산 8-27; 또는 서열식별번호: 17의 아미노산 10-27을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 19의 아미노산 1-33, 서열식별번호: 19의 아미노산 18-33, 또는 서열식별번호: 19를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 VD200 가설 단백질 IKG_04663 (서열식별번호: 20)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 19의 아미노산 2-33; 서열식별번호: 19의 아미노산 5-33; 서열식별번호: 19의 아미노산 8-33; 서열식별번호: 19의 아미노산 10-33; 또는 서열식별번호: 19의 아미노산 15-33을 포함할 수 있다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 21의 아미노산 1-33, 서열식별번호: 21의 아미노산 18-33, 또는 서열식별번호: 21을 포함하거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 YVTN β-프로펠러 단백질 (서열식별번호: 22)을 포함할 수 있다. 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 YVTN β-프로펠러 단백질의 아미노산 18-33에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 101을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 21의 아미노산 2-33; 서열식별번호: 21의 아미노산 5-33; 서열식별번호: 21의 아미노산 8-33; 서열식별번호: 21의 아미노산 10-33; 또는 서열식별번호: 21의 아미노산 15-33을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 23의 아미노산 1-24, 서열식별번호: 23의 아미노산 9-24, 또는 서열식별번호: 23을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2363 (서열식별번호: 24)을 포함할 수 있다. 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2363의 아미노산 9-24에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 102를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 23의 아미노산 2-24; 서열식별번호: 23의 아미노산 5-24; 또는 서열식별번호: 23의 아미노산 8-24를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 25의 아미노산 1-24, 서열식별번호: 25의 아미노산 9-24, 또는 서열식별번호: 25를 포함하거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2131 (서열식별번호: 26)을 포함할 수 있다. 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 가설 단백질 bcerkbab4_2131의 아미노산 9-24에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 103을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 25의 아미노산 2-24; 서열식별번호: 25의 아미노산 5-24; 또는 서열식별번호: 25의 아미노산 8-24를 포함할 수 있다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 27의 아미노산 1-30, 서열식별번호: 27의 아미노산 15-30, 또는 서열식별번호: 27을 포함하거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부 함유 콜라겐 (서열식별번호: 28)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 27의 아미노산 2-30; 서열식별번호: 27의 아미노산 5-30; 서열식별번호: 27의 아미노산 8-30; 또는 서열식별번호: 27의 아미노산 10-30을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 29의 아미노산 1-33, 서열식별번호: 29의 아미노산 18-33, 또는 서열식별번호: 29를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyco0001_21660 (서열식별번호: 30)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 29의 아미노산 2-33; 서열식별번호: 29의 아미노산 5-33; 서열식별번호: 29의 아미노산 8-33; 서열식별번호: 29의 아미노산 10-33; 또는 서열식별번호: 29의 아미노산 15-33을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 31의 아미노산 1-24, 서열식별번호: 31의 아미노산 9-24, 또는 서열식별번호: 31을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_22540 (서열식별번호: 32)을 포함할 수 있다. 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_22540의 아미노산 9-24에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 104를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 31의 아미노산 2-24; 서열식별번호: 31의 아미노산 5-24; 또는 서열식별번호: 31의 아미노산 8-24를 포함할 수 있다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 33의 아미노산 1-15, 서열식별번호: 33을 포함하거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 미코이데스 2048 가설 단백질 bmyc0001_21510 (서열식별번호: 34)을 포함한다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 35의 아미노산 1-16, 서열식별번호: 35를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 투린기엔시스 35646 콜라겐 삼중 나선 반복 단백질 (서열식별번호: 36)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 43의 아미노산 1-29, 서열식별번호: 43의 아미노산 14-29, 또는 서열식별번호: 43을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 가설 단백질 WP_69652 (서열식별번호: 44)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 43의 아미노산 2-29; 서열식별번호: 43의 아미노산 5-29; 서열식별번호: 43의 아미노산 8-29; 또는 서열식별번호: 43의 아미노산 10-29를 포함할 수 있다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 45의 아미노산 1-35, 서열식별번호: 45의 아미노산 20-35, 또는 서열식별번호: 45를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 포자외막 리더 WP016117717 (서열식별번호: 46)을 포함할 수 있다. 비. 세레우스 포자외막 리더 WP016117717의 아미노산 20-35에 연결된 메티오닌 잔기는 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 106을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 45의 아미노산 2-35; 서열식별번호: 45의 아미노산 5-35; 서열식별번호: 45의 아미노산 8-35; 서열식별번호: 45의 아미노산 10-35; 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 15-35를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 47의 아미노산 1-43, 서열식별번호: 47의 아미노산 28-43, 또는 서열식별번호: 47을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 포자외막 펩티드 WP002105192 (서열식별번호: 48)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 47의 아미노산 2-43; 서열식별번호: 47의 아미노산 5-43; 서열식별번호: 47의 아미노산 8-43; 서열식별번호: 47의 아미노산 10-43; 서열식별번호: 47의 아미노산 15-43; 서열식별번호: 47의 아미노산 20-43; 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 25-43을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 49의 아미노산 1-32, 서열식별번호: 49의 아미노산 17-32, 또는 서열식별번호: 49를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 가설 단백질 WP87353 (서열식별번호: 50)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 49의 아미노산 2-32; 서열식별번호: 49의 아미노산 5-32; 서열식별번호: 49의 아미노산 8-32; 서열식별번호: 49의 아미노산 10-32; 또는 서열식별번호: 49의 아미노산 15-32를 포함할 수 있다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 51의 아미노산 1-33, 서열식별번호: 51의 아미노산 18-33, 또는 서열식별번호: 51을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 포자외막 펩티드 02112369 (서열식별번호: 52)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 51의 아미노산 2-33; 서열식별번호: 51의 아미노산 5-33; 서열식별번호: 51의 아미노산 8-33; 서열식별번호: 51의 아미노산 10-33; 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 15-33을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 53의 아미노산 1-33, 서열식별번호: 53의 아미노산 18-33, 또는 서열식별번호: 53을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 포자외막 단백질 WP016099770 (서열식별번호: 54)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 53의 아미노산 2-33; 서열식별번호: 53의 아미노산 5-33; 서열식별번호: 53의 아미노산 8-33; 서열식별번호: 53의 아미노산 10-33; 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 15-33을 포함할 수 있다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 55의 산 1-30, 서열식별번호: 55의 아미노산 15-30, 또는 서열식별번호: 55를 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 투린기엔시스 가설 단백질 YP006612525 (서열식별번호: 56)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 55의 아미노산 2-30; 서열식별번호: 55의 아미노산 5-30; 서열식별번호: 55의 아미노산 8-30; 또는 서열식별번호: 55의 아미노산 10-30을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 57의 아미노산 1-130, 서열식별번호: 57의 아미노산 115-130, 또는 서열식별번호: 57을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 미코이데스 가설 단백질 TIGR03720 (서열식별번호: 58)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 57의 아미노산 2-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 5-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 10-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 20-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 30-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 40-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 50-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 60-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 70-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 80-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 90-130; 서열식별번호: 57의 아미노산 100-130; 또는 서열식별번호: 57의 아미노산 110-130을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 59의 아미노산 1-30; 또는 서열식별번호: 59를 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 ATCC 10987 콜라겐 삼중 나선 반복 도메인 단백질 (서열식별번호: 60)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 59의 아미노산 2-30; 서열식별번호: 59의 아미노산 4-30; 또는 서열식별번호: 59의 아미노산 6-30을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 61의 아미노산 1-33; 서열식별번호: 61의 아미노산 18-33; 또는 서열식별번호: 61을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 E33L 콜라겐-유사 단백질 (서열식별번호: 62)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 61의 아미노산 2-33; 서열식별번호: 61의 아미노산 5-33; 서열식별번호: 61의 아미노산 10-33; 또는 서열식별번호: 61의 아미노산 15-33을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 63의 아미노산 1-35; 또는 서열식별번호: 63을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐 (서열식별번호: 64)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 63의 아미노산 2-35; 서열식별번호: 63의 아미노산 5-35; 서열식별번호: 63의 아미노산 8-35; 서열식별번호: 63의 아미노산 10-35; 또는 서열식별번호: 63의 아미노산 15-35를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 65의 아미노산 1-24; 서열식별번호: 65의 산 9-24; 서열식별번호: 65; 또는 서열식별번호: 107을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 투린기엔시스 균주 알 하캄 가설 단백질 BALH_2230 (서열식별번호: 66)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 65의 아미노산 2-24; 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 5-24를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 67의 산 1-27; 서열식별번호: 67의 아미노산 12-27; 또는 서열식별번호: 67을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐 (서열식별번호: 68)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 67의 아미노산 2-27; 서열식별번호: 67의 아미노산 5-27; 또는 서열식별번호: 67의 아미노산 10-27을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 69의 아미노산 1-38; 서열식별번호: 69의 아미노산 23-38; 또는 서열식별번호: 69를 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 콜라겐 삼중 나선 반복부 (서열식별번호: 70)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 69의 아미노산 2-38; 서열식별번호: 69의 아미노산 5-38; 서열식별번호: 69의 아미노산 10-38; 또는 서열식별번호: 69의 아미노산 15-38을 포함할 수 있다.
포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐 (서열식별번호: 72)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 73을 포함할 수 있거나, 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 E33L 가설 단백질 BCZK1835 (서열식별번호: 74)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 75의 아미노산 1-42; 서열식별번호: 75의 아미노산 27-42; 또는 서열식별번호: 75를 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐 (서열식별번호: 76)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 75의 아미노산 2-42; 서열식별번호: 75의 아미노산 5-42; 서열식별번호: 75의 아미노산 10-42; 서열식별번호: 75의 아미노산 15-42; 서열식별번호: 75의 아미노산 20-42; 또는 서열식별번호: 75의 아미노산 25-42를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 77의 아미노산 1-24; 서열식별번호: 77의 아미노산 9-24; 또는 서열식별번호: 77을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐 (서열식별번호: 78)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 77의 아미노산 2-24; 또는 서열식별번호: 77의 아미노산 5-24를 포함할 수 있다.
포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 ATCC 14579 가설 단백질 BC4725 (서열식별번호: 80)를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 81의 아미노산 1-38; 서열식별번호: 81의 아미노산 23-38; 또는 서열식별번호: 81을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 E33L 가설 단백질 BCZK4476 (서열식별번호: 82)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 81의 아미노산 2-38; 서열식별번호: 81의 산 5-38; 서열식별번호: 81의 아미노산 10-38; 서열식별번호: 81의 아미노산 15-38; 또는 서열식별번호: 81의 아미노산 20-38을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 83의 아미노산 1-34; 또는 서열식별번호: 83을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 안트라시스 균주 '에임스 안세스터' 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐 (서열식별번호: 84)을 포함할 수 있다.
포자외막 단백질은 전장 비. 투린기엔시스 혈청형 콘쿠키안 균주 97-27 BclA 단백질 (서열식별번호: 86)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 87의 아미노산 1-28; 서열식별번호: 87의 아미노산 13-28; 또는 서열식별번호: 87을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 ATCC 10987 보존된 가설 단백질 (서열식별번호: 88)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 87의 아미노산 2-28; 서열식별번호: 87의 아미노산 5-28; 또는 서열식별번호: 87의 아미노산 10-28을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 89의 아미노산 1-28; 또는 서열식별번호: 89를 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 전장 비. 세레우스 ATCC 14579 삼중 나선 반복부-함유 콜라겐 (서열식별번호: 90)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 89의 아미노산 2-28; 서열식별번호: 89의 아미노산 5-28; 또는 서열식별번호: 89의 아미노산 10-28을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 91의 아미노산 1-93; 또는 서열식별번호: 91을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 비. 세레우스 포자외막 리더 펩티드 부분 서열 (서열식별번호: 92)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 91의 아미노산 2-93; 서열식별번호: 91의 아미노산 10-93; 서열식별번호: 91의 아미노산 20-93; 서열식별번호: 91의 아미노산 30-93; 서열식별번호: 91의 아미노산 40-93; 서열식별번호: 91의 아미노산 50-93; 또는 서열식별번호: 91의 아미노산 60-93을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 93의 아미노산 1-130; 또는 서열식별번호: 93을 포함할 수 있거나; 포자외막 단백질은 비. 웨이헨스테파넨시스) 가설 단백질 ER45_27600, 부분 서열 (서열식별번호: 94)을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 93의 아미노산 2-130; 서열식별번호: 93의 아미노산 10-130; 서열식별번호: 93의 아미노산 20-130; 또는 서열식별번호: 93의 아미노산 30-130을 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 204의 아미노산 1-35, 서열식별번호: 204의 아미노산 20-35, 서열식별번호: 204, 또는 서열식별번호: 205를 포함할 수 있다.
표적화 서열은 서열식별번호: 206의 아미노산 1-35, 서열식별번호: 206의 아미노산 20-35, 서열식별번호: 206, 또는 서열식별번호: 207을 포함할 수 있다.
더욱이, BclA의 아미노산 20-35보다 더 짧은 서열은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 특히, BclA의 아미노산 20-33, BclA의 아미노산 20-31, BclA의 아미노산 21-33, 또는 BclA의 아미노산 23-31은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-33, 서열식별번호: 1의 아미노산 20-31, 서열식별번호: 1의 아미노산 21-33, 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 23-31로 이루어질 수 있다. 도 1a 및 1b에 나타내어진 임의의 서열식별번호의 상응하는 영역은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다. "상응하는 영역"이란, 서열이 서열식별번호: 1과 정렬되는 경우, 도 1a 및 1b에 나타내어진 바와 같이, 서열식별번호:의 아미노산과 정렬되는 다른 아미노산 서열의 영역이 그들 서열의 "상응하는 영역"임을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 12-25, 서열식별번호: 5의 아미노산 23-36, 서열식별번호: 7의 아미노산 13-26 등은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있는데, 이는 이들 영역이 도 1a에 나타내어진 바와 같이 서열식별번호: 1의 아미노산 20-33과 정렬되기 때문이다.
BclA의 아미노산 20-35 내의 훨씬 더 짧은 영역은 또한 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다. 특히, 서열식별번호: 1의 아미노산 25-30 또는 도 1a 및 1b에 나타내어진 임의의 서열로부터의 상응하는 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 서열식별번호: 1의 아미노산 25-30 또는 도 1a 및 1b에 나타내어진 임의의 서열의 상응하는 영역으로 시작하여, 추가의 아미노산이 아미노-말단, 카르복시 말단, 또는 아미노- 및 카르복시 말단 둘 다에 첨가되어 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 효과적일 표적화 서열을 생성할 수 있음을 인식할 것이다.
추가로, BclA의 아미노산 20-35는 보존되고, 아미노산 25-35는 보다 보존되지만, 일부 정도의 변이는 단백질을 포자외막에 표적화하는 표적화 서열의 능력에 영향을 미치지 않으면서 이 영역에서 일어날 수 있음을 '661 공보의 도 1a 및 1b에서의 서열 정렬로부터 용이하게 볼 수 있다. '661 공보의 도 1a 및 1b는 BclA의 아미노산 20-35에 대한 ("20-35% 동일성") 및 BclA의 아미노산 25-35에 대한 ("25-35 % 동일성") 각각의 서열의 각각의 상응하는 아미노산의 퍼센트 동일성을 열거한다. 따라서, 예를 들어, BclA의 아미노산 20-35와 비교하여, BetA/BAS3290의 상응하는 아미노산은 약 81.3% 동일하고, BAS4623의 상응하는 아미노산은 약 50.0% 동일하고, BclB의 상응하는 아미노산은 약 43.8% 동일하고, BAS1882의 상응하는 아미노산은 약 62.5% 동일하고, KBAB4 2280 유전자 생성물의 상응하는 아미노산은 약 81.3% 동일하고, KBAB4 3572 유전자 생성물의 상응하는 아미노산은 약 81.3% 동일하다. 나머지 서열에 대한 이 영역에 비한 서열 동일성은 도 1a 및 1b에 열거되어 있다.
BclA의 아미노산 25-35에 관하여, BetA/BAS3290의 상응하는 아미노산은 약 90.9% 동일하고, BAS4623의 상응하는 아미노산은 약 72.7% 동일하고, BclB의 상응하는 아미노산은 약 54.5% 동일하고, BAS1882의 상응하는 아미노산은 약 72.7% 동일하고, KBAB4 2280 유전자 생성물의 상응하는 아미노산은 약 90.9% 동일하고, KBAB4 3572 유전자 생성물의 상응하는 아미노산은 약 81.8% 동일하다. 나머지 서열에 대한 이 영역에 비한 서열 동일성은 도 1a 및 1b에 열거되어 있다.
따라서, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 43%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 54%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 43%인 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 54%이다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 50%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 63%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 50%인 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 63%이다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 50%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 50%인 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 56%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 63%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 56%인 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 63%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 62%인 아미노 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 62%인 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 서열식별번호: 1의 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 68%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 68%인 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 75%인 아미노 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 75%인 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 서열식별번호: 1의 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 75%인 아미노 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 75%인 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 서열식별번호: 1의 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
표적화 서열은 또한 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 81%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 81%인 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 81%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 90%이다. 대안적으로, 표적화 서열은 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 81%인 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 90%이다.
통상의 기술자는 표적화 서열이 BclA의 아미노산 20-35, BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882, KBAB4 2280 유전자 생성물, 또는 KBAB 3572 유전자 생성물의 상응하는 아미노산을 포함하거나, BclA의 아미노산 20-35 및 25-35에 대한 임의의 상기 언급된 서열 동일성을 포함하는 서열이 존재하는 한, 상기 서열의 변이체가 또한 표적화 서열로서 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
BclA의 아미노산 25-35에 대해 상동성을 갖는 영역이 결여된 특정 바실루스 세레우스 패밀리 포자외막 단백질은 또한 펩티드 또는 단백질을 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다. 특히, 융합 단백질은 서열식별번호: 108을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 미코이데스 InhA), 서열식별번호: 109를 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 스턴 BAS1141 (ExsY)), 서열식별번호: 110을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 스턴 BAS1144 (BxpB/ExsFA)), 서열식별번호: 111을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 스턴 BAS1145 (CotY)), 서열식별번호: 112를 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 스턴 BAS1140), 서열식별번호: 113을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 H9401 ExsFB), 서열식별번호: 114를 포함하는 포자외막 단백질 (비. 투린기엔시스 HD74 InhA1), 서열식별번호: 115를 포함하는 포자외막 단백질 (비. 세레우스 ATCC 10876 ExsJ), 서열식별번호: 116을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 세레우스 ExsH), 서열식별번호: 117을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 Ames YjcA), 서열식별번호: 118을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 YjcB), 서열식별번호: 119를 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 스턴 BclC), 서열식별번호: 120을 포함하는 포자외막 단백질 (바실루스 투린기엔시스 혈청형 콘쿠키안 균주 97-27 산 포스파타제), 서열식별번호: 121을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 투린기엔시스 HD74 InhA2), 서열식별번호: 122를 포함하는 포자외막 단백질 (비. 미코이데스 InhA3), 또는 서열식별번호: 203을 포함하는 포자외막 단백질 (비. 안트라시스 CotY 변이체)을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질에서 임의의 서열식별번호: 108-122 또는 203을 포함하는 포자외막 단백질의 포함은 비. 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에의 표적화를 일으킬 것이다.
더욱이, 상기 기재된 임의의 전장 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편과 높은 정도의 서열 동일성을 갖는 포자외막 단백질은 또한 펩티드 또는 단백질을 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 및 203 중 어느 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
대안적으로, 융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 및 203 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 및 203 중 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 및 203 중 어느 하나와 적어도 98% 동일성을 갖는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 및 203 중 어느 하나와 적어도 99% 동일성을 갖는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 및 203 중 어느 하나와 100% 동일성을 갖는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편은 또한 표적화 기능을 제공하는 모티프의 관점에서 기재될 수 있다. 도 1a 및 1b는 다수의 다른 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자외막 단백질의 상응하는 아미노-말단 영역과 BclA의 아미노-말단 영역 (서열식별번호: 1)의 서열 정렬을 나타낸다. 도 1로부터 볼 수 있는 바와 같이, BclA의 아미노산 20-35에 보존된 모티프 (도 1에서 볼드체로 나타내어짐)와, BclA의 아미노산 25-35에 보다 고도로 보존된 모티프 (도 1에서 볼드체 및 밑줄쳐서 나타내어짐)가 있다. 이 보다 고도로 보존된 영역은 기재된 포자외막 단백질을 포자외막의 표면 상에 지정하고 어셈블리하는 ExsFA/BxpB/ExsFB 및 동족체에 대한 인식 서열이다.
더욱이, BclA의 아미노산 20-35는 보존되고, 아미노산 25-35는 보다 보존되며, 일부 정도의 변이는 단백질을 포자외막에 표적화하는 표적화 서열의 능력에 영향을 미치지 않으면서 이 영역에서 일어날 수 있다. 도 1은 BclA의 아미노산 20-35에 대한 ("20-35% 동일성") 및 BclA의 아미노산 25-35에 대한 ("25-35 % 동일성") 각각의 서열의 상응하는 아미노산의 퍼센트 동일성을 열거한다. BclA의 아미노산 20-35 (서열식별번호: 1)과 43.8%만큼 낮은 표적화 서열 동일성을 갖는 서열 (여기서 BclA의 아미노산 25-35와의 동일성은 54.5%임)은 융합 단백질을 포자외막에 표적화하는 능력을 보유한다. 데이터는 PCT 공개 번호 WO 2016/044661 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 59 중의 표 58에 제공된다. 표 58은 이들 효소 및 다양한 표적화 서열을 함유하는 융합 단백질을 발현하는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자 상의 포스파티딜콜린-특이적 포스포리파제 C 유전자 (PC-PLC) 및 리파제의 효소 수준을 나타낸다. PCT 공개 번호 WO 2016/044661의 표 58의 관련 부분은 하기에 재현되며, 추가된 2개의 추가의 칼럼은 BclA의 아미노산 20-35 및 25-35 (서열식별번호: 1)와의 각각의 표적화 서열의 퍼센트 동일성을 나타낸다.
Figure pct00007
이들 데이터는 포자외막 단백질에의 관심의 단백질 (예를 들어, 효소)의 표적화가 BclA의 아미노산 20-35 (서열식별번호: 1)에 대해 50-68.8% 동일성을 갖는 표적화 서열을 사용하여 달성될 수 있고, 여기서 BclA의 아미노산 25-35에 대한 동일성은 63.6% 내지 81.8%임을 나타낸다. 이러한 모티프는 융합 단백질을 재조합 바실루스 박테리아의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편에 존재하고, 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16을 포함하며, 여기서
X1은 임의의 아미노산이거나 부재하고;
X2는 페닐알라닌 (F), 류신 (L), 이소류신 (I), 또는 메티오닌 (M)이고;
X3은 임의의 아미노산이고;
X4는 프롤린 (P) 또는 세린 (S)이고;
X5는 임의의 아미노산이고;
X6은 류신 (L), 아스파라긴 (N), 세린 (S), 또는 이소류신 (I)이고;
X7은 발린 (V) 또는 이소류신 (I)이고;
X8은 글리신 (G)이고;
X9는 프롤린 (P)이고;
X10은 트레오닌 (T) 또는 프롤린 (P)이고;
X11은 류신 (L) 또는 페닐알라닌 (F)이고;
X12는 프롤린 (P)이고;
X13은 임의의 아미노산이고;
X14는 임의의 아미노산이고;
X15는 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 또는 트레오닌 (T)이고;
X16은 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 세린 (S)이다.
임의의 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 본원에 기재된 세린 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 포함한 관심의 임의의 단백질 또는 펩티드를 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 임의의 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편 (예를 들어, 임의의 서열식별번호: 203-207)은 관심의 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 210, 211, 또는 212의 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소)를 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자형성 동안, 표적화 모티프, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 포자 포자외막 어셈블리 기구에 의해 인식되고 포자외막에 지정되어, 포자 외부에서 융합 단백질 (예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소)의 관심의 부분의 단백질 또는 펩티드의 제시를 일으킨다.
상이한 표적화 서열의 사용은 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자의 표면 상의 융합 단백질의 발현 수준의 제어를 허용한다. 본원에 기재된 특정 표적화 서열의 사용은 보다 높은 수준의 융합 단백질의 발현을 일으킬 것인 반면, 다른 표적화 서열의 사용은 포자의 표면 상의 보다 낮은 수준의 융합 단백질의 발현을 일으킬 것이다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 그의 카르복시 말단에 아미노산 서열 GXT를 포함할 수 있고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 20에 상응하는 표적화 서열의 위치에 알라닌 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편의 제1 아미노산의 바로 앞의 아미노산 위치에 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 20에 상응하는 표적화 서열의 위치에 메티오닌, 세린, 또는 트레오닌 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
B. 세린 프로테아제 단백질
융합 단백질은 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 포함할 수 있다.
세린 프로테아제는 프로테아제의 가장 크고 가장 폭넓게 분포된 부류 중 하나이다. 세린 프로테아제는 단백질 중의 특이적 인식 부위 내의 세린 잔기에서 펩티드 결합을 절단한다. 이들 프로테아제는 환경에서 영양분 스캐빈징을 위해 박테리아에서 빈번히 사용된다. 세린 프로테아제는 또한 선충에서 장 조직의 소화를 통해 살선충 활성을 나타내는 것으로 나타났다. 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 및 대두 포낭 선충에 대한 살선충 활성을 나타내는 바실루스 피르무스 균주 DS-1의 연구는 그 균주에 의해 생산된 세린 프로테아제가 세린 프로테아제 활성을 가지며 선충의 장 조직을 분해함을 밝혀내었다. 문헌 [Geng, C., et al., "A Novel Serine Protease, Sep1, from Bacillus firmus DS-1 Has Nematicidal Activity and Degrades Multiple Intestinal-Associated Nematode Proteins", Scientific Reports, 2016, vol. 6, no. 25012].
다른 연구는 세린 프로테아제가 병원체, 예컨대 진균 식물 병원체 및 난균, 예컨대 피티움(Pythium)에 대한 활성을 가짐을 나타내었다. 문헌 [Dunne et al., "Overproduction of an Inducible Extracellular Serine Protease Improves Biological Control of Pythium ultimum by Stenotrophomonas maltophilia strain W81," Microbiology, 2000, vol. 146, pp. 2069-2078, 및 Yen, Y., et al., "An Antifungal Protease Produced by Pseudomonas aeruginosa M-1001 with Shrimp and Crab Shell Powder as a Carbon Source," Enzyme and Microbial Technology, 2006, vol. 39, pp. 311-317]을 참조한다.
표 2에서, 서열식별번호: 210-212는 세린 프로테아제 활성을 나타내거나 나타낼 것으로 예측되는 야생형 효소 및 변이체 효소에 대한 아미노산 서열이다. 따라서, 예를 들어, 서열식별번호: 210 및 211은 2가지 상이한 바실루스 피르무스 균주로부터의 야생형 세린 프로테아제 효소에 대한 아미노산 서열을 제공하고, 98% 서열 유사성을 갖는다. 서열식별번호: 212는 서열식별번호: 210의 아미노산 181-240의 결실을 제외하고는 서열식별번호: 210에서와 동일한 효소에 대한 아미노산 서열을 제공하고, 서열식별번호: 210 및 212는 81% 서열 유사성을 갖는다. 상기 문헌 [Geng, et al., 2016]에 언급된 촉매 잔기는 서열식별번호: 212의 변이체 세린 프로테아제 아미노산 서열에서 유지된다.
표 2. 세린 프로테아제 및 변이체에 대한 아미노산 서열
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신호 펩티드
융합 단백질이 그의 천연 서열이 신호 펩티드를 포함하는 효소를 포함하는 경우, 효소는 신호 펩티드 없이 사용될 수 있다. 대안적으로, 천연 신호 펩티드 (또는 또 다른 신호 펩티드)는 임의로 효소 서열의 제1 아미노산의 바로 앞의 효소의 아미노 말단에 포함될 수 있다.
추가로, 신호 펩티드는 임의로 그의 천연 서열이 신호 펩티드를 포함하지 않는 효소의 아미노 말단에 포함될 수 있다.
C. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 발현을 위한 융합 단백질
융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 융합 단백질은 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 융합 단백질은 (1) 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 43%인 아미노산 서열을 포함하는 표적화 서열 (여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 54%임); (2) 서열식별번호: 1의 아미노산 1-35를 포함하는 표적화 서열; (3) 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35를 포함하는 표적화 서열; (4) 서열식별번호: 1을 포함하는 표적화 서열; (5) 서열식별번호: 2와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (6) 서열식별번호: 1의 아미노산 2-35를 포함하는 표적화 서열; (7) 서열식별번호: 1의 아미노산 5-35를 포함하는 표적화 서열; (8) 서열식별번호: 1의 아미노산 8-35를 포함하는 표적화 서열; (9) 서열식별번호: 1의 아미노산 10-35를 포함하는 표적화 서열; (10) 서열식별번호: 1의 아미노산 15-35를 포함하는 표적화 서열; (11) 서열식별번호: 3의 아미노산 1-27을 포함하는 표적화 서열; (12) 서열식별번호: 3의 아미노산 12-27을 포함하는 표적화 서열; (13) 서열식별번호: 3을 포함하는 표적화 서열; (14) 서열식별번호: 4와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (15) 서열식별번호: 3의 아미노산 2-27을 포함하는 표적화 서열; (16) 서열식별번호: 3의 아미노산 5-27을 포함하는 표적화 서열; (17) 서열식별번호: 3의 아미노산 8-27을 포함하는 표적화 서열; (18) 서열식별번호: 3의 아미노산 10-27을 포함하는 표적화 서열; (19) 서열식별번호: 5의 아미노산 1-38을 포함하는 표적화 서열; (20) 서열식별번호: 5의 아미노산 23-38을 포함하는 표적화 서열; (21) 서열식별번호: 5를 포함하는 표적화 서열; (22) 서열식별번호: 6과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (23) 서열식별번호: 5의 아미노산 2-38을 포함하는 표적화 서열; (24) 서열식별번호: 5의 아미노산 5-38을 포함하는 표적화 서열; (25) 서열식별번호: 5의 아미노산 8-38을 포함하는 표적화 서열; (26) 서열식별번호: 5의 아미노산 10-38을 포함하는 표적화 서열; (27) 서열식별번호: 5의 아미노산 15-38을 포함하는 표적화 서열; (28) 서열식별번호: 5의 아미노산 20-38을 포함하는 표적화 서열; (29) 서열식별번호: 7의 아미노산 1-28을 포함하는 표적화 서열; (30) 서열식별번호: 7의 아미노산 13-28을 포함하는 표적화 서열; (31) 서열식별번호: 7을 포함하는 표적화 서열; (32) 서열식별번호: 8과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (33) 서열식별번호: 7의 아미노산 2-28을 포함하는 표적화 서열; (34) 서열식별번호: 7의 아미노산 5-28을 포함하는 표적화 서열; (35) 서열식별번호: 7의 아미노산 8-28을 포함하는 표적화 서열; (36) 서열식별번호: 7의 아미노산 10-28을 포함하는 표적화 서열; (37) 서열식별번호: 9의 아미노산 1-24를 포함하는 표적화 서열; (38) 서열식별번호: 9의 아미노산 9-24를 포함하는 표적화 서열; (39) 서열식별번호: 9를 포함하는 표적화 서열; (40) 서열식별번호: 10과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (41) 서열식별번호: 9의 아미노산 2-24를 포함하는 표적화 서열; (42) 서열식별번호: 9의 아미노산 5-24를 포함하는 표적화 서열; (43) 서열식별번호: 9의 아미노산 8-24를 포함하는 표적화 서열; (44) 서열식별번호: 11의 아미노산 1-33을 포함하는 표적화 서열; (45) 서열식별번호: 11의 아미노산 18-33을 포함하는 표적화 서열; (46) 서열식별번호: 11을 포함하는 표적화 서열; (47) 서열식별번호: 12와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (48) 서열식별번호: 11의 아미노산 2-33을 포함하는 표적화 서열; 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(73) 서열식별번호: 17의 아미노산 1-27을 포함하는 표적화 서열; (74) 서열식별번호: 17의 아미노산 12-27을 포함하는 표적화 서열; (75) 서열식별번호: 17을 포함하는 표적화 서열; (76) 서열식별번호: 18과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (77) 서열식별번호: 17의 아미노산 2-27을 포함하는 표적화 서열; (78) 서열식별번호: 17의 아미노산 5-27을 포함하는 표적화 서열; (79) 서열식별번호: 17의 아미노산 8-27을 포함하는 표적화 서열; (80) 서열식별번호: 17의 아미노산 10-27을 포함하는 표적화 서열; (81) 서열식별번호: 19의 아미노산 1-33을 포함하는 표적화 서열; (82) 서열식별번호: 19의 아미노산 18-33을 포함하는 표적화 서열; (83) 서열식별번호: 19를 포함하는 표적화 서열; (84) 서열식별번호: 20과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (85) 서열식별번호: 19의 아미노산 2-33을 포함하는 표적화 서열; (86) 서열식별번호: 19의 아미노산 5-33을 포함하는 표적화 서열; (87) 서열식별번호: 19의 아미노산 8-33을 포함하는 표적화 서열; (88) 서열식별번호: 19의 아미노산 10-33을 포함하는 표적화 서열; (89) 서열식별번호: 19의 아미노산 15-33을 포함하는 표적화 서열; (90) 서열식별번호: 21의 아미노산 1-33을 포함하는 표적화 서열; (91) 서열식별번호: 21의 아미노산 18-33을 포함하는 표적화 서열; (92) 서열식별번호: 21을 포함하는 표적화 서열; (93) 서열식별번호: 22와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (94) 서열식별번호: 21의 아미노산 2-33을 포함하는 표적화 서열; (95) 서열식별번호: 21의 아미노산 5-33을 포함하는 표적화 서열; (96) 서열식별번호: 21의 아미노산 8-33을 포함하는 표적화 서열; (97) 서열식별번호: 21의 아미노산 10-33을 포함하는 표적화 서열; (98) 서열식별번호: 21의 아미노산 15-33을 포함하는 표적화 서열; (99) 서열식별번호: 23의 아미노산 1-24를 포함하는 표적화 서열; (100) 서열식별번호: 23의 아미노산 9-24를 포함하는 표적화 서열; (101) 서열식별번호: 23을 포함하는 표적화 서열; (102) 서열식별번호: 24와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (103) 서열식별번호: 23의 아미노산 2-24를 포함하는 표적화 서열; (104) 서열식별번호: 23의 아미노산 5-24를 포함하는 표적화 서열; (105) 서열식별번호: 23의 아미노산 8-24를 포함하는 표적화 서열; (106) 서열식별번호: 25의 아미노산 1-24를 포함하는 표적화 서열; (107) 서열식별번호: 25의 아미노산 9-24를 포함하는 표적화 서열; (108) 서열식별번호: 25를 포함하는 표적화 서열; (109) 서열식별번호: 26과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (110) 서열식별번호: 25의 아미노산 2-24를 포함하는 표적화 서열; (111) 서열식별번호: 25의 아미노산 5-24를 포함하는 표적화 서열; (112) 서열식별번호: 25의 아미노산 8-24를 포함하는 표적화 서열; (113) 서열식별번호: 27의 아미노산 1-30을 포함하는 표적화 서열; (114) 서열식별번호: 27의 아미노산 15-30을 포함하는 표적화 서열; (115) 서열식별번호: 27을 포함하는 표적화 서열; (116) 서열식별번호: 28과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (117) 서열식별번호: 27의 아미노산 2-30을 포함하는 표적화 서열; (118) 서열식별번호: 27의 아미노산 5-30을 포함하는 표적화 서열; (119) 서열식별번호: 27의 아미노산 8-30을 포함하는 표적화 서열; (120) 서열식별번호: 27의 아미노산 10-30을 포함하는 표적화 서열; 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(145) 서열식별번호: 43을 포함하는 표적화 서열; (146) 서열식별번호: 44와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (147) 서열식별번호: 43의 아미노산 2-29를 포함하는 표적화 서열; (148) 서열식별번호: 43의 아미노산 5-29를 포함하는 표적화 서열; (149) 서열식별번호: 43의 아미노산 8-29를 포함하는 표적화 서열; (150) 서열식별번호: 43의 아미노산 10-29를 포함하는 표적화 서열; (151) 서열식별번호: 45의 아미노산 1-35를 포함하는 표적화 서열; (152) 서열식별번호: 45의 아미노산 20-35를 포함하는 표적화 서열; (153) 서열식별번호: 45를 포함하는 표적화 서열; (154) 서열식별번호: 46과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (155) 서열식별번호: 45의 아미노산 2-35를 포함하는 표적화 서열; (156) 서열식별번호: 45의 아미노산 5-35를 포함하는 표적화 서열; (157) 서열식별번호: 45의 아미노산 8-35를 포함하는 표적화 서열; (158) 서열식별번호: 45의 아미노산 10-35를 포함하는 표적화 서열; (159) 서열식별번호: 45의 아미노산 15-35를 포함하는 표적화 서열; (160) 서열식별번호: 47의 아미노산 1-43을 포함하는 표적화 서열; (161) 서열식별번호: 47의 아미노산 28-43을 포함하는 표적화 서열; (162) 서열식별번호: 47을 포함하는 표적화 서열; (163) 서열식별번호: 48과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (164) 서열식별번호: 47의 아미노산 2-43을 포함하는 표적화 서열; (165) 서열식별번호: 47의 아미노산 5-43을 포함하는 표적화 서열; (166) 서열식별번호: 47의 아미노산 8-43을 포함하는 표적화 서열; (167) 서열식별번호: 47의 아미노산 10-43을 포함하는 표적화 서열; (168) 서열식별번호: 47의 아미노산 15-43을 포함하는 표적화 서열; 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(310) 서열식별번호: 75의 아미노산 20-42를 포함하는 표적화 서열; (311) 서열식별번호: 75의 아미노산 25-42를 포함하는 표적화 서열; (312) 서열식별번호: 77의 아미노산 1-24를 포함하는 표적화 서열; (313) 서열식별번호: 77의 아미노산 9-24를 포함하는 표적화 서열; (314) 서열식별번호: 77을 포함하는 표적화 서열; (315) 서열식별번호: 78과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (316) 서열식별번호: 77의 아미노산 2-24를 포함하는 표적화 서열; (317) 서열식별번호: 77의 아미노산 5-24를 포함하는 표적화 서열; (318) 서열식별번호: 80과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (319) 서열식별번호: 81의 아미노산 1-38을 포함하는 표적화 서열; (320) 서열식별번호: 81의 아미노산 23-38을 포함하는 표적화 서열; (321) 서열식별번호: 81을 포함하는 표적화 서열; (322) 서열식별번호: 82와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (323) 서열식별번호: 81의 아미노산 2-38을 포함하는 표적화 서열; (324) 서열식별번호: 81의 아미노산 5-38을 포함하는 표적화 서열; (325) 서열식별번호: 81의 아미노산 10-38을 포함하는 표적화 서열; (326) 서열식별번호: 81의 아미노산 15-38을 포함하는 표적화 서열; (327) 서열식별번호: 81의 아미노산 20-38을 포함하는 표적화 서열; (328) 서열식별번호: 83의 아미노산 1-34를 포함하는 표적화 서열; (329) 서열식별번호: 83을 포함하는 표적화 서열; (330) 서열식별번호: 84와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (331) 서열식별번호: 86과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (332) 서열식별번호: 87의 아미노산 1-28을 포함하는 표적화 서열; (333) 서열식별번호: 87의 아미노산 13-28을 포함하는 표적화 서열; (334) 서열식별번호: 87을 포함하는 표적화 서열; (335) 서열식별번호: 88과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (336) 서열식별번호: 87의 아미노산 2-28을 포함하는 표적화 서열; (337) 서열식별번호: 87의 아미노산 5-28을 포함하는 표적화 서열; (338) 서열식별번호: 87의 아미노산 10-28을 포함하는 표적화 서열; (339) 서열식별번호: 89의 아미노산 1-28을 포함하는 표적화 서열; (340) 서열식별번호: 89를 포함하는 표적화 서열; (341) 서열식별번호: 90과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (342) 서열식별번호: 89의 아미노산 2-28을 포함하는 표적화 서열; (343) 서열식별번호: 89의 아미노산 5-28을 포함하는 표적화 서열; (344) 서열식별번호: 89의 아미노산 10-28을 포함하는 표적화 서열; (345) 서열식별번호: 91의 아미노산 1-93을 포함하는 표적화 서열; (346) 서열식별번호: 91을 포함하는 표적화 서열; (347) 서열식별번호: 92와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (348) 서열식별번호: 91의 아미노산 2-93을 포함하는 표적화 서열; (349) 서열식별번호: 91의 아미노산 10-93을 포함하는 표적화 서열; (350) 서열식별번호: 91의 아미노산 20-93을 포함하는 표적화 서열; (351) 서열식별번호: 91의 아미노산 30-93을 포함하는 표적화 서열; (352) 서열식별번호: 91의 아미노산 40-93을 포함하는 표적화 서열; (353) 서열식별번호: 91의 아미노산 50-93을 포함하는 표적화 서열; (354) 서열식별번호: 91의 아미노산 60-93을 포함하는 표적화 서열; (355) 서열식별번호: 93의 아미노산 1-130을 포함하는 표적화 서열; (356) 서열식별번호: 93을 포함하는 표적화 서열; (357) 서열식별번호: 94와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (358) 서열식별번호: 93의 아미노산 2-130을 포함하는 표적화 서열; (359) 서열식별번호: 93의 아미노산 10-130을 포함하는 표적화 서열; (360) 서열식별번호: 93의 아미노산 20-130을 포함하는 표적화 서열; (361) 서열식별번호: 93의 아미노산 30-130을 포함하는 표적화 서열; (362) 서열식별번호: 122와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (363) 서열식별번호: 1의 아미노산 20-33으로 이루어진 표적화 서열; (364) 서열식별번호: 1의 아미노산 21-33으로 이루어진 표적화 서열; (365) 서열식별번호: 1의 아미노산 23-31로 이루어진 표적화 서열; (366) 서열식별번호: 96의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (367) 서열식별번호: 96의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (368) 서열식별번호: 3의 아미노산 12-25로 이루어진 표적화 서열; (369) 서열식별번호: 3의 아미노산 13-25로 이루어진 표적화 서열; (370) 서열식별번호: 3의 아미노산 15-23으로 이루어진 표적화 서열; (371) 서열식별번호: 97의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (372) 서열식별번호: 98의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (373) 서열식별번호: 5의 아미노산 23-36으로 이루어진 표적화 서열; (374) 서열식별번호: 5의 아미노산 23-34로 이루어진 표적화 서열; (375) 서열식별번호: 5의 아미노산 24-36으로 이루어진 표적화 서열; (376) 서열식별번호: 5의 아미노산 26-34로 이루어진 표적화 서열; (377) 서열식별번호: 7의 아미노산 13-26으로 이루어진 표적화 서열; (378) 서열식별번호: 7의 아미노산 13-24로 이루어진 표적화 서열; (379) 서열식별번호: 7의 아미노산 14-26으로 이루어진 표적화 서열; (380) 서열식별번호: 7의 아미노산 16-24로 이루어진 표적화 서열; (381) 서열식별번호: 9의 아미노산 9-22로 이루어진 표적화 서열; (382) 서열식별번호: 9의 아미노산 9-20으로 이루어진 표적화 서열; (383) 서열식별번호: 9의 아미노산 10-22로 이루어진 표적화 서열; (384) 서열식별번호: 9의 아미노산 12-20으로 이루어진 표적화 서열; (385) 서열식별번호: 105의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (386) 서열식별번호: 105의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (387) 서열식별번호: 11의 아미노산 18-31로 이루어진 표적화 서열; (388) 서열식별번호: 11의 아미노산 18-29로 이루어진 표적화 서열; (389) 서열식별번호: 11의 아미노산 19-31로 이루어진 표적화 서열; (390) 서열식별번호: 98의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (391) 서열식별번호: 98의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (392) 서열식별번호: 13의 아미노산 18-31로 이루어진 표적화 서열; (393) 서열식별번호: 13의 아미노산 18-29로 이루어진 표적화 서열; (394) 서열식별번호: 13의 아미노산 19-31로 이루어진 표적화 서열; (395) 서열식별번호: 13의 아미노산 21-29로 이루어진 표적화 서열; (396) 서열식별번호: 99의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (397) 서열식별번호: 99의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (398) 서열식별번호: 15의 아미노산 28-41로 이루어진 표적화 서열; (399) 서열식별번호: 15의 아미노산 28-39로 이루어진 표적화 서열; (400) 서열식별번호: 15의 아미노산 29-41로 이루어진 표적화 서열; (401) 서열식별번호: 15의 아미노산 31-39로 이루어진 표적화 서열; (402) 서열식별번호: 17의 아미노산 12-25로 이루어진 표적화 서열; (403) 서열식별번호: 17의 아미노산 13-25로 이루어진 표적화 서열; (404) 서열식별번호: 100의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (405) 서열식별번호: 19의 아미노산 18-31로 이루어진 표적화 서열; (406) 서열식별번호: 19의 아미노산 18-29로 이루어진 표적화 서열; (407) 서열식별번호: 19의 아미노산 19-31로 이루어진 표적화 서열; (408) 서열식별번호: 19의 아미노산 21-29로 이루어진 표적화 서열; (409) 서열식별번호: 21의 아미노산 18-31로 이루어진 표적화 서열; (410) 서열식별번호: 21의 아미노산 18-29로 이루어진 표적화 서열; (411) 서열식별번호: 21의 아미노산 19-31로 이루어진 표적화 서열; (412) 서열식별번호: 21의 아미노산 21-29로 이루어진 표적화 서열; (413) 서열식별번호: 101의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (414) 서열식별번호: 101의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (415) 서열식별번호: 23의 아미노산 9-22로 이루어진 표적화 서열; (416) 서열식별번호: 23의 아미노산 9-20으로 이루어진 표적화 서열; (417) 서열식별번호: 23의 아미노산 10-22로 이루어진 표적화 서열; (418) 서열식별번호: 23의 아미노산 12-20으로 이루어진 표적화 서열; (419) 서열식별번호: 102의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (420) 서열식별번호: 102의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (421) 서열식별번호: 25의 아미노산 9-22로 이루어진 표적화 서열; (422) 서열식별번호: 25의 아미노산 9-20으로 이루어진 표적화 서열; (423) 서열식별번호: 25의 아미노산 10-22로 이루어진 표적화 서열; (424) 서열식별번호: 25의 아미노산 12-20으로 이루어진 표적화 서열; (425) 서열식별번호: 103의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (426) 서열식별번호: 103의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (427) 서열식별번호: 27의 아미노산 15-28로 이루어진 표적화 서열; (428) 서열식별번호: 27의 아미노산 15-26으로 이루어진 표적화 서열; (429) 서열식별번호: 27의 아미노산 16-28로 이루어진 표적화 서열; (430) 서열식별번호: 27의 아미노산 18-26으로 이루어진 표적화 서열; (431) 서열식별번호: 104의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (432) 서열식별번호: 104의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (433) 서열식별번호: 33의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (434) 서열식별번호: 33의 아미노산 1-11로 이루어진 표적화 서열; (435) 서열식별번호: 33의 아미노산 3-11로 이루어진 표적화 서열; (436) 서열식별번호: 35의 아미노산 1-14로 이루어진 표적화 서열; (437) 서열식별번호: 35의 아미노산 1-12로 이루어진 표적화 서열; (438) 서열식별번호: 35의 아미노산 2-14로 이루어진 표적화 서열; (439) 서열식별번호: 43의 아미노산 14-27로 이루어진 표적화 서열; (440) 서열식별번호: 43의 아미노산 14-25로 이루어진 표적화 서열; (441) 서열식별번호: 43의 아미노산 15-27로 이루어진 표적화 서열; (442) 서열식별번호: 45의 아미노산 20-33으로 이루어진 표적화 서열; (443) 서열식별번호: 45의 아미노산 20-31로 이루어진 표적화 서열; (444) 서열식별번호: 45의 아미노산 21-33으로 이루어진 표적화 서열; (445) 서열식별번호: 106의 아미노산 1-15로 이루어진 표적화 서열; (446) 서열식별번호: 106의 아미노산 1-13으로 이루어진 표적화 서열; (447) 서열식별번호: 47의 아미노산 28-41로 이루어진 표적화 서열; (448) 서열식별번호: 47의 아미노산 28-39로 이루어진 표적화 서열; (449) 서열식별번호: 53의 아미노산 18-31로 이루어진 표적화 서열; (450) 서열식별번호: 53의 아미노산 18-29로 이루어진 표적화 서열; (451) 서열식별번호: 53의 아미노산 19-31로 이루어진 표적화 서열; (452) 서열식별번호: 61의 아미노산 18-31을 포함하는 표적화 서열; (453) 서열식별번호: 61의 아미노산 18-29를 포함하는 표적화 서열; (454) 서열식별번호: 61의 아미노산 19-31을 포함하는 표적화 서열; (455) 서열식별번호: 65의 아미노산 9-22를 포함하는 표적화 서열; (456) 서열식별번호: 65의 아미노산 9-20을 포함하는 표적화 서열; (457) 서열식별번호: 65의 아미노산 10-22를 포함하는 표적화 서열; (458) 서열식별번호: 107의 아미노산 1-15를 포함하는 표적화 서열; (459) 서열식별번호: 107의 아미노산 1-13을 포함하는 표적화 서열; (460) 서열식별번호: 67의 아미노산 12-25를 포함하는 표적화 서열; (461) 서열식별번호: 67의 아미노산 12-23을 포함하는 표적화 서열; (462) 서열식별번호: 67의 아미노산 13-25를 포함하는 표적화 서열; (463) 서열식별번호: 67의 아미노산 15-23을 포함하는 표적화 서열; (464) 서열식별번호: 69의 아미노산 23-36을 포함하는 표적화 서열; (465) 서열식별번호: 69의 아미노산 23-34를 포함하는 표적화 서열; (466) 서열식별번호: 69의 아미노산 24-36을 포함하는 표적화 서열; (467) 서열식별번호: 69의 아미노산 26-34를 포함하는 표적화 서열; (468) 서열식별번호: 75의 아미노산 27-40을 포함하는 표적화 서열; (469) 서열식별번호: 75의 아미노산 27-38을 포함하는 표적화 서열; (470) 서열식별번호: 77의 아미노산 9-22를 포함하는 표적화 서열; (471) 서열식별번호: 77의 아미노산 9-20을 포함하는 표적화 서열; (472) 서열식별번호: 77의 아미노산 10-22를 포함하는 표적화 서열; (473) 서열식별번호: 77의 아미노산 12-20을 포함하는 표적화 서열; (474) 서열식별번호: 81의 아미노산 23-36을 포함하는 표적화 서열; (475) 서열식별번호: 81의 아미노산 23-34를 포함하는 표적화 서열; (476) 서열식별번호: 81의 아미노산 24-36을 포함하는 표적화 서열; (477) 서열식별번호: 81의 아미노산 26-34를 포함하는 표적화 서열; (478) 서열식별번호: 87의 아미노산 13-26을 포함하는 표적화 서열; (479) 서열식별번호: 87의 아미노산 13-24를 포함하는 표적화 서열; 또는 (480) 서열식별번호: 87의 아미노산 14-26을 포함하는 표적화 서열; (481) 서열식별번호: 201을 포함하는 표적화 서열; (482) 서열식별번호: 202를 포함하는 표적화 서열; (483) 서열식별번호: 203과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (484) 서열식별번호: 204와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; (485) 서열식별번호: 205와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 단편; (486) 서열식별번호: 206과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질; 또는 (487) 서열식별번호: 207과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 50%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 63%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 50%인 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 63%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 50%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 50%인 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 56%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 63%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 56%인 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 63%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 62%인 아미노 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 62%인 아미노 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 68%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 68%인 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 75%인 아미노 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 75%인 아미노 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 72%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 75%인 아미노 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 75%인 아미노 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 81%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 81%인 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 81%이다.
표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 81%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 90%이다.
대안적으로, 표적화 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 81%인 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 90%이다.
예를 들어, 표적화 서열은 (a) 16개의 아미노산으로 이루어지고 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 43%인 아미노산 서열 (여기서 아미노산 25-35와의 동일성은 적어도 약 54%임); (b) 서열식별번호: 1의 아미노산 1-35; (c) 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35; (d) 서열식별번호: 1; (e) 서열식별번호: 96; 또는 (f) 서열식별번호: 120으로 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 및 121과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 및 121과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 및 121과 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 및 121과 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 및 121과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 또는 122와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 또는 122와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 또는 122와 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 또는 122와 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 또는 122와 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 203-207 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 203-207 중 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 203-207 중 어느 하나와 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 203-207 중 어느 하나와 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 203-207 중 어느 하나와 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 융합 단백질을 재조합 바실루스 박테리아의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함할 수 있고, 여기서 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16을 포함하며, 여기서:
X1은 임의의 아미노산이거나 부재하고;
X2는 페닐알라닌 (F), 류신 (L), 이소류신 (I), 또는 메티오닌 (M)이고;
X3은 임의의 아미노산이고;
X4는 프롤린 (P) 또는 세린 (S)이고;
X5는 임의의 아미노산이고;
X6은 류신 (L), 아스파라긴 (N), 세린 (S), 또는 이소류신 (I)이고;
X7은 발린 (V) 또는 이소류신 (I)이고;
X8은 글리신 (G)이고;
X9는 프롤린 (P)이고;
X10은 트레오닌 (T) 또는 프롤린 (P)이고;
X11은 류신 (L) 또는 페닐알라닌 (F)이고;
X12는 프롤린 (P)이고;
X13은 임의의 아미노산이고;
X14는 임의의 아미노산이고;
X15는 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 또는 트레오닌 (T)이고;
X16은 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 세린 (S)이다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 그의 카르복시 말단에 아미노산 서열 GXT를 포함할 수 있고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 20에 상응하는 표적화 서열의 위치에 알라닌 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편의 제1 아미노산의 바로 앞의 아미노산 위치에 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 20에 상응하는 표적화 서열의 위치에 메티오닌, 세린, 또는 트레오닌 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 포함하는 융합 단백질
융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편 및 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 또한 바실루스 피르무스 세린 프로테아제 효소로도 지칭되는 바실루스 피르무스로부터의 세린 프로테아제를 포함할 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 바실루스 피르무스로부터의 세린 프로테아제는 바실루스 피르무스 균주로부터의 Sep1일 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제는 바실루스 피르무스 DS-1로부터의 Sep1일 수 있으며, 이는 서열식별번호: 210이다. 상기 문헌 [Geng, et al., 2016]을 참조한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제는 또 다른 바실루스 피르무스 균주로부터의 Sep1, 예컨대 서열식별번호: 211일 수 있다.
본원에 기재된 세린 프로테아제 효소에 대해, 서열 동일성은 최소 수의 편집 작업 (예를 들어, 삽입, 결실 및 치환)이 한 서열을 정렬되는 다른 서열의 정확한 카피 내로 형질전환하기 위해 필요하도록 최적의 매칭을 얻도록 하는 방식으로 서열의 전체 길이를 정렬함으로써 결정된다. 미국 국립 의학 도서관의 국립 생명공학 정보 센터 ("NCBI") 웹사이트를 통해 입수가능한 알고리즘인 니들만-운쉬(Needleman-Wuensch) 단백질 서열의 전반적 정렬은 이러한 분석의 한 예이다.
대안적으로 또는 추가로, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 효소는 서열식별번호: 210-211을 포함할 수 있다.
대안적으로, 효소는 서열식별번호: 210-211로 이루어질 수 있다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 바실루스 피르무스 박테리아로부터의 야생형 세린 프로테아제 효소의 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 결실은 야생형 효소의 촉매 잔기를 보유하고, 동일한 조건 하에서 야생형 세린 프로테아제 효소의 세린 프로테아제 활성과 비교하여 동일하거나 증가된 세린 프로테아제 활성을 일으킨다. 한 실시양태에서, 야생형 세린 프로테아제 효소는 바실루스 피르무스 DS-1로부터의 Sep1이다. 상기 문헌 [Geng, et al., 2016]을 참조한다.
한 실시양태에서, 효소는 동일한 조건 하에서 야생형 세린 프로테아제 효소의 세린 프로테아제 활성과 비교하여 증가된 세린 프로테아제 활성을 갖는다.
예를 들어, 효소의 아미노산 서열은 서열식별번호: 212를 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에 대해 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 효소는 서열식별번호: 212로 이루어질 수 있다.
추가로, 세린 프로테아제 활성을 갖고 서열식별번호: 212에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 효소는 서열식별번호: 212에서 결실 (서열식별번호: 211의 아미노산 181-240의)을 유지한다.
융합 단백질에서 신호 펩티드의 임의적 포함
본원에 기재된 임의의 융합 단백질에서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
신호 펩티드가 존재하는 경우, 이는 바람직하게는 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소의 아미노 말단에 존재한다.
신호 펩티드는 바람직하게는 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소의 제1 아미노산의 바로 앞에 있다.
융합 단백질이 신호 펩티드를 포함하는 경우, 신호 펩티드는 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소의 아미노 말단에 존재할 수 있다.
D. 융합 단백질을 제조하는 방법
본원에 기재된 임의의 융합 단백질은 관련 기술분야에 공지된 표준 클로닝 및 분자 생물학 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 관심의 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소)를 코딩하는 유전자는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되고, 본원에 기재된 임의의 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 코딩하는 DNA에 라이게이션되어, 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 형성할 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 벡터는 적합하게는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자가 용이하게 삽입될 수 있는 다수의 클로닝 부위를 포함한다. 벡터는 또한 벡터로 형질전환되거나, 형질감염되거나, 메이팅된 박테리아가 용이하게 확인되고 단리될 수 있도록, 선택가능한 마커, 예컨대 항생제 저항성 유전자를 함유한다. 벡터가 플라스미드인 경우, 플라스미드는 적합하게는 또한 복제 원점을 포함한다. 대안적으로, 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 비. 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자-형성 박테리아 숙주의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.
E. 융합 단백질에 포함될 수 있는 태그, 마커, 및 링커
본원에 기재된 임의의 융합 단백질은 또한 표적화 서열, 포자외막 단백질, 포자외막 단백질 단편, 또는 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소의 일부가 아닌 추가의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 융합 단백질의 정제 또는 가시화 (예를 들어, 폴리히스티딘 태그 또는 형광 단백질, 예컨대 GFP 또는 YFP) 또는 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자의 가시화를 용이하게 하는 태그 또는 마커를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 표적화 서열, 포자외막 단백질, 및 포자외막 단백질 단편을 사용한 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막 상의 융합 단백질의 발현은 융합된 단백질의 천연 폴딩 및 활성의 보유를 허용하는 이들 서열의 아미노-말단에서의 2차 구조의 결여로 인해 향상된다. 적절한 폴딩은 표적화 서열, 포자외막 단백질, 포자외막 단백질 단편, 포자 외피 단백질, 및 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소 사이에 짧은 아미노산 링커의 포함에 의해 추가로 향상될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 임의의 융합 단백질은 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편 및 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소 사이에 아미노산 링커를 포함할 수 있다.
링커는 폴리알라닌 링커 또는 폴리글리신 링커를 포함할 수 있다. 알라닌 및 글리신 잔기 둘 다의 혼합물을 포함하는 링커는 또한 사용될 수 있다. 폴리알라닌 링커의 예는 서열식별번호: 208 및 209로서 제공된다.
예를 들어, 표적화 서열이 서열식별번호: 1을 포함하는 융합 단백질에서, 융합 단백질은 하기 구조 중 하나를 가질 수 있다:
링커 없음: 서열식별번호: 1 - POI
알라닌 링커: 서열식별번호: 1-An-POI
글리신 링커: 서열식별번호: 1-Gn-POI
혼합된 알라닌 및 글리신 링커: 서열식별번호: 1 - (A/G)n - POI
여기서 An, Gn, 및 (A/G)n은 각각 임의의 수의 알라닌, 임의의 수의 글리신, 또는 임의의 수의 알라닌 및 글리신의 혼합물이다. 예를 들어, n은 1 내지 25일 수 있고, 바람직하게는 6 내지 10이다. 링커가 알라닌 및 글리신 잔기의 혼합물을 포함하는 경우, 글리신 및 알라닌 잔기의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 상기 구조에서, "POI"는 "관심의 단백질"을 의미하고, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소를 나타낸다.
대안적으로 또는 추가로, 링커는 프로테아제 인식 부위를 포함할 수 있다. 프로테아제 인식 부위의 포함은 프로테아제 인식 부위를 인식하는 프로테아제에의 노출시, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소의 표적화된 제거를 허용한다.
융합 단백질이 링커 및 신호 펩티드 둘 다를 포함하는 경우, 링커는 전형적으로 신호 펩티드에 대해 아미노-말단일 것이다. 예를 들어, 융합 단백질이 서열식별번호: 96, 폴리알라닌 링커, 신호 서열, 및 서열식별번호: 210의 세린 프로테아제를 포함하는 경우, 이들 요소는 전형적으로 융합 단백질 내에서 하기 순서로 배열될 것이다 (융합 단백질의 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 진행): 서열식별번호: 96- An-신호 서열-서열식별번호: 210.
II. 융합 단백질의 발현을 위한 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 숙주
본 발명은 추가로 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에 관한 것이다. 융합 단백질은 상기 섹션 I에 기재된 임의의 융합 단백질일 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 포자외막을 생성할 수 있는 임의의 바실루스 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 미코이데스, 바실루스 슈도미코이데스, 바실루스 사마니이, 바실루스 가에모켄시스, 바실루스 웨이헨스테파넨시스, 바실루스 토요이엔시스, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 적합하게는 바실루스 투린기엔시스 또는 바실루스 미코이데스를 포함한다.
융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 생성하기 위해, 임의의 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 관련 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 (예를 들어, 전기천공에 의해) 융합 단백질을 코딩하는 벡터로 접합되거나, 형질도입되거나, 형질전환될 수 있다. 이어서 박테리아는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 형질전환체를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 벡터가 항생제 저항성 유전자를 포함하는 경우, 박테리아는 항생제 저항성에 대해 스크리닝될 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 비. 세레우스 패밀리 구성원 숙주의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 이어서 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 포자형성을 유도할 조건에 노출될 수 있다. 포자형성을 유도하기 위한 적합한 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 한천 플레이트 상으로 플레이팅되고, 약 30℃의 온도에서 수 일 (예를 들어, 3일) 동안 인큐베이션될 수 있다.
따라서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 포자의 형태일 수 있다.
임의의 상기 종의 불활성화된 균주, 비-독성 균주, 또는 유전자 조작된 균주는 또한 적합하게 사용될 수 있다. 예를 들어, Cry 독소가 결여된 바실루스 투린기엔시스가 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 융합 단백질을 발현하는 재조합 비. 세레우스 패밀리 구성원 포자가 생성되었으면, 이는 일단 사용되면 추가의 발아를 방지하기 위해 불활성화될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 박테리아 포자를 불활성화시키는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은 제한 없이 열 처리, 감마 조사, x-선 조사, UV-A 조사, UV-B 조사, 화학적 처리 (예를 들어, 글루타르알데히드, 포름알데히드, 과산화수소, 아세트산, 표백제, 또는 이들의 임의의 조합으로의 처리), 또는 이들의 조합을 포함한다. 대안적으로, 비독소발생 균주, 또는 유전자 또는 물리적으로 불활성화된 균주로부터 유래된 포자가 사용될 수 있다.
따라서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 포자의 형태일 수 있고, 여기서 포자는 불활성화된다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질 중 2종 이상을 공동발현할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 서열식별번호: 210을 포함하는 적어도 1종의 융합 단백질을 서열식별번호: 212를 포함하는 융합 단백질과 함께 공동발현할 수 있다.
많은 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 균주는 내재적 박테리아 속성을 갖는다. 예를 들어, 일부 균주는 식물-성장 촉진 효과를 갖는다. 다른 균주는 내성장성이다. 일부 균주는 내성장성이고 또한 식물-성장 촉진 활성을 갖는다.
따라서, 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 식물-성장 촉진 박테리아 균주, 내성장성 박테리아 균주, 또는 식물-성장 촉진 및 내성장성 둘 다인 박테리아 균주를 포함할 수 있다.
식물-성장 촉진 박테리아 균주는 살곤충 독소 (예를 들어, Cry 독소)를 생산하거나, 살진균 화합물 (예를 들어, β-1,3-글루카나제, 키토사나제, 리티카제, 또는 임의의 이들의 조합)을 생산하거나, 살선충 화합물 (예를 들어, Cry 독소)을 생산하거나, 살박테리아 화합물을 생산하거나, 1종 이상의 항생제에 저항성이거나, 1종 이상의 자유롭게 복제하는 플라스미드를 포함하거나, 식물 뿌리에 결합하거나, 식물 뿌리를 콜로니화하거나, 바이오필름을 형성하거나, 영양분을 가용화하거나, 유기 산을 분비하거나, 이들의 임의의 조합인 박테리아 균주를 포함할 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 내성장성 박테리아 균주를 포함할 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 그의 BclA 유전자, 그의 CotE 유전자, 또는 그의 CotO 유전자에서 불활성화 돌연변이 (예를 들어, BclA 유전자, CotE 유전자, 또는 CotO 유전자의 넉-아웃)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 그의 BclA 유전자에 불활성화 돌연변이 (예를 들어, BclA 유전자의 넉-아웃)를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이를 갖는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 융합 단백질의 발현은 융합 단백질의 증가된 발현 수준을 일으킴이 밝혀졌다.
본 발명의 조성물은 본원에 기재된 균주의 배양물, 예컨대 전체 브로쓰 배양물을 포함한다. 용어 배양물은 제어된 실험실 또는 제조 조건 하에서 미리 결정된 배양 배지에서 다른 종의 부재 하에서 성장하는 세포의 집단을 지칭한다. 본 발명의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 생물학적으로 순수한 배양물은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 얻어질 수 있다.
통상적인 대규모 미생물 배양 과정은 침지 발효, 고상 발효, 또는 액체 표면 발효를 포함한다. 발효 동안, 영양분이 고갈됨에 따라, 세포는 성장기로부터 포자형성기로 전이를 시작하고, 발효의 최종 생성물은 대체로 포자, 대사물 및 잔여 발효 배지이다. 포자형성은 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 자연 생활 주기의 일부이고, 일반적으로 스트레스가 심한 환경 조건, 예컨대 영양분 제한에 반응하여 세포에 의해 개시된다. 발효는 높은 수준의 콜로니 형성 단위를 얻고 포자형성을 촉진하도록 구성된다. 발효로부터 생성된 배양 배지 중의 박테리아 세포, 포자 및 대사물은 직접적으로 사용되거나 통상적인 공업적 방법, 예컨대 원심분리 또는 여과, 예컨대 접선-유동 여과 또는 깊이 여과, 및 증발에 의해 농축될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본원에 기재된 미생물 배양 과정의 생성물을 포함한다. 침지 발효가 배양 과정으로서 사용되는 실시양태에서, 생성물은 "발효 브로쓰" 또는 "전체 브로쓰 배양물"로 지칭된다. 이러한 브로쓰는 상기 기재된 바와 같이 농축될 수 있다. 농축된 발효 브로쓰는 잔여 발효 브로쓰 및 대사물을 제거하기 위해 예를 들어 투석여과 과정을 통해 세척될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "브로쓰 농축물"은 상기 기재된 바와 같은 통상적인 공업적 방법에 의해 농축되었지만, 액체 형태로 잔류하는 발효 브로쓰를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "발효 생성물"은 발효 브로쓰 또는 전체 브로쓰 배양물, 브로쓰 농축물 및/또는 건조된 발효 브로쓰 또는 브로쓰 농축물을 지칭한다.
발효 브로쓰 또는 브로쓰 농축물은 통상적인 건조 과정 또는 방법, 예컨대 분무 건조, 동결 건조, 트레이 건조, 유체층 건조, 드럼 건조, 또는 증발을 사용하여 담체의 첨가와 함께 또는 없이 건조될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "발효 생성물"은 발효 브로쓰 또는 전체 브로쓰 배양물, 브로쓰 농축물 및/또는 건조된 발효 브로쓰 또는 브로쓰 농축물을 지칭한다.
생성된 건조 생성물은 특정 입도 또는 물리적 형식을 달성하기 위해 에컨대 분쇄 또는 과립화에 의해 추가로 프로세싱될 수 있다. 하기 기재된 담체는 또한 건조 후 첨가될 수 있다.
본 발명의 균주의 발효 브로쓰의 무세포 제제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단, 예컨대 발효 브로쓰의 추출, 원심분리 및/또는 여과에 의해 얻어질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 소위 무세포 제제가 세포가 없지 않을 수 있지만, 오히려 세포를 제거하는데 사용되는 기술 (예를 들어, 원심분리의 속도)에 따라, 대체로 무세포이거나 본질적으로 무세포임을 인지할 것이다. 생성된 무세포 제제는 식물에의 또는 식물 성장 배지에의 그의 적용을 돕는 성분과 함께 건조되고/거나 제제화될 수 있다. 발효 브로쓰에 대한 상기 기재된 농축 방법 및 건조 기술은 또한 무세포 제제에도 적용가능하다.
섹션 IV에서 하기 추가로 기재된 바와 같이, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자로부터 융합 단백질을 포함하는 포자외막 단편의 수집을 허용하는 돌연변이 또는 다른 변형을 포함할 수 있다.
III. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 융합 단백질의 발현을 위한 프로모터
본원에 기재된 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 제제, 식물 종자, 및 방법에 사용되는 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 적합하게는 비. 세레우스 패밀리 구성원 내생포자의 포자외막 상에 융합 단백질의 발현을 유발할 포자형성 프로모터 (예를 들어, 비. 세레우스 패밀리 구성원으로부터의 천연 bclA 프로모터)의 제어 하에 있다.
따라서, 섹션 I에서 상기 기재된 임의의 융합 단백질은 융합 단백질의 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편에 대해 천연인 포자형성 프로모터, 또는 이러한 프로모터의 부분의 제어 하에서 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서 발현될 수 있다.
임의의 융합 단백질은 고-발현 포자형성 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
고-발현 포자형성 프로모터는 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
참고의 편의를 위해, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서 임의의 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있는 프로모터에 대한 예시적인 뉴클레오티드 서열이 그들의 서열식별번호와 함께 하기 표 3에 제공된다. 표 3은 또한 많은 프로모터에 대한 예시적인 최소 프로모터 서열을 제공한다. 표 3에서, 프로모터 중의 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열은 볼드체 및 밑줄친 텍스트에 의해 지시된다. 몇몇 서열은 서로 중첩하는 다수의 시그마 K 서열을 갖는다. 중첩은 표에서 이중 밑줄에 의해 지시된다. 프로모터 서열은 각각의 지시된 유전자에 대한 시작 코돈의 바로 상류이다. 다시 말해서, 하기 표 3에 나타내어진 서열에서, 프로모터 서열의 마지막 뉴클레오티드는 지시된 단백질을 코딩하는 유전자의 코딩 영역에 대한 시작 코돈의 제1 뉴클레오티드의 바로 앞에 있다.
표 3. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 융합 단백질의 발현을 위한 프로모터 서열
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표 3에 나타내어진 프로모터 서열에서 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열은 후기 포자형성 동안 융합 단백질의 높은 발현 수준을 일으킨다. 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열에 대한 컨센서스 서열은 CATANNNTN (서열식별번호: 200)이지만; 이 서열은 최대 2개의 돌연변이를 포함하고 여전히 기능적일 수 있다. 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열은 일반적으로 리보솜 결합 부위 (RBS)의 상류에서 발견된다.
표 3에서 상기 나타내어진 임의의 서열에 대해 높은 정도의 서열 동일성을 갖는 프로모터는 또한 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 융합 단백질은 서열식별번호: 37-42 및 123-191 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37-42 및 123-191 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37-42 및 123-191 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37-42 및 123-191 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37-42 및 123-191 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37-42 및 123-191 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37-42 및 123-191 중 어느 하나의 핵산 서열과 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
예를 들어, 융합 단백질은 BclA 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 149, 150, 175, 189, 또는 190), CotY 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 41, 42, 또는 181), ExsY 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 37, 38, 또는 180), 또는 람노스 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 185), 또는 임의의 이들 프로모터에 대해 높은 정도의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 융합 단백질은 서열식별번호: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189, 또는 190 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189, 또는 190 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189, 또는 190 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189, 또는 190 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189, 또는 190 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189, 또는 190 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 서열식별번호: 37, 38, 41, 42, 149, 150, 175, 180, 181, 185, 189, 또는 190 중 어느 하나의 핵산 서열과 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
융합 단백질은 시그마-K 포자형성 특이적 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있고, 여기서 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열 또는 서열들은 임의의 서열식별번호: 37-42 및 123-191의 상응하는 뉴클레오티드와 100% 동일성을 갖는다.
융합 단백질은 융합 단백질의 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편에 대해 천연인 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 표적화 서열이 BclA로부터 유래된 경우, 융합 단백질은 천연 BclA 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 149, 150, 175, 189 또는 190)의 제어 하에서 발현될 수 있다.
표 3은 또한 예시적인 최소 프로모터 서열을 제공한다. 융합 단백질은 임의의 이들 최소 프로모터 서열 하에서 발현될 수 있다.
더욱이, 융합 단백질은 프로모터의 부분이 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 한, 표 3에서 상기 열거된 임의의 프로모터의 부분 하에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 그 영역이 시그마-K 포자형성-특이적 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 한, 시작 코돈의 상류의 제1 25, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 뉴클레오티드를 포함하는 프로모터 영역 하에서 발현될 수 있다.
IV. 이러한 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 유리 포자외막 및 포자외막 단편의 수집을 허용하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에 대한 돌연변이 및 다른 유전자 변경
하기에 추가로 기재되는 바와 같이, 관심의 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소) 및 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 관심의 단백질 또는 펩티드를 식물, 종자, 식물 성장 배지, 또는 종자 또는 식물을 둘러싼 영역에 전달하는 것 (예를 들어, 토양 관주, 엽면 적용을 통해, 또는 종자 처리로서)을 포함한 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 일부 경우에, 살아 있는 미생물의 존재는 요망되지 않을 수 있고, 대신, 살아 있는 포자를 포자의 외부 표면 상의 포자외막에서의 융합 단백질로부터 분리하는 것이 요망될 것이다. 예를 들어, 일부 적용에서, 포자 통합에 대한 우려 없이 효소 활성을 증가시키는 것이 요망될 것이다. 이러한 상황에서, 포자로부터 분리된 포자외막 단편의 사용은 그들의 포자외막 상에 효소를 갖는 살아 있는 미생물의 사용에 비해 바람직할 수 있다.
추가로, 일부 용도에 대해, 생성물의 밀도를 감소시키는 것이 요망될 수 있다. 이러한 경우에, 포자외막 (융합 단백질을 함유함)으로부터 농밀한 포자를 분리하는 것이 요망될 것이다. 더욱이, 일부 상황 하에서, 살아 있는 포자의 존재는 일부 적용에 대해 요망되지 않을 생성물에서의 박테리아 성장에 대한 잠재성을 초래할 것이다.
유리 포자외막이 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자로부터 분리되는 것을 허용하는 돌연변이 또는 다른 유전자 변경 (예를 들어, 단백질의 과발현)은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 내로 도입될 수 있다. 이 분리 과정은 융합 단백질을 함유하지만 그들 자신은 포자가 실질적으로 없는 포자외막 단편을 생성한다. "포자가 실질적으로 없는"이란, 유리 포자외막이 포자로부터 분리되면, 5 부피% 미만의 포자, 바람직하게는 3 부피% 미만의 포자, 보다 더 바람직하게는 1 부피% 미만의 포자를 함유하고, 가장 바람직하게는 포자를 함유하지 않거나 포자가 존재하는 경우 이들이 비검출가능한 제제가 얻어지는 것을 의미한다. 이들 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 제제, 식물 종자, 및 방법에서 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 그들 자신 대신 사용될 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자로부터 유래된 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 제제, 식물 종자, 및 방법에 사용될 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 발현한다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 또한 돌연변이를 포함하거나 단백질을 발현하고, 여기서 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 단백질의 발현과 비교하여 증가된다. 돌연변이 또는 단백질의 증가된 발현은 야생형 포자의 포자외막과 비교하여 포자로부터 제거하기가 보다 용이한 포자외막을 갖는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자를 생성한다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 (i) CotE 유전자에 돌연변이를 포함할 수 있거나; (ii) ExsY 단백질을 발현할 수 있고, 여기서 ExsY 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 ExsY 단백질의 발현과 비교하여 증가되고, ExsY 단백질은 구상 단백질을 포함하는 카르복시-말단 태그를 포함하거나; (iii) BclB 단백질을 발현할 수 있고, 여기서 BclB 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 BclB 단백질의 발현과 비교하여 증가되거나; (iv) YjcB 단백질을 발현할 수 있고, 여기서 YjcB 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 YjcB 단백질의 발현과 비교하여 증가되거나; (v) ExsY 유전자에 돌연변이를 포함할 수 있거나;(vi) CotY 유전자에 돌연변이를 포함할 수 있거나; (vii) ExsA 유전자에 돌연변이를 포함할 수 있거나; (viii) CotO 유전자에 돌연변이를 포함할 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 CotE 유전자에 돌연변이, 예컨대 CotE 유전자의 넉-아웃 또는 CotE 유전자의 우성 음성 형태를 포함할 수 있다. CotE 유전자에서의 돌연변이는 포자외막을 포자에 부착시키는 CotE의 능력을 부분적으로 또는 완전히 억제할 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 ExsY 단백질을 발현할 수 있다. ExsY 단백질은 구상 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 그의 변이체)을 포함하는 카르복시-말단 태그를 포함하고, ExsY 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 ExsY 단백질의 발현과 비교하여 증가된다. 구상 단백질은 25 kDa 내지 100 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 구상 단백질을 포함하는 카르복시-말단 태그를 포함하는 ExsY 단백질의 발현은 포자외막에서 그의 표적에의 ExsY 단백질의 결합을 억제할 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 BclB 단백질을 발현할 수 있다. BclB 단백질의 발현은 취약성 포자외막의 형성을 일으킬 수 있다. BclB 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 BclB 단백질의 발현과 비교하여 증가될 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 YjcB 단백질을 발현할 수 있다. YjcB 단백질의 발현은 포자외막이 완전한 구조로라기 보다는 조각으로 형성되는 것을 유발할 수 있다. YjcB 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 YjcB 단백질의 발현과 비교하여 증가될 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 ExsY 유전자에 돌연변이, 예컨대 ExsY 유전자의 넉-아웃을 포함할 수 있다. ExsY 유전자에서의 돌연변이는 포자외막의 형성을 완결하거나 포자외막을 포자에 부착시키는 ExsY의 능력을 부분적으로 또는 완전히 억제할 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 CotY 유전자에 돌연변이, 예컨대 CotY 유전자의 넉-아웃을 포함할 수 있다. CotY 유전자에서의 돌연변이는 취약성 포자외막의 형성을 일으킬 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 ExsA 유전자에 돌연변이, 예컨대 ExsA 유전자의 넉-아웃을 포함할 수 있다. ExsA 유전자에서의 돌연변이는 취약성 포자외막의 형성을 일으킬 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 CotO 유전자에 돌연변이, 예컨대 CotO 유전자의 넉-아웃 또는 CotO 유전자의 우성 음성 형태를 포함할 수 있다. CotO 유전자에서의 돌연변이는 포자외막이 줄지어 형성되는 것을 유발할 수 있다.
참고의 편의을 위해, CotE, ExsY, BclB, YjcB, CotY, ExsA, 및 CotO에 대한 예시적인 서열의 설명은 하기 표 4에 제공된다.
표 4. 유리 포자외막의 수집을 허용하는 돌연변이되거나 다르게는 유전자 변경될 수 있는 단백질의 서열
Figure pct00024
포자외막 단편은 임의의 이들 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 제조되고 하기 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 융합 단백질을 발현하는 경우, 포자외막 단편은 융합 단백질을 포함할 것이다. 포자로부터의 융합 단백질을 함유하는 포자외막 단편의 정제시, 융합 단백질이 안정화되고 포자외막 단편에 공유 결합을 통해 지지되는 무세포 단백질 제제가 얻어진다.
유리 포자외막의 수집을 허용하는 돌연변이 또는 다른 유전자 변경을 갖는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자로부터 포자외막을 제거하기 위해, 포자의 현탁액 또는 발효 브로쓰는 원심분리 또는 여과로 처리되어 포자로부터 분리된 포자외막의 단편을 생성할 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 융합 단백질을 발현하는 경우, 포자외막 단편은 융합 단백질을 포함할 것이다.
포자를 포함하는 현탁액 또는 발효 브로쓰는 원심분리, 이어서 상청액의 수집으로 처리될 수 있다. 상청액은 포자외막의 단편을 포함하고, 포자가 실질적으로 없다.
대안적으로, 포자를 포함하는 현탁액 또는 발효 브로쓰는 여과, 이어서 여액의 수집으로 처리될 수 있다. 여액은 포자외막의 단편을 포함하고, 포자가 실질적으로 없다.
포자의 현탁액 또는 발효 브로쓰는 원심분리 또는 여과 전에 교반되거나 기계적으로 파괴될 수 있다.
포자외막 단편은 또한 구배 원심분리, 친화도 정제에 의해, 또는 포자가 현탁액으로부터 침전되게 함으로써 포자로부터 분리될 수 있다.
융합 단백질 및 포자외막 단편 사이의 강한 공유 결합으로 인해, 융합 단백질은 열에 저항성이 된다. 포자외막 단편에 결합된 융합 단백질의 열 저항성은 열-저항성 단백질 또는 효소를 필요로 하는 적용을 위해 사용될 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 포자외막 단편이 제공된다.
포자외막 단편은 유리 포자외막의 수집을 허용하는 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 다른 유전자 변경을 포함하는 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래될 수 있다.
포자외막 단편은 섹션 I에서 상기 기재된 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
V. 제제
제제가 제공된다. 제제는 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 포함한다. 제제는 농업상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
또 다른 제제가 제공된다. 제제는 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 포자외막 단편을 포함한다. 제제는 농업상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
VI. 처리된 종자
처리된 식물 종자가 제공된다. 식물 종자는 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로 처리될 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 발현할 수 있다.
또 다른 처리된 식물 종자가 제공된다. 식물 종자는 본원에 기재된 임의의 포자외막 단편으로 처리될 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래될 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 처리된 식물 종자가 제공된다. 식물 종자는 본원에 기재된 임의의 제제로 처리될 수 있다.
임의의 처리된 식물 종자에서, 식물 종자는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제로 코팅될 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제는 종자 처리물, 예를 들어, 종자 코팅 또는 드레싱으로서 사용될 수 있다. 종자 코팅 또는 드레싱 제제는 액체 담체 제제, 슬러리 제제, 또는 분말 제제의 형태일 수 있다.
종자 코팅 또는 드레싱 제제는 종자 처리물이 종자에 점착되고 이를 코팅하는 점착성 품질을 갖도록 만들기 위해 제공되는 통상적인 첨가제와 함께 적용될 수 있다. 적합한 첨가제는 활석, 흑연, 검, 안정화 중합체, 코팅 중합체, 마감 중합체, 종자 유동 및 식재가능성을 위한 슬립제, 화장료제, 및 셀룰로스성 물질, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 등을 포함한다.
종자 처리 제제는 착색제 및/또는 다른 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
종자 처리 제제(들)는 적합한 담체, 예컨대 물 또는 분말에서 종자에 적용될 수 있다. 이어서, 종자는 통상적인 방식으로 건조되고 식재될 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편은 용액으로서 또는 다른 상업적으로 입수가능한 첨가제와 조합으로 종자에 직접적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편은 묘목-허용되는 담체(들) (예를 들어, 액체 담체 또는 고체 담체)와 조합으로 적용될 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편을 함유하는 용액은 종자에 (예를 들어, 종자 슬러리 또는 침종에) 분무되거나 다르게는 적용될 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편을 함유하는 고체 또는 건조 물질은 또한 효과적인 묘목 발아, 성장, 및 초기 묘목 정착 동안 보호를 촉진시키는데 유용하다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편은 가용화 담체, 예컨대 물, 완충제 (예를 들어, 시트레이트 또는 포스페이트 완충제), 다른 처리제 (예를 들어, 알콜 또는 또 다른 용매), 및/또는 임의의 가용성 작용제와 함께 사용될 수 있다.
추가로, 소량의 건조제 향상제, 예컨대 저급 알콜 등은 종자 코팅 제제에 사용될 수 있다.
계면활성제, 유화제 및 보존제는 또한 종자 코팅 생성물의 안정성을 향상시키기 위해 상대적으로 낮은 (예를 들어, 약 0.5% w/v 이하) 수준으로 첨가될 수 있다.
종자는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편을 함유하는 수용액을 종자 상에 또는 위에 붓거나, 펌핑하거나, 드리즐링하거나, 분무하는 것; 또는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편을 컨베이어 시스템을 사용하여 또는 사용하지 않고 종자의 층 상으로 분무하거나 적용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법을 사용하여 처리될 수 있다.
종자 처리에 유용한 혼합 장치는 텀블러, 혼합 대야, 혼합 드럼, 및 코팅 동안 종자를 함유하는데 사용되는 대야 또는 드럼을 포함하는 유체 적용 장치를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
종자 처리 후, 종자는 공기-건조될 수 있거나, 건조 공기의 스트림은 임의로 종자 코팅의 건조를 보조하는데 사용될 수 있다.
재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 포자외막 단편을 포함하는 종자 처리물은 임의의 상업적으로 입수가능한 종자 처리 기계를 사용하여 적용될 수 있거나, 또한 임의의 허용되는 비-상업적 방법(들)을 사용하여, 예컨대 시린지 또는 임의의 다른 종자 처리 장치를 사용하여 적용될 수 있다.
VII. 식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키고/거나 식물 병원체를 방제하는 방법
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키고/거나 식물 해충, 예컨대 선충을 방제하고/거나, 식물 병원체를 방제하는 방법이 제공된다. 방법은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하거나, 식물 해충을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원과 접촉시키는 것을 포함한다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 포함할 수 있다. 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 발현할 수 있다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키고/거나 식물 해충, 예컨대 선충을 방제하고/거나, 식물 병원체를 방제하는 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 포자외막 단편을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하거나, 식물 해충을 포자외막 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 포자외막 단편을 포함할 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키고/거나 식물 해충, 예컨대 선충을 방제하고/거나, 식물 병원체를 방제하는 추가의 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 제제를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함한다. 제제는 본원에 기재된 임의의 제제를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 방법은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하기 전에 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 불활성화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 방법은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 식물 성장 배지에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
식물 성장 배지의 사용을 수반하는 본원에 기재된 임의의 방법에서, 식물 성장 배지는 토양, 물, 수용액, 모래, 자갈, 다당류, 뿌리덮개, 퇴비, 초탄, 짚, 통나무, 점토, 대두 분쇄물, 효모 추출물, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
식물 성장 배지는 비료를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법은 식물 성장 배지를 효소에 대한 기질로 보충하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 기질은 단백질 분쇄물, 카세인, 젤라틴, 알부민, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 방법은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 식물에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, 방법은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 식물의 뿌리에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 방법은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 엽면으로 적용하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 방법은 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 식물 종자에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
방법이 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 식물 종자에 적용하는 것을 포함하는 경우, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 식물 종자에 적용하는 것은 (a) 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제를 식재시에 식물 종자에 적용하는 것; 또는 (b) 식물 종자를 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제로 코팅하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 방제되는 식물 해충은 선형동물문으로부터의 식물기생성 해충, 예를 들어, 아글렌쿠스(Aglenchus) 종, 안구이나(Anguina) 종, 아펠렌코이데스(Aphelenchoides) 종, 벨로놀라이무스(Belonolaimus) 종, 부르사펠렌쿠스(Bursaphelenchus) 종, 카코파우루스(Cacopaurus) 종, 크리코네멜라(Criconemella) 종, 크리코네모이데스(Criconemoides) 종, 디틸렌쿠스(Ditylenchus) 종, 돌리코도루스(Dolichodorus) 종, 글로보데라(Globodera) 종, 헬리코틸렌쿠스(Helicotylenchus) 종, 헤미크리코네모이데스(Hemicriconemoides) 종, 헤미시클리오포라(Hemicycliophora) 종, 헤테로데라(Heterodera) 종, 호플롤라이무스(Hoplolaimus) 종, 론기도루스(Longidorus) 종, 리구스(Lygus) 종, 멜롤이도기네(Meloidogyne) 종, 멜로이네마(Meloinema) 종, 나코부스(Nacobbus) 종, 네오틸렌쿠스(Neotylenchus) 종, 파라론기도루스(Paralongidorus) 종, 파라펠렌쿠스(Paraphelenchus) 종, 파라트리코도루스(Paratrichodorus) 종, 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종, 슈도할렌쿠스(Pseudohalenchus) 종, 실렌쿠스(Psilenchus) 종, 푼크토데라(Punctodera) 종, 퀴니술시우스(Quinisulcius) 종, 라도폴루스(Radopholus) 종, 로틸렌쿨루스(Rotylenchulus) 종, 로틸렌쿠스(Rotylenchus) 종, 스쿠텔로네마(Scutellonema) 종, 서브안구이나(Subanguina) 종, 트리코도루스(Trichodorus) 종, 틸렌쿨루스(Tylenchulus) 종, 틸렌코르힌쿠스(Tylenchorhynchus) 종, 크시피네마(Xiphinema) 종일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 증가된 성장을 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제가 적용된 종자는 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물이 적용되지 않은 종자와 비교하여 증가된 발아율을 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 증가된 영양분 흡수를 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 해충, 예컨대 선충에 대한 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 감소된 벌레혹, 감소된 포낭, 및/또는 뿌리의 중량 당 감소된 선충을 포함한 감소된 선충 손상을 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제가 적용된 식물 또는 식물이 성장되는 장소, 예컨대 토양은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 토양의 부피 당 감소된 선충 알 및/또는 감소된 선충을 나타낼 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 동일한 조건 하에서 그러나 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에 의한 처리 없이 생산된 식물과 비교할 경우 선충 및/또는 선충 손상을 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 6%, 또는 적어도 약 7%, 또는 적어도 약 8%, 또는 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 11%, 또는 적어도 약 12% 감소시킨다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 병원체에 대한 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 환경적 스트레스 (예를 들어, 가뭄, 홍수, 열, 결빙, 염, 중금속, 낮은 pH, 높은 pH, 또는 임의의 이들의 조합)에 대한 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 증가된 뿌리 마디화를 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 보다 큰 작물 수율을 나타낼 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 동일한 조건 하에서 그러나 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에 의한 처리 없이 생산된 식물과 비교할 경우 수율 또는 총 식물 중량을 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 6%, 또는 적어도 약 7%, 또는 적어도 약 8%, 또는 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 11%, 또는 적어도 약 12% 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 동일한 조건 하에서 그러나 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에 의한 처리 없이 생산된 식물과 비교할 경우 식물 활기의 일부 측면, 예컨대 발아를 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 6%, 또는 적어도 약 7%, 또는 적어도 약 8%, 또는 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 11%, 또는 적어도 약 12% 개선시킨다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원, 포자외막 단편, 또는 제제의 존재 하에서 성장된 식물은 동일한 조건 하에서 효소 또는 미생물의 부재 하에서 성장된 식물과 비교하여 변경된 잎 노쇠를 나타낼 수 있다.
XIII. 담체
상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 제제는 농업상 허용되는 담체를 포함한다.
농업상 허용되는 담체는 분산제, 계면활성제 (예를 들어, 중석유 오일, 중석유 증류액, 폴리올 지방산 에스테르, 폴리에톡실화 지방산 에스테르, 아릴 알킬 폴리옥시에틸렌 글리콜, 알킬 아민 아세테이트, 알킬 아릴 술포네이트, 다가 알콜, 알킬 포스페이트, 또는 임의의 이들의 조합), 첨가제 (예를 들어, 오일, 검, 수지, 점토, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 테르펜, 점성 유기물, 지방산 에스테르, 술페이트화 알콜, 알킬 술포네이트, 석유 술포네이트, 알콜 술페이트, 나트륨 알킬 부탄 디아메이트, 나트륨 티오부탄 디오에이트의 폴리에스테르, 벤젠 아세토니트릴 유도체, 단백질성 물질, 또는 임의의 이들의 조합), 물, 증점제 (폴리에틸렌 글리콜의 장쇄 알킬술포네이트, 폴리옥시에틸렌 올레에이트, 또는 임의의 이들의 조합), 케이킹 방지제 (예를 들어, 나트륨 염, 탄산칼슘, 규조토, 또는 임의의 이들의 조합), 잔류물 파괴 생성물, 퇴비화 제제, 과립 적용물, 규조토, 오일, 착색제, 안정화제, 보존제, 중합체, 코팅, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
농업상 허용되는 담체가 계면활성제를 포함하는 경우, 계면활성제는 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
농업상 허용되는 담체가 첨가제를 포함하고, 첨가제가 단백질성 물질을 포함하는 경우, 단백질성 물질은 우유 제품, 밀가루, 대두 분쇄물, 혈액, 알부민, 젤라틴, 알팔파 분쇄물, 효모 추출물, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
농업상 허용되는 담체가 케이킹 방지제를 포함하고, 케이킹 방지제가 나트륨 염을 포함하는 경우, 나트륨 염은 모노메틸 나프탈렌 술포네이트의 나트륨 염, 디메틸 나프탈렌 술포네이트의 나트륨 염, 아황산나트륨, 황산나트륨, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
농업상 허용되는 담체는 질석, 숯, 제당 공장 탄산화 프레스 머드, 왕겨, 카르복시메틸 셀룰로스, 토탄, 진주암, 세사, 탄산칼슘, 가루, 백반, 전분, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 제제는 종자 코팅 제제 (예를 들어, 종자에의 적용을 위한 수성 또는 오일-기재 용액 또는 종자에의 적용을 위한 분말 또는 과립 제제), 식물 또는 식물 성장 배지에의 적용을 위한 액체 제제 (예를 들어, 농축된 제제 또는 사용 준비된 제제), 또는 식물 또는 식물 성장 배지에의 적용을 위한 고체 제제 (예를 들어, 과립 제제 또는 분말제)를 포함할 수 있다.
농업상 허용되는 담체는 제제 성분을 포함할 수 있다. 제제 성분은 습윤화제, 증량제, 용매, 자발성 촉진제, 유화제, 분산제, 서리 보호제, 증점제, 및/또는 아주반트일 수 있다. 한 실시양태에서, 제제 성분은 습윤화제이다.
본 발명의 조성물은 회수율, 효능, 또는 물리적 특성을 개선시키기 위해 및/또는 프로세싱, 패키징 및 투여를 보조하기 위해 본 발명에 조성물에 첨가되는 제제 성분을 포함할 수 있다. 이러한 제제 성분은 개별적으로 또는 조합으로 첨가될 수 있다.
제제 성분은 효능, 안정성, 및 물리적 특성, 사용성을 개선시키기 위해 및/또는 프로세싱, 패키징 및 최종-사용 적용을 용이하게 하기 위해 세포, 무세포 제제 및/또는 포자외막 단편을 포함하는 조성물에 첨가될 수 있다. 이러한 제제 성분은 불활성물, 안정화제, 보존제, 영양분, 또는 물리적 특성 변형제를 포함할 수 있으며, 이는 개별적으로 또는 조합으로 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체는 액체 물질, 예컨대 물, 오일, 및 다른 유기 또는 무기 용매 및 고체 물질, 예컨대 미네랄, 중합체, 또는 생물학적으로 또는 화학적 합성에 의해 유도된 중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 성분은 식물 부분, 예컨대 잎, 종자, 또는 뿌리에의 조성물의 부착을 용이하게 하는 결합제, 아주반트, 또는 접착제이다. 예를 들어, 문헌 [Taylor, A.G., et al., "Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments," Annu. Rev. Phytopathol., 28: 321-339 (1990)]을 참조한다. 안정화제는 케이킹 방지제, 항산화제, 침전방지제, 발포방지제, 건조제, 보호제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 영양분은 탄소, 질소, 및 인 공급원, 예컨대 당, 다당류, 오일, 단백질, 아미노산, 지방산 및 포스페이트를 포함할 수 있다. 물리적 특성 변형제는 벌크화제, 습윤화제, 증점제, pH 변형제, 유동학 변형제, 분산제, 아주반트, 계면활성제, 필름-형성제, 굴수성물질, 빌더, 동결방지제 또는 착색제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 발효에 의해 생산된 세포, 무세포 제제 및/또는 포자외막 단편을 포함하는 조성물은 임의의 다른 제형 제제 없이 희석제로서 물과 함께 또는 없이 직접적으로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 습윤화제, 또는 분산제는 발효로부터 생성된 전체 브로쓰의 건조된 농축물, 예컨대 동결-건조된 또는 분무-건조된 분말에 첨가된다. 습윤화제는 분산 및 침투 특성을 증가시키거나, 분산제는 그것이 표면에 적용되는 경우 활성 성분 (희석됨)의 분산성 및 용해도를 증가시킨다. 예시적인 습윤화제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 술포숙시네이트 및 유도체, 예컨대 멀티웨트(MULTIWET)™ MO-70R (크로다 인크.(Croda Inc.), 미국 뉴저지주 에디슨); 실록산, 예컨대 브레이크-트루(BREAK-THRU)® (에보닉(Evonik), 독일); 비이온성 화합물, 예컨대 아틀록스(ATLOX)™ 4894 (크로다 인크., 미국 뉴저지주 에디슨); 알킬 폴리글루코시드, 예컨대 테르웨트(TERWET)® 3001 (헌츠만 인터내셔널 엘엘씨(Huntsman International LLC), 미국 텍사스주 더 우드랜즈); C12-C14 알콜 에톡실레이트, 예컨대 테르기톨(TERGITOL)® 15-S-15 (더 다우 케미칼 컴퍼니(The Dow Chemical Company), 미국 미시간주 미드랜드); 포스페이트 에스테르, 예컨대 로다팍(RHODAFAC)® BG-510 (로디아, 인크.(Rhodia, Inc.)); 및 알킬 에테르 카르복실레이트, 예컨대 에멀소겐(EMULSOGEN)™ LS (클래리언트 코포레이션(Clariant Corporation), 미국 노쓰 캐롤라이나주)를 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 임의의 제제는 농약을 포함할 수 있다.
IX. 유리 효소
본원에 기재된 임의의 효소는 또한 유리 효소로서 또는 재조합 미생물에서 발현된 효소로서 사용될 수 있다.
X. 식물
식물과 관련된 임의의 상기 방법에서, 식물은 쌍자엽식물, 단자엽식물, 나자식물, 또는 피자식물일 수 있다.
마찬가지로, 본원에 기재된 임의의 종자에 대해, 종자는 쌍자엽식물, 단자엽식물, 나자식물, 또는 피자식물의 종자일 수 있다.
예를 들어, 식물이 쌍자엽식물이거나 종자가 쌍자엽식물의 종자인 경우, 쌍자엽식물은 콩, 완두콩, 토마토, 피망, 스쿼시, 알팔파, 아몬드, 아니스씨, 사과, 살구, 아라차, 아티초크, 아보카도, 밤바라 땅콩, 비트, 버가모트, 후추, 블랙 와틀, 블랙베리, 블루베리, 광귤, 청경채, 브라질 너트, 브레드프루트, 브로콜리, 잠두, 브루셀 스프라우트, 메밀, 양배추, 카멜리나, 중국 양배추, 카카오, 칸탈루프, 캐러웨이 씨, 카르둔, 캐럽, 당근, 캐슈 너트, 카사바, 피마자, 콜리플라워, 셀러리악, 셀러리, 체리, 밤, 병아리콩, 치커리, 고추, 국화, 계피, 시트론, 감귤류, 귤, 정향, 클로버, 커피, 콜라 너트, 평지, 옥수수, 목화, 목화씨, 카우피, 크램브, 크랜베리, 갓, 오이, 까치밥나무, 커스터드 애플, 북채 나무, 땅콩, 가지, 꽃상추, 회향, 호로파, 무화과, 개암, 아마, 제라늄, 구스베리, 박, 포도, 자몽, 구아바, 대마, 대마씨, 헤나, 홉, 잠두 콩, 서양고추냉이, 인디고, 자스민, 예루살렘 아티초크, 황마, 케일, 케이폭, 케나프, 키위, 콜라비, 금귤, 라벤더, 레몬, 렌틸, 싸리, 상추, 라임, 감초, 리치, 비파, 루핀, 마카다미아 너트, 메이스, 만다린, 망겔, 망고, 양모과, 멜론, 민트, 뽕나무, 겨자, 천도복숭아, 니거 씨, 육두구, 오크라, 올리브, 아편, 오렌지, 파파야, 파스닙, 완두콩, 복숭아, 땅콩, 배, 피칸 너트, 감, 비둘기 콩, 피스타치오 너트, 질경이, 자두, 석류, 포멜로, 양귀비 씨, 감자, 고구마, 말린 자두, 호박, 케브라초, 마르멜로, 신코나(Cinchona) 속의 나무, 퀴노아, 무, 모시, 평지씨, 산딸기, 레아, 대황, 장미, 러버, 순무, 홍화, 세인포인, 서양우엉, 사포딜라, 사츠마, 쇠채, 참깨, 시어버터 나무, 대두, 시금치, 스쿼시, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 스웨덴 순무, 스위트 페퍼, 탄제린, 차, 테프, 담배, 토마토, 트레포일, 유동 나무, 순무, 유레나, 살갈퀴, 호두, 수박, 예르바 마테, 겨울냉이, 냉이, 큰다닥냉이, 후추냉이, 물냉이, 말냉이, 스타 아니스, 월계수, 베이 로웰, 카시아, 자문, 딜, 타마린드, 페퍼민트, 오레가노, 로즈마리, 세이지, 가시여지, 피막이, 칼로필럼, 발삼 페어, 쿠쿠이 너트, 타히티 밤, 바질, 월귤나무, 히비스커스, 패션프루트, 스타 애플, 사사프라스, 선인장, 성요한초, 좁쌀풀, 산사나무, 고수, 커리 플랜트, 키위, 타임, 주키니, 울루코, 히카마, 워터리프, 가시 원숭이 오렌지, 노랑 몸빈, 스타프루트, 아마란스, 고추냉이, 산초, 황매, 마슈아, 참죽나무, 번행초, 보워 시금치, 우구, 쑥국화, 별꽃, 호코테, 말레이 애플, 파라크레스, 방가지똥, 중국 감자, 홀스 파슬리, 유럽 장대, 캄피온, 애거트, 카소드 나무, 엉겅퀴, 오이풀, 스타 구스베리, 솔장다리, 퉁퉁마디, 수영, 은색 레이스 고사리, 콜라드 그린, 프림로즈, 황화구륜초, 쇠비름, 마디풀, 테레빈, 나무 상추, 와일드 베텔, 서아프리카 피망, 예르바 산타, 사철쑥, 파슬리, 처빌, 랜드 크레스, 버넷 삭시프라게, 허니허브, 머위, 시소, 버들여뀌, 페릴라, 비터 빈, 오카, 캄퐁, 중국 셀러리, 레몬 바질, 타이 바질, 워터 미모사, 시셀리, 캐비지-트리, 모링가, 마우카, 청나래 고사리, 소엽풀, 노랑 사와 상추, 로바지, 다닥 냉이, 마카, 조롱박, 제비콩, 물 시금치, 금혼초, 약모밀, 오키나와 시금치, 로터스 스위트주스, 별꽃아재비, 쿨란트로, 아루굴라, 카르둔, 카이구아, 미츠바, 치필린, 샘파이어, 맘파트, 에볼로, 담쟁이덩굴 박, 양배추 엉겅퀴, 갯배추, 차야, 후아우존틀, 에티오피아 겨자, 마젠타 스프린, 굳 킹 헨리, 에파졸, 명아주, 만드레기, 케이퍼, 라피니, 배추, 미즈나, 중국 사보이, 카이-란, 겨자 잎, 말라바 시금치, 근대, 마시멜로, 클라이밍 와틀, 중국 황마, 파프리카, 안나토 씨, 스피어민트, 사보리, 마조람, 쿠민, 카모마일, 레몬 밤, 올스파이스, 월귤나무, 체리모야, 클라우드베리, 댐슨, 피타야, 두리안, 엘더베리, 페이조아, 잭프루트, 잼불, 대추, 꽈리, 퍼플 망고스틴, 람부탄, 레드커런트, 블랙커런트, 살랄 베리, 사츠마, 어글리 프루트, 아즈키 콩, 검정 콩, 동부, 볼로티 콩, 강낭콩, 생두, 강낭콩, 리마콩, 녹두, 흰 강낭콩, 핀토 콩, 깍지콩, 완두콩, 스냅 완두콩, 스위트피, 브로코플라워, 칼라브레스, 쐐기풀, 벨 페퍼, 라디치오, 무, 흰무, 감자개발나물, 다채, 브로콜리니, 검정무, 우엉 뿌리, 파바 콩, 브로콜리 라브, 라블랍, 루핀, 스터쿨리아, 벨벳 콩, 날개 콩, 얌 콩, 멀가, 아이언위드, 우산 부시, 츤출라, 와칼풀카, 위체티 부시, 와이어리 와틀, 키아, 비치 너트, 캔들너트, 콜로신스, 마몬치요, 마야 너트, 몽공고, 오그보노 너트, 파라다이스 너트, 및 쳄페닥으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
식물이 단자엽식물이거나 종자가 단자엽식물의 종자인 경우, 단자엽식물은 옥수수, 밀, 귀리, 벼, 보리, 수수, 바나나, 양파, 마늘, 아스파라거스, 독보리, 수수, 포니오, 라이산, 니파 그래스, 강황, 사프란, 양강, 골파, 카르다몸, 대추 야자, 파인애플, 샬롯, 리크, 스칼리온, 마름, 램프, 율무, 대나무, 왕바랭이, 분개구리밥, 화살잎 코끼리귀, 타히티 시금치, 마닐라삼, 빈랑, 바즈라, 베텔 너트, 빗자루 수수, 빗자루 수수, 시트로넬라, 코코넛, 코코얌, 메이즈, 토란, 듀라, 듀럼 밀, 에도, 피크, 포르미오, 생강, 새발풀, 에스파르토 그래스, 수단 그래스, 기니아 콘, 마닐라삼, 용설란, 하이브리드 메이즈, 팥수수, 레몬 잔디, 마게이, 블러시 밀레트, 핑거 밀레트, 폭스테일 밀레트, 일본 밀레트, 프로소 밀레트, 뉴질랜드 삼, 귀리, 기름 야자, 팔미라 야자, 사고 야자, 레드톱, 사이잘, 수수, 스펠트 밀, 사탕 옥수수, 사탕 수수, 사탕수수, 타로, 테프, 티모시 그래스, 라이밀, 바닐라, 밀, 및 얌으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
식물이 나자식물이거나 종자가 나자식물의 종자인 경우, 나자식물은 아라우카리아세아에(Araucariaceae), 보웨니아세아에(Boweniaceae), 브라시카세아에(Brassicaceae), 세팔로탁사세아에(Cephalotaxaceae), 쿠프레사세아에(Cupressaceae), 시카다세아에(Cycadaceae), 에페드라세아에(Ephedraceae), 긴코아세아에(Ginkgoaceae), 그네타세아에(Gnetaceae), 피나세아에(Pinaceae), 포도카르파세아에(Podocarpaceae), 탁사세아에(Taxaceae), 탁소디아세아에(Taxodiaceae), 웰위치아세아에(Welwitschiaceae), 및 자미아세아에(Zamiaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 과로부터의 것일 수 있다.
식물이 브라시카세아에 과로부터의 것인 경우, 식물은 브라시카(Brassica) 속의 식물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 브라시카세아에 과의 식물은 브라시카 나푸스(Brassica napus), 브라시카 라파(Brassica rapa), 브라시카 준세아(Brassica juncea), 브라시카 히르타(Brassica hirta), 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea), 라파누스 사티부스(Raphanus sativus), 시나푸스 알바(Sinapus alba), 또는 레피디움 사티붐(Lepidium sativum)을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 식물 및 식물 종자는 트랜스제닉 식물 또는 식물 종자, 예컨대 트랜스제닉 곡물 (밀, 벼), 메이즈, 대두, 감자, 목화, 담배, 오일시드 평지 및 과실 식물 (사과, 배, 감귤류 과실 및 양조용 포도를 포함한 포도의 과실)을 포함할 수 있다. 바람직한 트랜스제닉 식물은 옥수수, 대두, 감자, 목화, 담배, 사탕무, 사탕수수, 및 오일시드 평지를 포함한다.
적합한 트랜스제닉 식물 및 종자는 특히 바실루스 투린기엔시스 유전 물질로부터의 독소의 식물의 형성 (예를 들어, 유전자 CryIA (a), CryIA (b), CryIA (c), CryIIA, CryIIIA, CryIIIB2, Cry9c, Cry2Ab, Cry3Bb, CryIF 또는 이들의 조합에 의한)을 특징으로 할 수 있다. 식물에서의 독소의 형성은 곤충, 거미류, 선충 및 민달팽이 및 달팽이에 대한 식물의 저항성을 증가시킨다 (이하 "Bt 식물"로 지칭됨). Bt 식물은 예를 들어 상표명 일드 가드(YIELD GARD)® (예를 들어 메이즈, 목화, 대두), 넉아웃(KNOCKOUT)® (예를 들어 메이즈), 스타링크(STARLINK)® (예를 들어 메이즈), 볼가드(BOLLGARD)® (목화), 누코튼(NUCOTN)® (목화) 및 뉴리프(NEWLEAF)® (감자) 메이즈 변종, 목화 변종, 대두 변종 및 감자 변종 하에서 상업적으로 입수가능하다. 제초제 내성 식물은 상표명 라운드업 레디(ROUNDUP READY)® (글리포세이트 내성, 예컨대 옥수수, 목화, 대두), 클리어필드(CLEARFIELD)® (예를 들어 메이즈), 리버티 링크(LIBERTY LINK)® (글루포시네이트로의 내성, 예를 들어 오일시드 평지), IMI® (이미다졸리논 내성을 가짐) 및 STS® (술포닐우레아에 대한 내성, 예컨대 메이즈) 하의 식물을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 식물 종자는 유전자 변형될 수 있다 (예를 들어, 제초제 내성, 환경 인자, 예컨대 물 스트레스, 가뭄, 바이러스, 및 질소 생산에 대한 내성, 또는 박테리아, 진균 또는 곤충 독소에 대한 저항성을 발현하는 유전자 변형된 식물 또는 식물 부분을 생성하는 임의의 종자). 적합한 유전자 변형된 종자는 서양평지 작물, 채소, 과실, 나무, 섬유 작물, 오일 작물, 괴경 작물, 커피, 꽃, 콩과식물, 곡물, 뿐만 아니라 단자엽식물 및 쌍자엽식물 종의 다른 식물의 것들을 포함한다. 바람직하게는, 유전자 변형된 종자는 땅콩, 담배, 잔디, 밀, 보리, 호밀, 수수, 벼, 평지씨, 사탕무, 해바라기, 토마토, 피망, 콩, 상추, 감자, 및 당근을 포함한다. 가장 바람직하게는, 유전자 변형된 종자는 목화, 대두, 및 옥수수 (사탕, 사료용, 종자용, 또는 팝콘)를 포함한다.
본 발명에 따라 처리될 수 있는 특히 유용한 트랜스제닉 식물은 예를 들어 다양한 국가 또는 지역 규제 기관으로부터의 데이터베이스에 열거된 형질전환 사건, 또는 형질전환 사건의 조합을 함유하는 식물이다 (예를 들어 http://gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx 및 http://www.agbios.com/dbase.php 참조).
본 발명을 상세하게 설명하였지만, 첨부된 청구범위에서 한정된 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 변형 및 변경이 가능함이 명백할 것이다.
실시예
하기 비-제한적 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공된다.
실시예 1. 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 제시하는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 구축
서열식별번호: 210 또는 서열식별번호: 211의 세린 프로테아제 또는 서열식별번호: 212의 세린 프로테아제 변이체를 제시하는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 구축하기 위해, pSUPER 플라스미드를 pUC57 플라스미드 (암피실린 저항성 카세트 및 ColE1 복제 원점을 함유함)와 바실루스 세레우스로부터의 pBC16-1 플라스미드 (테트라시클린 저항성 유전자, repU 복제 유전자 및 oriU 복제 원점을 함유함)의 융합을 통해 생성하였다. 이 5.8 kb 플라스미드는 이. 콜라이 및 바실루스 종 둘 다에서 복제할 수 있고, 이. 콜라이에서 β-락탐 항생제에 대한 저항성 및 바실루스 종에서 테트라시클린에 대한 저항성을 부여함으로써 선택될 수 있다. 기저 pSUPER 플라스미드를 BclA 프로모터 (서열식별번호: 149), 시작 코돈, BclA의 아미노산 20-35 (서열식별번호: 1의 아미노산 20-35) 및 알라닌 링커 서열을 서열식별번호: 210, 서열식별번호: 211, 또는 서열식별번호: 212와 프레임 내에서 융합시킨 PCR-생성된 단편의 삽입에 의해 변형시켜, 각각 pSUPER-BclA 20-35-서열식별번호: 210, pSUPER-BclA 20-35-서열식별번호: 211, 또는 pSUPER-BclA 20-35-서열식별번호: 212로 용어화된 플라스미드를 생성하였다. 이 구축물을 이. 콜라이 내로 형질전환시키고, 리소제니(Lysogeny) 브로쓰 플레이트 더하기 암피실린 (100 μg/mL) 상에 플레이팅하여 단일 콜로니를 얻었다. 개별 콜로니를 사용하여 리소제니 브로쓰 더하기 암피실린을 접종하고, 37℃, 300 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성된 배양물로부터의 플라스미드를 상업용 플라스미드 정제 키트를 사용하여 추출하였다. 이들 플라스미드 추출물의 DNA 농도를 분광광도법을 통해 결정하고, 얻어진 플라스미드를 제한 효소의 적절한 조합으로의 분석적 소화로 처리하였다. 생성된 소화 패턴을 아가로스 겔 전기영동에 의해 가시화하여 플라스미드 크기 및 뚜렷한 플라스미드 특색의 존재를 조사하였다. 정제된 pSUPER 유도체의 관련 섹션, 예컨대 서열식별번호: 210, 서열식별번호: 211 또는 서열식별번호: 212 발현 카세트를 생거 시퀀싱에 의해 추가로 조사하였다.
추가적으로 및 대안적으로, 상기 기재된 pSUPER 플라스미드의 유도체 플라스미드를 하기와 같이 생성하였다. 상기 기재된 pSUPER 플라스미드의 pBC 단편 (BclA/세린 프로테아제 변이체 발현 카세트 및 테트라시클린 저항성을 포함하는 pSUPER의 pBC16-1-유래 섹션)을 PCR에 의해 증폭시키고, 이어서 블런트-말단 라이게이션에 의해 원형화하였다.
상기 기재된 바와 같이 확인된 pSUPER, 및 pBC 플라스미드 라이게이션물을 전기천공에 의해 바실루스 투린기엔시스 BT013A 내로 도입하였다. 단일 형질전환된 콜로니를 테트라시클린 (10 μg/mL)을 함유하는 영양분 브로쓰 플레이트 상에 플레이팅함으로써 단리하였다. 개별 양성 콜로니를 사용하여 테트라시클린 (10 μg/mL)을 함유하는 뇌 심장 주입 브로쓰를 접종하고, 30℃, 300 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성된 배양물의 게놈 DNA를 정제하고, pSUPER 플라스미드 또는 pBC 플라스미드의 관련 섹션을 재-시퀀싱하여 클로닝된 서열의 유전자 순도를, 및 pBC에 대해, 올바른 라이게이션 부위를 확인하였다. 확인된 콜로니를 10 μg/mL 테트라시클린을 갖는 뇌 심장 주입 브로쓰에서 밤새 성장시키고, 효모 추출물-기재 배지에서 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션을 통해 포자형성하도록 유도하였다. 상기-기재된 플라스미드를 운반하는 BT013A에 대한 약칭은 하기 표 5에 기재되어 있다.
바실루스 투린기엔시스 BT013A를 미국 61604 일리노이주 피오리아 노쓰 유니버시트 스트리트 1815에 주소를 둔 미국 농무부 (USDA) 농업 연구소 (ARS)에 2014년 3월 10일에 기탁하고, 수탁 번호 NRRL B-50924를 할당받았다. 바실루스 투린기엔시스 BT013A는 또한 바실루스 투린기엔시스 4Q7로 공지되어 있다.
실시예 2. 세린 프로테아제 변이체를 발현하는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터의 포자외막 단편의 구축 및 정제
넉 아웃 (KO) 돌연변이체: 바실루스 투린기엔시스 BT013A의 exsY 넉아웃 (KO) 돌연변이체 균주를 제조하기 위해, 이. 콜라이에서 복제할 수 있는 pUC57 백본, 뿐만 아니라 pE194로부터의 복제 원점 및 에리트로마이신 저항성 카세트를 함유한 플라스미드 pKOKI 셔틀 및 통합 벡터를 구축하였다. 이 구축물은 이. 콜라이 및 바실루스 종 둘 다에서 복제할 수 있다. exsY 유전자의 상류 영역에 상응한 1 kb DNA 영역 및 유전자 exsY의 하류 영역에 상응한 1 kb 영역을 함유한 구축물을 제조하였으며, 이들 둘 다는 바실루스 투린기엔시스 BT013A로부터 PCR 증폭되었다. 각각의 구축물에 대해, 2개의 1 kb 영역을 이어서 각각 서로에 대해 중첩하는 영역으로 및 pKOKI 플라스미드로 상동성 재조합을 사용하여 함께 스플라이싱하였다. 이 플라스미드 구축물을 소화 및 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 클론을 에리트로마이신 저항성에 대해 스크리닝하였다.
클론을 고온 (40℃) 하에서 뇌 심장 주입 브로쓰에서 계대하였다. 개별 콜로니를 에리트로마이신 5 μg/mL를 함유하는 LB 한천 플레이트 상으로 이쑤시개로 찍어내고, 30℃에서 성장시키고, 콜로니 PCR에 의해 염색체 내로 통합된 pKOKI 플라스미드의 존재에 대해 스크리닝하였다. 통합 사건을 가진 콜로니를 계대를 통해 계속하여 에리트로마이신 저항성을 소실한 단일 콜로니에 대해 스크리닝하였다 (재조합에 의한 플라스미드의 소실 및 exsY 유전자의 제거를 의미함). 확인된 결실을 PCR 증폭 및 염색체의 표적 영역의 시퀀싱에 의해 확인하였다. 마지막으로, pSUPER-BclA 20-35 서열식별번호: 210 플라스미드, pSUPER-BclA 20-35 서열식별번호: 211 플라스미드 또는 pSUPER-BclA 20-35 서열식별번호: 212 플라스미드 (실시예 1에서 상기 기재됨)의 PCR-증폭된 원형화된 pBC 섹션을 BT013A의 이 exsY 돌연변이체 균주 내로 형질전환시켰다.
서열식별번호: 210 또는 211의 세린 프로테아제 또는 서열식별번호: 212의 세린 프로테아제 변이체를 발현하는 각각의 esxYKO 돌연변이체에 대해, 밤샘 배양물을 BHI 배지에서 30℃, 300 rpm에서 항생제 선택을 갖는 배플형 플라스크에서 성장시켰다. 이 밤샘 배양물 1 밀리리터를 배플형 플라스크 중의 효모 추출물-기재 배지 (50 mL) 내로 접종하고, 30℃에서 2일 동안 성장시켰다. 포자의 분취물을 제거하고, 포자를 볼텍싱에 의해 교반하였다. 포자를 8,000 x g에서 10분 동안 원심분리를 통해 수집하고, 포자외막 단편을 함유하는 상청액을 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 임의의 잔여 포자를 제거하였다. 여액에서 포자가 발견되지 않았다.
상기-기재된 플라스미드를 운반하는 BT013AexsYKO에 대한 약칭은 하기 표 5에 기재되어 있다.
실시예 3. 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자의 표면 상에 세린 프로테아제 변이체를 발현하는 비-항생제 선택가능한 마커를 포함하는 발현 카세트의 용도
서열식별번호: 212를 실시예 1에 기재된 pSUPER 플라스미드의 유도체 내로 클로닝하였다. 이 유도체에서, 테트라시클린 저항성 마커는 이전에 비-항생제 선택가능한 마커로 교환되었다. 이 유도체 pSUPER 플라스미드의 pBC 단편을 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다. pBCnam212로 지칭되는 생성된 pBC 라이게이션물을 전기천공을 사용하여 비-항생제 선택가능한 마커의 용도를 지지하도록 변형된 바실루스 투린기엔시스 BT013A 유도체 균주 내로 도입하였다. 형질전환물의 단일 콜로니를 페트리 플레이트 상의 적합한 선택 배지 상에 플레이팅함으로써 얻었다. 개별 콜로니를 사용하여 적합한 선택 배지를 접종하고, 30℃, 300 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성된 배양물의 게놈 DNA를 정제하고, pBC 플라스미드를 재-시퀀싱하여 유전자 순도를 확인하였다. 확인된 콜로니를 적합한 선택 배지에서 밤새 성장시키고, 효모 추출물-기재 배지에서 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션을 통해 포자형성하도록 유도하였다.
표 5. 다양한 플라스미드를 운반하는 박테리아에 대한 약칭
Figure pct00025
실시예 4. 대두 성장 룸 연구
식물 성장 및 발달을 측정하기 위해, 성장 룸 검정을 수행하였다. 2가지 대두 변종의 종자를 살진균 및 다른 살충 활성을 갖는 화학적 베이스 처리와 함께 BT013A-pBCnam212로부터의 전체 브로쓰 또는 BT013AexsYKO-pBC212로부터의 포자외막 단편 제제로 처리하였다. 대조군 종자를 단지 화학적 베이스로만 처리하였다. 전체 브로쓰 및 포자외막 단편 제제를 각각 전체 브로쓰에 대해 3.8 x 104 콜로니 형성 단위 ("CFU")/종자와 등가인 cwt 당 3.6 액량 온스의 비율로 적용하였다. (전체 브로쓰와 동일한 포자외막 단편 제제의 부피를 종자에 적용하여 전체 브로쓰의 그것과 대등한 적용률을 달성하였는데, 이는 세포로부터 포자외막 단편을 분리하는데 사용된 원심분리 및 여과 과정 동안 매우 적은 액체가 소실되기 때문이다.) 성장 룸 검정을 설정하기 위해, 상부 토양을 균질할 때까지 시멘트 혼합기 내부에서 모래와 2:1의 부피 비로 혼합하였다. 이어서 토양 혼합물을 트레이 당 9개의 포트를 갖는 플라스틱 트레이 내로 정치된 작은 포트 (3.5" L x 3.5" W x 4" D)에 첨가하였다. 트레이를 성장 룸 시험 위치로 이동시켰다. 48시간 후, 50 mL의 물을 각각의 포트에 고르게 첨가하였다. 이어서, 2개의 종자를 포트 당 1"의 깊이로 식재하고, 건조 토양 혼합물로 덮었다. 총 16개의 종자를 반복실험 당 식재하였다. 각각의 종자 처리를 변종 당 3회의 반복실험에서 시험하였다. 생성된 트레이를 선반 상에 13-시간 명/11-시간 암 스케줄로 설정된 고-강도 광 하에 정치하였다. 필요에 따라 물을 주었다. 비료는 사용하지 않았다. 트레이를 2일마다 회전시켜 위치 효과를 최소화하였다. 데이터를 각각의 발아된 식물로부터 수집하였다.
높이 측정을 2개의 식물 성장 마일스톤 자엽 신장 및 단엽 출현에서 상응하는 잎 마디에 대해 취하였다. 이들 측정을 대조군 식물의 대략 50%가 상응하는 표석 성장 단계를 나타내었을 때 취하였다. 잎 표면적 백분율을 오클라호마 스테이트 유니버시티(Oklahoma State University)에서 개발된 모바일 애플리케이션 카노페오(Canopeo) (미국 오클라호마주 스틸워터; (https://appcenter.okstate.edu/content/canopeo)를 이용하여 단엽 출현 마일스톤에서 취하였다. 이 애플리케이션은 식물 물질에 의해 점유된 기록된 면적의 백분율을 결정하기 위해 디지털 사진을 이용한다. 식물이 제2 삼출엽 성장 단계에 있으면, 이들을 그들의 삽입물로부터 제거하고, 뿌리 구조에 부착된 먼지를 물을 사용하여 제거하였다. 페이퍼 타올로 패딩함으로써 과잉의 물의 제거 후, 신선한 뿌리 바이오매스를 기록하였다. 각각의 경우, 화학적 베이스에 추가로 세린 프로테아제 구축물로 처리된 식물로부터의 결과를 단지 화학적 베이스 처리만을 받은 각각의 시험에서의 식물에 대해 정규화하였다. 표 6은 단지 화학적 베이스로만 처리된 종자와 비교하여 퍼센트 증가를 나타낸다. 결과는 둘 다의 처리가 동일한 방식으로 식물 성장을 향상시킴을 지시한다.
표 6
Figure pct00026
실시예 5. 대두 포낭 선충을 방제하는 세린 프로테아제 변이체를 제시하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 용도
종자를 1 x 1010 콜로니 형성 단위 (세린 프로테아제 변이체를 발현하는 재조합 세포의) ("CFU")/100 kg 종자와 등가인 살곤충제/살진균제 (화학적) 베이스 또는 동일한 화학적 베이스 더하기 234.8 mL/100 kg의 BT013A-pBCnam212의 전체 브로쓰 배양물로 처리하였다. 둘 다의 처리를 사양토 토양 내로 식재하였다. 출현 후 10일에, 대두 식물을 2,000개의 제2 단계 유생 대두 포낭 선충 (헤테로데라 글리시네(Heterodera glycine))으로 접종하였다. 식물을 4주 후에 수확하고, 포낭을 제거하고, 체, 원심분리, 및 수크로스 용액의 시스템을 사용하여 수집하였다. 이어서 포낭을 으깨어 알을 방출시키고, 이를 각각의 처리로부터 각각의 10개의 식물로부터 수집된 총 용액으로부터 3개의 하위-샘플을 취함으로써 나열하였다. Sep1-처리된 종자는 하기 표 7에 나타내어진 바와 같이, 선충 알의 총 수, 및 포낭 추출 후 각각의 식물 근계의 건조 중량에 의해 계산된 뿌리의 그램 당 알의 수 둘 다의 감소를 나타내었다. 평균 알/그램 뿌리는 Sep1-처리된 종자에서 50% 초과 감소되었다.
표 7
Figure pct00027
그의 제조가 상기 실시예 3 및 2에 기재된 BT013A-pBCnam212의 전체 브로쓰 배양물 및 BT013AexsYKO-pBC212의 포자외막 단편을 활성을 시험하는 추가의 실험을 상기와 같이 수행하였다. 모든 종자를 (i) 표 8에 나타내어진 바와 같은 살곤충제/살진균제 (화학적) 베이스; (ii) 상업용 살선충제 (0.25 mg ai/종자로 적용됨)를 갖는 표 8의 화학적 베이스; 또는 (iii) 표 8의 화학적 베이스, 및 234.8 mL/100kg의 둘 다 세린 프로테아제 변이체를 발현하는 전체 브로쓰 배양물 또는 포자외막 단편 제제로 처리하였다. 각각의 전체 브로쓰 배양물의 농도는 5 x 106 CFU/mL이었다. 상기 언급된 바와 같이, 전체 브로쓰와 동일한 부피의 포자외막 단편 제제를 종자에 적용하여 전체 브로쓰의 그것과 대등한 적용률을 달성하였는데, 이는 세포로부터 포자외막 단편을 분리하는데 사용된 원심분리 및 여과 과정 동안 매우 적은 액체가 소실되기 때문이다. 알/뿌리의 그램을 각각의 샘플링된 식물로부터의 근계의 건조 중량을 이용하여 계산하였다 (표 9에 나타내어진 바와 같음). 둘 다의 세린 프로테아제 구축물은 뿌리의 그램 당 회수된 SCN 알의 수를 감소시키고 (~40%) 뿌리 부피를 증가시키는 (감소된 선충 압력과 관련될 가능성이 큼)데 관하여 상업용 살선충제와 유사한 성능을 나타내었다.
표 8
Figure pct00028
표 9
Figure pct00029
실시예 6. 대두에서 식물 성장을 자극시키는 세린 프로테아제 변이체를 제시하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 또는 정제된 포자외막의 용도
상기 실시예 3 및 2에 기재된 제제인 BT013A-pBCnam212의 전체 브로쓰 배양물 및 BT013AexsYKO-pBC212의 포자외막 단편의 식물 성장 촉진 능력을 시험하기 위한 필드 시험을 대두에서 수행하였다. 각각 서열식별번호: 212의 세린 프로테아제 변이체를 제시하는 전체 브로쓰 배양물 또는 포자외막 단편 제제를 살진균 및 살충 활성을 갖는 화학적 베이스 처리와 함께 대두 종자에 적용하였다. 전체 브로쓰를 100 kg 종자 당 234 mL인 1 x 1010 콜로니 형성 단위 ("CFU")/100 kg 종자의 비율로 적용하였다. 전체 브로쓰와 동일한 부피의 포자외막 단편 제제를 종자에 적용하여 전체 브로쓰의 그것과 대등한 적용률을 달성하였는데, 이는 세포로부터 포자외막 단편을 분리하는데 사용된 원심분리 및 여과 과정 동안 매우 적은 액체가 소실되기 때문이다. 이러한 처리된 대두 종자를 식재하고, 수확까지 정상 시즌 동안 성장시켰다. 하기 표 10은 단지 화학적 베이스로만 처리된 종자에 비해, 각각 4회의 반복실험으로 이루어진 10회의 시험에서 상기 구축물이 어떠한 성능을 나타내었는지를 나타낸다.
표 10
Figure pct00030
실시예 7. 대두 포낭 선충, 뿌리 혹 선충 및 병변 선충을 방제하는 세린 프로테아제 변이체를 제시하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 용도 - 필드 시험
헤테로데라 글리시네스 (SCN) 실험
종자를 상업용 살곤충제/살진균제 베이스 단독으로 또는 2가지 상업용 종자 적용된 살선충제 및 하기 표에서 "세린 프로테아제 구축물"로 지칭되는 BT013AexsYKO-pBC212로부터의 포자외막 단편을 포함한 3가지 시험 처리 중 하나로 처리하였다. 포자외막 단편에 대한 적용률은 CFU/종자 및 부피/100 kg 종자의 용어로 제공된다. 이는 포자외막 단편 제제가 그것이 유래된 전체 브로쓰로부터 분리되는 경우, 세포로부터 포자외막 단편을 분리하는데 사용된 원심분리 및 여과 과정 동안 매우 적은 액체가 소실되기 때문이며, 따라서 CFU/종자는 결과를 다른 실험과 비교할 때 유용한 또 다른 적용률을 제공한다. 처리 당 총 140개의 종자 (표 1)를 작은 스트립 마이크로-플롯에서 손으로 식재하였다. 처리 당 4개의 렙 (각각 35개의 종자)을 무작위화 완전 블록 디자인으로 배열하였다. 식재 직전에, 5개의 토양 코어 샘플 (각각 상부 10 cm를 버린 30 cm 깊이)을 취하고, 각각의 마이크로-플롯에 대한 종합 샘플을 생성하는데 이용하고, 분석하여 자연 SCN 집단을 결정하였다. 마이크로-플롯 당 SCN 유충의 평균 수는 402 내지 556개/토양의 100 cc의 범위였다 (표 12). 출현 후, 각각의 식물을 6,200개의 SCN 알 및 유충을 함유하는 혼합물로 접종하고, 식물을 V2 발달 단계에서 마이크로-플롯 당 정확히 30개로 후자를 얇게 하였다. 10주 (70 DAP)에서, 플롯 당 5개의 식물을 캐내었다. 토양을 수집하고, 각각의 식물의 뿌리 구역 주위로부터 종합하고, 선충의 카운트/토양의 100 cm3를 결정하는데 사용하였다. 수확된 뿌리를 프로세싱하여 (포낭을 수집하고, 뿌리를 건조 및 칭량함) 포낭/뿌리의 그램을 결정하였다. 마지막으로, 포낭을 으깨고, 알을 수집하여 회수된 총 알/플롯을 비교하였다. 표 12에 나타내어진 바와 같이, SCN의 평균 초기 자연 집단의 평가는 모든 4가지 처리에 걸쳐 유사하였으며, 세린 프로테아제 구축물은 뿌리 상의 및 주위의 토양에서의 선충 카운트를 감소시키는데 관하여 2가지 상업용 살선충제와 유사한 (수치적으로 약간 더 양호한) 성능을 나타내었다.
표 11
Figure pct00031
표 12
Figure pct00032
멜로이도기네 인코그니타 (RKN) / 헤테로데라 글리시네스 (SCN) 실험
마이크로-플롯을 식재시 훈증된 확인된 선충 무함유 토양을 갖는 매몰된 용기 (16" 직경)에서 생성하였다. 2가지 별개의 실험을 수행하였는데, 하나는 RKN (표 13)으로 및 하나는 RKN 및 SCN의 조합 (표 14)으로였다. 상이한 변종의 그러나 이전의 실험 (표 11)으로부터의 동일한 처리 목록을 갖는 종자를 무작위화 완전 블록 디자인으로 배열된 각각의 시험에 대해 처리 당 8개의 마이크로-플롯/렙으로 손으로 식재하였다 (마이크로-플롯 당 2개). 마이크로-플롯의 절반 (32)을 RKN 알로 접종하고, 다른 절반은 VC 및 VE 발달 단계 사이의 RKN 및 SCN 알의 믹스로 접종하였다. 접종 후 30일에, 처리 당/실험 당 4개의 마이크로-플롯을 취하고, 회수된 2개의 식물을 종합 정성적 벌레혹 레이팅 (0-가장 양호 내지 6-가장 나쁨)을 제공하였다. 토양 샘플을 또한 수확된 식물 주위로부터 수집하여 4개의 개별 종합 샘플을 생성하고, 이를 토양의 100 cm3 당 선충에 대해 분석하였다. 이어서 나머지 마이크로-플롯을 30일 후에 수확하였다 (접종 후 60일). 동일한 절차를 사용하여 모든 나머지 식물에 대해 벌레혹 레이팅을 수행하고, 마지막으로 캐낸 뿌리를 종합하고, 제1 실험에서 뿌리의 그램 당 RKN 및 공동-접종 실험에서 뿌리의 그램 당 RKN 및 SCN을 결정하기 위해 분석하였다. 표 13 및 표 14에 나타내어진 바와 같이, 세린 프로테아제 구축물은 토양 및 처리된 식물의 뿌리 상 둘 다에서 RKN 및 SCN 집단 둘 다를 감소시키는데 관하여 2가지 상업용 살선충제보다 양호한 (또는 보다 양호한) 성능을 나타내었다.
표 13
Figure pct00033
표 14
Figure pct00034
프라틸렌쿠스( Pratylenchus ) - 병변 선충 실험
종자를 상업용 살곤충제/살진균제 베이스 단독으로 또는 2가지 상업용 종자 적용된 살선충제 및 하기 표에서 "세린 프로테아제 구축물"로 지칭되는 BT013AexsYKO-pBC212로부터의 포자외막 단편을 포함한 3가지 시험 처리 중 하나로 처리하였다. 표 8에 기재된 바와 같이 처리된 종자를 손으로 식재하고, 온실에서 작은 포트에서 발아시키고, V1 발달 단계에서 처리 당 8개의 식물을 100개의 병변 (프라틸렌쿠스) 유충으로 접종하였다. 접종된 식물 (및 주위의 토양)을 무작위 완전 블록 디자인으로 필드 (시험되고 자연 병변 집단을 나타내지 않았음)에 이식하였다. 8주 후, 코어 토양 샘플을 각각의 시험 식물의 주위로부터 취하여 토양의 100 cm3 당 선충의 수를 결정하였다. 토양 샘플링 후, 개별 식물을 캐내고, 25 g의 뿌리 조직을 각각의 식물의 근단으로부터 수집하였다. 이어서 뿌리 조직을 배르만 펀넬(Baermann Funnel) 절차를 사용하여 분석하여 뿌리의 그램 당 병변 선충의 수를 결정하였다 (표 15). 표 15에 나타내어진 바와 같이, 2가지 상업용 살선충제 및 세린 프로테아제 구축물은 대조군과 비교하여 뿌리 및 처리된 식물을 둘러싼 토양 둘 다에서 프라틸렌쿠스 (뿌리 병변) 선충에 대한 유사한 영향을 가졌다.
표 15
Figure pct00035
실시예 8. 프로테아제 검정
바실루스 포자의 포자외막 상에 발현된 전장 (서열식별번호: 210 및 211) 및 변이체 (서열식별번호: 212) 세린 프로테아제 효소의 활성을 결정하고 비교하기 위해, 프로테아제 검정을 다양한 프로테아제, 예컨대 세린, 시스테인, 메탈로 및 아스파르트산 프로테아제를 검출하는 상업용 프로테아제 키트 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) PF0100)를 사용하여 수행하였다.
BT013A 야생형 (7.90 x 107 CFU/mL), BT013A-pBC210, BT013A-pBC211 (각각 4.34 x 107 CFU/mL로) 및 BT013A-pSuper212 (3.40 x 107 CFU/mL)의 1 mL의 포자형성된 배양물을 8,000 x g에서 10분 동안 회전시키고, 상청액을 제거하였다.
세포를 1mL 버터필드(Butterfield) 포스페이트 완충제로 세척하고, 8,000 x g에서 10분 동안 다시 회전시키고, 상청액을 제거하였다. 세포 펠릿을 50 μL (20X 농축) 버터필드 포스페이트 완충제에 재현탁시켰다. 10 μL의 각각의 샘플을 검정에 사용하였다.
검정을 제조업체의 지시서에 따라 수행하였다. 간략하게, 10 μL의 3가지 배양물 또는 10 μL의 다양한 농도의 트립신, 양성 대조군을 20 μL 인큐베이션 완충제 및 20 μL의 FITC 카세인 기질과 혼합하였다. 각각의 검정을 동일한 출발 농축된 세포 배양물을 사용하여 삼중으로 수행하였다. 블랭크를 또한 샘플로서 버터필드 포스페이트 완충제를 치환함으로써 제조하였다. 샘플을 어둠에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 150 μL의 0.6N TCA를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 샘플을 어둠에서 37℃에서 추가의 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 펠릿화하였다. 10 μL의 상청액을 1 mL 검정 완충제와 혼합하고, 200 μL를 이중으로 96-웰 흑색 평저 검정 플레이트에 옮겼다. 형광을 485 nm에서의 여기 및 535 nm에서의 방출로 측정하였다. 플레이트로부터의 이중 값을 평균하고, 그들 값을 사용하여 삼중 샘플의 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 블랭크 샘플의 평균을 포자를 함유하는 샘플의 평균으로부터 차감하였다. 도 2는 삼중 샘플의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 이 검정은 서열식별번호: 210의 세린 프로테아제 및 서열식별번호: 212의 변이체 세린 프로테아제를 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터의 전체 브로쓰 및 야생형 BT013A로부터의 전체 브로쓰 사이의 활성의 차이를 고려하여, 시험된 전체 브로쓰 배양물이 프로테아제 활성을 가지며, 추가의 활성은 서열식별번호: 210 및 서열식별번호: 212의 발현된 세린 프로테아제로부터 유래됨을 나타낸다.
실시예 9. 세린 프로테아제 검정에서 측정된 바와 같은 유리 및 결합된 단백질의 안정성
BT013A의 포자외막에 결합된 세린 프로테아제 변이체 효소의 및 유리 효소의 안정성을 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 관심의 균주를 포자형성까지 성장시키고 (24시간 30℃ 250 rpm 콜로니 접종된 BHI; 48시간 30℃ 250 rpm 2% 종자 배양물 접종된 효모 추출물-기재 배지), 이어서 이 전체 브로쓰의 다중 여과 단계를 수행함으로써 효소 용액을 제조하였다. 관심의 균주는 BT013AexsYKO-pBC212 (포자외막 단편 상에 변이체 세린 프로테아제를 발현하는 균주) 및 BT013AexsYKO (포자외막 단편을 생성하는 플라스미드가 없는 돌연변이체 균주)이다. 전체 브로쓰는 상기 2가지 균주의 세포, 및 포자외막 상에 분비되고 또한 제시되는 염색체적으로 생성된 내인성 단백질 및 단지 포자외막 상에 제시되기만 하는 플라스미드 생성된 세린 프로테아제 효소 둘 다를 함유한다. 플라스미드는 본 발명자들이 결합된 단백질로 지칭하는, 대부분의 경우 포자외막 상에 머무는 단백질, 및 본 발명자들이 유리로 지칭하는 포자외막에서 떨어지는 일부를 생성하였다. 결합된 대 유리 형태의 단백질의 안정성을 시험하기 위해, 여과 단계를 사용하여 결합된 단백질 대 유리를 분리하였다.
관심의 균주의 세포는 그들의 포자외막 층을 흘려 (ExsY 넉-아웃으로 인해), 포자외막 단편을 함유한 전체 브로쓰를 생성하였다. 전체 브로쓰 샘플을 8000 x g에서 10분 동안 25℃에서 펠릿화하고, 펠릿을 버리고, 상청액을 0.22 μm 필터를 통해 유동시켜 모든 세포를 제거하였다. 무세포 상청액은 포자외막 결합된 및 유리 단백질 둘 다를 나타내고, "프로세싱된 스트립"으로 지칭된다. 이어서 프로세싱된 스트립을 50 kd 필터를 통해 여과하고, 포자외막의 스트립 상에 결합된 단백질을 나타내는 농축물을 저장하였다. 이어서 50 kd 여액을 3 kd 필터를 통해 여과하고, 유리 단백질을 나타내는 농축물을 저장하였다. 이들이 BT013AexsYKO-pBC212의 전체 브로쓰 배양물로부터의 상청액에서 발생할 때 결합된 단백질 안정성 및 유리 단백질 안정성을 나타내기 위해, 여과 전에 존재할 배경 단백질을 여과된 유리 및 결합된 단백질 분획에 다시 첨가하였다. 이를 달성하기 위해, BT013AexsYKO-pBC212의 배양물로부터의 포자외막-결합된 단백질 (즉, 50 kd 단백질 농축물)에 BT013AexsYKO에 대한 출발 전체 브로쓰 배양물의 CFU 농도에 대해 정규화된 BT013AexsYKO의 배양물로부터의 3 kd 농축물을 첨가하였다. 반대로, BT013AexsYKO-pBC212의 배양물로부터의 3kd 단백질 농축물에 BT013AexsYKO에 대한 출발 전체 브로쓰 배양물의 CFU 농도에 대해 정규화된 BT013AexsYKO의 배양물로부터의 50kd 농축물을 첨가하였다. 하기 연구에서 "결합된" 효소 용액은 50kd BT013AexsYKO-pBC212 + 3kd BT013AexsYKO를 함유하였다. 하기 연구에서 "유리" 효소 용액은 3kd BT013AexsYKO-pBC212 + 50kd BT013AexsYKO를 함유하였다.
결합된 및 유리 효소 용액의 온도 안정성을 상기 기재된 조 효소 용액을 상이한 온도에서 인큐베이션함으로써 결정하였다. 시험 튜브 중의 결합된 및 유리 효소 용액 (50 ml)을 특정된 온도 (22℃-80℃)에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 프로테아제 활성을 하기 기재된 바와 같이 측정하고, 퍼센트 잔여 활성을 상이한 온도에서 인큐베이션된 효소의 프로테아제 활성을 22℃에서의 활성과 비교함으로써 계산하였다. 이 실험은 삼중으로 수행하였다.
Sep1 프로테아제 활성을 합성 펩티드 기질 (Ala-Ala-Pro-Phe)을 사용하여 결정하였다. 펩티드 기질은 C-말단에서 니트로 페닐 및 N-말단에서 숙시닐 기와 융합된다. 펩티드는 프로테아제 절단 전에 320 nm에서 흡광도 최대값을 나타내고, 절단 후 390 nm로 이동한다. 검정 혼합물은 5 mM CaCl2를 함유하는 240 μl의 50 mM 헤페스(Hepes) 완충제 pH 7.5 중 10 μl의 2.5 mg/mL 펩티드 기질로 이루어졌다. 기질 및 완충제를 실온에서 사전-인큐베이션하고, 이어서 25 μl의 효소 용액을 첨가하였다. 효소 활성의 속도를 390 nm에서 OD의 연속적 증가로서 분광광도계에서 모니터링하였다. 효소 활성의 속도를 곡선의 초기 기울기를 측정함으로써 결정하였다. 결과는 도 3에 나타내어진다. 이 데이터는 결합된 세린 프로테아제 효소가 유리 효소보다 더 안정함을 나타낸다.
실시예 10. 세린 프로테아제 검정에서의 포자외막 단편의 활성의 비교
BT013AExsYKO (9.79 x 107 CFU/ml), BT013AExsYKO-pBC210 (7.06 x 107 CFU/ml) 및 BT013AExsYKO-pBC212 (7.06 x 107 CFU/ml)의 전체 브로쓰 배양물을 실시예 2에 기재된 바와 같이 각각의 균주 뒤에 지시된 CFU 농도로 성장시켰다. 포자외막 단편 여액을 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하고, 각각의 동등한 부피를 하기와 같이 시험하였다. 효소 활성을 합성 펩티드 기질 (Ala-Ala-Pro-Phe)을 사용하여 결정하였다. 펩티드 기질은 C-말단에서 니트로 페닐 및 N-말단에서 숙시닐 기와 융합된다. 펩티드는 프로테아제 절단 전에 320 nm에서 흡광도 최대값을 나타내고, 절단 후 390 nm로 이동한다. 검정 혼합물은 5 mM CaCl2를 함유하는 240 μL의 50 mM 헤페스 완충제 pH 7.5 중 10 μL의 2.5 mg/mL 펩티드 기질로 이루어졌다. 기질 및 완충제를 실온에서 사전-인큐베이션하고, 이어서 25 μL의 효소 용액을 첨가하였다. 결과는 도 4에 나타내어진다. 이 데이터는 둘 다의 전체 브로쓰 배양물이 효소 활성을 갖고, BT013AExsYKO-pBC212가 BT013AExsYKO-pBC210보다 약간 더 높은 활성을 가짐을 나타낸다. 임의의 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 본 출원인은 변이체 세린 프로테아제 (서열식별번호: 212)를 갖는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 전장 세린 프로테아제 (서열식별번호: 210)를 갖는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원보다 더 큰 생물학적 활성을 갖는다고 가설화한다.
실시예 11 - 대두 포낭 선충을 방제하는 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 제시하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 용도
모든 종자를 (i) 표 16에 나타내어진 바와 같은 살곤충제/살진균제 베이스, (ii) 상업용 살선충제 (0.25mg ai/종자로 적용됨)를 갖는 표 16에 나타내어진 베이스, 또는 (iii) 표 16에 나타내어진 베이스 및 표 17에 열거된 바와 같은 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 제조된 전체 브로쓰 배양물 또는 포자외막 단편 제제로 처리하였다. 모든 생물학적 처리물을 234.8 mL/대두 종자의 100 kg으로 적용하였다. 하기 표 17에 제공된 CFU 농도 (CFU/mL)는 종자에 적용된 전체 브로쓰 배양물의 또는 실시예 2에 기재된 바와 같이 포자외막 단편이 제조된 전체 브로쓰 배양물의 CFU를 나타낸다.
각각의 처리로부터의 단일 종자를 사양토 토양의 개별 포트 내로 식재하고, 식재 후 7일에 ~1,500개의 연충형 헤테로데라 글리시네스 (SCN) 알로 접종하였다. 4주 후에, 식물 및 포낭을 수확하고, 상대 포낭/뿌리의 그램을 비교하는데 이용하였다. 세린 프로테아제 구축물로 형질전환되지 않은 2가지 생물학적 처리물, BT013A의 전체 브로쓰 배양물 및 BT013AexsYKO의 배양물의 포자외막 단편 제제는 베이스 처리와 유사한 수의 포낭을 가진 반면, 세린 프로테아제 구축물을 함유하는 4가지 생물학적 처리물은 상업용 살선충제와 유사한 포낭의 감소를 가졌다 (도 5).
표 16
Figure pct00036
표 17
Figure pct00037
상기의 관점에서, 본 발명의 몇몇 목적이 달성되고, 다른 유리한 결과가 얻어졌음을 알 것이다. 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 상기 생성물, 제제, 및 방법에 다양한 변화가 이루어질 수 있기 때문에, 상기 설명에 함유된 모든 요지는 예시적인 것으로 해석될 것이고, 제한적인 의미로 해석되지 않을 것으로 의도된다.
실시양태
추가의 예시를 위해, 본 개시내용의 추가의 비-제한적 실시양태가 하기 제시된다.
실시양태 1은 하기 표 18의 칼럼 2에 기재된 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편 및 칼럼 1에 기재된 효소를 포함하는 융합 단백질이다.
표 18. 융합 단백질
Figure pct00038
실시양태 2는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편 및 효소 사이에 아미노산 링커를 갖는 실시양태 1의 임의의 융합 단백질이다.
실시양태 3은 링커가 폴리알라닌 링커, 폴리글리신 링커, 또는 알라닌 및 글리신 잔기 둘 다의 혼합물을 포함하는 링커를 포함하는 것인 실시양태 2의 임의의 융합 단백질이다.
실시양태 4는 실시양태 1-3의 임의의 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이다.
실시양태 5는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 바실루스 투린기엔시스 BT013A를 포함하는 것인 실시양태 4의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이다.
실시양태 6은 야생형 포자의 포자외막과 비교하여 포자로부터 제거하기가 보다 용이한 포자외막을 갖는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자를 생성하는 돌연변이를 갖는 실시양태 4의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이다. 구체적으로, 돌연변이를 갖는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 하기 돌연변이 중 하나를 가질 수 있다:
(i) CotE 유전자에 돌연변이;
(ii) ExsY 단백질을 발현하고, 여기서 ExsY 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 ExsY 단백질의 발현과 비교하여 증가되고, ExsY 단백질은 구상 단백질을 포함하는 카르복시-말단 태그를 포함함;
(iii) BclB 단백질을 발현하고, 여기서 BclB 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 BclB 단백질의 발현과 비교하여 증가됨;
(iv) YjcB 단백질을 발현하고, 여기서 YjcB 단백질의 발현은 동일한 조건 하에서 야생형 바실루스 세레우스 패밀리 구성원에서의 YjcB 단백질의 발현과 비교하여 증가됨;
(v) ExsY 유전자에 돌연변이를 포함함;
(vi) CotY 유전자에 돌연변이를 포함함;
(vii) ExsA 유전자에 돌연변이를 포함함; 또는
(viii) CotO 유전자에 돌연변이를 포함함.
실시양태 7은 ExsY 또는 CotY 유전자에 돌연변이를 갖는 실시양태 6의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 포함한다.
실시양태 8은 실시양태 6 및 7 중 어느 하나의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터의 포자외막 단편을 포함한다.
실시양태 9는 실시양태 4 및 5 중 어느 하나의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 및 농업상 허용되는 담체를 포함한다.
실시양태 10은 실시양태 8의 포자외막 단편 및 농업상 허용되는 담체를 포함한다.
실시양태 11은 선충 방제 활성을 갖는 세린 프로테아제 변이체에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 이 실시양태의 한 측면에서, 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열식별번호: 213의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (iii) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
실시양태 12는 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 지정할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 실시양태 11의 핵산 분자를 포함한다. 상기 실시양태의 한 측면에서, 프로모터는 뉴클레오티드 서열에 대해 이종이거나 외래이고, 뉴클레오티드 서열에 대해 천연이거나 천연 발생 프로모터가 아니다.
실시양태 13은 실시양태 11 또는 12의 핵산 분자를 함유하는 벡터를 포함한다. 한 측면에서, 벡터는 발현 벡터이다.
실시양태 14는 실시양태 13의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 바실루스 세포 또는 이. 콜라이 세포이다.
실시양태 15는 (i) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; (ii) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 또는 (iii) 서열식별번호: 213에 의해 코딩되는 펩티드를 포함하는 해충 방제 활성을 갖는 세린 프로테아제 변이체를 포함한다. 한 측면에서, 펩티드는 이종 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 해충 방제 활성은 선충 방제 활성이다.
실시양태 16은 실시양태 15의 세린 프로테아제 변이체를 포함하는 조성물을 포함한다.
실시양태 17은 약 1 중량% 내지 약 99 중량%의 세린 프로테아제 변이체를 포함하는 실시양태 16의 조성물을 포함한다.
실시양태 18은 실시양태 14의 숙주 세포를 세린 프로테아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 실시양태 15의 세린 프로테아제 변이체를 생산하는 방법을 포함한다.
실시양태 19는 실시양태 15의 세린 프로테아제 변이체 또는 실시양태 16의 조성물을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 또는 해충, 예컨대 선충에 적용하는 것을 포함하는, 해충을 방제하는 방법을 포함한다. 실시양태 19의 한 측면에서, 세린 프로테아제 변이체는 실시양태 14의 숙주 세포의 전체 브로쓰 배양물 또는 발효 생성물로서 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience LP <120> FUSION PROTEINS, RECOMBINANT BACTERIA, AND EXOSPORIUM FRAGMENTS FOR PEST CONTROL AND PLANT HEALTH <130> BCS199002 WO <150> 62/820,773 <151> 2019-03-19 <160> 213 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 1 Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro 20 25 30 Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly 35 40 <210> 2 <211> 332 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 2 Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro 20 25 30 Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Phe Thr Thr 35 40 45 Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 50 55 60 Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro 65 70 75 80 Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 85 90 95 Gly Pro 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caaacaagaa gataagga 58 <210> 39 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 39 accacctacc gacgatccaa tctgtacatt cctagctgta ccaaatgcaa gattaatatc 60 gactaacact tgtcttactg ttgatttaag ttgcttctgt gcgattcaat gcttgcgtga 120 tgttacgatt taaaactaaa taatgagcta agcatggatt gggtggcaga attatctgcc 180 acccaatcca tgcttaacga gtattattat gtaaatttct taaaattggg aacttgtcta 240 gaacatagaa cctgtccttt tcattaactg aaagtagaaa cagataaagg agtgaaaaac 300 <210> 40 <211> 58 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 40 acatagaacc tgtccttttc attaactgaa agtagaaaca gataaaggag tgaaaaac 58 <210> 41 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 41 tagaagaaga acgccgacta ctttatgtcg caattacacg ggcgaaagaa gaactttaca 60 tttcctctcc gcaatttttt agaggaaaaa aattagatat atctcgtttt ttatacactg 120 tgcgaaaaga tttacctgaa aagacatcca ctaaataagg atgtcttttt ttatattgta 180 ttatgtacat ccctactata taaattccct gcttttatcg taagaattaa cgtaatatca 240 accatatccc gttcatattg tagtagtgta tgtcagaact cacgagaagg agtgaacata 300 <210> 42 <211> 63 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 42 tcaaccatat cccgttcata ttgtagtagt gtatgtcaga actcacgaga aggagtgaac 60 ata 63 <210> 43 <211> 35 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 43 Met Ser Asn Asn Asn Ile Pro Ser Pro Phe Phe Phe Asn Asn Phe Asn 1 5 10 15 Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Pro Leu Thr Leu 20 25 30 Pro Thr Gly 35 <210> 44 <211> 222 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 44 Met Ser Asn Asn Asn Ile Pro Ser Pro Phe Phe Phe Asn Asn Phe Asn 1 5 10 15 Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Pro Leu Thr Leu 20 25 30 Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro 35 40 45 Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr 50 55 60 Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly 65 70 75 80 Thr Phe Ser Ser Ala Asn Ala Ser Ile Val Thr Pro Ala Pro Gln Thr 85 90 95 Val Asn Asn Leu Ala Pro Ile Gln Phe Thr Ala Pro Val Leu Ile Ser 100 105 110 Lys Asn Val Thr Phe Asn Gly Ile Asp Thr Phe Thr Ile Gln Ile Pro 115 120 125 Gly Asn Tyr 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300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 123 taactcaatc ttaagagaaa ttgaggagcg cgcaccactt cgtcgtacaa caacgcaaga 60 agaagttggg gatacagcag tattcttatt cagtgattta gcacgcggcg taacaggaga 120 aaacattcac gttgattcag ggtatcatat cttaggataa atataatatt aattttaaag 180 gacaatctct acatgttgag attgtccttt ttatttgttc ttagaaagaa cgatttttaa 240 cgaaagttct taccacgtta tgaatataag tataatagta cacgatttat tcagctacgt 300 <210> 124 <211> 172 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 124 acgttgattc agggtatcat atcttaggat aaatataata ttaattttaa aggacaatct 60 ctacatgttg agattgtcct ttttatttgt tcttagaaag aacgattttt aacgaaagtt 120 cttaccacgt tatgaatata agtataatag tacacgattt attcagctac gt 172 <210> 125 <211> 291 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 125 cataaaaatc tacttttctt gtcaaagagt atgcttatat gcgtgctctt tttatttggt 60 tttctttcat ttctaaataa cattttcaac tctattcata ctattctttc aactttaggt 120 tacaaactat ttctgtaagc gtagtgtttc ttttgtacta taggcagtta gttttatcca 180 taacagtaca cctctgcact attcactata aattttcata tattatattg tgcttgtcca 240 aaacatgtgg ttattactca cgcgatctaa atgaaagaaa ggagtgaaaa t 291 <210> 126 <211> 94 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 126 actattcact ataaattttc atatattata ttgtgcttgt ccaaaacatg tggttattac 60 tcacgcgatc taaatgaaag aaaggagtga aaat 94 <210> 127 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 127 aatacatgat aatgaaatcc gattttgtgt tttatatagt gaattatcaa atattgtgta 60 gatgaaacaa agataaaatc cccattaaac tccctctatg gaaattataa attgttcgat 120 aaaaactttc aatattttca gaaaacattg ttgaattgtg atatattcgt atgctaacta 180 tgaaattttt acaaatatat taaaaacatt acataatatg actaaatatt gaaaaaatat 240 tgaattttta ataaaattta atttgtaata catattattt attaggggag gaaataaggg 300 <210> 128 <211> 48 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 128 aaaatttaat ttgtaataca tattatttat taggggagga aataaggg 48 <210> 129 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus mycoides <400> 129 aattgtgcat attgtctttt aaattttcta tctaagttat ttaatatata ataaataact 60 cttttttgtg agtttttttg atacgaggta aataatcagt acagggtctg accagaggac 120 tggagggcat gattctataa gggaatattt actattccat gattatagaa ctatgtcttt 180 tttattgtat atagaagggg ggataggtct atattataga acttatatat attgtgcatt 240 ccatattatc aattatctaa attttaagtc ttgttacaat taataaggga ggaaatagta 300 <210> 130 <211> 80 <212> DNA <213> Bacillus mycoides <400> 130 acttatatat attgtgcatt ccatattatc aattatctaa attttaagtc ttgttacaat 60 taataaggga ggaaatagta 80 <210> 131 <211> 141 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 131 aatgacgttt tcaagtttga ttatcattca tgtttcctat tttaagagaa acatataact 60 caactacttt tttcaatggc atcttttata gtacttagaa taggaaaaca ctcaactata 120 agaaaagtaa ggaggaaata a 141 <210> 132 <211> 79 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 132 actacttttt tcaatggcat cttttatagt acttagaata ggaaaacact caactataag 60 aaaagtaagg aggaaataa 79 <210> 133 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 133 atatgctaat gcttagtttt tatactcaag ttaaaatgtg cttttggacc taagagataa 60 acgtggaaaa ataaaataaa ctcttaagtt taggtgttta atctaagcag tcaattatta 120 aaaacatata attaatatgt gagtcatgaa cataattaaa taatgttttc aagtttaatt 180 atcgttcatg tttcctattt taagcagaac aaataactca attacttttt tcgattggat 240 cttttttaac tcttataata ggaaaacact caactataaa aataagtaag gaggaaataa 300 <210> 134 <211> 167 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 134 aatatgtgag tcatgaacat aattaaataa tgttttcaag tttaattatc gttcatgttt 60 cctattttaa gcagaacaaa taactcaatt acttttttcg attggatctt ttttaactct 120 tataatagga aaacactcaa ctataaaaat aagtaaggag gaaataa 167 <210> 135 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 135 tataaaataa aagggcgtgt atttgctact gatgcagtat tgtgtgcgcc taaaaatgga 60 atttcacaac cagatccaca tgttgttgta gaacaatctt gtaattcatt gatgaatttt 120 acaacgtcaa ctacacaatg agaagagcca tggtgtttat tttcgttaca actcattaat 180 gtcactcctt atcttcttgt ttgtatttac attaataaga tattggagtt gaggagattt 240 ggtcacaatc tcaagacctt ttttttaaat aggcgaaaga ggataaggga aggtggaatt 300 <210> 136 <211> 106 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 136 tcttgtttgt atttacatta ataagatatt ggagttgagg agatttggtc acaatctcaa 60 gacctttttt ttaaataggc gaaagaggat aagggaaggt ggaatt 106 <210> 137 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 137 atcaactttt acaaaagtaa agggtaaagg attaagaaag tggattggcg aattattaag 60 ctgttattgg tgtacaggtg tatgggttag tgctttttta ttagttttat ataattggat 120 tccgatcgtt gcagagccgt tacttgcatt attagctatt gcaggagcag cagcaatcat 180 tgaaacgatt acaggatatt ttatgggaga ataatatatt ttcataatac gagaaaaagc 240 ggagtttaaa agaatgaggg aacggaaata aagagttgtt catatagtaa atagacagaa 300 <210> 138 <211> 39 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 138 acggaaataa agagttgttc atatagtaaa tagacagaa 39 <210> 139 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 139 tgaagtatct agagctaatt tacgcaaagg aatctcagga caacactttc gcaacaccta 60 tattttaaat ttaataaaaa aagagactcc ggagtcagaa attataaagc tagctgggtt 120 caaatcaaaa atttcactaa aacgatatta tcaatacgca gaaaatggaa aaaacgcctt 180 atcataaggc gttttttcca ttttttcttc aaacaaacga ttttactatg accatttaac 240 taatttttgc atctactatg atgagtttca ttcacattct cattagaaag gagagattta 300 <210> 140 <211> 70 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 140 accatttaac taatttttgc atctactatg atgagtttca ttcacattct cattagaaag 60 gagagattta 70 <210> 141 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 141 gactatgttt attcaggata aaatatagca ctacactctc tcctcttatt atgtagcatc 60 tctctaatcc atcatttgtt tcatttagtt aaaattgtaa ataaaatcac atgatttgtc 120 aattataatt gtcatttcga caattaaact tgtcaaaata attctcatca ttttttctca 180 tctttctaat ataggacata ctactatata tacaaaagac aatatgcaaa tgttcataca 240 aaaaatatta tttttcgata tataatatta actgattttc taacatcaag gagggtacat 300 <210> 142 <211> 84 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 142 agacaatatg caaatgttca tacaaaaaat attatttttc gatatataat attaactgat 60 tttctaacat caaggagggt acat 84 <210> 143 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 143 atagtgagta atatggtaat ccatagatta aatagtatag aaaatattta attcttattt 60 ttattaaaaa agcatgaatc ccagatttac tgggttttga ttgtaactaa gaacatataa 120 aagttcactg ttatttatag gagagtctgt ttgtttttat atcttatgta tttcaccctg 180 cataaaaaaa tatttctcaa cattttattt gttgaaaaat attgaatatt cgtattataa 240 cgaatattat gttgttatcg gcaaaaaacg ataatttgca gacactgggg aggaaataca 300 <210> 144 <211> 139 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 144 tcttatgtat ttcaccctgc ataaaaaaat atttctcaac attttatttg ttgaaaaata 60 ttgaatattc gtattataac gaatattatg ttgttatcgg caaaaaacga taatttgcag 120 acactgggga ggaaataca 139 <210> 145 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 145 cttcgtcagc aataagtgtg agcggagaat tggttgatct tggctttaca attggagcat 60 tgacgaaaga ctctttaacg tggtcgcata acggagtaga atatatgctc gtgtctaaag 120 gtttagagcc gaaggagcta ttaatggttg ctcgttcagt tacagagaag caagtgaagt 180 aaacttctta gacgtggtga tatatgtgca ccacgtcttt tcttagtttg aagggtggat 240 ttcataaaag aagcatataa aagaataagc ttcgcatatc gtgtataagg aagtgtattt 300 <210> 146 <211> 44 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 146 ataaaagaat aagcttcgca tatcgtgtat aaggaagtgt attt 44 <210> 147 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 147 catttcaaat aatgaacgct tcgattgaat cggagctatt ttcaaatcaa tttcagtata 60 ttgatccagc atttgaatag aagtatcaac agcaacttta agttgatgca atgcagattg 120 tacaaacatt gtaattctcc tcttctccgt atataatagt ttcttgaggg tattatatca 180 tgctcaaaat tccgaaaatt ctagtagttt gactagcata ttgaaaagta ttatattgta 240 aaaggtcata tgaaacgtga aatagaatgg aatgcaatta ttgagttagg agttagacca 300 <210> 148 <211> 70 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 148 ttatattgta aaaggtcata tgaaacgtga aatagaatgg aatgcaatta ttgagttagg 60 agttagacca 70 <210> 149 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 149 atcgatggaa cctgtatcaa ccactataat ttcatccaca attttttcaa ctgagtctaa 60 acaacgggct attgtcttct cctcatctcg aacaatcata cataaactaa ttgtaattcc 120 ttgcttgttc aacataatca ccctcttcca aatcaatcat atgttataca tatactaaac 180 tttccatttt tttaaattgt tcaagtagtt taagatttct tttcaataat tcaaatgtcc 240 gtgtcatttt ctttcggttt tgcatctact atataatgaa cgctttatgg aggtgaattt 300 <210> 150 <211> 150 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 150 aatcaatcat atgttataca tatactaaac tttccatttt tttaaattgt tcaagtagtt 60 taagatttct tttcaataat tcaaatgtcc gtgtcatttt ctttcggttt tgcatctact 120 atataatgaa cgctttatgg aggtgaattt 150 <210> 151 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 151 gacctgtaag tctgtaggga agaataattt caagagccag tgataataga tttttttgtt 60 ttttcattct tatcttgaat ataaatcacc tcatctttta attagaacgt aaccaattta 120 gtattttgaa atagagctat cattttataa tatgaatact actagttata gaaacggcaa 180 aaagtttaat atatgtaaaa atcatttgga tatgaaaaaa gtagccatag attttttcga 240 aatgataaat gttttatttt gttaattagg aaacaaaaat gtggaatgag ggggatttaa 300 <210> 152 <211> 91 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 152 atatgaaaaa agtagccata gattttttcg aaatgataaa tgttttattt tgttaattag 60 gaaacaaaaa tgtggaatga gggggattta a 91 <210> 153 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 153 ttttcatctg ctacatcgtg aagtaatgct gccatttcaa ttataaaacg atttcctcct 60 tcttgctcgg ataaagaaat cgccagttta tgtacacgct caatatgata ccaatcatgc 120 ccactggcat ctttttctaa aatatgtttt acaaaagtaa ttgttttttc tatcttttct 180 tgttttgtca ttttatcttc acccagttac ttattgtaac acgcccgcat tttttcatca 240 catattttct tgtccgccca tacactaggt ggtaggcatc atcatgaagg aggaatagat 300 <210> 154 <211> 61 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 154 acatattttc ttgtccgccc atacactagg tggtaggcat catcatgaag gaggaataga 60 t 61 <210> 155 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 155 ggtgacgaca acatatacaa gaggcactcc tgctggtact gtaacaggaa caaatatggg 60 gcaaagtgta aatacatcgg gtatagcaca agctgtcccg aatacagata atatggattc 120 aacggcggga ctcccttaag aaattagggg agtctttatt tggaaaaaga gcttatgtta 180 cataaaaaca ggagtaattg ttttaaaagt agtattggtg acgttgttag aaaatacaat 240 ttaagtagaa ggtgcgtttt tatatgaaat atattttata gctgtacttt acctttcaag 300 <210> 156 <211> 213 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 156 acaagctgtc ccgaatacag ataatatgga ttcaacggcg ggactccctt aagaaattag 60 gggagtcttt atttggaaaa agagcttatg ttacataaaa acaggagtaa ttgttttaaa 120 agtagtattg gtgacgttgt tagaaaatac aatttaagta gaaggtgcgt ttttatatga 180 aatatatttt atagctgtac tttacctttc aag 213 <210> 157 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 157 atttatttca ttcaattttt cctatttagt acctaccgca ctcacaaaaa gcacctctca 60 ttaatttata ttatagtcat tgaaatctaa tttaatgaaa tcatcatact atatgtttta 120 taagaagtaa aggtaccata cttaattaat acatatctat acacttcaat atcacagcat 180 gcagttgaat tatatccaac tttcatttca aattaaataa gtgcctccgc tattgtgaat 240 gtcatttact ctccctacta catttaataa ttatgacaag caatcatagg aggttactac 300 <210> 158 <211> 180 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 158 taagaagtaa aggtaccata cttaattaat acatatctat acacttcaat atcacagcat 60 gcagttgaat tatatccaac tttcatttca aattaaataa gtgcctccgc tattgtgaat 120 gtcatttact ctccctacta catttaataa ttatgacaag caatcatagg aggttactac 180 <210> 159 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 159 agttgtacaa gaatttaaat cttcacaaac atatgtaaat gacttactac agctagttgc 60 aagtacgatt tctaacaacg taacagatga aatattaatt tcaactaatg gcgatgtatt 120 gaagggtgaa acgggcgcag cggtagaaag taaaaaagga aattgtggtt gttaaagaga 180 tgtcgaaatg acatctcttt ttttagtgga ttaaacgtaa gttcttctca aaaaaagaat 240 gacacattcc gctattgtca cgcatatgat taagtgaata gtgattgagg agggttacga 300 <210> 160 <211> 57 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 160 acattccgct attgtcacgc atatgattaa gtgaatagtg attgaggagg gttacga 57 <210> 161 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 161 aacgttatta gcgtagacaa acaagtaacg gcagaagcag ttcttgcatt aaatcgtatg 60 ttagagcgtg tgtaaagcaa cggtattccc gttgcttttt ttcatacata taatcataac 120 gagaacgaaa tgggcataca ttgttttgaa gaaatcattg tggttcttta tgcttattcc 180 acttcgaatg atattgaaaa tcgaagaagt gataaaagta aaaagaagtt aatgttattt 240 agaaagagtt acttcatgag atttgttact tatagataag ttatacagga gggggaaaat 300 <210> 162 <211> 47 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 162 tcatgagatt tgttacttat agataagtta tacaggaggg ggaaaat 47 <210> 163 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 163 aagccgcggt caatgctgta tatgcaaata agattgcagc tttacctgaa gaagagcgtg 60 atagcttcat tgctgaaaaa cgagaagagt ataagaaaga tattgatatt taccatttag 120 catcagagat ggtcattgat ggtattgttc atccaaacaa tttaagagaa gagttaaaag 180 gacgattcga aatgtatatg agtaaatatc aagtatttac ggatcgtaaa catcctgttt 240 atccagttta aaagccctat ttagggcttt cttgctcaaa aagttaagga ggggaaaaca 300 <210> 164 <211> 92 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 164 tcaagtattt acggatcgta aacatcctgt ttatccagtt taaaagccct atttagggct 60 ttcttgctca aaaagttaag gaggggaaaa ca 92 <210> 165 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 165 aggatttcag tgggacgcct cctctcttct tacattaaat taatcatact ataaaatgaa 60 agaaatgaaa tgaaaaatag cggaaaaatc agaaattttt tctggtagta tacaatatgt 120 tacaataagc tttgtcaatg aaagaaggaa ttccgtgcaa tgcacgggag aggttcgcga 180 actccctcta taaaaaacta tggaaacaac aatatcttta ggtattgttt tgttttttta 240 ttgtgacagt tcaagaacgt tctttcttct tattcgtagt agagaaggag aatgagtgaa 300 <210> 166 <211> 104 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 166 actatggaaa caacaatatc tttaggtatt gttttgtttt tttattgtga cagttcaaga 60 acgttctttc ttcttattcg tagtagagaa ggagaatgag tgaa 104 <210> 167 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 167 ttttgcacaa cgccgtaaaa ctttaatgaa taatttatca aataatttaa atggtttccc 60 gaaagataaa gagctgttgg atcgaatttt aacagaagta ggaattgatc caaaacgaag 120 aggcgaaacg ctatctatcg aagagtttgc gacattaagt aatgcattag ttcttcataa 180 gttatcataa gaatacaaaa gggacagttc aatttgaact gtcccttttg tcacctttct 240 cctcctaaat tcatacttta aaaacaggta agatggccta acgagtttgg aggtaggaga 300 <210> 168 <211> 63 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 168 tctcctccta aattcatact ttaaaaacag gtaagatggc ctaacgagtt tggaggtagg 60 aga 63 <210> 169 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 169 ggaaacagaa gtcatcccat ttgaaaatgc agcaggtcgt attatagctg atttcgttat 60 ggtttatccg ccagggattc caatctttac tccgggggaa attattacac aagacaactt 120 agagtatatt cgtaaaaact tagaagcagg tttacctgta caaggtcctg aagatatgac 180 attacaaaca ttacgcgtga tcaaagagta caagcctatc agttgatagg ctttttttca 240 ccctttttcc cttttctcat acgatattat gtaatgtaac gtataggtgg ggatactact 300 <210> 170 <211> 61 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 170 accctttttc ccttttctca tacgatatta tgtaatgtaa cgtataggtg gggatactac 60 t 61 <210> 171 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 171 attgtggacc cttagctcag ctggttagag cagacggctc ataaccgtcc ggtcgtaggt 60 tcgagtccta cagggtccat atccatttca catgtttatt atgtcggcag gaagcttcct 120 tgtagaaggg agcttttttt atgaaatata tgagcatttt aattgaaatg aagtgggaat 180 tttgctactt taatgatagc aagacaatgt gatttatttg tttgcaccct atggcaatta 240 gggtagaatg aagttgtatg tcacttaagt ggcaatacat aaactgggag gaatataaca 300 <210> 172 <211> 38 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 172 acttaagtgg caatacataa actgggagga atataaca 38 <210> 173 <211> 300 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 173 aatataacag aaaattctga tgttttttca aatcctataa taaggagtgt tccgtatgat 60 gcctttatat tttccggaag ataaaacaga atatattatt ccagggattg tttgtgttct 120 atttatcatc ggtgcgattg ctacgtggcg tatgttcatt cgtgtatcaa aacgagaagc 180 agagcgatta cagaaagttg aagaaaagct gttagctgaa aagaaacagt aactcatttt 240 tgtatgtttc cctctatgct cggacaatct aagggcagaa tgtattttgg agggaatgaa 300 <210> 174 <211> 228 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 174 tccggaagat aaaacagaat atattattcc agggattgtt tgtgttctat ttatcatcgg 60 tgcgattgct acgtggcgta tgttcattcg tgtatcaaaa cgagaagcag agcgattaca 120 gaaagttgaa gaaaagctgt tagctgaaaa gaaacagtaa ctcatttttg tatgtttccc 180 tctatgctcg gacaatctaa gggcagaatg tattttggag ggaatgaa 228 <210> 175 <211> 166 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 175 taatcaccct cttccaaatc aatcatatgt tatacatata ctaaactttc cattttttta 60 aattgttcaa gtagtttaag atttcttttc aataattcaa atgtccgtgt cattttcttt 120 cggttttgca tctactatat aatgaacgct ttatggaggt gaattt 166 <210> 176 <211> 173 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 176 aattacataa caagaactac attagggagc aagcagtcta gcgaaagcta actgcttttt 60 tattaaataa ctattttatt aaatttcata tatacaatcg cttgtccatt tcatttggct 120 ctacccacgc atttactatt agtaatatga atttttcaga ggtggatttt att 173 <210> 177 <211> 121 <212> DNA <213> Bacillus weihenstephanensis <400> 177 ctatgattta agatacacaa tagcaaaaga gaaacatatt atataacgat aaatgaaact 60 tatgtatatg tatggtaact gtatatatta ctacaataca gtatactcat aggaggtagg 120 t 121 <210> 178 <211> 373 <212> DNA <213> Bacillus weihenstephanensis <400> 178 ggtaggtaga tttgaaatat gatgaagaaa aggaataact aaaaggagtc gatatccgac 60 tccttttagt tataaataat gtggaattag agtataattt tatataggta tattgtatta 120 gatgaacgct ttatccttta attgtgatta atgatggatt gtaagagaag gggcttacag 180 tccttttttt atggtgttct ataagccttt ttaaaagggg taccacccca cacccaaaaa 240 cagggggggt tataactaca tattggatgt tttgtaacgt acaagaatcg gtattaatta 300 ccctgtaaat aagttatgtg tatataaggt aactttatat attctcctac aataaaataa 360 aggaggtaat aaa 373 <210> 179 <211> 225 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 179 aacccttaat gcattggtta aacattgtaa agtctaaagc atggataatg ggcgagaagt 60 aagtagattg ttaacaccct gggtcaaaaa ttgatattta gtaaaattag ttgcactttg 120 tgcatttttt cataagatga gtcatatgtt ttaaattgta gtaatgaaaa acagtattat 180 atcataatga attggtatct taataaaaga gatggaggta actta 225 <210> 180 <211> 115 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 180 taattccacc ttcccttatc ctctttcgcc tatttaaaaa aaggtcttga gattgtgacc 60 aaatctcctc aactccaata tcttattaat gtaaatacaa acaagaagat aagga 115 <210> 181 <211> 144 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 181 aggatgtctt tttttatatt gtattatgta catccctact atataaattc cctgctttta 60 tcgtaagaat taacgtaata tcaaccatat cccgttcata ttgtagtagt gtatgtcaga 120 actcacgaga aggagtgaac ataa 144 <210> 182 <211> 125 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 182 ttaatgtcac tccttatctt cttgtttgta tttacattaa taagatattg gagttgagga 60 gatttggtca caatctcaag accttttttt taaataggcg aaagaggata agggaaggtg 120 gaatt 125 <210> 183 <211> 87 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 183 atatattttc ataatacgag aaaaagcgga gtttaaaaga atgagggaac ggaaataaag 60 agttgttcat atagtaaata gacagaa 87 <210> 184 <211> 168 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 184 aaactaaata atgagctaag catggattgg gtggcagaat tatctgccac ccaatccatg 60 cttaacgagt attattatgt aaatttctta aaattgggaa cttgtctaga acatagaacc 120 tgtccttttc attaactgaa agtagaaaca gataaaggag tgaaaaac 168 <210> 185 <211> 111 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 185 attcactaca acggggatga gtttgatgcg gatacatatg agaagtaccg gaaagtgttt 60 gtagaacatt acaaagatat attatctcca tcataaagga gagatgcaaa g 111 <210> 186 <211> 273 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 186 cgcgcaccac ttcgtcgtac aacaacgcaa gaagaagttg gggatacagc agtattctta 60 ttcagtgatt tagcacgcgg cgtaacagga gaaaacattc acgttgattc agggtatcat 120 atcttaggat aaatataata ttaattttaa aggacaatct ctacatgttg agattgtcct 180 ttttatttgt tcttagaaag aacgattttt aacgaaagtt cttaccacgt tatgaatata 240 agtataatag tacacgattt attcagctac gta 273 <210> 187 <211> 240 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 187 tatatcatat gtaaaattag ttcttattcc cacatatcat atagaatcgc catattatac 60 atgcagaaaa ctaagtatgg tattattctt aaattgttta gcaccttcta atattacaga 120 tagaatccgt cattttcaac agtgaacatg gatttcttct gaacacaact ctttttcttt 180 ccttatttcc aaaaagaaaa gcagcccatt ttaaaatacg gctgcttgta atgtacatta 240 <210> 188 <211> 267 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 188 tatcacataa ctctttattt ttaatatttc gacataaagt gaaactttaa tcagtggggg 60 ctttgttcat ccccccactg attattaatt gaaccaaggg ataaaaagat agagggtctg 120 accagaaaac tggagggcat gattctataa caaaaagctt aatgtttata gaattatgtc 180 tttttatata gggagggtag taaacagaga tttggacaaa aatgcaccga tttatctgaa 240 ttttaagttt tataaagggg agaaatg 267 <210> 189 <211> 124 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 189 attttttact tagcagtaaa actgatatca gttttactgc tttttcattt ttaaattcaa 60 tcattaaatc ttccttttct acatagtcat aatgttgtat gacattccgt aggaggcact 120 tata 124 <210> 190 <211> 170 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 190 acataaattc acctccataa agcgttcatt atatagtaga tgcaaaaccg aaagaaaatg 60 acacggacat ttgaattatt gaaaagaaat cttaaactac ttgaacaatt taaaaaaatg 120 gaaagtttag tatatgtata acatatgatt gatttggaag agggtgatta 170 <210> 191 <211> 212 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 191 ttctattttc caacataaca tgctacgatt aaatggtttt ttgcaaatgc cttcttggga 60 agaaggatta gagcgttttt ttatagaaac caaaagtcat taacaatttt aagttaatga 120 cttttttgtt tgcctttaag aggttttatg ttactataat tatagtatca ggtactaata 180 acaagtataa gtatttctgg gaggatatat ca 212 <210> 192 <211> 180 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 192 Met Ser Glu Phe Arg Glu Ile Ile Thr Lys Ala Val Val Gly Lys Gly 1 5 10 15 Arg Lys Tyr Thr Lys Ser Thr His Thr Cys Glu Ser Asn Asn Glu Pro 20 25 30 Thr Ser Ile Leu Gly Cys Trp Val Ile Asn His Ser Tyr Glu Ala Arg 35 40 45 Lys Asn Gly Lys His Val Glu Ile Glu Gly Phe Tyr Asp Val Asn Thr 50 55 60 Trp Tyr Ser Phe Asp Gly Asn Thr Lys Thr Glu Val Val Thr Glu Arg 65 70 75 80 Val Asn Tyr Thr Asp Glu Val Ser Ile Gly Tyr Arg Asp Lys Asn Phe 85 90 95 Ser Gly Asp Asp Leu Glu Ile Ile Ala Arg Val Ile Gln Pro Pro Asn 100 105 110 Cys Leu Glu Ala Leu Val Ser Pro Asn Gly Asn Lys Ile Val Val Thr 115 120 125 Val Glu Arg Glu Phe Val Thr Glu Val Val Gly Glu Thr Lys Ile Cys 130 135 140 Val Ser Val Asn Pro Glu Gly Cys Val Glu Ser Asp Glu Asp Phe Gln 145 150 155 160 Ile Asp Asp Asp Glu Phe Glu Glu Leu Asp Pro Asn Phe Ile Val Asp 165 170 175 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 208 Ala Ala Ala Ala Ala Asp Leu Glu 1 5 <210> 209 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 209 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu 1 5 <210> 210 <211> 321 <212> PRT <213> Bacillus firmus <400> 210 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Glu Gly Asp Gly Asp Asp Ser Thr Asp Glu Phe Ala Tyr Pro Gly 180 185 190 Cys Tyr Asn Glu Val Ile Ser Val Gly Ala Ile Asn Leu Glu Arg Asp 195 200 205 Ser Ser Asp Phe Thr Asn Ser His Asn Glu Ile Asp Leu Val Ala Pro 210 215 220 Gly Glu Gly Ile Leu Ser Thr Phe Leu Asn Gly Lys Tyr Ala Thr Leu 225 230 235 240 Ser Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu 245 250 255 Ile Lys Asp Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu Pro 260 265 270 Glu Leu Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn Ser 275 280 285 Pro Lys Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp His 290 295 300 Leu Ala Gly Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn Ala 305 310 315 320 Ile <210> 211 <211> 321 <212> PRT <213> Bacillus firmus <400> 211 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asp Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Asp Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Glu Gly Asp Gly Asp Asp Ser Thr Asp Glu Phe Ala Tyr Pro Gly 180 185 190 Cys Tyr Asn Glu Val Ile Ser Val Gly Ala Ile Asn Leu Glu Arg Asp 195 200 205 Ser Ser Glu Phe Thr Asn Ser His Asn Glu Ile Asp Leu Val Ala Pro 210 215 220 Gly Glu Gly Ile Leu Ser Thr Phe Leu Asn Gly Lys Tyr Ala Thr Leu 225 230 235 240 Ser Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu 245 250 255 Ile Lys Glu Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu Pro 260 265 270 Glu Leu Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn Ser 275 280 285 Pro Lys Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp His 290 295 300 Leu Ala Gly Ile Phe Asp Gln Glu Phe Lys Ser Thr Val Leu Asn Ala 305 310 315 320 Ile <210> 212 <211> 261 <212> PRT <213> Bacillus firmus <400> 212 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Glu Gly Asp Ser Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly 180 185 190 Ala Leu Ala Leu Ile Lys Asp Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys 195 200 205 Leu Ser Glu Pro Glu Leu Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro 210 215 220 Leu Gly Asn Ser Pro Lys Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr 225 230 235 240 Val Pro Asp His Leu Ala Gly Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr 245 250 255 Val Leu Asn Ala Ile 260 <210> 213 <211> 783 <212> DNA <213> Bacillus firmus <400> 213 atggaacagt atgtgcgcgt gatcccgtat aaagtgatcc agcaagaaga aaacgtgaaa 60 gaagtcccga aaggagttga actgattcaa gcgccgaaag tgtggtcaga aacaaaaggc 120 aaaggcatta aaattgccgt tttggatacg ggctgcgaca tcagccatcc ggatctgaaa 180 gatcgtgtca caggcggccg caactttacg gacgatgaca actcagaccc gaatagcttt 240 aaagactata atggccatgg cacacatgtc gcgggcacaa tcgcggcgta tgaaaataat 300 gcgggcgtca tcggcgtcgc gcctgaggcc gaactgctga ttgtgaaagt cctgaataaa 360 gacggaagcg gccagtatga atggatcatc aaaggcattc attatgcgat tgaacagaat 420 gccgacatca tctcgatgtc actgggagga cctgcggatg tgccggaact tcatgatgcg 480 attaaagcgg cggtgaacaa aaacatcctg gtcgtgtgcg ccgcgggaaa cgagggcgat 540 agcggcacga gcatggcggc gccgcatgtg tctggcgcgc tggcactgat taaagatttt 600 gccaatcggc agtttgaacg gaaactgagc gaaccggaac tgtatgcgca gcttatccgc 660 cgcacggtcc ctctgggcaa ttctccgaaa ctggagggca atggcctggt ttatctgaca 720 gttccggatc atctggcggg cattttcgat caggaactga aaagcacagt cctgaatgcg 780 att 783

Claims (23)

  1. 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 패밀리 구성원의 포자외막에 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편; 및
    세린 프로테아제 활성을 갖는 효소
    를 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는
    바실루스 피르무스(Bacillus firmus) 효소;
    서열식별번호: 210-211 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열식별번호: 212에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    또는 임의의 이들의 조합
    을 포함하는 것인 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 표적화 서열이
    (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35와의 동일성이 적어도 약 43%인 아미노산 서열이며, 여기서 아미노산 25-35와의 동일성이 적어도 약 54%인 아미노산 서열;
    (b) 서열식별번호: 1의 아미노산 1-35;
    (c) 서열식별번호: 1의 아미노산 20-35;
    (d) 서열식별번호: 1;
    (e) 서열식별번호: 96; 또는
    (f) 서열식별번호: 120
    을 포함하거나 이로 이루어진 것인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 표적화 서열이 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16을 포함하고, 여기서
    X1은 임의의 아미노산이거나 부재하고;
    X2는 페닐알라닌 (F), 류신 (L), 이소류신 (I), 또는 메티오닌 (M)이고;
    X3은 임의의 아미노산이고;
    X4는 프롤린 (P) 또는 세린 (S)이고;
    X5는 임의의 아미노산이고;
    X6은 류신 (L), 아스파라긴 (N), 세린 (S), 또는 이소류신 (I)이고;
    X7은 발린 (V) 또는 이소류신 (I)이고;
    X8은 글리신 (G)이고;
    X9는 프롤린 (P)이고;
    X10은 트레오닌 (T) 또는 프롤린 (P)이고;
    X11은 류신 (L) 또는 페닐알라닌 (F)이고;
    X12는 프롤린 (P)이고;
    X13은 임의의 아미노산이고;
    X14는 임의의 아미노산이고;
    X15는 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 또는 트레오닌 (T)이고;
    X16은 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 세린 (S)인 융합 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편이 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편의 제1 아미노산의 바로 앞의 아미노산 위치에 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 20에 상응하는 표적화 서열의 위치에 메티오닌, 세린, 또는 트레오닌 잔기를 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편 및 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소 사이에 아미노산 링커를 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 링커가 폴리알라닌 링커, 폴리글리신 링커, 또는 알라닌 및 글리신 잔기 둘 다의 혼합물을 포함하는 링커를 포함하는 것인 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 서열식별번호: 210을 포함하거나 이로 이루어진 것인 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 서열식별번호: 211을 포함하거나 이로 이루어진 것인 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 서열식별번호: 212를 포함하거나 이로 이루어진 것인 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 서열식별번호: 210-212 중 어느 하나에 대해 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원.
  12. 제11항에 있어서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) BT013A로부터 유래된 것인 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원.
  13. 제11항에 있어서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 야생형 포자의 포자외막과 비교하여 포자에 대해 제거하기가 보다 용이한 포자외막을 갖는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자를 생성하는 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원.
  14. 제13항에 있어서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이
    (i) CotE 유전자에 돌연변이;
    (ii) ExsY 유전자에 돌연변이;
    (iii) CotY 유전자에 돌연변이;
    (iv) ExsA 유전자에 돌연변이;
    (v) CotO 유전자에 돌연변이
    를 포함하는 것인 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원.
  15. 제14항에 있어서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 ExsY 유전자에 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원.
  16. 제15항에 있어서, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 ExsY 유전자의 넉-아웃을 포함하는 것인 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원.
  17. 제11항의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 발효 생성물.
  18. 제13항의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래된 포자외막 단편.
  19. 제17항의 발효 생성물 및 농업상 허용되는 담체를 포함하는 제제.
  20. 제18항의 포자외막 단편 및 농업상 허용되는 담체를 포함하는 제제.
  21. 제19항 또는 제20항의 제제로 처리된 식물 종자.
  22. 제11항의 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함하는, 식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키고/거나 선충을 방제하는 방법.
  23. 제18항의 포자외막 단편을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자를 둘러싼 영역에 적용하는 것을 포함하는, 식물 성장을 자극시키고/거나 식물 건강을 촉진시키고/거나 선충을 방제하는 방법.
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