JP6120769B2 - 抗菌ペプチド改変体及びそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

抗菌ペプチド改変体及びそれをコードするポリヌクレオチド Download PDF

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Description

配列リストへの参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形式の配列リストを含み、それは、参照により本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、抗菌ペプチドの改変体、該改変体をコードするポリヌクレオチド、該改変体を製造する方法、及び該改変体を用いる方法に関する。
関連技術の説明
いくつかの種類の抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は文献に記載され、その例には、デフェンシン及びアルファ−螺旋形ペプチドが挙げられる。
本発明は、タマシキゴカイ（Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａ）から単離された抗菌ペプチドの改変体、及びＷＯ２００７／０２３１６３に記載される抗菌ペプチドの改変体を提供する。
本発明の改変抗菌ペプチドは、親抗菌ペプチドと比較して、改善された抗菌活性を示す。特に、改変体は、血清及び血液中のタンパク質の存在下で改良された抗菌活性を示す。本発明の改変ペプチドの別の利点は、例えば、血清及び血液中のタンパク質へのタンパク質結合の減少であり、これは、親抗菌ペプチドと比較して、改善された生物学的利用能をもたらす。
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドの単離された改変体に関し、これは、配列番号２の成熟ペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位の１以上（いくつか）において変更を含み、ここで、該改変体は抗菌活性を有する。
また、本発明は、改変体をコードする単離されたポリヌクレオチド；核酸構築物；ベクター、及び該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞；並びに該改変体を生産するための方法に関する。
また、本発明は、本発明に係る改変体を用いた細菌感染を治療するための方法；及び細菌感染を治療するための薬剤を製造するための改変体の使用に関する。
発明の詳細な説明
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドの単離された改変体に関し、これは、配列番号２の成熟ペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位の１以上（いくつか）において変更を含み、ここで、該改変体は抗菌活性を有する。
抗菌活性：用語「抗菌活性」は、本明細書において、微生物細胞を殺傷するか又はその増殖を阻害し得る活性として定義される。本発明との関連において、用語「抗菌性」とは、殺菌性及び／又は静菌性及び／又は殺真菌性及び／又は静真菌性作用及び／又は殺ウイルス作用があることを意味するものとして意図され、ここで、用語「殺菌性」は、細菌性細胞を殺傷し得るものとして理解されなければならない。用語「静菌性」は、細菌増殖を阻害し得るもの、即ち、細菌性細胞の増殖を阻害し得るものとして理解されなければならない。用語「抗真菌性」は、真菌細胞を殺傷し得るものとして理解されなければならない。用語「抗真菌性」は、真菌増殖を阻害し得るもの、即ち、真菌細胞の増殖を阻害し得るものとして理解されなければならない。用語「抗ウイルス性」は、ウイルスを不活性化し得るものとして理解されなければならない。用語「微生物細胞」は、細菌細胞又は真菌細胞（酵母を含む）を示す。
本発明との関連において、用語「微生物細胞の増殖を阻害すること」とは、細胞が非増殖期にあること、即ち、細胞が繁殖することができないことを意味するものとして意図される。
好ましい実施形態では、用語「抗菌活性」は、殺菌性及び／又は静菌性活性として定義される。より好ましくは、「抗菌活性」は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する抗菌活性及び／又は静菌性活性として定義される。
本発明の目的のために、抗菌活性は、Ｌｅｈｒｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．１３７（２） ｐｐ．１６７−１７４（１９９１年）に記載される手法に従って決定されてもよい。あるいは、抗菌活性は、ＣＬＳＩ（米国臨床検査標準協議会；以前は国立臨床及び検査標準のための委員会として知られていた）からのＮＣＣＬＳガイドラインに従って決定されてもよい。
抗菌活性を有するペプチドは、関連微生物増殖基質において、５００μｇ／ｍｌの濃度で；好ましくは２５０μｇ／ｍｌの濃度で；より好ましくは１００μｇ／ｍｌの濃度で；さらにより好ましくは５０μｇ／ｍｌの濃度で；最も好ましくは２５μｇ／ｍｌの濃度で；及び、特に、抗菌活性を有するペプチドの１０μｇ／ｍｌの濃度で、３７℃にて８時間後（好ましくは４時間後、より好ましくは２時間後、最も好ましくは１時間後、及び特に３０分後）、大腸菌（ＤＳＭ１５７６）の生細胞数が１／１００に減少することができてもよい。
また、抗菌活性を有するペプチドは、５００μｇ／ｍｌの濃度で添加した場合；好ましくは２５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した場合；より好ましくは１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した場合；さらにより好ましくは５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した場合；最も好ましくは１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した場合；及び、特に５μｇ／ｍｌの濃度で添加した場合、関連微生物増殖基質において、３７℃にて８時間、大腸菌（ＤＳＭ１５７６）の増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を阻害することができてもよい。
本発明の改変ペプチドは、配列番号２の抗菌ペプチドと比較して、改善された抗菌活性を有する。ある実施形態では、本発明の改変ペプチドは、血清の存在下で配列番号２のペプチドの抗菌活性の１００％超を有する。
改変体：用語「改変体」とは、抗菌活性を有するペプチドであって、変更、即ち、置換、挿入、及び／又は欠失を１以上（いくつか）の部位で含むペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸を除くことを意味する；挿入とはある位置のアミノ酸に隣接して１〜３個のアミノ酸を加えることを意味する。
突然変異：用語「突然変異」とは改変体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
野生型抗菌ペプチド：用語「野生型」抗菌ペプチドは、天然に見られる細菌、酵母、又は糸状菌などの天然に存在する微生物によって発現される抗菌ペプチドを意味する。
親又は親の抗菌ペプチド：用語「親」又は「親の抗菌ペプチド」とは、変更が本発明の酵素改変体を生産するために行われる抗菌ペプチドを意味する。親は、天然に存在する（野生型）ペプチド又はその改変体であってもよい。
単離された改変体：用語「単離された改変体」とは、ヒトの手によって修飾された改変体を意味する。一局面では、改変体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、少なくとも１％純粋、例えば、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０、及び少なくとも９０％純粋である。
実質的に純粋な改変体：用語「実質的に純粋な改変体」とは、天然に又は組換え的に付随される他のペプチド材料に対して、重量比で最大１０％、最大８％、最大６％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、及び最大０．５％含む調製物を意味する。好ましくは、改変体は、該調製物に存在する全ペプチド材料に対して、重量比で少なくとも９２％純粋、例えば、少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％％純粋、少なくとも９９％純粋、少なくとも９９．５％純粋、及び少なくとも１００％純粋である。本発明の改変体は、好ましくは、実質的に純粋な形態である。これは、例えば、周知の組換え法によって、又は伝統的な精製法によって改変体を調製することにより達成することができる。
成熟ペプチド：用語「成熟ペプチド」とは、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセッシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの後の最終形態であるペプチドを意味する。
成熟ペプチドをコードする配列：用語「成熟ペプチドをコードする配列」とは、抗菌活性を有する成熟ペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって記載される。
本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定され、これは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅら，２０００年，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）（好ましくはバージョン３．０．０以降）において行われる。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルディが１０、ギャップ伸長ペナルディが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳ版）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識の「最長同一性」の出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は同一性％として用いられ、以下のように計算される。
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
本発明の目的のため、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０年，上述）を用いて決定され、これは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅら，２０００年，上述）（好ましくはバージョン３．０．０以降）において行われる。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルディが１０、ギャップ伸長ペナルディが０．５、及びＥＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳ版）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識の「最長同一性」のアウトプット（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は同一性％として用いられ、以下のように計算される。
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
断片：用語「断片」とは、成熟ペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端から欠失される１以上（いくつか）のアミノ酸を有するペプチドを意味し；ここで、該断片は抗菌活性を有する。一実施形態では、断片は、少なくとも１５アミノ酸残基、例えば、少なくとも１７、及び少なくとも１９アミノ酸残基（例えば、配列番号２のアミノ酸１〜２０）を含む。
サブ配列：用語「サブ配列」とは、成熟ペプチドをコードする配列の５’末端及び／又は３’末端から欠失された１以上（いくつか）のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味し；該配列は抗菌活性を有する断片をコードする。
対立遺伝子改変体：用語「対立遺伝子改変体」とは、同じ染色体座を占める遺伝子の２以上の代替形態のいずれかを意味する。対立遺伝子改変体は、天然では突然変異を通じて生じ、集団内に多型をもたらすことがある。遺伝子突然変異はサイレント（コードされたペプチドにおいて無変化）であってもよく、又は変更されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードしてもよい。ペプチドの対立遺伝子改変体は、遺伝子の対立遺伝子改変体によってコードされたペプチドである。
単離されたポリヌクレオチド：用語「単離されたポリヌクレオチド」とは、ヒトの手によって修飾されたポリヌクレオチドを意味する。一局面では、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動によって決定される場合、少なくとも１％純粋、例えば、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、及び少なくとも９５％純粋である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。
実質的に純粋なポリヌクレオチド：用語「実質的に純粋なポリヌクレオチド」とは、他の外部からの又は望ましくないヌクレオチドがなく、遺伝子操作されたペプチド産物システム内での使用に適した形態であるポリヌクレオチド調製物を意味する。このようにして、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然又は組換え的に付随される他のポリヌクレオチド材料に対して、重量比で最大１０％、最大８％、最大６％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、及び最大０．５％を含む。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然に存在する５’−及び３’−非翻訳領域、例えばプロモータ及びターミネーションを含んでもよい。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量比で少なくとも９０％純粋、例えば、少なくとも９２％純粋、少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％純粋、及び少なくとも９９．５％純粋であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態である。
コード配列：用語「コード配列」とは、そのペプチド産物のアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定され、これは、通常、ＡＴＧ開始コドン又は代替の開始コドン、例えばＧＴＧ及びＴＴＧで開始し、終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡで終了する。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、又は組換えポリヌクレオチドであってもよい。
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」とは、真核細胞から得られる成熟のスプライシングされたｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製され得るＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡに存在し得るイントロン配列を欠損している。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前に、スプライシングを含む一連のステップを通じて処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
核酸構築物：用語「核酸構築物」とは、天然に存在する遺伝子から単離されたか、又はさもなければ天然に存在しない様式で核酸のセグメントを含むように修飾され、又は合成されたものである一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。核酸構築物なる用語は、該核酸構築物が、本発明のコード配列の発現に必要とされる調節配列を含む場合、用語「発現カセット」と同義である。
調節配列：用語「調節配列」とは、本発明の改変体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全構成要素を意味する。各々の調節配列は、改変体をコードするポリヌクレオチドに対して天然のものであっても若しくは異質なものであってもよく、又は互いに天然のものであっても若しくは異質なものであってもよい。このような調節配列には、限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、調節配列には、プロモータ、並びに転写及び翻訳終止シグナルが含まれる。調節配列は、改変体をコードするポリヌクレオチドのコード領域と調節配列の連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、リンカーとともに提供されてもよい。
作動可能に連結された：用語「作動可能に連結された」とは、調節配列がコード配列の発現を指向するようにポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に配置された構造を意味する。
発現：用語「発現」には、改変体の生産に関与したいずれかのステップを含み、限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。
発現ベクター：用語「発現ベクター」とは、改変体をコードするポリヌクレオチドを含み、その発現をもたらす付加的なヌクレオチドに作動可能に連結された線状又は環状ＤＮＡ分子を意味する。
宿主細胞：用語「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターを用いた形質転換、トランスフェクション、トランスダクションなどに対して感受性であるいずれかの細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製中に生じる突然変異により、親細胞とは同一でない親細胞のいずれかの子孫を包含する。
改変体を表示するための取り決め
本発明の目的のために、配列番号２に開示されている成熟ペプチドは、別の抗菌ペプチドにおける対応するアミノ酸残基を決定するために用いられる。別の抗菌ペプチドのアミノ酸配列は配列番号２に開示されている成熟ペプチドと整列され、そのアラインメントに基づいて、配列番号２に開示されている成熟ペプチドにおける任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号がＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定され、それはＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅら，２０００年，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）（好ましくはバージョン３．０．０）において行われる。
別の抗菌ペプチドにおける対応するアミノ酸残基の同定は、「ＣｌｕｓｔａＩＷ」（Ｌａｒｋｉｎら，２００７年，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：２９４７−２９４８）を用いて複数のペプチド配列のアラインメントによって確認することができる。
他の酵素と配列番号２の成熟ペプチドの関係を伝統的な配列に基づく比較が検出しないように、他の酵素が配列番号２の成熟ペプチドから分岐した場合（Ｌｉｎｄａｈｌ及びＥｌｏｆｓｓｏｎ，２０００年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることができる。配列に基づく検索のより大きな感度は、データベースを検索するためのペプチドファミリー（プロフィール）の確率的表現を利用するサーチプログラムを用いて獲得され得る。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは反復データベースサーチプロセスを通じてプロフィールを生じさせ、遠隔ホモログを検出することができる（Ａｔｓｃｈｕｌら，１９９７年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ペプチドのファミリー又はスーパーファミリーがタンパク質構造のデータベースにおいて１又は複数の表現を有する場合、さらにより大きな感度が達成され得る。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ及びＪｏｎｅｓ，２００３年，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４−８８１）などのプログラムは、クエリー配列の折り畳み構造を予測する神経ネットワークへ入力すると同様に、種々の供給源からの情報（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロフィール、及びソルベーションポテンシャル（ｓａｌｖａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ））を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈら（２０００年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３１３：９０３−９１９）の方法は、ＳＣＯＰデータベースに存在するスーパファミリーモデルと、未知の構造の配列を整列させるために使用することができる。これらのアラインメントを順次用いて、ペプチドに対する相同的なモデルを生成することができ、このようなモデルはその目的のために開発された種々のツールを用いて、精度を評価することができる。
既知の構造のタンパク質について、構造アラインメントを回復し、生成させるためにいくつかのツール及び資源を用いることができる。例えば、タンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーを構造的に整列させ、それらのアラインメントはアクセル及びダウンロードが可能である。２以上のタンパク質構造は、間隔アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ及びＳａｎｄｅｒ，１９９８年，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８−９６）、又はコンビナトリアル伸長（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ及びＢｏｕｒｎｅ，１９９８年，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９−７４７）などの種々のアルゴリズムを用いて整列することができ、これらのアラインメントの実行は、可能な構造ホモログを発見するために、対象の構造を用いて構造データベースを検索するために付加的に用いることができる（例えば、Ｈｏｌｍ及びＰａｒｋ，２０００年，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６−５６７）。
本発明の抗菌ペプチド改変体の記述において、以下に記載される命名は、参照を容易にするために採用される。承認されるＩＵＰＡＣの１文字又は３文字のアミノ酸省略形が用いられる。
置換。アミノ酸置換については、以下の命名を用いる：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。したがって、２２６位でスレオニンをアラニンで置換することを、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」として指定する。複数の突然変異は、符号（「＋」）を加えることで分離し、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」により、グリシン（Ｇ）をアルギン（Ｒ）で、セリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）で、それぞれ２０５と４１１位で置換する突然変異変異体を表す。
欠失。アミノ酸欠失について、以下の命名を用いる：元のアミノ酸、位置、*。したがって、１９５位でのグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５*」又は「Ｇ１９５*」として指定される。複数の欠失は、符号（「＋」）を加えることで分離し、例えば、「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓｅｒ４１１*」又は「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓ４１１*」により表される。
挿入。アミノ酸挿入について、以下の命名を用いる：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。したがって、１９５位のグリシンの後へのリジンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」として指定される。複数のアミノ酸の挿入が指定される［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２など］。例えば、１９５位のグリシンの後へのリジン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」として指定される。
このような場合、挿入されたアミノ酸残基（単数又は複数）は、挿入されたアミノ酸残基（単数又は複数）に先行するアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加するとによって番号付けされる。したがって、上記の例では、配列は以下のようになる：
Figure 0006120769
複数変更。複数の変更を含む改変体は、符号（「＋」）を加えることで分離し、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ１７０位及び１９５位のアルギニン及びグリシンに対してチロシン及びグルタミン酸の置換を表す。
様々な置換。様々な置換はある位置で導入可能な場合、その様々な置換はコンマによって分離され、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ，Ｅ」は１７０位でチロシン又はグルタミン酸によるアルギニンの置換を表す。したがって、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」又は「Ｙ１６７Ｇ，Ａ ＋Ｒ１７０Ｇ，Ａ」は、以下の改変体：「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」を指定する。
親抗菌ペプチド
親抗菌ペプチドは、（ａ）配列番号２の成熟ペプチドと少なくとも６０％配列同一性を有するペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１の配列をコードする成熟ペプチド、若しくは（ｉｉ）（ｉ）の全長相補鎖；又は（ｃ）配列番号１の配列をコードする成熟ペプチドと少なくとも６０％配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたペプチドである。
第一の局面では、親は、配列番号２の成熟ペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、抗菌活性を有する。一局面では、親のアミノ酸配列は、配列番号２の成熟ペプチドと、１０個以下のアミノ酸、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸、および１個のアミノ酸で異なる。
好ましくは、親は、配列番号２のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。
一実施形態では、親は、少なくとも１５個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも１７個、及び少なくとも１９個のアミノ酸残基を含む、配列番号２のペプチドの断片である。
別の実施形態では、親は、配列番号２のペプチドの対立遺伝子改変体である。第２の局面では、親ペプチドは、中程度のストリンジェントな条件、中程度から高程度のストリンジェントな条件、高程度のストリンジェントな条件、又は非常に高程度のストリンジェントな条件下で、（ｉ）配列番号１の配列をコードする成熟ペプチド、又は（ｉｉ）（ｉ）の全長の相補鎖、とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
配列番号１のポリヌクレオチド又はそのサブ配列、並びに配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を用いて、当該技術分野において周知な方法に従って、異なる属又は種の菌株から親をコードするＤＮＡを同定し、クローニングするための核酸プローブを設計してもよい。具体的には、このようなプローブは、標準的なサザンブロッティング手段に従う、対象とする属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いて、そこにおいて対応する遺伝子を同定及び単離することができる。このようなプローブは、全長の配列よりもかなり短いものであってもよいが、長さにして少なくとも１４、例えば、少なくとも２５、又は少なくとも３５ヌクレオチドである必要がある。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブをともに用いることができる。これらのプローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジン）を用いて標識される。このようなプローブは本発明によって包含される。
このような他の生物から調製されるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上記のプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。このような他の生物由来のゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技術によって分離されてもよい。ライブラリーからのＤＮＡ、又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の適した担体材料に移され、そこに固相化されてもよい。クローン、又は配列番号１若しくはそのサブ配列と相同なＤＮＡを同定するために、担体材料をサザンブロットに用いる。
本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、配列番号１に示されるポリヌクレオチド、その相補鎖、又はそのサブ配列、に対応する標識されたヌクレオチドプローブに対して、低から非常に高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを指示する。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルム、又は当該技術分野において知られている任意の他の検出手段を用いて検出することができる。
一局面では、核酸プローブは配列番号１である。
長さにして少なくとも６０ヌクレオチドの長いプローブについて、非常に低いから非常に高いストリンジェントな条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手法に従う、５×ＳＰＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断され、変性されたサケ精子ＤＮＡ、及び２５％ホルムアミド（非常に低い及び低いストリンジェンシーについて）、３５％ホルムアミド（中程度から中高程度のストリンジェンシーについて）、又は５０％ホルムアミド（高い及び非常に高いストリンジェンシーについて）中の４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。担体材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液を用いて、４５℃（非常に低いストリンジェンシー）、５０℃（低いストリンジェンシー）、５５℃（中程度のストリンジェンシー）、６０℃（中程度から高いストリンジェンシー）、６５℃（高いストリンジェンシー）、又は７０℃（非常に高いストリンジェンシー）にて、それぞれ１５分間、３回洗浄される。
長さにして約１５ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドである短いプローブについて、ストリンジェントな条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手法に従う、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハルト溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸一ナトリウム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ／ｍｌ中で、Ｂｏｌｔｏｎ及びＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：１３９０）に従った計算を用いて計算されたＴｍ未満で、約５℃から約１０℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。担体材料は、最終的には、６×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにおいて１５分間で１回、さらに６×ＳＳＣを用いて各２回、５℃から１０℃にて、計算されたＴｍ未満で洗浄される。
第三の局面では、親は、配列番号１の配列をコードするペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされ、それは抗菌活性を有するペプチドをコードする。
親は、任意の属の微生物から得られてもよい。本発明の目的のために、用語「から得られる」とは、本明細書で使用するとき、所定の供給源と関連して、ポリヌクレオチドによってコードされる親が、該供給源によって、又は該供給源からのポリヌクレオチドが挿入された細胞によって生成されることを意味する。一局面では、親は、細胞外に分泌される。
親は、細菌性抗菌ペプチドであってもよい。親は、グラム陽性細菌性ペプチド、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、若しくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）抗菌ペプチド、又はグラム陰性細菌性ペプチド、例えばカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、若しくはウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）抗菌ペプチドであってもよい。
一局面では、親は、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はバチルス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）抗菌ペプチドである。
別の局面では、親は、スタフィロコッカス・エクイジミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、又はスタフィロコッカス・エクイｓｕｂｓｐ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ），ズーエピデミクス（Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）抗菌ペプチドである。
別の局面では、親は、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、又はストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）抗菌ペプチドである。
親は、真菌の抗菌ペプチドであってもよい。例えば、親は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）抗菌ペプチドなどの酵母の抗菌ペプチドであってもよい。例えば、親は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリカス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスパエラ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、カエトミジウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボラス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリホネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコーカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロジア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エキシジア（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴイデス（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、ヒューミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペクス（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポリス（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルパス（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピラス（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオプソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカノマスチックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュウドプレクタニア（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュウドトリコニンファ（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファラ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）又はキシラリア（Ｘｙｌａｒｉａ）などの糸状真菌の抗菌ペプチドであってもよい。別の局面では、親は、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）抗菌ペプチドである。
別の局面では、親は、アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギラス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギラス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギラス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギラス・ホエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギラス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギラス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギラス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・トピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・パニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓａｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ヒュミコラ・グリサエ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペクス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオプラソ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボマイセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・オウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメチ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スブサーモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコダーマ・ハルジアナル（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコダーマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコダーマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコダーマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコダーマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）抗菌ペプチドである。
別の局面では、本発明は、アレニコラ・マリナ（Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａ）の抗菌ペプチドであり、例えば、配列番号２の抗菌ペプチドである。
上述の種に関して、本発明は、完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学的同等物、例えばアナモルフ（それらが知られている種の名称にかかわらず）を包含することが理解される。当業者は、適切な同等物の正体を容易に認識する。
これらの種の株は、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃａｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＮＲＲＬ）。
親は、他の供給源、例えば、天然源（例えば、土壌、培養土、水など）から単離された微生物、又は天然材料（例えば、土壌、培養土、水など）から直接的に得られたＤＮＡ試料から、上述したプローブを用いて同定され、得られてもよい。天然の生息地から直接、微生物及びＤＮＡを単離する技術は、当該技術分野において良く知られている。次に、親をコードするポリヌクレオチドは、別の微生物のゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリー、又は混合されたＤＮＡ試料を同様にスクリーニングすることによって誘導されてもよい。親をコードするポリヌクレオチドがプローブ（単数又は複数）により検出されると、ポリヌクレオチドは、当業者に知られている技法を用いることによって同定され、又はクローン化され得る（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，１９８９年，上述を参照されたい）。
親は、１つのペプチドの一部が、別のペプチドの一部のＮ末端又はＣ末端で融合されたハイブリッドペプチドであってもよい。
また、親は、１つのペプチドが、別のペプチドのＮ末端又はＣ末端で融合された融合された又は切断可能な融合ペプチドであってもよい。融合されたペプチドは、１つのペプチドをコードするポリヌクレオチドを別のペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合することによって生成される。融合ペプチドを生成するための技術は当該技術分野において知られ、ポリペプチドをコードするコード配列がインフレームにあり、融合されたポリペプチドの発現が同じプロモータ（単数又は複数）及びターミネータの調節下にあるように、それらのコード配列を連結することを含む。また、融合タンパク質は、融合がポスト翻訳的に作製されるインテイン技術を用いて構成されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒら，１９９３年，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎら，１９９４年，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）。
融合ペプチドは、２つのペプチド間の切断部位をさらに含むことができる。融合タンパク質の分泌に際して、該部位は２つのペプチドに切断され、放出される。切断部位の例は、限定されてないが、以下：Ｍａｒｔｉｎら，２００３年，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａら，２０００年，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎら，１９９７年，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄら，１９９５年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８−５０３；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，１９９１年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎら，１９８６年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅら，１９９５年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒら，１９８９年，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，及びＧｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０−２４８；及びＳｔｅｖｅｎｓ，２００３年，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５−４８に開示される部位を含む。
改変体の調製
本発明はまた、抗菌活性を有する改変体を得るための方法に関し、この方法は、（ａ）配列番号の成熟ペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位に対応する１以上（いくつか）における置換を親の抗菌ペプチドに導入し、ここで、該改変体は抗菌活性を有し；及び（ｂ）改変体を回収することを含む。
改変体は、当該技術分野において知られているいずれかの突然変異誘発方法、例えば部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャフリングなどを用いて調製することができる。
部位特異的突然変異誘発は、１以上（いくつか）の突然変異が、親をコードするポリヌクレオチドにおいて１以上の画定された部位で作製される技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによりインビトロで達成され得る。また、部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける１つの部位での制限酵素による切断、及びポリヌクレオチドにおける突然変異を含むオリゴヌクレオチドの続く連結を伴うカセット突然変異誘発によってインビトロで実施することができる。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドで消化する制限酵素は同じであり、プラスミド及びインサートの付着端が互いに連結することを可能にする。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ及び Ｄａｖｉｓ，１９７９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９−４９５５；及びＢａｒｔｏｎら，１９９０年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：７３４９−４９６６を参照されたい。
部位特異的突然変異誘発は、当業者に知られている方法によって、インビボで達成され得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号；Ｓｔｏｒｉｃｉら，２００１年，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎら，１９９８年，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；Ｃａｌｉｓｓａｎｏ及びＭａｃｉｎｏ，１９９６年，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照されたい。
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において使用され得る。親改変体を調製するために使用され得る多くの市販のキットが利用可能である。
合成の遺伝子構築物は、対象とするペプチドをコードするように設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を必要とする。遺伝子合成は、Ｔｉａｎらによる多重マイクロチップに基づく技術（２００４年，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０−１０５４）、及びオリゴヌクレオチドが合成され、光−プログラムできるマイクロ液体チップ上に集められる類似する技術などの多数の技術を利用して実施することができる。
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、突然変異誘発、組換え及び/又はシャフリング、続く適切なスクリーニング手法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ及びＳａｕｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７，１９８８年）、Ｂｏｗｉｅ及びＳａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６，１９８９年）、ＷＯ９５／１７４１３号又はＷＯ９５／２２６２５号により開示される既知の方法を用いて行われ、試験され得る。使用され得る他の方法は、エラーが発生し易いＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎら，１９９１年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７、米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／０６２０４）及び領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら，１９８６年，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒら，１９８８年，ＤＮＡ ７：１２７）を含む。
突然変異誘発／シャフリング方法は、宿主細胞において発現された、クローン化され、突然変異誘発されたペプチドの活性を検出するために、ハイスループットの自動化されたスクリーニング法と組み合わせることができる（Ｎｅｓｓら，１９９９年，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ペプチドをコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収され、当該技術分野における標準的な方法を用いて急速に配列決定され得る。これらの方法は、ペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を急速に決定することができる。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、及び／又は部位特異的突然変異誘発、及び／又はランダム突然変異誘発、及び／又はシャフリングの局面を組み合わせることによって達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わせて、合成されるポリヌクレオチド断片を利用するプロセスによって象徴化される。したがって、遺伝子の画定された領域が新たに合成されてもよく、一方、他の領域は部位特異的変異誘発プライマを用いて増幅されてもよく、さらなる他の領域は修復ミスの多いＰＣＲ又は修復ミスのないＰＣＲ増幅に供されてもよい。次に、ポリヌクレオチド断片がシャフルされてもよい。
改変体
本発明はまた、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位（好ましくは、１、２、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、１７、及び２１位；より好ましくは、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、及び１７位）に対応する１以上（いくつか）の位置での置換を含む親の抗菌ペプチドの改変体であり、抗菌活性を有する改変体を提供する。一実施形態では、改変体は、好ましくは血液又は血清の存在下で、配列番号２のペプチドと比較して改善された抗菌活性を有する。別の実施形態では、改変体は、配列番号２のペプチドと比較して、少ないタンパク質結合を示す。好ましくは、改変体の抗菌ペプチドは、ほぼ９９％の血清タンパク質結合を示す。また、改変体の抗菌ペプチドは、改善された生物学的利用能を示す。好ましくは、皮下の生物学的利用能は、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％である。
一実施形態では、改変体は、親の抗菌ペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するが、しかし、１００％未満の配列同一性を有する。
別の実施形態では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドと少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するが、しかし、１００％未満の配列同一性を有する。
一局面では、本発明の改変体における置換数は、１〜１１であり、例えば、１〜１０置換、１〜９置換、１〜８置換、１〜７置換、１〜６置換、１〜５置換、１〜４置換、１〜３置換、及び１〜２置換である。
一局面では、改変体は、配列番号３〜配列番号５４８に示されるアミノ酸配列を含む又はそれらからなる。
用語「配列番号３〜配列番号５４８」とは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５４、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配列番号５２４、配列番号５２５、配列番号５２６、配列番号５２７、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０、配列番号５３１、配列番号５３２、配列番号５３３、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４１、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４４、配列番号５４５、配列番号５４６、配列番号５４７、及び／又は配列番号５４８のいずれか１つを意味することが意図される。
一局面では、改変体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位；好ましくは、１、２、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、１７、及び２１位；より好ましくは、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、及び１７位に対応する１以上（いくつか）の位置での置換を含む。別の局面では、改変体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位；好ましくは、１、２、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、１７、及び２１位；より好ましくは、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、及び１７位のいずれかに対応する２つの位置での置換を含む。別の局面では、改変体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位；好ましくは、１、２、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、１７、及び２１位；より好ましくは、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、及び１７位のいずれかに対応する３つの位置での置換を含む。別の局面では、改変体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位；好ましくは、１、２、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、１７、及び２１位；より好ましくは、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、及び１７位のいずれかに対応する４つの位置での置換を含む。別の局面では、改変体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位；好ましくは、１、２、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、１７、及び２１位；より好ましくは、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、及び１７位のいずれかに対応する５つの位置での置換を含む。別の局面では、改変体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、及び２１位；好ましくは、１、２、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、１７、及び２１位；より好ましくは、４、５、６、８、９、１２、１３、１５、及び１７位のいずれかに対応する６つの位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｇ１Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｆ２Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｃ３Ｌを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｗ４Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ５Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｗを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｖ６Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｃ７Ｖを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｖ８Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ９Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｒ１０Ｋ、Ｐ、Ｓ、Ｔを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｎ１１Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｇ１２Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｖ１３Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｖ１５Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ１７Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｒ１９Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｔ、Ｙを含む。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｎ２１Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は１位での置換を含む。別の局面では、１位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｇ１Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は２位での置換を含む。別の局面では、２位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｆ２Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は３位での置換を含む。別の局面では、３位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＬｅｕで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｃ３Ｌを含む。
一局面では、改変体は４位での置換を含む。別の局面では、４位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｗ４Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は５位での置換を含む。別の局面では、５位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＧｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、又はＴｒｐで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ５Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｗを含む。
一局面では、改変体は６位での置換を含む。別の局面では、６位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｖ６Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は７位での置換を含む。別の局面では、７位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＶａｌで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｃ７Ｖを含む。
一局面では、改変体は８位での置換を含む。別の局面では、８位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｖ８Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は９位での置換を含む。別の局面では、９位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｒｐで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ９Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗを含む。
一局面では、改変体は１０位での置換を含む。別の局面では、１０位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＬｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｒ１０Ｋ、Ｐ、Ｓ、Ｔを含む。
一局面では、改変体は１１位での置換を含む。別の局面では、１１位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｎ１１Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は１２位での置換を含む。別の局面では、１２位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｇ１２Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は１３位での置換を含む。別の局面では、１３位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｖ１３Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は１５位での置換を含む。別の局面では、１５位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｖ１５Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は１７位での置換を含む。別の局面では、１７位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｒｐで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ１７Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗを含む。
一局面では、改変体は１９位での置換を含む。別の局面では、１９位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｒ１９Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｔ、Ｙを含む。
一局面では、改変体は２１位での置換を含む。別の局面では、２１位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒで置換される。別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｎ２１Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙを含む。
別の局面では、改変体は、５位及び１７位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、５位及び９位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、５位及び１５位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、１７位及び９位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、１７位及び１５位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、９位及び１５位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、５位、１７位、及び９位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、５位、１７位、及び１５位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、５位、９位、及び１５位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、１７位、９位、及び１５位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、５位、１７位、９位、及び１５位に対応する位置での置換、例えば上記される位置での置換を含む。
別の局面では、改変体は、下記：
Ｇ１Ａ、Ｇ１Ｄ、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｈ、Ｇ１Ｉ、Ｇ１Ｋ、Ｇ１Ｍ、Ｇ１Ｑ、Ｇ１Ｒ、Ｇ１Ｓ、Ｇ１Ｔ、Ｇ１Ｖ、Ｇ１Ｗ、Ｇ１Ｙ、
Ｆ２Ａ、Ｆ２Ｇ、Ｆ２Ｈ、Ｆ２Ｉ、Ｆ２Ｌ、Ｆ２Ｍ、Ｆ２Ｐ、Ｆ２Ｓ、Ｆ２Ｖ、Ｆ２Ｗ、Ｆ２Ｙ、
Ｃ３Ｌ、
Ｗ４Ａ、Ｗ４Ｅ、Ｗ４Ｆ、Ｗ４Ｇ、Ｗ４Ｉ、Ｗ４Ｌ、Ｗ４Ｍ、Ｗ４Ｎ、Ｗ４Ｑ、Ｗ４Ｓ、Ｗ４Ｔ、Ｗ４Ｖ、Ｗ４Ｙ、
Ｙ５Ｅ、Ｙ５Ｆ、Ｙ５Ｇ、Ｙ５Ｈ、Ｙ５Ｋ、Ｙ５Ｎ、Ｙ５Ｒ、Ｙ５Ｓ、Ｙ５Ｗ、
Ｖ６Ａ、Ｖ６Ｃ、Ｖ６Ｅ、Ｖ６Ｆ、Ｖ６Ｇ、Ｖ６Ｈ、Ｖ６Ｉ、Ｖ６Ｌ、Ｖ６Ｍ、Ｖ６Ｎ、Ｖ６Ｑ、Ｖ６Ｒ、Ｖ６Ｓ、Ｖ６Ｔ、Ｖ６Ｗ、Ｖ６Ｙ、Ｃ７Ｖ、
Ｖ８Ａ、Ｖ８Ｆ、Ｖ８Ｇ、Ｖ８Ｈ、Ｖ８Ｉ、Ｖ８Ｌ、Ｖ８Ｎ、Ｖ８Ｓ、Ｖ８Ｔ、Ｖ８Ｗ、Ｖ８Ｙ、
Ｙ９Ａ、Ｙ９Ｄ、Ｙ９Ｆ、Ｙ９Ｇ、Ｙ９Ｈ、Ｙ９Ｉ、Ｙ９Ｋ、Ｙ９Ｍ、Ｙ９Ｑ、Ｙ９Ｒ、Ｙ９Ｓ、Ｙ９Ｔ、Ｙ９Ｖ、Ｙ９Ｗ、
Ｒ１０Ｋ、Ｒ１０Ｐ、Ｒ１０Ｓ、Ｒ１０Ｔ、
Ｎ１１Ａ、Ｎ１１Ｇ、Ｎ１１Ｈ、Ｎ１１Ｑ、Ｎ１１Ｒ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１Ｙ、
Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｅ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｈ、Ｇ１２Ｋ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｙ、
Ｖ１３Ａ、Ｖ１３Ｃ、Ｖ１３Ｆ、Ｖ１３Ｇ、Ｖ１３Ｈ、Ｖ１３Ｋ、Ｖ１３Ｌ、Ｖ１３Ｐ、Ｖ１３Ｑ、Ｖ１３Ｒ、Ｖ１３Ｓ、Ｖ１３Ｔ、Ｖ１３Ｗ、Ｖ１３Ｙ、
Ｖ１５Ａ、Ｖ１５Ｃ、Ｖ１５Ｆ、Ｖ１５Ｇ、Ｖ１５Ｈ、Ｖ１５Ｉ、Ｖ１５Ｋ、Ｖ１５Ｌ、Ｖ１５Ｍ、Ｖ１５Ｎ、Ｖ１５Ｐ、Ｖ１５Ｑ、Ｖ１５Ｒ、Ｖ１５Ｓ、Ｖ１５Ｔ、Ｖ１５Ｗ、Ｖ１５Ｙ、
Ｙ１７Ｃ、Ｙ１７Ｆ、Ｙ１７Ｇ、Ｙ１７Ｈ、Ｙ１７Ｉ、Ｙ１７Ｋ、Ｙ１７Ｌ、Ｙ１７Ｍ、Ｙ１７Ｎ、Ｙ１７Ｑ、Ｙ１７Ｒ、Ｙ１７Ｓ、Ｙ１７Ｔ、Ｙ１７Ｖ、Ｙ１７Ｗ、
Ｒ１９Ｄ、Ｒ１９Ｈ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｍ、Ｒ１９Ｔ、Ｒ１９Ｙ、
Ｎ２１Ａ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｆ、Ｎ２１Ｇ、Ｎ２１Ｈ、Ｎ２１Ｉ、Ｎ２１Ｋ、Ｎ２１Ｌ、Ｎ２１Ｍ、Ｎ２１Ｐ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ２１Ｒ、Ｎ２１Ｓ、
Ｎ２１Ｔ、Ｎ２１Ｗ、及びＮ２１Ｙ；
好ましくは、
Ｗ４Ａ、Ｙ５Ｈ、Ｙ５Ｎ、Ｙ５Ｒ、Ｖ６Ａ、Ｖ６Ｆ、Ｖ８Ａ、Ｙ９Ｋ、Ｙ９Ｒ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｋ、Ｖ１３Ａ、Ｖ１５Ｉ、Ｖ１５Ｓ、及びＹ１７Ｈ
からなる群から選択される１以上（いくつか）の置換を含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ５Ｎ＋Ｙ１７Ｈを含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ５Ｎ＋Ｙ９Ｒを含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ５Ｎ＋Ｙ９Ｋを含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ１７Ｈ＋Ｙ９Ｒを含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ１７Ｈ＋Ｙ９Ｋを含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ５Ｎ＋Ｙ１７Ｈ＋Ｙ９Ｒを含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ５Ｎ＋Ｙ１７Ｈ＋Ｙ９Ｋを含む。
別の局面では、改変体は、配列番号２の成熟ペプチドの置換Ｙ５Ｎ＋Ｖ６Ａ＋Ｙ９Ｋ、又はＶ８Ａ＋Ｙ９Ｒ＋Ｖ１３Ａ、又はＹ５Ｎ＋Ｙ９Ｒ＋Ｙ１７Ｈ、又はＹ９Ｋ＋Ｖ１５Ｓ、又はＷ４Ａ＋Ｙ５Ｒ＋Ｙ９Ｋ、又はＹ５Ｎ＋Ｇ１２Ｒ＋Ｙ１７Ｈ、又はＹ５Ｎ＋Ｖ６Ｆ＋Ｙ１７Ｈ、又はＹ５Ｎ＋Ｖ１５Ｉ＋Ｙ１７Ｈ、又はＹ５Ｈ＋Ｖ８Ａ＋Ｙ９Ｒ、又はＹ５Ｎ＋Ｇ１２Ｋ＋Ｙ１７Ｈを含む。
親における必須アミノ酸は、当該技術分野において知られている手法、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，１９８９年，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあらゆる残基に導入され、得られる突然変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、抗菌活性について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎなど（１９９６年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８）を参照されたい。また、必須アミノ酸の同地は、親に関連されるペプチドとの同一性の分析から推測することができる。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の改変体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
核酸構築物
本発明はまた、調節配列と適合可能な条件下で、適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指向する１以上（いくつか）の調節配列に作動可能に連結された本発明の改変体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
ポリヌクレオチドは、改変体の発現を提供するために種々の手段で操作されてもよい。ベクターへのそのインサート前のポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要とされ得る。組換えＤＮＡ法を用いてポリヌクレオチドを修飾する技術は、当該技術分野において周知である。
調節配列は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるプロモータ配列であってもよい。プロモータ配列は、改変体の発現を仲介する転写調節配列を含む。プロモータは、宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であってもよく、例えば突然変異体の、切断された、及びハイブリッドのプロモータであり得て、さらに、宿主細胞に対して相同であるか又は異種である細胞外又は細胞内ペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。
細菌宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を指向するための適切なプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｇｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉ）ｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、及び原生動物のベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、並びにｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータは、“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｇｉｌｂｅｒｔなど，１９８０年，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４−９４；及びＳａｍｂｒｏｏｋなど（１９８９年、上述）に記載される。
糸状菌宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写を指向するための適切なプロモータの例は、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ）、アスペルギラス・ニガー中性アルファ−アミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｎｅｕｔｒａｌ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ）、アスペルギラス・ニガー酸安定性アルファ−アミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｃｉｄ ｓｔａｂｌｅ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ）、アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）（ｇｌａＡ）、アスペルギラス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ ａｍｙｌａｓｅ）、アスペルギラス・オリザエ アルカリプロテアーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｔｒｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、フサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）（ＷＯ９６／００７８７）、フサリウム・ベネナタムアミログルコシダーゼ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）（ＷＯ００／５６９００）、フサリウム・ベネナタムＤａｒｉａ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｄａｒｉａ）（ＷＯ００／５６９００）、フサリウム・ベネナタムＱｕｉｎｎ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｑｕｉｎｎ）（ＷＯ００／５６９００）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｌｉｐａｓｅ）、リゾムコル・ミエヘイ アスパラギン酸プロテイナーゼ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、トリコダーマ・レセイベータ−グルコシダーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）、トリコダーマ・レセイ／セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉ）、トリコダーマ・レセイ／セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ＩＩ）、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｉ）、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼＩＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ＩＩ）、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼＩＩＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ＩＩＩ）、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼＩＶ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ＩＶ）、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼＶ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｖ）、トリコダーマ・レセイキシラナーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｘｙｌａｎａｓｅ Ｉ）、トリコダーマ・レセイキシラナーゼＩＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｘｙｌａｎａｓｅ ＩＩ）、トリコダーマ・レセイベータ−キシロシダーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｂｅｔａ−ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ）に関する遺伝子から得られるプロモータ、並びにＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（アスペルギリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）における中性アルファ−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾されたプロモータ、ここで、非翻訳リーダーはアスペルギリにおけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置換されている；非制限的な例は、アスペルギラス・ニガーにおける中性アルファ−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾されたプロモータを含み、ここで、非翻訳リーダーは、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・オリザエにおけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置換されている）；それらの突然変異体の、切断された、及びハイブリッドプロモータである。
酵母宿主においては、有用なプロモータは、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシアエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシアエトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシアエ金属チオニン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼから得られる。酵母宿主細胞のための有用な他のプロモータは、Ｒｏｍｕｎｏｓなど（１９９２年，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８）により報告されている。
また、調節配列は、適切な転写ターミネーター配列であってもよく、それは、転写を終結するために宿主細胞により認識される。ターミネーター配列は、改変体をコードするポリヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結される。宿主細胞において機能的であるいずれのターミネーターを用いてもよい。
糸状菌宿主細胞用の好ましいターミネーターは、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーアルファ−グルコシダーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼに関する遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞用の好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロミセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞用の有用な他のターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓなど（１９９２年，前記）により報告されている。
また、調節配列は、適切なリーダー配列であってもよく、それは、宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、改変体をコードするポリヌクレオチド配列の５’末端に作動可能に連結される。宿主細胞において機能的であるいずれのリーダー配列を用いてもよい。
糸状菌宿主細胞用の好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、及びアスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼに関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞用の適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセル・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシアエアルファ−因子、及びサッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子から得られる。
また、調節配列は、ポリアデニル化配列であってもよく、それは、改変体をコードする配列の３’末端に作動可能に連結され、転写される場合、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である。宿主細胞において機能的であるいずれのポリアデニル化配列を用いてもよい。
糸状菌宿主細胞用の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギキラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーアルファ−グルコシダーゼ、アスペルギラス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼに関する遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞用の有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ及びＳｈｅｒｍａｎ（１９９５年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：５９８３−５９９０）により報告されている。
また、制御配列は、改変体のＮ末端に連結されるシグナルペプチドをコードし、その改変体を細胞の分泌経路に指向するシグナルペプチドコード領域でもあってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、改変体をコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠において、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を固有に含んでもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含んでもよい。そのコード配列が天然においてシグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされ得る。あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、改変体の分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換してもよい。しかしながら、分泌経路に、発現された改変体を指向するいずれのシグナルペプチドコード領域を用いてもよい。
細菌宿主細胞用の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルスＮＣＩＢ１１８３７マルトゲン性アミラーゼ、バチルス・リケニホルミススブチリシン、バチルス・リケニホルミスβ−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスアルファ−アミラーゼ、バチルス・ステロサーモフィラス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、及びバチルス・サブチリスｐｒｓＡに関する遺伝子から得られるシグナルペプチド配列である。更なるシグナルペプチドは、Ｓｉｎｏｍｅｎ及びＰａｌｖａ（１９９３年，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７）により報告されている。
糸状菌宿主細胞用の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、ヒューミコラ・インソレンスセルラーゼ、ヒューミコラ・イソレンスエンドグルカーゼＶ、ヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼ、及びリゾムコル・ミエヘイアスペラギン酸プロテイナーゼに関する遺伝子から得られたシグナルペプチドコード配列である。
酵母宿主細胞用の有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシアエアルファ−因子、及びサッカロミセル・セレビシアエインバーターゼに関する遺伝子から得られる。有用な他のシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓなど（１９９２年，前記）により報告されている。
また、調節配列は、改変体のＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード領域であってもよい。得られるペプチドは、プロ酵素又はプロペプチド（又はある場合、チモーゲン）として知られている。プロペプチドは、一般的に不活性であり、プロペプチドからプロペプチドの触媒又は自己触媒による切断によって、活性ペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオプソラ・サーモフィリア ラッカーゼ（ＷＯ９５／３３８３６）、リゾムコル・ミエヘイ アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシアエアルファ−因子に関する遺伝子から得られてもよい。
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両方は、改変体のＮ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、改変体のＮ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のＮ末端の次に位置する。
また、宿主細胞の増殖に関して、改変体の発現の制御を可能にする制御配列を付加することが所望されてもよい。調節システムの例は、制御化合物の存在を含む、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすシステムである。原核生物系における調節システムは、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐオペレーターシステムを含む。酵母においては、ＡＤＨ２システム又はＧＡＬ１システムを用いてもよい。糸状菌においては、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼプロモータ、アスペルギラス・オリザエＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、及びアスペルギラス・オリザエグルコアミラーゼプロモータを用いてもよい。制御配列の他の列は、遺伝子増幅を可能にする配列である。真核システムにおいては、これらの制御配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属のより増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、改変体をコードするポリヌクレオチドは、制御配列により作動可能に連結される。
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチド及び調節配列は、１以上（いくつか）の好都合な制限部位で改変体をコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能にするために、それらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結されてもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配又は該ポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を発現に適切したベクターに挿入することによって発現され得る。発現ベクターを作製する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な調節配列により作動可能に連結される。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に好都合に供され得て、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことができるいずれかのベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入されるべき宿主細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターは、線状又は閉環された環状プラスミドであり得る。
ベクターは、自律的に複製するベクターであってもよく、すなわち、染色体外の存在物として存在するベクター（その複製は染色体複製には無関係である）、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニクロモソーム、又は人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確実にするためのいずれかの手段を含むことができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体（単数又は複数）と一緒に複製されるベクターであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡ、又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドが使用されてもよい。
ベクターは、好ましくは、形質転換された、トランスフェクトされた、形質導入された等の細胞の容易な選択を可能にする１以上（いくつか）の選択マーカーを含む。選択マーカーは、１つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性などを提供する。
細菌選択マーカーの例は、バチルス・リケニホルミス若しくはバチルス・サブチリス由来のｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞用の適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞に使用するための選択マーカーは、限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びにそれらの同等物を含む。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、並びにストレプトミセス・ヒグロスコピカスのｂａｒ遺伝子は、アスペルギラス細胞への使用に好ましい。
ベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込み、又はゲノムとは無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にするエレメント（単数又は複数）を含む。
宿主細胞のゲノムへの組み込みについて、ベクターは、相同又は非相同な組換えによるゲノムへの組み込みのための改変体又はベクターのいずれか他のエレメントをコードするポリヌクレオチド配列に依存してもよい。あるいは、ベクターは、染色体（単数又は複数）における正確な位置（単数又は複数）で、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組み込みを指向するための追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込みエレメントは、相同組換えの可能性を高めるためにその対応する標的配列と高い程度の同一性を示す十分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００個の塩基対、４００〜１０，０００個の塩基対、及び８００〜１０，０００個の塩基対を含むべきである。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同である任意の配列であってもよい。さらに、組み込みエレメントは、非コード又はコードヌクレオチド配列であってもよい。他方では、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
自律複製について、ベクターは、対象とする宿主細胞においてのベクターの自律的な複製を可能にする複製の起点をさらに含むことができる。複製の起点は、細胞において機能する自律複製を仲介する任意のプラスミド複製体であってもよい。用語「複製の起点」又は「プラスミド複製体」とは、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能にするヌクレオチド配列を意味する。
複製の細菌起点の例は、大腸菌において複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４、及びバチルスにおいて複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１の複製の起点である。
酵母宿主細胞において使用するための複製の起点の例は、複製の２ミクロン起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１及びＣＥＮ３の組み合わせ、並びにＡＲＳ４及びＣＥＮ６の組み合わせである。
糸状菌細胞において有用な複製の起点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓら，１９９１年，Ｇｅｎｅ ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎら，１９８７年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；ＷＯ００／２４８８３）。ＡＭＡ１遺伝子の単離及び該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、ＷＯ００／２４８８３に開示される方法に従って達成することができる。
本発明のポリヌクレオチドの１を超えるコピーは、改変体の生成を増加させるために宿主細胞に挿入されてもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、宿主細胞ゲノムに配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって、又はポリヌクレオチドとともに増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ、この場合、細胞は選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、それにより、ポリヌクレオチドの追加のコピーが、適切な選択試薬の存在下で前記細胞を培養することによって選択され得る。
本発明の組換え発現ベクターを構築するために上記したエレメントを連結するために使用される方法は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど，１９８９年，前記を参照されたい）。
宿主細胞
本発明はまた、本発明の改変体の生成を指向する１以上（いくつか）の調節配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む組か宿主細胞に関する。
生成において都合良く使用される、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主にも関する。ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターは、その構築物又はベクターが染色体組み込み体として、又は先に記載されるような自己複製の染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に生じる突然変異に起因して、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、改変体をコードする遺伝子及びその供給源に、非常な程度依存する。
宿主細胞は、改変体の組換え生成に有用な任意の細胞であってもよく、例えば、原核生物又は真核生物である。
原核宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であってもよい。グラム陽性細菌には、限定されないが、バチルス、クロストリジウム、エンテロコッカス、ゲオバチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、オセアノバチルス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、及びストレプトミセスが挙げられる。グラム陰性細菌には、限定されないが、カンピロバクター、大腸菌、フラボバクテリウム、フソバクテリウム、ヘリコバクター、イリオバクター、ナイセリア、シュードモナス、サルモネラ、及びウレアプラズマが挙げられる。
細菌宿主細胞は、任意のバチルス細胞であってもよく、例えば、限定されないが、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞が挙げられる。
また、細菌宿主細胞は、任意のストレプトコッカス細胞であってもよく、例えば、限定されないが、ストレプトコッカス・エクイジミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、及びストレプトコッカス・エクイｓｕｂｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．）、及びズーエピデミクス（Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞が挙げられる。
また、細菌宿主細胞は、任意のストレプトミセス細胞であってもよく、例えば、限定されないが、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、及びストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）が挙げられる。
細菌細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換を用いることによって（例えば、Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ，１９７９年，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５参照）、コンピテント細胞を用いることによって（例えば、Ｙｏｕｎｇ及びＳｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１年，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、又はＤｕｂｎａｕ及びＤａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１参照）、エレクトロポレーションによって（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ及びＤｏｗｅｒ，１９８８年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１参照）、又はコンジュゲーションによって（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＴｈｏｒｎｅ，１９８７年，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８参照）達成され得る。大腸菌細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換によって（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０参照）、又はエレクトロポレーションによって（例えば、Ｄｏｗｅｒら，１９８８年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５参照）達成され得る。ストレプトミセス細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換及びエレクトロポレーションによって（例えば、Ｇｏｎｇら，２００４年，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５参照）、コンジュゲーションによって（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒら，１９８９年，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５参照）、又は形質導入によって（例えば、Ｂｕｒｋｅら，２００１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９−６２９４参照）達成され得る。シュードモナス細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、エレクトロポレーションによって（例えば、Ｃｈｏｉら，２００６年，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１−３９７参照）、又はコンジュゲーションによって（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ及びＳｍｅｔｓ，２００５年，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７参照）達成されてもよい。ストレプトコッカス細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、天然コンピテンスによって（例えば、Ｐｅｒｒｙ及びＫｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１年，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７参照）、プロトプラスト形質転換によって（例えば、Ｃａｔｔ及びＪｏｌｌｉｃｋ，１９９１年，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９−２０７０参照）、エレクトロポレーションによって（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙら，１９９９年，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４参照）、又はコンジュゲーションによって（Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１年，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６参照）達成されてもよい。しかしながら、宿主細胞にＤＮＡを導入するための当該技術分野において知られている任意の方法を用いることができる。
宿主細胞はまた、真核生物、例えば哺乳類、昆虫、植物、又は真菌細胞であり得る。
宿主細胞は真菌細胞であってもよい。「真菌」には、本明細書中で使用するとき、門アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、キトリジオミコタ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、及びヅイゴミコタ（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、並びにオーミコタ（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及び全ての栄養胞子菌が含まれる（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈなど，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，第８版，１９９５年，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって定義される）。
真菌宿主細胞は酵母細胞であってもよい。「酵母」には、本明細書中で使用するとき、子嚢胞子酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、担子胞子酵母、及び不完全菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する酵母が含まれる。酵母の分類は将来的に変化し得るため、本発明の目的では、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，及びＤａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．編集，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０年）に記載されるように定義される。
酵母宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈｕｎｓｅｎｕｌａ）、クレベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であってもよく、例えば、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイビリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓｉ）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、又はヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である。
真菌宿主細胞は糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」には、細分ユーミコタ（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及びオーミコタ（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のすべての糸状形を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈなど，１９９５年，前記によって定義される通りである）。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類から構成される菌子体壁により特徴付けられる。成長増殖は菌子拡張によるものであり、炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母、例えばサッカロミセス・セレビジエによる成長増殖は、単細胞葉状体の発芽によるものであり、炭素代謝は発酵性であり得る。
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジュウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ベルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコーカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒューミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオプソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ）、ファネロカエト（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フェビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、又はトリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であってもよい。
例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギラス・ホエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギラス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギラス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギラス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギラス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ベルカンデラ・アダスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クロストリジウム・パニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓａｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオプラソ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フェビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロタス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコダーマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコダーマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコダーマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコダーマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコダーマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞であってもよい。
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含するプロセスにより形質転換されてもよい。アスペルギラス及びトリコダーマ宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ＥＰ２３８０２３、及びＹｅｌｔｏｎら，１９８４年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フラリウム種を形質転換するための適切な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９年，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６、及びＷＯ９６／００７８７に記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ及びＧｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．及びＳｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．編集，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏら，１９８３年，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；並びにＨｉｎｎｅｎら，１９７８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０年により報告されている手法を用いて形質転換されてもよい。
生成方法
本発明はまた、（ａ）改変体の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養し；および（ｂ）該改変体を回収することを含む、改変体を生成する方法に関する。
宿主細胞は、当該技術分野において知られている方法を用いて改変体の生成に適した栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ペプチドの発現及び／又は単離を可能にする、適切な培地において、及び条件下で行われる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、又は小規模若しくは大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は固体状態発酵を含む）により培養されてもよい。培養は、炭素及び窒素源、及び無機塩を含む適切な栄養培地において、当該技術分野において知られている手段を用いて行われる。適切な培地は、商業上の供給業者から利用可能であり、又は公開されている組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ のカタログにおける）に従って調製されてもよい。改変体が栄養培地に分泌される場合、改変体は培地から直接的に回収することができる。改変体が分泌されない場合、細胞溶解物から回収することができる。
改変体は、その改変体に対して特異的である、当該技術分野において知られている方法を用いて検出されてもよい。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、又は酵素基質の消失を含み得る。例えば、酵素アッセイは、改変体の活性を決定するために用いることができる。
改変体は、当該技術分野において知られている方法によって回収され得る。例えば、改変体は、従来の手段、例えば、限定されないが、回収、遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発、又は沈殿によって栄養培地から回収され得る。
改変体は、当該技術分野において知られている種々の手段によって精製されてもよく、例えば、限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手段（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ編集，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年を参照されたい）。
代替の局面では、改変体は回収されないが、しかし、むしろ改変体を発現する本発明の宿主細胞が改変体の供給源として用いられる。
インビトロ合成
本発明のポリペプチドはまた、当該技術分野において知られている従来の方法を用いて、インビトロ合成により調製され得る。種々の市販の合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｃｋｍａｎなどによる自動化されたシンセサイザーが市販されている。シンセサイザーを用いることによって、天然に存在するアミノ酸は、天然にないアミノ酸、特にＤ−異性体（又はＤ−形）、例えばＤ−アラニン及びＤ−イソロイシン、ジアステレオ異性体、異なった長さ又は官能性を有する側鎖等により置換され得る。特定の配列及び調製の様式は、便利性、経済性、必要とされる純度等により決定される。
化学結合は、結合のための好都合な官能基、例えばアミド又は置換されたアミン形成、例えば還元性アミノ化のためのアミノ基、チオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基等を含む種々のペプチド又はタンパク質に提供されてもよい。
所望により、種々の基が、他の分子又は表面への結合を可能にする、合成中又は発現中のペプチドに導入され得る。従って、システインが、チオエーテルを形成するために使用され、金属的複合体への結合のためにヒスチジンが、アミド又はエステルの形成のためにカルボキシル基が、アミドの形成のためにアミノ基が使用等される。
ポリペプチドは、組換え合成の従来の方法に従って単離及び精製されてもよい。溶解物は、発現宿主から調製され、さらに、溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クリマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術を用いて精製されてもよい。ほとんどの場合、使用される組成物は、生成物の調製方法に関する汚染物及びその精製に関して、所望の生成物の少なくとも２０重量％、より通常には少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、及び治療目的のためには、通常少なくとも約９９．５重量％を含む。通常、パーセンテイジ（％）は、総タンパク質に基づく。
植物
本発明はまた、改変体を回収できる量で発現及び生成するために、本発明のポリヌクレオチドを含む植物、例えばトランスジェニック植物、植物部分、又は植物細胞に関する。改変体は、植物又は植物部分から回収されてもよい。あるいは、改変体を含有する植物又は植物部分は、食物又は飼料の品質を改良し、例えば栄養価値、嗜好性、及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。トランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植物の例は、草、例えば湿潤地の草本（ブルーグラス、イチゴツナギ属）、飼草、例えばウシノケグサ、ドクムギ、温帯性草本、例えばヌカボ、及び穀類、例えば小麦、オート麦、ライ麦、大麦、イネ、 モロコシ、ソルガム、及びトウモロコシ（コーン）である。
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、例えばルピナス、ジャガイモ、砂糖大根、エンドウ、インゲン豆及び大豆、並びにアブラナ科植物（ブラシカセアエ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ））、例えばカリフラワー、ナタネ種子、及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）である。
植物部分の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子、及び塊茎、並びにこれらの部分を含む個々の組織、例えば表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織である。また、特定の植物細胞コンパートメント、例えば葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシゾーム及び細胞質は、植物部分であると考えられる。さらに、組織起源が何であろうと、いずれの植物細胞も植物部分であると考えられる。同様に、植物部分、例えば本発明の利用を促進するために単離された特定の組織及び細胞はまた、植物部分、例えば胚、内生精子、アリューロン及び種皮であると考えられる。
また、このような植物、植物部分、及び植物細胞の子孫は本発明の範囲内に含まれる。
改変体を発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当該技術分野において知られている方法に従って構築されてもよい。簡単には、植物又は植物細胞は、改変体をコードする、１以上（いくつか）の発現構築物を植物宿主ゲノム又は葉緑体ゲノムに導入し、得られる修飾された植物又は植物細胞をトランスジェニック植物又は植物細胞に成長させることによって構築される。
発現構築物は、好都合には、選択の植物又は植物部分におけるポリヌクレオチドの発現のために必要とされる適切な制御配列により作動可能に連結される改変体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物である。さらに、発現構築物は、発現構築物が組み込まれている植物細胞を同定するために有用な選択マーカー、及び対象の植物への構築物の導入のために必要なＤＮＡ配列を含んでもよい（後者は、使用されるＤＮＡ導入法に依存する）。
制御配列、例えばプロモータ配列及びターミネーター配列、及び場合により、シグナル配列又は遷移配列の選択は、例えば改変体がいつ、どこで、いかにして発現されること望まれるのかに基づいて決定される。例えば、改変体をコードする遺伝子の発現は、構造的若しくは誘発的であり、又は進行的、段階的又は組織特異的であってもよく、遺伝子産物は、特定の組織又は植物部分、例えば種子又は葉に標的化されてもよい。制御配列は、例えば、Ｔａｇｕｅら，１９８８年，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．，８６：５０６により報告されている。
構成的発現につちえ、３５Ｓ−ＣａＭＶ（トウモロコシユビキチン１）、及びイネアクチン１プロモータが用いられてもよい（Ｆｒａｎｃｋら，１９８０年，Ｃｅｌｌ ２１：２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９２年，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９；Ｚｈａｎｇら，１９９１年，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１５５−１１６５）。器官特異的プロモータは、例えば、貯蔵吸込み組織、例えば種子、ジャガイモ塊茎、及び果物（Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｃｏｒｕｚｚｉ，１９９０年，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７５−３０３）、又は代謝吸込み組織、例えば分裂組織（Ｉｔｏなど，１９９４年，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８６３−８７８）からのプロモータ、種子特異的プロモータ、例えばイネ由来のグルテリン、プロラミン、グロブリン、又はアルブミンプロモータ（Ｗｕなど，１９９８年，Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３９：８８５−８８９）、レグニンＢ４由来のＶｉｃｉａ ｆａｂａプロモータ、及びＶｉｃｉａ ｆａｂａ由来の未知の種子タンパク質遺伝子由来のＶｉｃｉａ ｆａｂａプロモータ（Ｃｏｎｒａｄなど，１９９８年，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １５２：７０８−７１１）、種子油体タンパク質由来のプロモータ（Ｃｈｅｎなど，１９９８年，Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３９：９３５−９４１）、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来の貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモータ、又は当該技術分野において知られている、例えばＷＯ９１／１４７７２に記載されるいずれか他の種子特異的プロモータであってもよい。さらに、プロモータは、葉特異的プロモータ、例えばイネ又はトマト由来のｒｂｃｓプロモータ（Ｋｙｏｚｕｋａなど，１９９３年，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：９９１−１０００）、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモータ（Ｍｉｔｒａ及びＨｉｇｇｉｎｓ，１９９４年，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５−９３）、又はイネ由来のａｌｄＰ遺伝子プロモータ（Ｋａｇａｙａなど，１９９５年，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４８：６６８−６７４）、又は創傷誘発性プロモータ、例えばジャガイモｐｉｎ２プロモータ（Ｘｕなど，１９９３年，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：５７３−５８８）であってもよい。同様に、プロモータは、非生物学的処理、例えば温度、渇水、又は塩分の変更により誘発されてもよく、又はプロモータを活性化する外因的に適用される物質、例えばエタノール、エストロゲン、植物ホルモン、例えばエチレン、アブシジン酸、ジベレリン酸、及び重金属により誘発できる。
また、プロモータエンハンサーエレメントは、植物における改変体のより高い発現を達成するために用いられてもよい。例えば、プロモータエンハンサーエレメントは、プロモータと、改変体をコードするポリヌクレオチドとの間に位置するイントロンであってもよい。例えば、Ｘｕら（１９９３年，前記）は、発現を増強するためにイネアクチン１遺伝子の最初のイントロンの使用を開示する。
発現構築体の選択マーカー遺伝子及びいずれか他の部分は、当該技術分野において入手できるそれらから選択され得る。
核酸構築物は、当該技術分野において知られている従来の技術、例えばアグロバクテリウム介在性形質転換、ウイルス介在性形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃、バイオリステック形質転換、及びエレクトロポレーションに従って、植物ゲノムに組込まれる（Ｇａｓｓｅｒなど，１９９０年，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９０年，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：５３５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏなど，１９８９年，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４）。
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在性遺伝子導入は、トランスジェニック双子葉類を生成するための選択方法であり（概説には、Ｈｏｏｙｋａｓ及びＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，１９９２年，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１５−３８を参照）、さらに、単子葉類を形質転換するために使用され得るが、他の形質転換法が、多くの場合、これらの植物のために使用される。現在、トランスジェニック単子葉類を生成するための選択方法は、胚細胞又は成長胚の粒子衝撃である（形質転換ＤＮＡにより被覆された微小金又はタングステン粒子）（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，１９９２年，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：２７５−２８１；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，１９９４年，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１５８−１６２；Ｖａｓｉｌら，１９９２年，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６６７−６７４）。単子葉類の形質転換のための代替の方法は、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈなど（１９９３年，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１：４１５−４２８）により報告されるようなプロトプラスト形質転換に基づく。本開示に従った使用のための更なる形質転換法は、米国特許第６，３９５，９６６号及び 第７，１５１，２０４号（両者は全体として参照により本明細書に援用される）に記載されているものを含む。
形質転換後、組み込まれた発現構築物を有する形質転換体が選択され、当該技術分野において周知である方法に従って、完全な植物に再生される。多くの場合、形質転換手法は、例えば、２種の別々のＴ−ＤＮＡ構築物による同時形質転換を用いることによる、再生中又は次の生成において、選択遺伝子の選択的排除、又は特異的なリコンビナーゼによる選択遺伝子の部位特異的な排除のために設計される。
本発明に従って調製された構築物を用いた、特定の植物遺伝子型の直接的な形質転換に加えて、トランスジェニック植物は、該構築物を有する植物と該構築物を欠損している第２の植物と交差させることによって作成されてもよい。例えば、改変体をコードする構築物は、所定の多様性のある植物をさらに直接的に形質転換する必要なく、交差によって特定の植物多様性に導入することができる。したがって、本発明は、本発明に従って形質転換されている細胞から直接再生された植物だけでなく、このような植物の子孫も含む。本明細書で使用するとき、子孫は、本発明に従って調製された親植物のいずれの世代の子を意味し得る。このような子孫は、本発明に従って調製されたＤＮＡ構築物、又は本発明に従って調製されたＤＮＡ構築物の一部を含んでもよい。交差は、出発株をドナー植物株で受粉することによって、植物へのトランス遺伝子の導入をもたらす。このようなステップの非制限的な例は、米国特許第７，１５１，２０４号にさらに言及されている。
植物は、戻し交配変換のプロセスを通じて生じさせてもよい。例えば、植物は、戻し交配変換された遺伝子型、株、生まれつき、又はハイブリッドと呼ばれる植物を含む。
遺伝子マーカーは、１つの遺伝子バックグラウンドから別の遺伝子バックグラウンドに、本発明の１以上のトランス遺伝子の遺伝子導入を支援するために用いられてもよい。マーカー支援の選択は、表現型の変異によって引き起こされるエラーを避けるために用いることができる点において、従来の繁殖と比較して利点を与える。さらに、遺伝子マーカーは、特待の交差の個々の子孫における、相対程度の精鋭な遺伝資源に関するデータを与えることがある。例えば、そうでなければ非農業的に望まれる遺伝子バックグラウンドを有する、求められる特性を有する植物が精鋭な親と交差される場合、遺伝子マーカーは、対象とする特性を所有するだけでなく、相対的に大きな比率の所望の遺伝資源も有する子孫を選択するために用いられてもよい。このようにして、１以上の特性を特定の遺伝子バックグラウンドに遺伝子移入するために必要とされる世代の数は最小化される。
本発明はまた、（ａ）改変体の生成に貢献する条件下で改変体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し；および（ｂ）該改変体を回収することを含む、本発明の改変体を生成する方法に関する。
方法及び使用
本発明はまた、抗菌活性を有するポリペプチドの使用する方法に関する。抗菌ポリペプチドは、典型的には、微生物による汚染に晒されるいずれかの遺伝子座で有用である。典型的には、遺伝子座、微生物が殺傷される必要があり、又はそれらの増殖が制御される必要がある、冷却水システムなどの水性システムにおいて存在する。しかしながら、本発明はまた、既知の抗菌組成物が有用である全ての用途、例えば木材、ラテックス、接着剤、グルー、紙、厚紙、布地、革、及び飼料に使用されてもよい。
他の使用は、食品、飲料物、化粧品、例えばローション、クリーム、ゲル、軟膏、石鹸、シャンプー、コンディショナー、制汗剤、デオドラント、マウス洗浄剤、コンタクトレンズ製品、又は食品成分の保存を含む。
一般に、本発明の抗菌ポリペプチドは、いずれかの表面上での微生物を清浄し、消毒し、又はその増殖を阻害するために有用であることが意図される。本発明の抗菌ポリペプチドと好都合に接触され得る表面の例は、使用される加工装置、例えば酪農、化学又は医薬加工プラントの表面である。本発明の抗菌ポリペプチドは、対象とする表面上での微生物の清浄、消毒又はその増殖の阻害に有効である量で使用されなければならない。
さらに、本発明の抗菌ポリペプチドは、食品加工プラントにおいて、及び食品が調製されるか又は加工されるいずれかの領域、例えば病院、老人ホーム、及びレストランの場所における表面及び調理用品の清浄のために使用されてもよい。
また、本発明は、本発明の抗菌ポリペプチド又は組成物の薬剤としての使用に関する。さらに、本発明の抗菌ポリペプチド又は組成物はまた、微生物、例えば真菌又は細菌、好ましくはグラム陰性細菌を制御するか又は攻撃するための薬剤の製造のために使用され得る。
本発明の組成物及び抗菌ポリペプチドは、抗菌性獣医若しくはヒト治療剤又は予防剤とし使用されてもよい。したがって、本発明の組成物及び抗菌ポリペプチドは、微生物感染、例えば細菌又は真菌感染、好ましくはグラム陽性細菌感染を処置するための獣医若しくはヒト治療剤又は予防剤の調製に使用されてもよい。特に、微生物感染は、肺疾患、例えば、限定されないが、結核、肺炎及び嚢胞性線維症；皮膚観戦及び眼又は口における感染；性的に伝染する疾病、例えば、限定されないが、淋病及びクラミジアに関連し得る。また、本発明は、創傷治癒組成物又は製品、例えば包帯、医療装置、例えばカテーテルに関する。
本発明の組成物は、有効量の本発明の抗菌ポリペプチドを含む。
用語「有効量」とは、本明細書中で使用するとき、対象とする微生物の増殖を阻害するのに十分である、本発明の抗菌ポリペプチドの量を意味することが意図される。
本発明の抗菌ポリペプチドの製剤は、微生物感染を被る又はその素因を有する宿主に投与される。投与は、好ましくは局在化される特定の微生物に依存して、局部的である、局在化される、又は全身性であってもよい。一般に、本発明の抗菌ポリペプチドの投薬量は、微生物集団を少なくとも約５０％、通常、少なくとも１対数減らすのに十分であり、２以上の対数で殺傷してもよい。本発明の化合物は、いずれの副作用も最少にするとともに、微生物集団を減らす投薬量で投与される。組成物は、インビボでの使用のためには、医者の指導下で得られ、使用されることが意図される。本発明の抗菌ポリペプチドは、グラム陰性細菌、例えばシュードモナス・アエルギノサ及びクラミジア・トラコマチス；及びグラム陽性細菌、例えばストレプトコッカス、例えばストレプトコッカス・プネウモニア、Ｓ．ウベリス、Ｓ．ヒオインテスチナリス、Ｓ．ピオゲネス、及びＳ．アガラクチア；及びスタフィロコッカス、例えばスタフィロコッカス・アウレウス、Ｓ．エピダーミジス、Ｓ．シムランス、Ｓ．キシロサス、及びＳ．カルノサスを殺傷するために特に有用である。
本発明の抗菌ポリペプチドの製剤は、微生物による肺感染、例えば肺炎；又は微生物による創傷感染、例えば細菌創傷感染を被るか又は素因を有する宿主に投与されてもよい。
また、本発明の抗菌ポリペプチドの製剤は、皮膚感染、例えばニキビ、アトピー性皮膚炎、又は脂漏性皮膚炎を被るか又は素因を有する宿主に投与され得て；好ましくは、皮膚感染は、例えばスタフィロコッカス・エピダーミジス、スタフィロコッカス・アウレウス、プロピオニバクテリウム・アクネ、ピチロスポラム・オバレ又はマラセジア・フルフルにより引起される細菌性皮膚感染である。
また、本発明の抗菌ポリペプチドは、特に、従来量の抗菌物質を導入することを所望しない場合、微生物を殺傷するためのインビトロ製剤において有用である。例えば、本発明の抗菌ポリペプチドは、動物及び／又はヒト食品調製物に添加されてもよく；又は、それらは、組織培養物における微生物の過剰増殖を妨げるために、細胞のインビトロ培養物のための添加剤として含まれてもよい。
本発明の抗菌ポリペプチドによる殺傷に対する特定の微生物の感受性は、実験セクションにおいて詳述されるように、インビトロ試験によって決定され得る。典型的には、微生物の培養物が、タンパク質の作用を可能にするのに十分な時間、通常約１時間〜１日間、種々の濃度で抗菌ポリペプチドと組み合わされる。次に、生存微生物が計数され、殺傷レベルが決定される。
対象とする微生物は、限定されないが、以下を含む：グラム陰性細菌、例えばシトロバクターｓｐ．（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）；エンテロバクターｓｐ．（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）；エスシュリシアｓｐ．（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．），例えばＥ．コリ；クレブシエラｓｐ．（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）；モノガネラｓｐ．（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐ．）；プロテウスｓｐ．（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．）；プロビデンシアｓｐ．（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．）；サルモネラｓｐ．（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、例えばＳ．チピ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．チビムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；セラチアｓｐ．（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）；シゲラｓｐ．（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）；シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．），例えばＰ．アエスギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；エルシニアｓｐ．（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）、例えばＹ．ペスチス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、Ｙ．シュードツベルクロシス（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｙ．エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）；フランシスセラｓｐ．（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ ｓｐ．）；パスツレラｓｐ．（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｓｐ．）；ビブリオｓｐ．（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、例えばＶ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｖ．パラヘモリチカス（Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）；カンピロバクターｓｐ．（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．），例えばＣ．ジュジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）；ヘモフィラスｓｐ．（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．）、例えばＨ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｈ．ダクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）；ボルデテラｓｐ．（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ．）、例えばＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．ブロンキセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、Ｂ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；ブルセラｓｐ．（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．）；ネイセリアｓｐ．（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、例えばＮ．ゴノルホエアエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、Ｎ．メニングチジス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）など。対象とする他の細菌は以下を含む：レジオホラｓｐ．（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、例えばＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；リステリアｓｐ．（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．）、例えばＬ．モノシストゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；マイコプラズマｓｐ．（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．）、例えばＭ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ニューモニアエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；マイコバクテリウムｓｐ．（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、例えばＭ．チュベルキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）；トレポネマｓｐ．（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）、例えばＴ．パリダム（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）；ボレリアｓｐ．（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐ．）、例えばＢ．ブルゴドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レプトスピラエｓｐ．（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｅ ｓｐ．）；リケツシアｓｐ．（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ．）、例えばＲ．リケッシ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、Ｒ．チピ（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）；クラミジアｓｐ．（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐ．），Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｃ．ニューモニアエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｃ．ピシタジ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）；ヘリコバクターｓｐ．（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、例えばＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）など。
対象とする非細菌性病原体は、真菌及び原生動物病原体を含み、例えばプラスモジアｓｐ．（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ ｓｐ．）、例えばＰ．ファルシパラム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トリパノソマｓｐ．（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｓｐ．）、例えばＴ．ブルセイ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）；シストゾーム（ｓｈｉｓｔｏｓｏｍｅｓ）；エンタエモエバｓｐ．（Ｅｎｔａｅｍｏｅｂａ ｓｐ．）、クリプトコッカスｓｐ．（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、カンジダｓｐ．（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）、例えばＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）などが挙げられる。
投与のための種々の方法が採用さえ得る。ポリペプチド製剤は、経口投与されるか、又は静脈内、皮下、腹膜内注射されるか、エアロゾルによる、眼内、膀胱内、局所などにより注入されてもよい。例えば、吸入による投与方法は、当該技術分野において周知である。治療製剤の投薬量は、投与されるべき特定の抗菌ポリペプチド、疾患の性質、投与の頻度、投与の様式、宿主からの薬剤のクリアランス等に依存して、幅広く変更される。初期投薬量は大きく、続いて少量の維持の投薬量が続いてもよい。投薬量は、まれに、週ごと又は２週ごとに投与されるか、又は少ない投薬量に分けられ、１日１回又は数回、週２回等で投与され、有効投薬レベルが維持されてもよい。多くの場合、経口投与が、静脈内投与される場合よりも高い用量を必要とする。アミド結合、並びにアミノ及びカルボキシル末端が、経口投与に基づいて高い安定性のために修飾され得る。例えば、カルボキシ末端がアミド化されてもよい。
製剤
本発明の化合物は、治療投与のために種々の製剤中に組み込むことができる。より具体的には、本発明の化合物は、適切な医薬的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることによって、医薬組成物に配合され得て、固体、半固体、液体又は気体形態、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、クリーム、発泡体、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、マイクロスフェア、ローション、及びエアロゾルで調製物に配合され得る。例えば、化合物の投与は、種々の手段、例えば経口、頬内、直腸、非経口、腹膜内、皮膚内、経皮内、鞘内などの投与で達成することができる。本発明の抗菌ポリペプチドは、投与後、全身性であってもよく、又は移植の部位で活性用量を保持するように作用するインプラント若しくは他の製剤の使用によって局在化されてもよい。
本発明の化合物は、単独で、互い組み合わせて投与されるか、又はそれらは他の既知の化合物（例えば、ペルホリン、抗炎症剤、抗生物質など）と組み合わせて使用され得る。医薬剤形においては、化合物は、それらの医薬として許容される塩の形で投与されてもよい。次の方法及び賦形剤は単なる例示であり、制限するものではない。
経口調製物に関しては、化合物は、錠剤、粉末、顆粒、又はカプセルを製造するために、単独で、又は適切な添加剤、例えば従来の添加剤、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチ又はジャガイモ澱粉；結合剤、例えば結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモ澱粉又はナトリウムカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム；及び所望により、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤及び風味剤と組み合わせて使用され得る。
化合物は、水性又は非水性溶媒、例えば植物油又は他の類似する油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル又はプロピレングリコールに；及び所望により、従来の添加剤、例えば溶解剤、等張剤、沈殿防止剤、乳化剤、安定剤及び保存剤とともに、該化合物を溶解し、懸濁し又は乳化することにより注射用調製物に配合され得る。
化合物は、吸入を通じて投与されるエアロゾル製剤に使用され得る。本発明の化合物は、加圧された許容できる噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等に配合され得る。
さらに、化合物は、種々の塩基、例えば乳化塩基又は水溶性塩基とともに混合することによって、坐剤に製造され得る。本発明の化合物は、坐剤を通じて直腸投与され得る。坐剤は、ビヒクル、例えば体温で溶解し、室温で固化されるコアアバター、カーボワックス及びポリエチレングリコールを含むことができる。
経口又は直腸投与のための単位剤形、例えばシロップ、エリキシル及び懸濁液が供給され得て、ここで各々の投薬量単位、例えば茶さじ１杯、テーブルスプーン１杯、錠剤又は坐剤は、本発明の１以上の化合物を含む、所定量の組成物を含む。同様に、注射又は静脈内投与のための単位剤形は、無菌水、通常の塩溶液又は別の医薬として許容される担体に溶液としての組成物に本発明の化合物を含んでもよい。
持続放出用製剤のためのインプラントは、当該技術分野において周知である。インプラントは、生分解性又は非生分解性ポリマーとともに、マイクロスフェア、スラブ等として配合される。例えば、乳酸及び／又はグリコール酸のポリマーは、宿主によって十分に許容される侵食できるポリマーを形成する。本発明の抗菌ポリペプチドを含有するインプラントは、感染部位に近接して配置され、その結果、活性剤の局所濃度は身体の残りと比較して増加される。
用語「単位剤形」とは、本明細書中で使用するとき、ヒト及び動物対象のための単位用量として適切な生理学的に別々の単位を意味し、各々の単位は、医薬として許容される希釈剤、担体又はビヒクルとともに、所望の効果を生じさせるのに十分な量で、計算された所定量の本発明の化合物を含む。本発明の単位剤形についての規定は、採用される特定の化合物、達成されるべき効果、及び宿主における化合物に関連する薬力学に依存する。
医薬として許容される賦形剤、例えばビヒクル、アジュバント、担体又は希釈剤は、公的に容易に入手できる。さらに、医薬として許容される補助物質、例えばｐＨ調節剤及び緩衝剤、張度調節剤、安定剤、湿潤剤などは、公的に容易に入手できる。
全身投与のための典型的な投薬量は、投与あたり０．１ｐｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。典型的な投薬量は、１日２〜６回、摂取される１つの錠剤であってもよく、又は１日１回、摂取され、比較的高い量の有効成分を含む１つの持続放出カプセル若しくは錠剤であり得る。持続放出効果は、異なったｐＨ値で溶解するカプセル材料によって、浸透圧によりゆっくり放出するカプセルによって、又は調節された放出のいずれかの他の既知手段によって得てもよい。
当業者は、投薬量レベルが特定の化合物、症状の重症度及び副作用に対する対象の感受性の関数として変化することができることを容易に理解するであろう。特定の化合物のいくつかは、他の化合物よりもより有能である。所定の化合物についての好ましい投薬量は、種々の手段によって当業者により容易に決定される。好ましい手段は、所定の化合物の生理学的能力を測定することである。
送達ビヒクルとしてのリポソームの使用は、関心のある１つ方法である。リポソームは、標的部位の細胞と融合し、内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームは、接触を維持するために種々の手段、例えば単離、結合剤などを用いて、融合のための十分な時間、細胞と接触して維持される。本発明の一局面では、リポソームは胚投与用に噴霧化されるように設計される。リポソームは、膜の融合に介在する精製されたタンパク質又はペプチド、例えばセンダイウィルス又はインフルエンザウィルスなどにより調製されてもよい。脂質は、既知のリポソーム形成脂質、例えばカチオン性又は両性イオン性脂質、例えばホスファチジルコリンのいずれかの有用な組み合せであってもよい。残りの脂質は、通常、中性又は酸性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどである。
リボソームの調製に関しては、Ｋａｔｏなど（１９９１年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３３６１）により報告されている方法を用いてもよい。簡単には、ペプチドを含有する脂質及び内腔組成物は、適切な水性媒体、好都合には、全固形物が約１〜１０重量％の範囲で存在する塩溶液媒体において組み合わせられる。約５〜６０秒の短時間の強い攪拌後、チューブを約２５〜４０℃で暖水浴に配置し、このサイクルを、約５〜１０回反復する。次に、組成物が好都合な時間、一般には約１〜１０秒間、超音波処理され、さらに、ボルテックスによって撹拌されてもよい。次に、この体積は、水性媒体を添加し、一般には、体積を約１〜２倍に増加することにより拡張され、続いて振とうされ、冷却される。この方法は、高分子量分子の内腔中への組み込みを可能にする。
他の活性剤を有する製剤
本方法における使用に関しては、本発明の抗菌ポリペプチドは、他の医薬として活性な薬剤、特に他の抗菌剤を用いて配合されてもよい。対象とする他の薬剤は、当該技術分野において知られている広範囲の種類の抗生物質を含む。抗生物質の種類は、ペニシリン、例えばペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリンなど；ベータ−ラクタマーゼ阻害剤と組み合わせたペニシリン、セファロスポリン、例えばセファクロール、セファゾリン、セフロキシム、モキサラクタムなど；カルバペネム；モノベクタム；アミノグリコシド；テトラサイクリン；マクロリド；リンコマイシン；ポリミキシン；スルホンアミド；キノロン；クロラムフェニコール；メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン等を包含する。
抗真菌剤はまた有用であり、例えばポリエン、例えばアンホテリシンＢ、ナイスタチン；５−フルコシン；及びアゾール、例えばミコナゾール、ケイコナゾール、イトラコナゾール及びフルコナゾールが挙げられる。抗結核薬剤には、イソニアジド、エタムブトール、ストレプトマイシン及びリファンピンが含まれる。サイトカイン、例えばインターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン１２等はまた、本発明の抗菌ポリペプチドの製剤に含むことができる。
本発明はさらに、次の例により記載されるが、それらは本発明を限定するものとして意図されない。
ＮＺ１７０７４は配列番号７０の抗菌ペプチドである。
実施例１
改善された抗菌活性を有する配列番号２の改変体の単離
配列番号２をコードするｃＤＮＡは、プレクタシンのプロ領域（Ｍｙｇｉｎｄら；Ｎａｔｕｒｅ，４３７，２００５）及びサッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の接合因子アルファ−リーダーに融合され、誘導性Ｓ．セレビジア発現ベクターに導入し、Ｓ．セレビジアに形質転換された。このシステムは、グルコースによって抑制され、ガラクトースによって活性化されるＧＡＬ１プロモータを利用する。
いくつかの戦略は、配列番号１のポリヌクレオチドの改変体生成のために用いられた。得られたライブラリーがクローニングされ、Ｓ．セレビジアにおいて発現された。形質転換されたクローンは、１．５％ガラクトース及び０．５％グルコース、並びにウマ血液２．５〜５％）又は血清（５％）のいずれかが補足された増殖培地を含み、標的生物である大腸菌（ＡＴＣＣ１０５３６）で重ねられたプレートアッセイについてスクリーニングされた（Ｒａｖｅｎｔｏｓら，Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．２００５；８：２１９−３３を参照されたい）。
プレートアッセイ条件は、配列番号２の抗菌ペプチド（親の抗菌ペプチド）の活性を完全に阻害した。２．５％血液、５％血液又は５％血清の存在下で改善された抗菌活性（空きゾーンを生じさせる）を示す改変体が選定され、配列決定され、表１に示される。
プレートアッセイスクリーニング手法
アレニシン改変体を発現するおよそ３００個のコロニーは、ウマ血液（２．５％若しくは５％）又は５％ウマ血清のいずれかを含むスクリーニングプレート上に播種された（以下のプレートの粗製を参照されたい）。プレートを３時間３０℃にてインキュベートし、それらを乾燥させた。次に、４２℃に温められた２５ｍｌのオーバーレイをプレートに添加した。培地を固化させた後、プレートを３日間３０℃にてインキュベートした。
４日目に、２．５％若しくは５％ウマ血液又は５％ウマ血清のいずれかと標的細菌である大腸菌（ＡＴＣＣ１０５３６）を含む、予め４２℃に温められた培地を用いてプレートを覆った（詳細には培地条件について以下を参照されたい）。オーバーレイを固化後、プレートを１６時間３７℃にてインキュベートした。翌日、プレートは、１．５ｍＭのＭＴＴの１０ｍｌをプレートに添加して着色され、室温にて３０分間インキュベートされた。空きゾーンに生じるクローンクローンを選定し、配列決定した。
プレート及び培地条件
異なる３種のスクリーニングプレートａ）、ｂ）及びｃ）をスクリーニングに用いた：
ａ）プレート＋２．５％ウマ血液
底層は５０ｍｌの１．５％アガロース＋１／４のＳＣ培地＋２．５％血液＋１．５％ガラクトース＋０．５％グルコースを含む。第１のオーバーレイは２５ｍｌの１％アガロース＋１／４のＳＣ培地＋２．５％血液＋１．５％のガラクトース＋０．５％グルコースを含む。最上部オーバーレイは２５ｍｌの０．２％ＭＨＢ（＃２１２３２２；ＢＤ）＋１％アガロース（Ｓｉｇｍａ Ａ−４７１８）＋２．５％ウマ血液、及び大腸菌（ＡＴＣＣ１０５３６）の１．２５×１０6コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む。
ｂ）プレート＋５％ウマ血液
底層は５０ｍｌの１．５％アガロース＋１／４のＳＣ培地＋５％血液＋１．５％ガラクトース＋０．５％グルコースを含む。第１のオーバーレイは２５ｍｌの１％アガロース＋１／４のＳＣ培地＋５％血液＋１．５％のガラクトース＋０．５％グルコースを含む。最上部オーバーレイは２５ｍｌの０．２％ＭＨＢ（＃２１２３２２；ＢＤ）＋１％アガロース（Ｓｉｇｍａ Ａ−４７１８）＋５％ウマ血液、及び大腸菌（ＡＴＣＣ１０５３６）の１．２５×１０6コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む。
ｃ）プレート＋５％ウマ血清
底層は５０ｍｌの１．５％アガロース＋１／２のＳＣ培地＋５％血清＋１．５％ガラクトース＋０．５％グルコースを含む。第１のオーバーレイは２５ｍｌの１％アガロース＋１／２のＳＣ培地＋５％血清＋１．５％のガラクトース＋０．５％グルコースを含む。最上部オーバーレイは２５ｍｌの０．２％ＭＨＢ（＃２１２３２２；ＢＤ）＋１％アガロース（Ｓｉｇｍａ Ａ−４７１８）＋５％ウマ血液、及び大腸菌（ＡＴＣＣ１０５３６）の１．２５×１０6コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む。
ＳＣ培地の粗製（４５０ｍｌ）
酵母窒素塩基ｗ／ｏアミノ酸：３．７５ｇ
コハク酸：５．６５ｇ
水酸化ナトリウム：３．４ｇ
カザミノ酸ビタミンアッセイ：２．８ｇ
Ｌ−トリプトファン：０．０５ｇ
水：４５０ｍｌ
ｐＨを６に調整し、培地をオートクレーブし、血液プレートを調製する場合には１／４に希釈し、血清プレートを調製する場合には１／２に希釈した。
ＭＴＴ：（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウリムブロミド、Ｓｉｇｍａ １３，５０３−８）
タンパク質結合の決定
タンパク質結合アッセイは以下の通りに行われた。精製されたペプチドは９０％血清と混合され、３０ｋＤａフィルターを介して遠心分離された。限外濾過された試料と濾過されていない試料は、ＨＰＬＣ測定によって定量され、次に、タンパク質結合が計算された。
配列番号２の抗菌ペプチド（親の抗菌ペプチド）はこのアッセイにおいて９９．５％のタンパク質結合を示した。表１に示されるように、全ての例示された改変体は、配列番号２の抗菌ペプチドよりも低いタンパク質結合を示す。
表１．改善された抗菌活性と減少されたタンパク質結合を示す改変体。シンボル「−」は「分析していない」ことを意味する。
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実施例２
好中球減少マウスの腹膜炎／敗血症モデルにおける大腸菌ＡＩＤ＃１７２に対するＮＺ１７０７４の効果及びＥＤ50の評価
導入
この研究の目的は、０．１６〜１２ｍｇ／ｋｇの範囲にあるＮＺ１７０７４の単回投薬の静脈（ｉ．ｖ．）投与後の投薬量−応答の関係を調べることである。その効果は、好中球減少腹膜炎モデルにおける大腸菌ＡＩＤ＃１７２について試験された。４０ｍｇ／ｋｇのメロペネムによる処置を陽性対照群として含めた。血液及び腹水中のコロニーカウントは、処置後の５時間で決定された。
マウス腹膜炎／敗血症モデルは、Ｎ．Ｆｒｉｍｏｄｔ−Ｍｏｌｌｅｒ及びＪ．Ｄ．Ｋｕｎｄｓｅｎ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（１９９９年），Ｏ．Ｚａｋ ＆ Ｍ．Ａ．Ｓａｎｄｅ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）によって報告されているように抗菌活性の研究についてよく認められているモデルである。
材料及び方法
・３０匹の非近交系のＮＭＲＩ雌性マウス、２５〜３０グラム（Ｈａｒｌａｎ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ）
・Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｕｔｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋの大腸菌（ＡＴＣＣ１０５３６）。２００３年以来、ヒト損傷からの臨床単離物。多剤耐性（アンピシリン、セフタジジム、アズトレオナム、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン）。
・酢酸リンガー中のＮＺ１７０７４、ｐＨ６：１．２ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｌ．溶液を使用するまで４℃で保存した。使用された製剤の投薬量の分析は、本研究の生存時期の完了後に行われた。
意図された濃度 測定された濃度
１．２ ｍｇ／ｍｌ １．１１ｍｇ／ｍｌ
０．６ｍｇ／ｍｌ ０．５１ｍｇ／ｍｌ
０．３ｍｇ／ｍｌ ０．２４ｍｇ／ｍｌ
０．１５ｍｇ／ｍｌ ０．１４ｍｇ／ｍｌ
０．０７５ｍｇ／ｍｌ ０．０４３ｍｇ／ｍｌ
０．０３ｍｇ／ｍｌ ０．０１０ｍｇ／ｍｌ
０．０１６ｍｇ／ｍｌ ０．００２ｍｇ／ｍｌ
・ビヒクル（酢酸リンガー、ｐＨ６）。この容器を使用するまで４℃にて保存した。
・メロペネム（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，５００ｍｇの注入基質、メロペネム）、ロット番号０９４６６Ｃ、有効期限：２０１３年８月。
・水、滅菌。
・０．９％生理食塩水、滅菌。
・シクロホスファミド、Ａｐｏｄａ（ｎ登録商標）（Ａ−Ｐｈａｒｍａ、１ｇ）バッチ、番号９２８４９１。有効期限：２０１２年５月。
・５％ウマ血液寒天プレート。
・ラクトースブロモチモールブルー寒天培地。
実験動物施設及びマウスのハウジング
温度及び湿度は、動物施設において毎日記録された。温度は２１℃±２℃であり、冷暖房によって調節することができる。湿度は５５±１０％であった。１時間あたりの空気交換は約１０〜２０回であり、明／暗期間は午前６時〜午後６時／午後６時〜午前６時の１２時間間隔であった。
マウスは、家庭内品質の水及び食餌に自由に接近した（２０１６，Ｈａｒｌａｎ）。マウスは、３マウス／ケージでタイプ３マクロローンケージに入れられた。寝床はＴａｐｖｅｉのＡｓｐｅｎ Ｗｏｏｄであった。さらに、動物は、入れ子材としてＳｉｚｚｌｅ−ｎｅｓｔのペーパーストランドを与えられた。ケージ内で個々を識別するためにマウスの尾をマークした。投薬前に毎日、マウスを計量した。
ＮＺ１７０７４溶液の調製
１．２ｍｇ／ｍｌの溶液を以下のようにＰＢＳビヒクルにおいてさらに希釈した：
０．６ｍｇ／ｍｌ〜７．５ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの１．２ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ｍｌのビヒクル
０．３ｍｇ／ｍｌ〜５．０ ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．６ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ ｍｌのビヒクル
０．１５ｍｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．３ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ｍｌのビヒクル
０．０７５ｍｇ／ｍｌ〜１．２５ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．１５ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ｍｌのビヒクル
０．０３ｍｇ／ｍｌ〜０．６３ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．０７５ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋２．２５ｍｌのビヒクル
０．０１６ｍｇ／ｍｌ〜０．１６ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．０３ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ｍｌのビヒクル
メロペネム溶液の調製
４０ｍｇ／ｋｇのメロペネムによる処置を陽性対照群として含めた。全５００ｍｇのメロペネム（１アンプル）を１０ｍｌの水〜５０ｍｇ／ｍｌに溶解した。このストック溶液を４ｍｇ／ｍｌ（０．４ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌ＋４．６ｍｌの生理食塩水）になるまでさらに希釈した。
シクロホスファミドの調製
全１ｇのシクロホスファミド（１アンプルのＡｐｏｄａｎ １ｇ）は、使用の各日に５０ｍｌの水に溶解し、約２０ｍｇ／ｍｌとした。このストック溶液は、−４日目の使用については１１ｍｇ／ｍｌ（１６．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ＋１３．５ｍｌの生理食塩水）、−１日目の使用については５ｍｇ／ｋｇ（８．２５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ＋２１．７５ｍｌの生理食塩水）にさらに希釈された。
マウスへのシクロホスファミドによる処置
マウスは、接種前に、４日間（２００ｍｇ／ｋｇ）及び１日間（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に０．５ｍｌのシクロホスファミド溶液を注射することによって好中球減少にさせた。
マウスの接種
５％のウマ血液寒天プレートからの新鮮な一晩の大腸菌ＡＩＤ＃１７２を滅菌生理食塩水に懸濁し、約２×１０6ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。処置開始の１時間前（−１時間）に、マウスは、腹部の側面下部四分円に０．５ｍｌの大腸菌懸濁液を腹腔内接種された。処置の約３０分〜１時間後、マウスは、疼痛緩和として４５μｌのニューロフェン（３０ｍｇ／ｋｇに対応する２０ｍｇのイブプロフェン／ｍｌ）を経口的に処理された。
マウスの処置
マウスは、０時間で、ＮＺ１７０７４、メロペネム又はビヒクルの単回投薬を用いて、１０ｍｌ／ｋｇにて約３０秒かけて外側尾静脈にｉ．ｖ．処理された（表１参照）。投薬量は平均重量３０ｇを基準にした。体重が２８〜３２ｇのマウスは、０．３０ｍｌ溶液を受けた。体重が２７〜２８ｇのマウスは、０．２５ｍｌ溶液を受け、体重が３２．１〜３６ｇのマウスは０．３５ｍｌ溶液を受けた。
Figure 0006120769
 Ｔは処置関する時間を示す。サンプリングカラムにおける数はマウスの識別番号である。
マウスの臨床スコアリング
マウスは研究中に観察され、それらの挙動及び診療兆候に基づいて０〜５でスコア付けされた。
スコア０：健常
スコア１：感染及び炎症の深刻でない臨床兆候、例えば、苦痛又は活動変化の深刻でない兆候の観察
スコア２：感染様、社会的離脱症状、好奇心の欠如、体位の変化、立毛、または運動パターンの変化
スコア３：感染様不自然な運動、好奇心の欠如、体位の変化、立毛、疼痛、又は運動パターンの変化の重篤な兆候
スコア４：重篤な疼痛、マウスは動物の苦しみを最少にするために即座に屠殺された
スコア５：マウスは死に至った。
サンプリング
コロニーカウントは、０時及び５時にて血液及び腹水から決定された。マウスをＣＯ2＋Ｏ2で麻酔し１．５ｍｌのＥＤＴＡ被覆されたエッペンドルフチューブに腋窩の血管切開からの血液を回収した。血液サンプリング後にマウスを即剤に屠殺し、全２ｍｌの滅菌生理食塩水をｉ．ｐ．注射し、腹部を穏やかにマッサージし、その後、回復し、ピペットで液体をサンプリングした。次に、各々の試料は、生理食塩水に１０倍希釈され、２０μｌのスポットを青色寒天プレート上に適用した。全ての寒天プレートは、周囲空気中で１８〜２２時間、３５℃にてインキュベートされた。
結果
コロニーカウントは、処置開始時、及び処置５時間後に行われた。ＣＦＵカウント及びマウスの臨床スコアを表３に示す。ＣＦＵ数は、計算前にｌｏｇ10変換された。
接種材料中のＣＦＵ／ｍｌが６．２９ｌｏｇ10に決定された。処置開始時、腹水中の平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌは５．７６であり、血液中では５．１３であった。ＣＦＵレベルは、処置５時間後ではビヒクル群において同レベルを維持した（腹膜及び血液中においてそれぞれ５．７２及び４．６５ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｍｌ）。ＮＺ１７０７４の０．１６〜３．０ｍｇ／ｋｇによる処置後、血液及び腹水において僅かに低いＣＦＵレベルが観察された。６及び１２ｍｇ／ｋｇのＮＺ１７０７４による処置により、腹水及び血液の両方において、ビヒクル処理後よりも有意に低いＣＦＲレベルが得られた（ｐ＜０．００１）（表３）。また、４０ｍｇ／ｋｇのメロペネム処理は、血液（ｐ＜０．０５）及び腹水（ｐ＜０．０１）の両方において、ビヒクル処理されたマウスと比較して、有意な減少をもたらした。
投薬量−応答曲線（データ示さず）は、Ｓ字状投薬量−応答（可変勾配）を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて計算された。これらのＥＤ５０値が決定され、腹水において３．０９±２．０７ｍｇ／ｋｇであり、血液において３．１７±０．５３ｍｇ／ｋｇであった。
ＮＺ１７０７４の最大効果であるＥmaxは、無応答と最大応答との間のｌｏｇＣＦＵ差異として定義された。無応答は、ビヒクル処理されたマウスについて決定されたものと同レベルのコロニーカウントとして特徴付けられた。Ｅmaxは、Ｓ字状投薬量−応答を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて「最上部プラトー」と「最下部プラトー」間の差異として計算され、腹水については４．７２ｌｏｇ10ＣＦＵであり、血液については３．１５ｌｏｇ10ＣＦＵであった。
さらに、１、２、及び３ｌｏｇ殺生は、処置開始と比較して、細菌充填において１、２、及び３ｌｏｇ減少を得るために必要とされる投薬量として定義され、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて推測された。ＮＺ１７０７４の１、２、及び３ｌｏｇ殺生は、腹水においてそれぞれ１．１１ｍｇ／ｋｇ、２．９５ｍｇ／ｋｇ及び４．７３ｍｇ／ｋｇであり、血液において０．２５ｍｇ／ｋｇ、２．７５ｍｇ／ｋｇ及び３．７８ｍｇ／ｋｇであった。無し又はほんの穏やかな臨床スコアが処置群の全てにおいて観察された（表３）。
検討及び結果
この研究の目的は、０．１６〜１２ｍｇ／ｋｇの範囲のＮＺ１７０７４の単回投薬の静脈内（ｉ．ｖ．）投与後、投薬量−応答の関係を調べることであった。効果は、好中球減少腹膜炎／敗血症モデルにおいて大腸菌ＡＩＤ＃１７２に対して試験された。
ＮＺ１７０７４についてのＥＤ５０値が決定され、腹水において３．０９±２．０７ｍｇ／ｋｇであり、血液において３．１７±０．５３ｍｇ／ｋｇであった。１ｌｏｇ殺生は、腹水において１．１１ｍｇ／ｋｇであり、血液において０．２５ｍｇ／ｋｇであると推測された。２ｌｏｇ殺生は、腹水において２．９５ｍｇ／ｋｇであり、血液において２．７６ｍｇ／ｋｇであると推測された。３ｌｏｇ殺生は、腹水において４．７３ｍｇ／ｋｇであり、血液において３．７８ｍｇ／ｋｇであると推測された。
Figure 0006120769
Figure 0006120769
 星印はビヒクル群とは有意に異なることを示す（Ａｎｏｖａ；多重比較）。
*はｐ＜０．０５に対応する；<**>はｐ＜０．０１に対応する；<***>はｐ＜０．００１に対応する。検出限界は１．４ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｍｌである。検出できない細菌の試料は１．０ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｍｌとして表される。
実施例３
腹膜炎／敗血症モデル：好中球減少ＮＭＲＩマウスにおける大腸菌ＡＩＤ＃１７２に対する７．５ｍｇ／ｋｇのＮＺ１７０７４の経時的効果
導入
この研究の目的は、７．５ｍｇ／ｋｇの単回投薬の静脈内（ｉ．ｖ．）投与後のＮＺ１７０７４のインビボ有効性を調べることである。効果は、マウス腹膜炎モデルにおいて通常適用されるムチンの使用を避けるために好中球減少性ＮＭＲＩマウスの腹膜炎モデルにおける大腸菌ＡＩＤ＃１７２に対して試験された。マウスは、シクロホスファミド注射により好中球減少にさせた。４０ｍｇ／ｋｇメロペネムによる処置を陽性対照群として含め、ビヒクルによる処置を陰性対照群として含めた。腹水及び血液におけるコロニーカウントは、処置後の２時間及び５時間で決定された。
材料及び方法
・３０匹の非近交系のＮＭＲＩ雌性ＮＭＲＩマウス、２８〜３２グラムＨａｒｌａｎ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ）
・Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｕｔｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋの大腸菌ＡＩＤ＃１７２。２００３年以来、ヒト損傷からの臨床単離物。多剤耐性（アンピシリン、セフタジジム、アズトレオナム、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン）。
・酢酸リンガー中のＮＺ１７０７４、ｐＨ６、１．２ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ。研究後に行われる投薬製剤の分析は、訳０．７８ｍｇ／ｍｌの濃度を示した。
・ビヒクル（酢酸リンガー、ｐＨ６）３ｍｌ。
・メロネン（登録商標）（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ、５００ｍｇメロペネン注入気質）。ロット番号０９４６６Ｃ 有効期限：２０１２年８月。
・アポダン（登録商標）（Ａ−Ｐｈａｒｍｅ．１ｇシクロホスファミド）バッチ番号９２８４９１（有効期限２０１２年５月）
・水、滅菌
・０．９％生理食塩水、滅菌
・５％ウシ血液寒天プレート
・ラクトースブロムチモールブルー寒天プレート
実験動物施設及びマウスのハウジング
温度及び湿度は、動物施設において毎日記録された。温度は２１℃±２℃であり、冷暖房によって調節することができる。湿度は５５±１０％であった。１時間あたりの空気交換は約１０〜２０回であり、明／暗期間は午前６時〜午後６時／午後６時〜午前６時の１２時間間隔であった。マウスは、家庭内品質の水及び食餌に自由に接近した（２０１６，Ｈａｒｌａｎ）。マウスは、３マウス／ケージでタイプ３マクロローンケージに入れられた。寝床はＴａｐｖｅｉのＡｓｐｅｎ Ｗｏｏｄであった。さらに、動物は、入れ子材としてＳｉｚｚｌｅ−ｎｅｓｔのペーパーストランドを与えられた。ケージ内で個々を識別するためにマウスの尾をマークした。
ＮＺ１７０７４溶液
０．７５ｍｇ／ｍｌの各試験化合物の溶液は、注射前の１時間まで＋４℃にて保存され、その後、室温で保存された。
メロペネム溶液の調製
全５００ｍｇのメロペネム（１アンプル）を１０ｍｌの水〜５０ｍｇ／ｍｌに溶解した。このストック溶液を４ｍｇ／ｍｌ（０．４ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌ＋４．６ｍｌの生理食塩水）になるまでさらに希釈した。
シクロホスファミドの調製
全１ｇのシクロホスファミド（１アンプルのＡｐｏｄａｎ）は、使用の各日に５０ｍｌの水に溶解し、約２０ｍｇ／ｍｌとした。このストック溶液は、−４日目の使用については１１ｍｇ／ｍｌ（１６．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ＋１３．５ｍｌの生理食塩水）、−１日目の使用については５．５ｍｇ／ｋｇ（８．２５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ＋２１．７５ｍｌの生理食塩水）にさらに希釈された。
マウスへのシクロホスファミドによる処置
マウスは、接種前に、４日間（２００ｍｇ／ｋｇ）及び１日間（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に０．５ｍｌのシクロホスファミド溶液を注射することによって好中球減少にさせた。
マウスの接種
５％のウマ血液寒天プレートからの新鮮な一晩の大腸菌ＡＩＤ＃１７２を滅菌生理食塩水に懸濁し、約２×１０6ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。
処置開始の１時間前（−１時間）に、マウスは、腹部の側面下部四分円に０．５ｍｌの大腸菌懸濁液を腹腔内接種された。
処置の約２．５時間後、感染の臨床兆候が有意である場合、マウスは、疼痛緩和として４５μｌのニューロフェン（３０ｍｇ／ｋｇに対応する２０ｍｇのイブプロフェン／ｍｌ）を経口的に処理された。
マウスのスコアリング
マウスは、各サンプリングの時間にて感染の兆候について臨床的にスコア付けされた。
スコア０：健常
スコア１：感染及び炎症の深刻でない臨床兆候、例えば、苦痛又は活動変化の深刻でない兆候の観察
スコア２：感染様、社会的離脱症状、好奇心の欠如、体位の変化、立毛、または運動パターンの変化
スコア３：感染様不自然な運動、好奇心の欠如、体位の変化、立毛、疼痛、又は運動パターンの変化の重篤な兆候
スコア４：重篤な疼痛、マウスは動物の苦しみを最少にするために即座に屠殺された
スコア５：マウスは死に至った。
マウスの処置
マウスは、０時間で、ＮＺ１７０７４、メロペネム又はビヒクルの単回投薬を用いて、約３０秒かけて外側尾静脈にｉ．ｖ．処理された（表１参照）。投薬量は平均重量３０ｇを基準にした。体重が２８〜３２ｇのマウスは、０．３０ｍｌ溶液を受けた。体重が２７〜２８ｇのマウスは、０．２５ｍｌ溶液を受け、体重が３２．１〜３６ｇのマウスは０．３５ｍｌ溶液を受けた。マウス１７は、体重が２９．５ｇであったが、誤って０．３５ｍｌを受けた。この投薬量は、このマウスにおけるＣＦＵレベルがグループの他の２匹のマウスと非常に似ていたので、結果に影響を及ぼしたようでない。
Figure 0006120769
 Ｔは処置関する時間を示す。サンプリングカラムにおける数はマウスの識別番号である。
サンプリング
コロニーカウントは、表１に従って処理した後、０時、２時及び５時にて血液及び腹水から決定された。
マウスをＣＯ2＋Ｏ2で麻酔し、腋窩の血管切開からの血液を回収した。頸椎脱臼によってマウスを屠殺し、全２ｍｌの滅菌生理食塩水をｉ．ｐ．注射し、腹部を穏やかにマッサージし、その後、回復し、ピペットで液体をサンプリングした。各々の試料は、生理食塩水に１０倍希釈され、２０μｌのスポットを青色寒天プレート上に適用した。全ての寒天プレートは、周囲空気中で１８〜２２時間、３５℃にてインキュベートされた。
結果
コロニーカウント及びマウスの臨床スコアを表２に示す。ＣＦＵ数は、計算を行う前にｌｏｇ10変換され、通常の分布を得る。
接種材料中のＣＦＵ／ｍｌが６．３０ｌｏｇ10に決定された。処置開始時、腹水中の平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌは３．５７であり、血液中では３．５４であった。ＣＦＵレベルは、ビヒクル処置された動物では２時間後、腹水及び血液においてそれぞれ５．４３及び４．５８まで増加し、ビヒクル処置されたマウスでは５時間後、腹水及び血液においてそれぞれ５．７２及び４．７４まで増加し、期待された通りであった。
ＮＺ１７０７４による処置の２時間後、ビヒクル処理と比較して、血液及び腹水の両方において有意に低いＣＦＵレベルが観察された（ｐ＜０．００１）。
ＣＦＲレベルの更なる減少は、血液及び腹水の両方において、ＮＺ１７０７４による処置の５時間後に観察された（ビヒクル対照と比較してｐ＜０．００１）。ＣＦＵラベルは、ビヒクル処置後、３ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｍｌを超えて低かった。
また、メロペネム処置は、処置の２時間及び５時間の両方で腹水において、しかし、処置の５時間にのみで血液において、ビヒクル処置と比較して有意（ｐ＜０．０１）に減少したＣＦＵレベルをもたらした。処置後の２時間で血液における有意性の欠如は、メロペネムの弱い効果というよりはむしろ、ビヒクル群における大きな変動性を反映している可能性がある。
ビヒクル処置と比較したＮＺ１７０７４又はメロペネム処置後のＣＦＵレベルの差異は以下の通りであった：
ＮＺ１７０７４、７．５ ｍｇ／ｋｇ
２時間：腹膜−１．６３ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍｌ 血液−２．５０ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍｌ
５時間：腹膜−３．７６ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍｌ 血液−３．７４ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍｌ
メロペネム、４０ ｍｇ／ｋｇ
２時間：腹膜−１．５１ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍｌ 血液−０．８２ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍｌ
５時間：腹膜−１．５１ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍｌ 血液−１．６４ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍｌ
Ａｌｌ ｍｉｃｅ ｈａｄ ｏｎｌｙ ｍｉｌｄ ｏｒ ｎｏ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ （Ｔａｂｌｅ ２）．
全てのマウスは、感染にほとんど影響がないか又は感染がなかった（表２）。
検討及び結果
この研究の目的は、ＮＭＲＩマウスの好中球減少腹膜炎モデルにおいて、７．５ｍｇ／ｋｇの単回投薬の静脈内（ｉ．ｖ．）投与後のＮＺ１７０７４の有効性を調べることであった。ビヒクル処理と比較した３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌを超える有意な（ｐ＜０．００１）減少は、処置後の５時間で血液及び腹水においてＮＺ１７０７４について観察された。また、ＮＺ１７０７４による処置後の２時間で、血液及び腹水における有意な減少（ｐ＜０．００１）が観察された。処置後の５時間での血液及び腹水の両方において、しかし、処置後の２時間での腹水において、ビヒクル群と比較して有意な減少を示した（ｐ＜０．０１）。
Figure 0006120769
 ＰＦ：腹水。使用された接種材料：１．９７×１０6ＣＦＵ／ｍｌ。
マウスは０．３０ｍｌの試験化合物の代わりに０．３５ｍｌを受けた。
ビヒクル群と比較して* ｐ＜０．０５、** ｐ＜０．０１、*** ｐ＜０．００１。
実施例４
好中球減少大腿部感染モデル：大腸菌ＡＩＤ＃１７２に対するＮＺ１７０７４の有効性及びＥＤ５０の評価
導入
この研究の目的は、０．１６〜１２ｍｇ／ｋｇの範囲にあるＮＺ１７０７４の単回投薬の静脈（ｉ．ｖ．）投与後の投薬量−応答の関係を調べることである。その効果は、好中球減少大腿部モデルにおける大腸菌ＡＩＤ＃１７２について試験された。４０ｍｇ／ｋｇのメロペネムによる処置を陽性対照群として含めた。大腿部中のコロニーカウントは、処置後の５時間で決定された。
マウス大腿部感染モデルは、Ｓ．Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ及びＨ．Ｅｒｌｅｎｓｄｏｔｔｉｒ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（１９９９年），Ｏ．Ｚａｋ ＆ Ｍ．Ａ．Ｓａｎｄｅ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ、及びいくつかの刊行物。Ｄ．Ａｎｄｅｓ ＆ Ｃ．Ｃｒａｉｇによる概説：Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ：ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ，１９（４）：２６１−２６８）によって報告されているように抗菌効果及び組織浸透の研究についてよく認められているモデルである。
材料及び方法
・４０匹の非近交系のＮＭＲＩ雌性マウス、２５〜３０グラム（Ｈａｒｌａｎ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ）
・Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｕｔｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋの大腸菌ＡＩＤ＃１７２。２００３年以来、ヒト損傷からの臨床単離物。多剤耐性（アンピシリン、セフタジジム、アズトレオナム、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン）。
・酢酸リンガー中のＮＺ１７０７４、ｐＨ６：１．２ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｌ．溶液を使用するまで４℃で保存した。使用された製剤の投薬量の分析は、本研究の生存時期の完了後に行われ、以下の結果を得た：
意図された濃度 測定された濃度
１．２ｍｇ／ｍｌ １．１１ｍｇ／ｍｌ
０．６ｍｇ／ｍｌ ０．５１ｍｇ／ｍｌ
０．３ｍｇ／ｍｌ ０．２４ｍｇ／ｍｌ
０．１５ｍｇ／ｍｌ ０．１４ｍｇ／ｍｌ
０．０７５ｍｇ／ｍｌ ０．０４３ｍｇ／ｍｌ
０．０３ｍｇ／ｍｌ ０．０１０ｍｇ／ｍｌ
０．０１６ｍｇ／ｍｌ ０．００２ｍｇ／ｍｌ
・ビヒクル（酢酸リンガー、ｐＨ６）。この容器を使用するまで４℃にて保存した。
・メロペネム（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，５００ｍｇの注入基質、メロペネム）、ロット番号０９４６６Ｃ、有効期限：２０１３年８月。
・水、滅菌。
・０．９％生理食塩水、滅菌。
・センドキサン（登録商標）（シクロホスファミド、Ｂａｘｔｅｒ、１ｇ）バッチ、番号０Ａ６７１Ｃ。有効期限：２０１３年１月。
・５％ウマ血液寒天プレート。
・ラクトースブロモチモールブルー寒天培地。
実験動物施設及びマウスのハウジング
温度及び湿度は、動物施設において毎日記録された。温度は２１℃±２℃であり、冷暖房によって調節することができる。湿度は５５±１０％であった。１時間あたりの空気交換は約１０〜２０回であり、明／暗期間は午前６時〜午後６時／午後６時〜午前６時の１２時間間隔であった。
マウスは、家庭内品質の水及び食餌に自由に接近した（２０１６，Ｈａｒｌａｎ）。マウスは、４マウス／ケージでタイプ３マクロローンケージに入れられた。寝床はＴａｐｖｅｉのＡｓｐｅｎ Ｗｏｏｄであった。さらに、動物は、入れ子材としてＳｉｚｚｌｅ−ｎｅｓｔのペーパーストランドを与えられた。ケージ内で個々を識別するためにマウスの尾をマークした。投薬前に毎日、マウスを計量した。
ＮＺ１７０７４溶液の調製
１．２ｍｇ／ｍｌの溶液を以下のようにＰＢＳビヒクルにおいてさらに希釈した：
０．６ｍｇ／ｍｌ〜７．５ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの１．２ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ｍｌのビヒクル
０．３ｍｇ／ｍｌ〜５．０ ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．６ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ ｍｌのビヒクル
０．１５ｍｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．３ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ｍｌのビヒクル
０．０７５ｍｇ／ｍｌ〜１．２５ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．１５ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ｍｌのビヒクル
０．０３ｍｇ／ｍｌ〜０．６３ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．０７５ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋２．２５ｍｌのビヒクル
０．０１６ｍｇ／ｍｌ〜０．１６ｍｇ／ｋｇ： １．５ｍｌの０．０３ｍｇ／ｍｌ ＮＺ１７０７４＋１．５ｍｌのビヒクル
メロペネム溶液の調製
４０ｍｇ／ｋｇのメロペネムによる処置を陽性対照群として含めた。全５００ｍｇのメロペネム（１アンプル）を１０ｍｌの水〜５０ｍｇ／ｍｌに溶解した。このストック溶液を４ｍｇ／ｍｌ（０．４ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌ＋４．６ｍｌの生理食塩水）になるまでさらに希釈した。
シクロホスファミドの調製
全１ｇのシクロホスファミド（１アンプルのセンドキサン（登録商標）１ｇ）は、使用の各日に５０ｍｌの水に溶解し、約２０ｍｇ／ｍｌとした。このストック溶液は、−４日目の使用については１１ｍｇ／ｍｌ（１６．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ＋１３．５ｍｌの生理食塩水）、−１日目の使用については５ｍｇ／ｋｇ（８．２５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ＋２１．７５ｍｌの生理食塩水）にさらに希釈された。
マウスへのシクロホスファミドによる処置
マウスは、接種前に、４日間（２００ｍｇ／ｋｇ）及び１日間（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に０．５ｍｌのシクロホスファミド溶液を注射することによって好中球減少にさせた。
マウスの接種
５％のウマ血液寒天プレートからの新鮮な一晩の大腸菌ＡＩＤ＃１７２を滅菌生理食塩水に懸濁し、約２×１０7ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。処置開始の１時間前（−１時間）に、マウスは、左脚に０．０５ｍｌの大腸菌懸濁液を筋内接種された。接種前の約３０分にて、マウスは、疼痛緩和として４５μｌのニューロフェン（３０ｍｇ／ｋｇに対応する２０ｍｇのイブプロフェン／ｍｌ）を経口的に処理された。
マウスの処置
マウスは、０時間で、ＮＺ１７０７４、メロペネム又はビヒクルの単回投薬を用いて、１０ｍｌ／ｋｇにて約３０秒かけて外側尾静脈にｉ．ｖ．処理された（表１参照）。投薬量は平均重量３０ｇを基準にした。体重が２８〜３２ｇのマウスは、０．３０ｍｌ溶液を受けた。体重が２７〜２８ｇのマウスは、０．２５ｍｌ溶液を受け、体重が３２．１〜３６ｇのマウスは０．３５ｍｌ溶液を受けた。
Figure 0006120769
 Ｔは処置関する時間を示す。サンプリングカラムにおける数はマウスの識別番号である。
マウスの臨床スコアリング
マウスは研究中に観察され、それらの挙動及び診療兆候に基づいて０〜５でスコア付けされた。
スコア０：健常
スコア１：感染及び炎症の深刻でない臨床兆候、例えば、苦痛又は活動変化の深刻でない兆候の観察
スコア２：感染様、社会的離脱症状、好奇心の欠如、体位の変化、立毛、または運動パターンの変化
スコア３：感染様不自然な運動、好奇心の欠如、体位の変化、立毛、疼痛、又は運動パターンの変化の重篤な兆候
スコア４：重篤な疼痛、マウスは動物の苦しみを最少にするために即座に屠殺された
スコア５：マウスは死に至った。
サンプリング
コロニーカウントは、０時及び５時にて大腿部から決定された。マウスをＣＯ2＋Ｏ2で麻酔した。その直後、皮膚を除去し、左脚を回収し、−７０℃で凍結した。解凍後、Ｄｉｓｐｏｍｉｘ（登録商標）ドライブを用いて大腿部をホモジナイズした。次に、各々の試料は、生理食塩水に１０倍希釈され、２０μｌのスポットを青色寒天プレート上に適用した。全ての寒天プレートは、周囲空気中で１８〜２２時間、３５℃にてインキュベートされた。
結果
コロニーカウントは、処置開始時、及び処置５時間後に行われた。ＣＦＵカウントを表３に示す。ＣＦＵ数は、計算前にｌｏｇ10変換された。
接種材料中のＣＦＵ／ｍｌが６．０５ｌｏｇ10ＣＦＵ／マウスに対応する７．３５ｌｏｇ10に決定された。観察された高い変動性は、いくつかのマウスの次善接種によって引き起こされてもよく、非常に低いＣＦＵ値をもたらした。したがって、各グラフの最低値は、グラフ及び計算から除外された（表３参照）。処置開始時、平均ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｍｌは４．９３であり、処置後の５時間にてビヒクルにおいて６．４９ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｍｌまで増加した。僅かに低いＣＦＲレベルは、ＮＺ１７０７４の０．１６〜３．０ｍｇ／ｋｇによる処置後に観察された。僅かに低いＣＦＵレベルは、ビヒクル処置と比較して、６ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）及び１２ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）のＮＺ１７０７４による処置後に観察された（表３）。メロペネム処置（４０ｍｇ／ｋｇ）は僅かであったが、ビヒクル処置されたマウスと比較して、有意な減少をもたらした。
投薬量−応答曲線（データ示さず）は、Ｓ字状投薬量−応答（可変勾配）を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて計算された。このＥＤ５０値は５．９ｍｇ／ｋｇに決定された。しかしながら、最下部プラトーは観察されず、したがって、この値は低く見積もられた。
ＮＺ１７０７４の最大効果であるＥmaxは、無応答と最大応答との間のｌｏｇＣＦＵ差異として定義された。無応答は、ビヒクル処理されたマウスについて決定されたものと同レベルのコロニーカウントとして特徴付けられた。Ｅmaxは、Ｓ字状投薬量−応答を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて「最上部プラトー」と「最下部プラトー」間の差異として計算され、２．４ｌｏｇ10ＣＦＵであった。さらに、１ｌｏｇ殺生は、処置開始と比較して、細菌充填において１ｌｏｇ減少を得るために必要とされる投薬量として定義され、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて６．１ｍｇ／ｋｇと推測された。２及び３ｌｏｇ殺生は得られなかった。
感染の臨床兆候は、マウスのいずれにおいても任意の時間点で観察されなかった。
Figure 0006120769
Figure 0006120769
 □この値は、異常値であると考えられたため、計算から排除された。
星印はビヒクル群とは有意に異なることを示す（Ａｎｏｖａ；多重比較）。
*はｐ＜０．０５に対応する；<**>はｐ＜０．０１に対応する。
検出限界は１．４ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｍｌである。
本明細書に記載及び請求されている発明は、これらの局面が本発明のいくつかの局面の例証として意図されているため、本明細書に開示されている特定の局面による範囲に限定されうべきでない。任意の均等な局面は、この発明の範囲内であることが意図される。確かに、本明細書に示され、記載されている発明に加えて、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかとなるまた、このような修飾は、添付されている特許請求の範囲内にあることが意図される。不一致な場合、定義を含む本開示が調節する。

Claims (11)

  1. 配列番号２のアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドの単離された改変体であって、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドと比較して、改善された抗菌活性、又は血清又は血液中のタンパク質への減少したタンパク質結合を有し、
    （ｂ）Ｆ２Ａ；Ｙ５Ｎ又はＹ５Ｒ；Ｖ６Ａ；Ｖ８Ａ；Ｙ９Ｒ；Ｖ１３Ａ；及びＹ１７Ｈから選択される１、２又は３個の置換を有し、及び
    （ｃ）配列番号３、７０、７２、２３５、２５７、２９９、３０８、３３５又は３５０のアミノ酸配列を含む、
    改変体。
  2. 配列番号３、７０、７２、２３５、２５７、２９９、３０８、３３５及び３５０のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の改変体。
  3. 配列番号３、配列番号７２又は配列番号３５０のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の改変体。
  4. 配列番号３、配列番号７２又は配列番号３５０のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の改変体。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
  7. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  8. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  9. 配列番号２のアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドの改変体を生産するための方法であって、
    ａ）改変体の発現に適した条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養し；及び
    ｂ）該改変体を回収する
    ことを含む方法。
  10. 薬剤として使用するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変体。
  11. 細菌感染を治療するための薬剤の製造に使用するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変体。
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