CN102127138A

CN102127138A - 由废弃的灵芝太空包中分离灵芝酸的方法

Info

Publication number: CN102127138A
Application number: CN2010100028780A
Authority: CN
Inventors: 陈登海; 许国忠; 陈孟堂; 陈光地
Original assignee: YONGJIAN INDUSTRY CO LTD
Current assignee: YONGJIAN INDUSTRY CO LTD
Priority date: 2010-01-18
Filing date: 2010-01-18
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2030-01-18
Also published as: CN102127138B

Abstract

本发明揭示一种由废弃的灵芝太空包中分离出灵芝酸的方法。所揭示方法特征在于在40-70℃的温度下，以重量比约6∶1的比例混合一种极性溶液与取自废弃的灵芝太空包中的灵芝菌丝体，萃取至少6小时；接着，再以制备级液相色谱层析柱自上述萃出液中分离出灵芝活性成分，特别是具有抗癌活性的灵芝酸T化合物。

Description

由废弃的灵芝太空包中分离灵芝酸的方法

技术领域

本发明大致是关于一种分离灵芝酸的方法，特别是关于一种从废弃的灵芝太空包中分离出灵芝酸的方法。

背景技术

食药用真菌被广泛作为保健食品，其中又以灵芝为大宗。一般所说的灵芝，泛指赤芝与紫芝两种。依据分类学，赤芝(Ganoderma lucidum)包含松杉灵芝(Ganoderma tsugae)等伞菌盖呈红褐色的灵芝。至于紫芝则以中国灵芝(G.sinense)为代表，其菌伞盖呈紫黑色或深褐色。由于灵芝含有多种活性成分，因此在东南亚地区，经常以灵芝子实体入药。这些活性成分包括灵芝三萜类、多糖体、蛋白质、核酸、多肽及植物固醇化合物等。灵芝三萜类是灵芝最重要的活性成分，包括灵芝酸、灵芝醇、灵芝醛及羊毛固烷类化合物，通称为灵芝三萜类。迄今已有许多文献陆续证明这些活性成分具有抗肿瘤、增强免疫力(参见美国专利第4,051,314号、第6,613,754B1号)及抗氧化等功效。同时，也有许多分离灵芝活性成分的方法被提出，这些方法大半都是以极性溶剂萃取灵芝子实体，进而分离出上述的灵芝活性成分。以灵芝酸T为例，已知灵芝酸T具有抗癌效果，其有效剂量低，约10-25m g/Kg，且没有不良副作用，因此是一种极具开发潜力的抗癌药物。然而，如果依照目前公知方式，以灵芝菌丝体发酵后进行萃取，每1000公斤发酵液至少需时50天才能制得干菌丝约1公斤，接着再由此1公斤的干菌丝中分离出灵芝酸T，所得灵芝酸T含量极低，少于1公克。因此，以目前方式分离灵芝酸T并不符合产业的需求。

有鉴于此，需要提出一种改良方法，其可大量制得具有活性的灵芝酸T化合物。

发明内容

为解决上述问题，本发明人发现废弃的灵芝太空包内的灵芝菌丝体含有灵芝活性成分，特别是灵芝酸。因此，提出一种以废弃的灵芝太空包为原料来分离灵芝活性成分的方法。

因此，本发明目的之一在于提供一种自废弃的灵芝太空包中分离出灵芝酸的方法。所揭示方法特征在于包含以下步骤：

(a)在40℃至70℃的温度下，以一第一极性溶液萃取该废弃的灵芝太空包中的灵芝菌丝体至少约4小时，其中该第一极性溶液与该灵芝菌丝体的用量比例(重量比)约为6∶1至10∶1间；及

(b)在一制备级液相色谱层析柱中，以浓度介于20％～90％(体积％)间的一第二极性溶液，冲提步骤(a)所得的萃出液，藉以自该萃出液中分离出灵芝酸。

该灵芝菌丝体取自松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、赤芝(Ganoderma lucidum)或其混合物。

在一特定实例中，该第一极性溶液包含70％(体积％)的乙醇；且步骤(a)是在约70℃的温度下，以70％(体积％)的乙醇溶液萃取约6小时。

在一实施方式中，本发明方法还包含在执行上述步骤(b)之前，执行以下步骤：

(a 1)将步骤(a)所得的该萃出液浓缩后，取其沉淀物；及

(a2)以浓度约30～70％(体积％)的乙醇溶液将该沉淀物溶解。

依照本发明方法萃出的该灵芝酸为灵芝酸T、灵芝酸S或灵芝酸R。在一特定实例中，该灵芝酸为灵芝酸T。

在一实施方式中，本发明方法萃取灵芝酸T、灵芝酸S及灵芝酸R的萃取率分别约达0.08％、0.01％及0.01％(重量％)。

本发明的另一目的在于提供一种灵芝活性成分，特别是以所述方法分离出的灵芝酸T化合物。

附图说明

图1为依据本发明实施例1的方法所分离出来的灵芝酸T的I R光谱图；

图2为依据本发明实施例1的方法所分离出来的灵芝酸T的N M R光谱图；

图3为依据本发明实施例1的方法所分离出来的灵芝酸T的质谱图；及

图4为以实施例1所分离出来的灵芝酸T抑制多种肺癌细胞株生长的曲线图。

具体实施方式

目前灵芝多半是以太空包种植而成，在采收后，估计每年最少产生两百万包的废弃太空包，需以废弃物的处理程序处理。以每包0.5公斤估计，总废包重量在1000公吨以上。而由于灵芝废包质地坚韧，比其它菌类废包更难处理，因此近年来相关资源回收厂商皆不太愿意回收灵芝废包，也使得各灵芝栽培农场都面临相同的废弃物处理问题。

有鉴于此，本发明人特为提出一种可有效利用这些废弃的灵芝太空包的方法，除了有助于解决目前棘手的废弃物处理问题外，还可通过一种简易的分离程序，自废弃太空包中的灵芝菌丝体获得大量的灵芝酸活性成分，特别是灵芝酸T，供后续医药用途。

因此，依据本发明，提供一种可自废弃的灵芝太空包中分离出高量活性化合物的方法；以及以此方法所分离出来的干燥灵芝酸粉末，特别是灵芝酸T粉末。

依据本发明的一种实施方式，提供一种自废弃的灵芝太空包中分离出灵芝酸化合物的方法，包含以下步骤：

(a)在40℃至70℃的温度下，以一第一极性溶液萃取该废弃的灵芝太空包中的灵芝菌丝体，其中该第一极性溶液与该灵芝菌丝体的用量比例(重量比)约为6∶1至10∶1间；及

(b)在一制备级液相色谱层析柱中，以浓度介于20％～90％(体积％)间的一第二极性溶液，冲提步骤(a)所得的一萃出液，藉以自该萃出液中分离出该灵芝酸。

适合用于本发明方法的废弃太空包，可为一般用来种植松杉灵芝(Ganoderma tsugae)或赤芝(Ganoderma lucidum)或其组合的太空包。此太空包内容物一般包含木屑、米糠、玉米粉、石灰(或碳酸钙)及水等，经过植菌栽种灵芝约60～120天，待灵芝采收后，整个太空包即变成废弃物。

依据本发明的一种实施方式，使用一种第一极性溶液来萃取这类废弃太空包内的灵芝菌丝体，接着，利用制备级液相色谱层析法，自该萃取液中分离出具活性的灵芝化合物。

操作时，首先在一适当的温度下，以重量比约6∶1至约10∶1的比例，混合第一极性溶液与废弃太空包内的灵芝菌丝体，并进行萃取至少约4小时，以获得一粗萃液。

适合混合第一极性溶液与废弃太空包内的灵芝菌丝体的温度范围约在40℃至70℃间，例如约40、45、50、55、60、65或70℃。在一特定实例中，此混合温度为70℃。

适合作为粗萃溶剂的第一极性溶液包括，但不限于，水或醇类，例如乙醇、丙醇、异丙醇、正-丁醇、异-丁醇等。在一实例中，第一极性溶液是70％(体积％)的乙醇。

第一极性溶液与废弃太空包内的灵芝菌丝体的混合比例，以重量计，约在6∶1至10∶1间，例如约6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1的比例，混合后实施萃取的时间至少需为4小时，例如4、5或6小时。

在一特定实例中，于70℃的温度下，以每一公斤废包内的灵芝菌丝体，混合约6公斤的70％(体积％)的乙醇来进行粗萃，且粗萃时间为6小时，藉此可得一粗萃液。

接着，将此粗萃液过滤、浓缩，使其重量成为原来第一极性溶液用量的至少1/5，更佳是至少1/6。然后，静置隔夜，取浓缩液中的沉淀物，加入少量第一极性溶液将该沉淀物回溶成为一萃出液。第一极性溶液可为20％至70％(体积％)的乙醇溶液，并且可以任何公知的方式来执行此过滤、浓缩的步骤。

接着，便将此萃出液加载至一制备级液相色谱层析柱中，在约80～220毫升/分钟的流速下(较佳是约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170或180毫升/分钟，更佳是约100、110、120、130、140或150毫升/分钟)，以浓度在20％～90％间，例如约20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％，更佳是约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的第二极性溶液进行冲提，并收集所得冲提液。适合用来冲提管柱的第二极性溶液包括，但不限于水或醇类，包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正-丁醇、异-丁醇等。在一特定实例中，此第二极性溶液是70％(体积％)的乙醇溶液。

在另一实例中，此冲提处理可分成两阶段进行：首先，在约100毫升/分钟的流速下，以约20～40％(体积％)的乙醇溶液进行第一次冲提；接着，以浓度介于50～90％(体积％)的乙醇溶液进行第二次冲提。将两次冲提后的冲提液收集在一起，并经减压浓缩及冷冻干燥后，可获得所需的灵芝酸化合物，包括灵芝酸T、灵芝酸S或灵芝酸R。在一特定实例中，所冲提出来的灵芝酸化合物经NMR、IR及质谱分析后，确认其为灵芝酸T。本发明方法的产率约在0.7％至2％间(此百分比为灵芝酸T重量/菌丝干重)。此外，可以任何公知的方式来将产物浓缩、干燥。在一实例中，在一减压环境下，例如压力约0.1托(torr)的环境下，将冲提液浓缩，待冲提液中的固形物含量达20％时，即停止此浓缩处理。接着，将浓缩物干燥，例如，在-30℃～-50℃下冷冻干燥。

依据本发明的一个特定实例，可从1公斤废包中的灵芝菌丝体分离出约850毫克的灵芝酸T、90毫克的灵芝酸S及约120毫克的灵芝酸R。

以下，将通过实施例来阐述本发明的较佳实施方式。

实施例1从废弃的灵芝太空包中分离灵芝酸

秤取约1公斤左右的废包菌丝，置入一容器中，并加入约6公斤70％(体积％)的乙醇使混合均匀。将容器加热到约70℃，并保持温度约6小时，以萃出菌丝中的灵芝化合物。接着，利用抽气过滤，收集滤液并去除残渣，同时以70％(体积％)的乙醇清洗残渣，将滤液集中。

将所收集的滤液浓缩至约1公斤左右，冷却并静置隔夜。接着，倒掉上清液部分，取其沉淀物。分批逐次加入少量的70％(体积％)乙醇至沉淀物中，促使其溶解，直到所有沉淀都回溶为止。

接着，将此回溶液加载至一制备级液相色谱层析柱中(Biotage，C-18Flash column)在约120毫升/分钟的流速下，以浓度在20％～90％间的乙醇溶液进行冲提，并收集所得冲提液。

利用NMR、IR及质谱分析来鉴别不同时间收集的冲提液中的灵芝酸化合物的结构与含量，结果分别示于图1-3中；其中图1、2及3分别示出以制备级液相色谱层析分离出的灵芝酸T的IR、¹H NMR及质谱分析结果。

所获得的灵芝酸T化合物的结构与相关数据如下所示：

GAT，Ganoderic acid T：R₁＝OAc，R₂＝OAc，C₃₆H₅₂O₈，MW＝612

IR_max(KBr，cm^-1)：2958，1730，1710，1377，1249

¹H NMR(CDCl₃)：0.66(3H，s)，0.88(3H，s)，0.97(3H，d J＝7.0Hz)，0.98(3H，s，)，0.99(3H，s)，1.03(3H，s)，2.05(3H，s)，2.07(3H，s)，2.57(1H，ddd，J＝15.1，7.7，7.1Hz)，5.03(1H，ddd，J＝7.5，6.9，1.0Hz)，5.08(1H，dd，J＝9.5，5.5Hz)，5.32(1H，d，J＝6.6Hz)，6.76(1H，br.)

MS m/z：612(M⁺，C₃₆H₅₂O₈＝612).

在此实例中，可获得约850毫克的灵芝酸T以及少量的灵芝酸S与灵芝酸R，分别为90毫克及约120毫克。

实施例2以实施例1所分离出来的灵芝酸T来抑制肺癌细胞

在本实施例中选择6种小细胞与非小细胞的肺癌细胞株，包括A549、NCI-H1650、NCI-H1975、CL-1-5、PC9与PC9-IR，进行体外细胞毒杀试验。简言之，以不同浓度的灵芝酸T(ganoderic acidT，GAT)来处理上述任一细胞株，利用测量细胞内的酸性磷酸酶的活性作为细胞活性的指针，接着，在72小时后，分别计算每一细胞株的细胞存活率，藉此估算出GAT对每一细胞株的EC₅₀。

以每一培养孔含有3,000个细胞的浓度将上述细胞株接种在平底的96孔细胞培养盘中，并培养在含有1％胎牛血清的培养液中。待所培养的细胞贴附于盘底后，再分别以不同浓度(0～20μM)的GAT处72小时后移除培养液，每个孔以200μl PBS清洗一次，加100μl的呈色剂(0.1M醋酸钠，p H 5.5，0.1％Triton X-100，10m M p-NPP)，在37℃下反应30～60分钟，最后加入10μl 1N NaOH终止反应，待呈现均匀黄色后，以微量盘测定仪于波长405nm下测定吸光值，以未加药物的对照组细胞吸光值当作100％，换算出细胞经不同处理后的活性。所有实验每一点皆为三次重复，取其平均值并将标准差的值标示于图形上。结果示于表1与图4中。

表1GAT对于不同肺腺癌细胞株的50％有效毒杀浓度

	H1650	H1975	A549	CL1-5	PC9	PC9-IR
							EC₅₀(μM)	15.2	11.7	12.5	6.7	1.9	2.6

实验结果显示，实施例1所分离出来的灵芝酸T对多种肺腺癌细胞都具有毒杀效果，因此可作为未来抗癌药物的潜在药物。

虽然本发明已以一较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以作出各种更动与润饰，因此本发明的保护范围应当以所附的权利要求所界定者为准。

Claims

1.一种从废弃的灵芝太空包中分离灵芝酸的方法，包含：

(b)在一制备级液相色谱层析柱中，以浓度介于20％～90％(体积％)间的一第二极性溶液，冲提步骤(a)所得的萃出液，藉以自该萃出液中分离出该灵芝酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中该灵芝菌丝体取自松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、赤芝(Ganoderma lucidum)或其混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其中该第一极性溶液包含70％(体积％)的乙醇。

4.如权利要求1所述的方法，其中该以第一极性溶液萃取该灵芝菌丝体的步骤实施了约6小时。

5.如权利要求1所述的方法，还包含在执行步骤(b)之前，执行以下步骤：

(a1)将步骤(a)所得的萃出液浓缩后，取其沉淀物；及

(a2)以浓度约30～70％(体积％)的乙醇溶液将该沉淀物溶解。

6.如权利要求1所述的方法，其中该第二极性溶液包含70％(体积％)的乙醇。

7.如权利要求1所述的方法，其中该灵芝酸为灵芝酸T、灵芝酸S或灵芝酸R。

8.如权利要求6所述的方法，其中该灵芝酸为灵芝酸T。

9.如权利要求1所述的方法，其中该方法萃取灵芝酸T的萃取率约为0.7-2％。