CN109633048A - 一种动物体内颠茄生物碱的快速检测方法 - Google Patents

一种动物体内颠茄生物碱的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种动物体内颠茄生物碱的快速检测方法，包括以下步骤：(1)取中毒动物体液，配制成待测样液；(2)将所述步骤(1)得到的待测样液用去蛋白剂除杂、净化后，再用高效液相色谱‑质谱法测定，即可。该方法简单易行、通过高效液相色谱‑质谱法检测，操作方便；结合HRMS分析，可快速准确检测出动物体内颠茄生物碱的含量，有助于后期对于治疗药物的筛选和评价。

Description

一种动物体内颠茄生物碱的快速检测方法
技术领域
本发明涉及食品毒素的检测方法，特别涉及一种动物体内颠茄生物碱的快速检测方法。
背景技术
颠茄是一种多年草本植物，表面浅棕灰棕色，具纵皱纹。根易折断，叶多皱缩破碎，完整叶片卵状椭圆形。表面黄绿色，茎粗状直立，上部分枝。冠钟状，淡紫褐色。浆果球形，成熟时黑紫色。成熟后为黑色，具长梗，种子多数。
现在有很多地方可以进行人工培植这种植物，一般是用在镇静、麻醉、止痛等作用上。但颠茄是有很强的毒性的，即使是一点点也会导致中毒，特别是对人的神经中枢有很强的毒性。颠茄的主要有毒成分为莨菪碱、阿托品及东莨菪碱等生物碱，它们都是一种毒蕈碱阻滞剂，竞争毒蕈碱受体，打断副交感神经的支配作用。东莨菪碱对正常人的呼吸兴奋作用较强，可增加呼吸频率及通气量，能对抗吗啡引起的呼吸抑制，但当呼吸严重抑制时用作为兴奋剂则作用不可靠，对高级脑中枢的作用与阿托品相反，主要是抑制而不是兴奋，治疗剂量时即引起困倦、欣快、遗忘、疲劳以至进入睡眠状态，如加大剂量可产生麻醉作用。阿托品的作用与东莨菪碱相似，除中枢作用外，应用较广的是它们的外周作用，即阻断乙酰胆碱对M-胆碱受体作用所产生的一系列效应。
目前，对动物体内颠茄生物碱含量检测方法报道的文献较少。所以，开发一种快速、准确、稳定的检测生物样品中颠茄生物碱含量的方法，及时发现颠茄生物碱中毒现象采取急救显得尤为重要。
发明内容
本发明提供了一种动物体内颠茄生物碱的快速检测方法，该方法可以对颠茄生物碱的中毒结果进行更快速准确的检测。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下的技术方案：一种动物体内颠茄生物碱的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)取中毒动物体液，配制成待测样液；
(2)将所述步骤(1)得到的待测样液用去蛋白剂除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定，即可。
进一步地，所述步骤(2)中的高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中流动相A:流动相B的体积比为90～10:10～90。
进一步地，所述步骤(2)中的质谱条件：分辨率为70000，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃；扫描质量范围为60～700amu，扫描模式为全扫描+全碎裂。
进一步地，所述步骤(2)中待测样液与去蛋白剂的体积比为1～3:4～6。
进一步地，所述步骤(2)中待测样液与去蛋白剂的体积比为2:5。
进一步地，所述步骤(1)中，中毒动物体液为尿液、血液和胃内容物中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明的动物体内颠茄生物碱的快速检测方法的有益效果为：
该方法简单易行、通过高效液相色谱-质谱法检测，操作方便；结合HRMS分析，可快速准确检测出动物体内颠茄生物碱的含量，有助于后期对于治疗药物的筛选和评价。
附图说明
下面结合附图中的具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
图1为颠茄生物碱的主成分分析对比图之一；
图2为颠茄生物碱的主成分分析对比图之二；
图3为颠茄生物碱的主成分分析对比图之三。
具体实施方式
实施例1
取中毒小鼠尿液2mL配制成待测样液，然后取待测样液1mL加入4mL1％的甲酸乙腈溶液除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定。其中，高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中，0-2min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，2-5min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5-5.1min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5.1-7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，第7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；所述质谱条件：分辨率为70000，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃；扫描质量范围为60～700amu，扫描模式为全扫描+全碎裂。
实施例2
取中毒小鼠血液3mL，血液置于肝素钠润洗过的离心管中混匀，配制成待测样液，然后取待测样液2mL加入5mL 1％的甲酸乙腈溶液除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定。其中，高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中，0-2min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，2-5min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5-5.1min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5.1-7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，第7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；所述质谱条件：分辨率为70000，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃；扫描质量范围为60～700amu，扫描模式为全扫描+全碎裂。
实施例3
取中毒小鼠胃内容物6mL，于2mL 1％的甲酸水溶液中剪碎常温浸泡30min配制成待测样液，然后取待测样液3mL加入6mL 1％的甲酸乙腈溶液除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定。其中，高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中，0-2min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，2-5min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5-5.1min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5.1-7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，第7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；所述质谱条件：分辨率为70000，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃；扫描质量范围为60～700amu，扫描模式为全扫描+全碎裂。
实验例1
1.颠茄药酒的配置
称取100g颠茄，放到酒瓶中，加20°米酒1000mL，泡制1个月，制成颠茄药酒。
2.提取颠茄药酒中的颠茄生物碱提取液，并检测浓度
量取5mL颠茄药酒于离心管中，加入95mL 1％甲酸水溶液稀释，超声提取30分钟，3000rpm离心5分钟。取20mL上清液于50mL离心管中，振荡3分钟，15000rpm离心5分钟。取上清液2.00mL直接上先用3mL甲醇和3mL水活化的pcx柱，再用3mL水和3mL甲醇淋洗固相萃取柱，抽干，用5mL 5％氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，并用40℃氮吹干，然后用1.00mL 0.1％甲酸甲醇定容，过0.22μm有机滤膜，用色谱仪进行检测。
色谱条件为安捷伦HPH-C18(3×100mm，1.9μm)、进样量1μL，柱温为35℃；质谱条件为：分辨率为70000，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃；扫描质量范围为60～700amu，扫描模式为全扫描+全碎裂。检测浓度的结果如表1所示，颠茄药酒中颠茄生物碱(即山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品)的浓度为分别为2188.7525ng/mL、2711.8025ng/mL和42724.2950ng/mL。
表1颠茄生物碱提取液的浓度检测结果
药酒生物碱含量(ng/mL) 山莨菪碱 东莨菪碱 阿托品
颠茄药酒 2188.7525 2711.8025 42724.2950
3.动物模型的制备
取10只SPF级雌性小鼠并分为两组，第一组：8只(1-8号)灌以上述提取的颠茄药酒(1.0mL/10g)(1.0mL/10g是指小鼠的体重每10g加1.0mL的提取液)；第二组：2只(8-10号)作为空白组，灌以20°米酒(1.0mL/10g)。
4.体液的采集和处理方法
上述小鼠灌胃后放入代谢笼观察记录动物行为，3h后取血液、胃内容物，收集实验过程中的尿液。
(1)尿液：收集代谢笼所得小鼠尿液，取0.4mL加入1％的甲酸乙腈溶液1.0mL混匀，离心上机分析。
(2)血液：血液置于肝素钠润洗过的离心管中混匀，离心取血浆0.4mL加入1％的甲酸乙腈溶液1.0mL混匀，离心上机分析。
(3)胃内容物：取小鼠胃内容物于1％甲酸水溶液2mL中剪碎常温浸泡30min，离心取上清液0.4mL，加入1％的甲酸乙腈溶液1.0mL混匀，离心上机分析。
以上分析条件为：
色谱条件：高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比见表2；质谱条件：分辨率为70000，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃；扫描质量范围为60～700amu，扫描模式为全扫描+全碎裂。
表2各时间段流动相体积比例
5.中毒小鼠体液分析
对中毒小鼠体液进行检测分析，条件与上述4中的相同。对小鼠灌胃之后的3h的行为表现以及体液分析结果如表3所示，对小鼠灌胃颠茄药酒之后大多数出现萎靡、昏睡的表现，也有一部分小鼠有四肢无力的表现，通过动物表现和体液中颠茄浓度的结果显示，所用提取方法、分析方法在对于体液中颠茄的应用有效，若为血液，仅检测阿托品即可。
表3动物实验结果
6.统计学差异分析
通过HRMS分别对血液、胃内容物和尿液中颠茄的主成分分析，结合Mass ProfilerProfessional软件(利用t-test p<0.05和强度倍数变化FC>2过滤)分析，分别得到图1、2、3中的胃内容物、血液以及尿液中的成分分析。
经过主成分分析，结合色谱对颠茄生物碱提取液、空白组、颠茄生物碱提取液-体液以及发病后小鼠体内颠茄生物碱的数据能明显分析，所用提取方法、分析方法在对于体液中颠茄生物碱的应用有效，胃内容物的差异性均较大，尿液、血液次之，所以应急采样中，可优先提供胃内容物进行检验，若为血液，仅检测阿托品即可。由以上筛选方法通过动物实验结合HRMS模拟测定动物服用颠茄生物碱后，体内胃内容物、血液、尿液中颠茄生物碱的分布情况，可以对动物中毒后体内颠茄生物碱含量进行快速准确的检测。
以上所述为本发明的优选实施方式，并不限制于本发明。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下做出的若干改进和变型，也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种动物体内颠茄生物碱的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取中毒动物体液，配制成待测样液；
(2)将所述步骤(1)得到的待测样液用去蛋白剂除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定，即可。
2.根据权利要求1所述的动物体内颠茄生物碱的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中流动相A：流动相B的体积比为90～10:10～90。
3.根据权利要求2所述的动物体内颠茄生物碱的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的质谱条件：分辨率为70000，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃；扫描质量范围为60～700amu，扫描模式为全扫描+全碎裂。
4.根据权利要求1所述的动物体内颠茄快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中待测样液与去蛋白剂的体积比为1～3:4～6。
5.根据权利要求1或2或3或4或5所述的动物体内颠茄生物碱的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中动物体液为尿液、血液和胃内容物中的一种或几种。
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