CN118191144A - 一种大建中汤特征图谱的构建方法及有效成分含量的测定方法 - Google Patents
一种大建中汤特征图谱的构建方法及有效成分含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种大建中汤特征图谱的构建方法及有效成分含量的测定方法。该构建方法包括供试品溶液的制备，并在特定条件下，采用UPLC‑UV‑ELSD色谱法得到了特征图谱1和特征图谱2。在超高效液相和紫外检测器下得到的特征图谱1专属于干姜、炒花椒，特征峰主要为干姜的姜酚类成分和炒花椒中酰胺类生物碱成分；在超高效液相和蒸发光散射检测器下得到的特征图谱2专属于人参的特征图谱，均为人参皂苷类，解决了两大类成分检测波长差异大、成分间互相干扰的问题。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种大建中汤特征图谱的构建方法及有效成分含量的测定方法。
背景技术
大建中汤出自张仲景的《金匮要略·腹满寒疝宿食病脉证治第十》，处方由蜀椒二合(去汗)，干姜四两，人参二两，胶饴一升组成，功效为温中补虚，降逆止痛，主治中阳衰弱，阴寒内盛证。方中蜀椒大辛大热，温中散寒，下气止痛，并能驱蛔杀虫，为君药；干姜大辛大热，温中散寒，和胃止呕，为臣药；阴寒内盛由于中阳之虚，故用人参甘温，补益脾胃，扶持正气，为佐药；饴糖逮中补虚，缓急止痛，且以缓和椒、姜辛烈之性，为使药。四药配伍，而成温中补虚，降逆止痛之剂。
大建中汤处方药味炒花椒、干姜、人参均收载于《中国药典》2020年版一部，干姜现行药典标准中载有6-姜辣素指标成分的定量标准，人参现行药典标准中载有人参皂苷Rg1、Re、Rb1的定量标准，炒花椒无指标成分定量标准。关于各单味药味质量研究的相关文献较多，但目前关于大建中汤或者相关处方的质量研究报道较少。现有技术中，张毅靖等基于传统汤剂的大建中汤配方颗粒的质量评价中，检测效果不佳，基线不平稳，检测结果与实际不符。李响等大建中汤颗粒质量标准研究中，其针对的处方与现行经典名方关键信息不符，未添加胶饴，现行处方中加入胶饴后制得的样品类似煎膏剂，实物检测分析用供试品制备难度较大。中国专利文献CN111505196 A公开了一种大建中汤物质基准的质量控制方法，该检测方法存在繁琐，时间长缺陷。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术大建中汤检测方法存在检测周期长，检测效果不佳，如基线不平稳、与实际不符、以单味药材为目标导致操作繁琐，以及还存在重现性差等缺陷，从而提供一种大建中汤特征图谱的构建方法及有效成分含量的测定方法。
为此，本发明提供了以下技术方案。
本发明第一方面提供了一种大建中汤特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：将供试品制成供试品溶液；
采用UPLC-UV-ELSD色谱法检测，其中，UPLC-UV-ELSD色谱法的色谱条件包括：以甲醇为流动相A，以甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0-12min，50％流动相A，50％流动相B；12-15min，50％→65％流动相A，50％→35％流动相B；15-30min，65％→70％流动相A，35％→30％流动相B；30-35min，70％→80％流动相A，30％→20％流动相B；35-40min，80％流动相A，20％流动相B。
超高效液相色谱(UPLC)-紫外(UV)-蒸发光散射检测法(ELSD)。
所述构建方法，UPLC-UV-ELSD色谱法的色谱条件还包括：
检测器：超高效液相色谱仪配置紫外检测器并串联蒸发光散射检测器；和/或，
紫外检测器的检测波长为270nm～290nm；和/或，
蒸发光散射检测器的载气流量2.3～2.8L/min；和/或，
漂移管温度为90～100℃；和/或，
超高效液相色谱仪的柱温为25～35℃；和/或，
流速为0.35～0.45ml/min；和/或，
色谱柱为：Agilent Infinity Lab Poroshell 120EC-C18，规格：内径为3.0mm，柱长为150mm，粒径为2.7μm；和/或，
以0.05～0.1％甲酸水溶液作为流动相B；和/或，
取样量为2～4μL。
所述构建方法，UPLC-UV-ELSD色谱法的色谱条件：以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B；柱温为30℃，流速为0.4ml/min，取样量为3μL；紫外检测器的检测波长为280nm，理论板数以6-姜辣素峰计算应不低于10000；蒸发光散射检测器的载气流量2.5L/min，漂移管温度为95℃，理论板数以人参皂苷Rb1峰计算应不低于10000。
所述构建方法得到特征图谱1和/或特征图谱2；
所述特征图谱1具有8个特征峰，以1号峰为参照物峰，2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰和8号峰的相对保留时间的规定值分别为：1.138、1.177、1.219、1.393、1.467、1.580、1.651；相对保留时间在规定值的±8％；
所述特征图谱2具有8个特征峰，以5号峰为参照物峰，3号峰、4号峰、6号峰、7号峰和8号峰的相对保留时间的规定值分别为：0.680、0.928、1.030、1.129、1.253；相对保留时间在规定值的±8％。
所述特征图谱1中，1号峰为6-姜辣素；
优选地，所述特征图谱2中1号峰为人参皂苷Re，2号峰为人参皂苷Rg1，5号峰为人参皂苷Rb1。
所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品，稀释，加提取溶剂，提取，得到供试品溶液；
优选地，所述提取溶剂为水饱和的正丁醇；
优选地，所述提取的次数为3-5次；
优选地，所述稀释的倍数为2-4倍。
所述供试品为大建中汤汤剂或煎膏剂。
所述构建方法还包括制备对照品溶液的步骤；
优选地，以6-姜辣素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1中的至少一种作为对照品；
优选地，每1ml对照品溶液中含0.15～0.25mg 6-姜辣素、0.25～0.35mg羟基-α-山椒素、0.025～0.035mg羟基-β-山椒素、0.15～0.25mg人参皂苷Rg1、0.15～0.25mg人参皂苷Re和0.15～0.25mg人参皂苷Rb1的对照品。
本发明第二方面提供了一种测定大建中汤中有效成分含量的测定方法，采用上述的构建方法，采用外标法测定有效成分含量。
所述有效成分包括6-姜辣素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1中的至少一种。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的大建中汤特征图谱的构建方法，该构建方法通过紫外检测器与蒸发光散射检测器串联，得到了特征图谱1和特征图谱2。在超高效液相和紫外检测器下得到的特征图谱1专属于干姜、炒花椒，特征峰主要为干姜的姜酚类成分和炒花椒中酰胺类生物碱成分；在超高效液相和蒸发光散射检测器下得到的特征图谱2专属于人参的特征图谱，均为人参皂苷类，解决了两大类成分检测波长差异大、成分间互相干扰的问题。
2.本发明提供的大建中汤特征图谱的构建方法，总检测时间缩短至40min，得到的特征图谱的基线平稳，特征峰间的分离度好，重现性好。
3.本发明提供的大建中汤特征图谱的构建方法，该构建方法一测多评，在测定特征图谱的同时测定6种有效成分的含量，阴性样品无干扰；该方法通过方法学验证，结果显示专属性、线性、重复性、准确度、供试品溶液稳定性和方法耐用性均良好。在制备供试品溶液时，以水饱和正丁醇作为提取溶剂，在提取前先进行稀释可以充分提取有效成分。
4.本发明提供的测定大建中汤中有效成分含量的测定方法，缩短了检测时间，一测多评，充分利用不同检测器的特性，同时分析不同类型的化学成分，检测方法效率高，有效节能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1中15批大建中汤基准样品的对照特征图谱1；
图2是本发明实验例1中15批大建中汤基准样品得到的特征图谱1；
图3是本发明实验例1在建立特征图谱1时，阴性样品和基准样品的色谱图；
图4是本发明实验例1在建立特征图谱1时，对照品的色谱图和特征图谱1；
图5是本发明实验例1中15批大建中汤基准样品的对照特征图谱2；
图6是本发明实验例1中15批大建中汤基准样品得到的特征图谱2；
图7是本发明实验例1在建立特征图谱2时，阴性样品和基准样品的色谱图；
图8是本发明实验例1在建立特征图谱2时，对照品的色谱图；
图9是本发明实验例1特征图谱2；
图10是本发明实验例2中1.2节不同色谱柱得到的特征图谱1；
图11是本发明实验例2中1.3节不同流动相得到的特征图谱1；
图12是本发明实验例2中1.4节不同柱温得到的特征图谱1；
图13是本发明实验例2中1.5节不同流速得到的特征图谱1；
图14是本发明实验例2中2.4节空白实验和二倍保留时间的考察的色谱图；
图15是本发明实验例3中1.1节不同色谱柱得到的色谱图；
图16是本发明实验例3中1.2节不同流动相得到的色谱图；
图17是本发明实验例3中1.3节不同柱温得到的色谱图；
图18是本发明实验例3中1.3节不同流速得到的色谱图
图19是本发明实验例3中2.4节得到的色谱图；
图20是本发明实施例2中2.6节专属性实验得到的图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
仪器：
超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY UPLC H-CLASS系列，ALLTECH ELSD6000型蒸发光散射检测器；超声清洗机：KQ-500DE型数控超声波清洗器，功率500W，频率40kHz；分析天平，德国Sartorius BT25S、BS2202S及BS124S。
试药：
乙腈为色谱纯(OCEANPAK、天津彪仕奇科技发展有限公司)，甲醇为色谱纯(FisherScientific)，水为超纯水，无水乙醇为分析纯(北京通广精细化工公司)，乙醇(95％)为分析纯(北京通广精细化工公司)，磷酸为分析纯(北京通广精细化工公司)，无水甲酸(98％)(国药集团化学试剂有限公司)，冰醋酸为分析纯(北京化工厂)，正丁醇为分析纯(北京通广精细化工公司)。
6-姜辣素，批号111833-201806，纯度99.90％，中国食品药品检定研究院；羟基-α-山椒素，批号PS012248，纯度＞95％，成都普斯生物科技股份有限公司；羟基-β-山椒素，批号DSTDQ071601，纯度≥98％，成都德斯特生物技术有限公司；人参皂苷Re，批号110754-202129，纯度96.0％，中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rg1，批号110703-202034，纯度94.0％，中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rb1，批号110704-202129，纯度94.3％，中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rb2，批号111715-201203，纯度93.8％，中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rb3，批号111686-201504，纯度97.0％，中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rf，批号MUST-16041002，纯度99.62％，成都曼斯特生物科技有限公司；人参皂苷Ro，批号DST160910-031，纯度≥98％，成都德斯特生物技术有限公司；人参皂苷Rd，批号130713，纯度>99％，上海融禾医药科技有限公司；人参皂苷Rg2，批号130622，纯度>98％，上海融禾医药科技有限公司；人参皂苷Rc，批号130724，纯度>99％，上海融禾医药科技有限公司。
以下实施例和实验例用到的大建中汤基准样品的制备方法包括：炒花椒、干姜和人参按照处方比例称取91.8g，置于砂锅，加水800ml，武火煮沸，改用文火煎煮至约400ml，滤过，弃去药渣，煎液再加入200ml胶饴，武火煮沸后改用文火煎煮至约300ml，得到大建中汤基准样品。其中，以不同批次的炒花椒、干姜、人参各15批，随机配伍，共制备大建中汤基准样品15批，批号对应DJZT0901～DJZT0915。其中，以重量份数计，大建中汤的处方包括9份炒花椒、55.2份干姜和27.6份人参。
实施例1
本实施例提供了一种大建中汤特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取大建中汤基准样品，摇匀，取约16g，称定重量，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度(按照大建中汤基准样品16g折算体积约12.5ml，稀释倍数约为4倍)，摇匀，精密量取25ml，置分液漏斗，加水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加70％甲醇适量使溶解，并转移至5ml量瓶，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。
对照品溶液的制备：取6-姜辣素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg6-姜辣素对照品的溶液，得到对照品溶液1。
取羟基-α-山椒素对照品、羟基-β-山椒素对照适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基-α-山椒素对照品0.3mg、羟基-β-山椒素0.03mg的混合溶液，得到对照品溶液2。
取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml各含0.2mg对照品的混合溶液，得到对照品溶液3。
取人参皂苷Rg2、Rf、Ro、Rb2、Rb3、Rc、Rd对照品，精密称定，分别加60％甲醇制成每1ml各含0.2mg的系列对照品溶液，统称对照品溶液4。
分别精密吸取2μL对照品溶液1和对照品溶液2、4μL对照品溶液3、2μL对照品溶液4和3μL供试品溶液，注入色谱仪，测定。
其中，采用UPLC-UV-ELSD色谱法检测，超高效液相色谱仪配置紫外检测器并串联蒸发光散射检测器，分别采集UPLC-UV和UPLC-ELSD图谱，UPLC-UV同时测定6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素对照品，UPLC-ELSD同时测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品；色谱条件包括：柱温为30℃，流速为0.4ml/min，色谱柱为：AgilentInfinityLab Poroshell 120EC-C18，规格：内径为3.0mm，柱长为150mm，粒径为2.7μm；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0-12min，50％流动相A，50％流动相B；12-15min，50％→65％流动相A，50％→35％流动相B；15-30min，65％→70％流动相A，35％→30％流动相B；30-35min，70％→80％流动相A，30％→20％流动相B；35-40min，80％流动相A，20％流动相B。紫外检测器的检测波长为280nm，理论板数以6-姜辣素峰计算应不低于10000。蒸发光散射检测器的载气流量2.5L/min，漂移管温度为95℃，理论板数以人参皂苷Rb1峰计算应不低于10000。
实验例1特征图谱的建立
1特征图谱1的建立
取15批大建中汤基准样品按照实施例1制备供试品溶液，测定UPLC-UV特征图谱，对其进行分析，以6-姜辣素为参照物，计算相对保留时间，结果见图1、图2和下表。
表1 15批基准样品特征图谱1中各特征峰的相对保留时间
| 样品名称 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 |
| DJZT0901 | 1.138 | 1.176 | 1.218 | 1.392 | 1.466 | 1.579 | 1.649 |
| DJZT0902 | 1.138 | 1.177 | 1.219 | 1.393 | 1.466 | 1.579 | 1.650 |
| DJZT0903 | 1.137 | 1.176 | 1.218 | 1.392 | 1.466 | 1.578 | 1.649 |
| DJZT0904 | 1.139 | 1.177 | 1.220 | 1.395 | 1.469 | 1.583 | 1.654 |
| DJZT0905 | 1.139 | 1.177 | 1.220 | 1.395 | 1.469 | 1.582 | 1.653 |
| DJZT0906 | 1.138 | 1.177 | 1.219 | 1.394 | 1.468 | 1.581 | 1.652 |
| DJZT0907 | 1.138 | 1.176 | 1.218 | 1.392 | 1.465 | 1.579 | 1.649 |
| DJZT0908 | 1.139 | 1.178 | 1.220 | 1.395 | 1.469 | 1.582 | 1.654 |
| DJZT0909 | 1.138 | 1.177 | 1.219 | 1.394 | 1.468 | 1.581 | 1.652 |
| DJZT0910 | 1.138 | 1.177 | 1.219 | 1.394 | 1.468 | 1.581 | 1.653 |
| DJZT0911 | 1.137 | 1.175 | 1.217 | 1.391 | 1.464 | 1.576 | 1.646 |
| DJZT0912 | 1.138 | 1.176 | 1.218 | 1.392 | 1.465 | 1.578 | 1.649 |
| DJZT0913 | 1.138 | 1.177 | 1.219 | 1.393 | 1.467 | 1.580 | 1.652 |
| DJZT0914 | 1.138 | 1.177 | 1.219 | 1.393 | 1.467 | 1.581 | 1.652 |
| DJZT0915 | 1.138 | 1.177 | 1.219 | 1.394 | 1.468 | 1.581 | 1.653 |
| 平均值 | 1.138 | 1.177 | 1.219 | 1.393 | 1.467 | 1.580 | 1.651 |
| RSD | 0.05 | 0.06 | 0.07 | 0.09 | 0.11 | 0.12 | 0.14 |
对15批大建中汤基准样品的特征图谱1结果进行分析，以1号峰为参照物峰，2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰和8号峰的相对保留时间的规定值分别为：1.138、1.177、1.219、1.393、1.467、1.580、1.651，相对保留时间在规定值的±8％；其中，3号峰为羟基-α-山椒素，4号峰为羟基-β-山椒素。
参照物峰的确定及特征峰归属：取大建中汤基准样品供试品、干姜阴性样品(与大建中汤基准样品的区别：缺少干姜，制法相同)、炒花椒阴性样品(与大建中汤基准样品的区别：缺少花椒，制法相同)、人参阴性样品(与大建中汤基准样品的区别：缺少人参，制法相同)、6-姜辣素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素对照品溶液，按照特征图谱检测方法检测，对应色谱图见图3-4。结果表明，6-姜辣素的色谱峰峰型、与相邻色谱峰分离效果均较好，且6-姜辣素稳定性优于山椒素成分，故选择6-姜辣素为参照峰；通过阴性样品分析，选定的8个特征峰中，1号峰、5号峰、6号峰专属于干姜，2号峰、3号峰、4号峰、7号峰、8号峰专属于炒花椒。
2特征图谱2的建立
取15批大建中汤基准样品按照实施例1制备供试品溶液，测定UPLC-ELSD特征图谱，对其进行分析，以人参皂苷Rb1(S3)为参照物，计算相对保留时间，结果见图5-6和下表。
表2 15批基准样品得到的特征图谱2中各特征峰相对保留时间
| 样品名称 | 峰3 | 峰4 | 峰6 | 峰7 | 峰8 |
| DJZT0901 | 0.680 | 0.928 | 1.030 | 1.128 | 1.254 |
| DJZT0902 | 0.680 | 0.928 | 1.030 | 1.129 | 1.254 |
| DJZT0903 | 0.680 | 0.927 | 1.030 | 1.128 | 1.254 |
| DJZT0904 | 0.678 | 0.928 | 1.030 | 1.129 | 1.250 |
| DJZT0905 | 0.679 | 0.928 | 1.030 | 1.129 | 1.251 |
| DJZT0906 | 0.680 | 0.928 | 1.030 | 1.128 | 1.253 |
| DJZT0907 | 0.680 | 0.928 | 1.031 | 1.129 | 1.255 |
| DJZT0908 | 0.679 | 0.928 | 1.030 | 1.129 | 1.251 |
| DJZT0909 | 0.679 | 0.927 | 1.030 | 1.129 | 1.252 |
| DJZT0910 | 0.679 | 0.927 | 1.033 | 1.129 | 1.252 |
| DJZT0911 | 0.681 | 0.929 | 1.030 | 1.128 | 1.256 |
| DJZT0912 | 0.680 | 0.928 | 1.030 | 1.128 | 1.255 |
| DJZT0913 | 0.679 | 0.927 | 1.030 | 1.129 | 1.252 |
| DJZT0914 | 0.679 | 0.927 | 1.031 | 1.129 | 1.252 |
| DJZT0915 | 0.679 | 0.927 | 1.030 | 1.129 | 1.252 |
| 平均值 | 0.680 | 0.928 | 1.030 | 1.129 | 1.253 |
| RSD | 0.11 | 0.07 | 0.08 | 0.04 | 0.14 |
对15批特征图谱2结果进行分析，以5号峰为参照物峰，3号峰、4号峰、6号峰、7号峰、8号峰的相对保留时间的规定值分别为：0.680、0.928、1.030、1.129、1.253；相对保留时间在规定值的±8％。通过与对照品比较可知，1号峰为人参皂苷Re，2号峰为人参皂苷Rg1，3号峰为人参皂苷Rf，4号峰为人参皂苷Ro，5号峰为Rb1，6号峰为人参皂苷Rc，7号峰为人参皂苷Rb2，8号峰为人参皂苷Rd。
参照物峰的选择及峰归属：取大建中汤基准样品供试品、干姜阴性样品、炒花椒阴性样品、人参阴性样品；人参皂苷Re、Rg1、Rg2、Rf、Ro、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd为对照品，按照特征图谱检测方法检测，对应色谱图见图7-9。结果表明，图谱中人参皂苷Rb1色谱峰峰型、与相邻色谱峰分离效果均较好，故选择人参皂苷Rb1峰作为参照峰进行特征峰相对保留时间计算；通过阴性样品分析，选定的8个特征峰专属于人参，均为人参皂苷成分。
实验例2UPLC-UV特征图谱1
1色谱条件的确定
1.1检测波长的选择
采用二极管阵列检测器对大建中汤样品进行光谱扫描，收集三维图谱，结果可知，供试品溶液在270-280nm波长处的色谱峰吸收较强。考虑姜酚的检出弱于山椒素类成分，选择姜酚的最大吸收280nm作为UV特征图谱的检测波长。
1.2色谱柱的选择
以色谱柱为变量，按照实施例1制备供试品溶液并测定，结果见图10；色谱柱1-3为：Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C18色谱柱，区别在于批号不同，批号分别为：S.N.USCFW16967、S.N.USCFW17959、S.N.USCFW19792；色谱柱4为CAPCELL CORE C18 A34RB01105；规格均为3.0×150mm，2.7μm。结果表明不同色谱柱检出效果基本一致，重现性好。
1.3流动相的选择
按照实施例1制备供试品溶液，以流动相为变量，流动相体系(A-B)1-4分别为甲醇-水、甲醇-0.05％甲酸溶液、甲醇-0.1％甲酸溶液和甲醇-0.1％冰醋酸溶液，采用下表梯度洗脱程序，按照实施例1测定，结果见图11。结果表明：流动相中加酸有助于检出人参皂苷Ro，因此，优选甲醇-0.1％甲酸为流动相。
表3梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-5 | 54 | 46 |
| 5-25 | 54→75 | 46→25 |
| 25-30 | 75→80 | 25→20 |
| 30-35 | 80 | 20 |
1.4柱温的选择
以柱温为变量，按照实施例1制备供试品溶液并测定，结果见图12。柱温分别为25℃、30℃、35℃。结果表明：柱温在25-35℃对色谱峰的分离效果无明显影响，柱温优选30℃。
1.5流速的选择
以流速为变量，按照实施例1制备供试品溶液并测定，结果见图13。流速分别为0.35ml/min、0.40ml/min、0.45ml/min。结果表明：流速在0.35-0.45ml/min时对色谱峰的分离效果无明显影响，基本一致，流速优选0.40ml/min。
根据上述内容确定UPLC-UV色谱条件最优方案为：以Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18(3.0×150mm 2.7μm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟0.40ml；柱温为30℃；检测波长为280nm。理论板数按6-姜辣素峰计应不低于10000。
表4梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～12 | 50 | 50 |
| 12～15 | 50→65 | 50→35 |
| 15～30 | 65→70 | 35→30 |
| 30～35 | 70→80 | 30→20 |
| 35～40 | 80 | 20 |
2 方法学验证
2.1 精密度实验
按照实施例1制备供试品溶液并连续进样6次，以1号峰6-姜辣素为参照物峰，计算各特征峰的相对保留时间和RSD值，2号峰～8号峰的RSD值依次为0.04％、0.03％、0.03％、0.03％、0.06％、0.07％和0.07％。结果表明仪器的精密度良好。
2.2稳定性实验
按照实施例1制备供试品溶液，分别在完成供试品溶液的0h、1.5h、4h、9h、15h、20h、36h测定，以6-姜辣素为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和RSD值，2号峰～8号峰的RSD值依次为0.05％、0.05％、0.08％、0.12％、0.15％、0.18％和0.21％。结果表明供试品溶液在36h内稳定性好。
2.3重复性实验
按照实施例1制备6份供试品溶液并测定，以6-姜辣素为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和RSD值，2号峰～8号峰的RSD值依次为0.05％、0.00％、0.03％、0.04％、0.03％、0.05％和0.03％。结果表明该方法的重复性良好，符合检测要求。
2.4空白实验和二倍保留时间的考察
按照实施例1制备供试品溶液，按照实施例1采集时间延长至80min测定图谱，同时按照实施例1分别测定空白溶剂70％甲醇和空白流动相的图谱，见图14。结果表明在40min后无明显色谱峰出现，空白溶剂70％甲醇和流动相无干扰。
实验例3UPLC-ELSD特征图谱2
1色谱条件的确定
超高效液相串联Alltech ELSD6000检测器，检测器设置漂移管温度95℃，载气流量2.5L/min，研究专属于人参皂苷的UPLC-ELSD特征图谱。
1.1色谱柱的选择
以色谱柱为变量，按照实施例1制备供试品溶液并测定，结果见图15；色谱柱1-3为：Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C18色谱柱，区别在于批号不同，批号分别为：S.N.USCFW16967、S.N.USCFW17959、S.N.USCFW19792；色谱柱4为CAPCELL CORE C18 A34RB01105；规格均为3.0×150mm，2.7μm。结果表明不同色谱柱检出效果基本一致，重现性好。
1.2流动相的选择
按照实施例1制备供试品溶液，采用下表洗脱程序，以流动相为变量，流动相体系(A-B)1-4分别为甲醇-水、甲醇-0.05％甲酸溶液、甲醇-0.1％甲酸溶液和甲醇-0.1％冰醋酸溶液，按照实施例1测定，结果见图16。结果表明：流动相加酸有助于人参皂苷Ro成分的检出，且甲酸的分离效果优于冰醋酸，因此，优选甲醇-0.1％甲酸为流动相。
表5洗脱程序表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 54 | 46 |
| 5～25 | 54→75 | 46→25 |
| 25～30 | 75→80 | 25→20 |
| 30～35 | 80 | 20 |
1.3柱温的选择
以柱温为变量，按照实施例1测定，结果见图17。柱温分别为25℃、30℃、35℃。结果表明：柱温在25-35℃对色谱峰的分离效果无明显影响，柱温优选30℃。
1.4流速的选择
以流速为变量，按照实施例1测定，结果见图18。流速分别为0.35ml/min、0.40ml/min、0.45ml/min。结果表明：流速在0.35-0.45ml/min对色谱峰的分离效果无明显影响，基本一致，流速优选0.40ml/min。
根据上述内容确定UPLC-ELSD色谱条件最优为：以Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18(3.0×150mm 2.7μm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟0.40ml；柱温为30℃；Alltech ELSD6000检测器，漂移管温度95℃，载气流量2.5L/min。理论板数按人参皂苷Rb1计应不低于10000。
表6梯度洗脱程序
2 方法学验证
2.1 精密度实验
按照实施例1制备供试品溶液，并连续进样6次，以5号峰人参皂苷Rb1为参照峰，计算3、4、6、7、8号峰的相对保留时间和RSD值，3号峰、4号峰、6号峰～8号峰的RSD值依次为0.08％、0.06％、0.00％、0.05和0.08％。结果表明仪器的精密度良好。
2.2稳定性实验
按照实施例1制备供试品溶液，分别在完成供试品溶液的0h、1.5h、4h、9h、15h、20h、36h测定，以人参皂苷Rb1为参照峰，计算3、4、6、7、8号峰的相对保留时间和RSD值，3号峰、4号峰、6号峰～8号峰的RSD值依次为0.18％、0.06％、0.04％、0.07％和0.29％。结果表明供试品溶液在36h内稳定性好。
2.3重复性实验
按照实施例1制备6份供试品溶液并测定，以人参皂苷Rb1为参照峰，计算3、4、6、7、8号峰的相对保留时间和RSD值，3号峰、4号峰、6号峰～8号峰的RSD值依次为0.06％、0.06％、0.00％、0.05％和0.06％，结果见下表。结果表明该方法的重复性良好，符合检测要求。
2.4空白实验和二倍保留时间的考察
按照实施例1制备供试品溶液并测定，分别按照实施例1测定空白溶剂70％甲醇、空白流动相和供试品溶液采集时间延长至80min的图谱，见图19。结果表明在40min后无明显色谱峰出现，且空白溶剂70％甲醇和流动相无干扰。
实施例2
本实施例提供了一种大建中汤基准样品中6-姜辣素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素含量的测定方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取大建中汤基准样品，摇匀，取约16g，称定重量，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置分液漏斗，加水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加70％甲醇适量使溶解，并转移至5ml量瓶，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。
精密吸取3μL供试品溶液，注入色谱仪，测定。其中，采用UPLC-UV-ELSD色谱法检测，超高效液相色谱仪配置紫外检测器并串联蒸发光散射检测器，分别采集UPLC-UV和UPLC-ELSD图谱，色谱条件包括：柱温为30℃，流速为0.4ml/min，色谱柱为：AgilentInfinityLab Poroshell 120EC-C18，规格：内径为3.0mm，柱长为150mm，粒径为2.7μm；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0-12min，50％流动相A，50％流动相B；12-15min，50％→65％流动相A，50％→35％流动相B；15-30min，65％→70％流动相A，35％→30％流动相B；30-35min，70％→80％流动相A，30％→20％流动相B；35-40min，80％流动相A，20％流动相B。紫外检测器的检测波长为280nm，理论板数以6-姜辣素峰计算应不低于10000。蒸发光散射检测器的载气流量2.5L/min，漂移管温度为95℃，理论板数以人参皂苷Rb1峰计算应不低于10000。
采用外标法计算6-姜辣素、羟基-α-山椒素(C16H25NO2)和羟基-β-山椒素(C16H25NO2)的含量。
供试品溶液制备的确定
提取方法的确定
大建中汤基准样品的预处理：称取大建中汤基准样品适量，加水稀释，稀释倍数约为2倍，摇匀，得到稀释液，备用。
方法1：精密量取上述稀释液10ml置已预处理的树脂柱(树脂型号分别：AB-8、HPD100、D101，玻璃柱内径1.5cm，树脂量10g)，先以水150ml洗脱并弃去，再加乙醇100ml洗脱，收集乙醇洗脱液，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml，摇匀，滤过，得到3份供试品溶液。
方法2：以萃取次数为变量制备供试品溶液，萃取次数为3、4、5、6次。精密量取上述稀释液10ml置分液漏斗，加水饱和正丁醇萃取，每次10ml，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml，摇匀，滤过，得到4份供试品溶液。
按照上述方法测定6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的含量，结果见下表，每组2个平行实验，mg/g表示每1g大建中汤基准样品中有效成分的含量。
表7不同方法制得的供试品溶液中有效成分的含量
在实验过程中，采用方法1，即大孔吸附树脂法上样后液体流速过慢，供试品溶液制备耗时长。考虑到效率、稳定性等因素，供试品溶液制备方法优选方法2，即采用萃取法，并且萃取次数为3-5次。稀释倍数和提取溶剂用量的确定
稀释液A：称取大建中汤基准样品80.4g，至250ml量瓶，加水至刻度，摇匀，备用，得到稀释倍数为4倍的稀释液。
稀释液B：称取大建中汤基准样品64.1g，至100ml量瓶，加水至刻度，摇匀，备用，得到稀释倍数为2倍的稀释液。
稀释液C：称取大建中汤基准样品40.2g，至250ml量瓶，加水至刻度，摇匀，备用，得到稀释倍数为8倍的稀释液。
实验1-1：精密量取稀释液A25ml，加水饱和正丁醇等体积萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液A和水饱和正丁醇体积比为1:1。
实验1-2：精密量取稀释液A25ml，加水饱和正丁醇50ml萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液A和水饱和正丁醇体积比为1:2。
实验2-1：精密量取稀释液B10ml，加水饱和正丁醇等体积萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液B和水饱和正丁醇体积比为1:1。
实验2-2：精密量取稀释液B10ml，加水饱和正丁醇20ml萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液B和水饱和正丁醇体积比为1:2。
实验3-1：精密量取稀释液C50ml，加水饱和正丁醇50ml萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液C和水饱和正丁醇体积比为1:1。
按照上述方法测定6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的含量见下表，每组2个平行实验，取平均值。
表8不同稀释倍数和提取溶剂用量得到的供试品溶液中有效成分的含量
上述结果表明：①稀释液与水饱和正丁醇体积1:1和1:2得到的有效成分的含量基本一致，稀释液与水饱和正丁醇体积比1:1萃取即可。②基准样品稀释2倍萃取4次得到的供试品中有效成分的含量略低于稀释4倍及8倍，而稀释4倍及8倍后萃取4次得到的供试品中有效成分的含量相近，基准样品萃取前加水稀释4倍即可。
综上所述，制备供试品溶液的最优方法：称取大建中汤基准样品16.0g(约12.5ml)，精密称定，置50ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml置分液漏斗，水饱和正丁醇等比例萃取4次，取正丁醇层，减压蒸干溶剂，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。
有效成分含量测定的色谱条件与系统适应性
1.1色谱柱的选择
以色谱柱为变量，按照实施例2制备供试品溶液并测定6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的含量，结果见下表；色谱柱1-3为：Agilent InfinityLab Poroshell120EC-C18色谱柱，区别在于批号不同，批号分别为：S.N.USCFW16967、S.N.USCFW17959和S.N.USCFW19792；色谱柱4为CAPCELL CORE C18 A34RB 01105；规格均为3.0×150mm，2.7μm。结果表明不同色谱柱的检出效果基本一致，重现性佳。
表9不同色谱柱的考察结果
| 色谱柱 | 6-姜辣素(mg/g) | 羟基-α-山椒素(mg/g) | 羟基-β-山椒素(mg/g) |
| 1 | 0.0852 | 0.1260 | 0.0154 |
| 2 | 0.0872 | 0.1285 | 0.0157 |
| 3 | 0.0838 | 0.1266 | 0.0155 |
| 4 | 0.0846 | 0.1268 | 0.0153 |
| RSD(％) | 1.70 | 0.84 | 1.10 |
1.2柱温的选择
以柱温为变量，按照实施例2制备供试品溶液并测定，结果见下表。柱温分别为25℃、30℃、35℃。结果表明：柱温在25-35℃对有效成分含量的测定无影响，本发明柱温优选30℃。
表10不同柱温的考察结果
| 柱温 | 6-姜辣素(mg/g) | 羟基-α-山椒素(mg/g) | 羟基-β-山椒素(mg/g) |
| 25 | 0.0850 | 0.1271 | 0.0157 |
| 30 | 0.0865 | 0.1290 | 0.0159 |
| 35 | 0.0850 | 0.1274 | 0.0157 |
| RSD(％) | 1.01 | 0.80 | 0.73 |
1.3流速的选择
以流速为变量，按照实施例2制备供试品溶液并测定，结果见下表。流速分别为0.35ml/min、0.40ml/min、0.45ml/min。结果表明：流速在0.35-0.45ml/min对指标成分含量的测定结果无影响，流速优选0.40ml/min。
表11不同流速的考察结果
综上所述，在测定6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的含量时，色谱条件优选为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C183.0×150mm 2.7μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.40ml；检测波长为280nm。理论板数按6-姜辣素峰计算应不低于10000。
表12梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～12 | 50 | 50 |
| 12～15 | 50→65 | 50→35 |
| 15～30 | 65→70 | 35→30 |
| 30～35 | 70→80 | 30→20 |
| 35～40 | 80 | 20 |
2 方法学验证
2.1 线性考察
(1)精密称取6-姜辣素对照品20.11mg(纯度99.9％)，置10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到对照品储备液，然后分别稀释至浓度为10.04、50.22、100.45、200.90、502.25、1004.49、2008.99μg/ml，得到系列标准品溶液，分别吸取上述标准品溶液各2μl，照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定，以峰面积值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，线性方程见下表。
(2)精密称取羟基-α-山椒素对照品11.95mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到对照品储备液，然后分别稀释至浓度为5.84、29.22、58.45、292.24、584.47、1168.95μg/ml，得到一系列标准品溶液，分别吸取2μL，照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定，以峰面积值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，线性方程见下表。
(3)精密称取羟基-β-山椒素对照品3.03mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液，然后分别稀释至浓度为0.59、2.97、5.94、29.69、59.39、118.78μg/ml，得到一系列标准品溶液，分别吸取2μL，照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定，以峰面积值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，线性方程见下表。
表13 6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的标准曲线及线性范围
| 对照品 | 标准曲线 | R2 | 线性范围(μg/ml) |
| 6-姜辣素 | Y＝3082.0454x-17933.8436 | 0.9999 | 10.04～2008.99 |
| 羟基-α-山椒素 | Y＝15918.5070x+133679.1909 | 0.9993 | 5.84～1168.95 |
| 羟基-β-山椒素 | Y＝30125.6027x+1865.2662 | 1.0000 | 0.59～118.78 |
结果表明：6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的标准曲线的线性关系良好。
2.2精密度实验
取大建中汤基准样品，精密称定，按照实施例2制备供试品溶液并测定，连续进样6次，记录峰面积，计算各个有效成分连续进样6次的RSD值，6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的RSD分别为1.10％、0.09％和0.14％。结果表明该方法的精密度良好。
2.3重复性实验
取大建中汤基准样品16g，精密称定，按照实施例2制备6份供试品溶液并测定有效成分的含量，计算6份供试品溶液中各有效成分的RSD值，6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的RSD分别为2.28％、2.44％和0.77％。结果表明该方法的重复性较好。
2.4稳定性实验
取大建中汤基准样品16g，精密称定，按照实施例2制备供试品溶液，并分别在制备完成后0h、1.5h、4h、9h、15h、20h、36h测定，记录峰面积，计算各有效成分在不同时间下峰面积间的RSD值，6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的RSD分别为1.27％、0.68％和0.91％。结果表明供试品溶液在36h内稳定性良好。
2.5准确度实验
取大建中汤基准样品约8.0g，至50ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，得到备用的大建中汤基准样品，重复制样6份，该备用的大建中汤基准样品(记为称量量)中6-姜辣素含量为0.0915mg/g、羟基-α-山椒素含量为0.1482mg/g、羟基-β-山椒素含量为0.0158mg/g。
按照指标成分浓度1:1加样：精密移取6-姜辣素对照品溶液(浓度为2.009mg/ml)180μL、羟基-α-山椒素对照品溶液(浓度为1.1689mg/ml)500μL、羟基-β-山椒素对照品溶液(浓度为0.1188mg/ml)500μL至磨口三角瓶，分别制备6份，快速减压蒸干溶剂后，分别精密加入上述备用的大建中汤基准样品溶液各25ml，超声助溶10min，全部转移到分液漏斗，按照实施例2制备供试品溶液并测定指标成分含量，计算回收率，结果如下。结果表明该方法符合定量分析的要求。表14中的加标量是在备用的大建中汤基准样品中加入的对照品溶液中有效成分的量；25ml样品量为25ml备用的大建中汤基准样品溶液中有效成分的含量；检测值按照实施例2制备供试品溶液中有效成分的检测含量。
表14准确度结果
2.6专属性实验
分别制备缺干姜的阴性样品1和缺炒花椒的阴性样品2，按照实施例2制备供试品溶液并测定，结果见图20。其中，阴性样品1和阴性样品2制备工艺同大建中汤基准样品，区别在于阴性样品1处方去掉干姜，阴性样品2处方去掉炒花椒。结果表明阴性样品对指标成分含量测定基本无干扰，该方法专属性好。
2.7耐用性实验
(1)流速：以流速为变量，流速分别为0.35ml/min、0.40ml/min、0.45ml/min，按照实施例2制备供试品溶液并测定指标成分含量，6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的RSD分别为1.53％、1.30％和1.27％，表明流速耐用性较好。
(2)柱温：以柱温为变量，柱温分别为25℃、30℃、35℃，按照实施例2制备供试品溶液并测定指标成分含量，6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的RSD分别为1.01％、0.80％和0.73％，表明柱温耐用性较好。
(3)色谱柱：以色谱柱为变量，色谱柱1-3分别为Agilent InfinityLab Poroshell120EC-C18色谱柱三个批号：S.N.USCFW16967、S.N.USCFW17959、S.N.USCFW19792；色谱柱4为CAPCELL CORE C18A34RB 01105。按照实施例2制备供试品溶液并测定指标成分含量，6-姜辣素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的RSD分别为1.70％、0.84％和1.10％，表明对同一规格的色谱柱耐用性较好。
实施例3
本实施例提供了一种大建中汤基准样品中人参皂苷Re、Rg1、Rb1含量的测定方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取大建中汤基准样品，摇匀，取约16g，称定重量，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置分液漏斗，加水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加70％甲醇适量使溶解，并转移至5ml量瓶，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。
精密吸取3μL供试品溶液，注入色谱仪，测定。其中，采用UPLC-UV-ELSD色谱法检测，超高效液相色谱仪配置紫外检测器并串联蒸发光散射检测器，分别采集UPLC-UV和UPLC-ELSD图谱；色谱条件包括：柱温为30℃，流速为0.4ml/min，色谱柱为：AgilentInfinityLab Poroshell 120EC-C18，规格：内径为3.0mm，柱长为150mm，粒径为2.7μm；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0-12min，50％流动相A，50％流动相B；12-15min，50％→65％流动相A，50％→35％流动相B；15-30min，65％→70％流动相A，35％→30％流动相B；30-35min，70％→80％流动相A，30％→20％流动相B；35-40min，80％流动相A，20％流动相B。紫外检测器的检测波长为280nm，理论板数以6-姜辣素峰计算应不低于10000。蒸发光散射检测器的载气流量2.5L/min，漂移管温度为95℃，理论板数以人参皂苷Rb1峰计算应不低于10000。
采用外标两点法对数方程计算人参皂苷Re、Rg1、Rb1的含量。
供试品溶液制备的确定
提取方法的确定
大建中汤基准样品的预处理：称取大建中汤基准样品适量，加水稀释，稀释倍数约为2倍，摇匀，得到稀释液，备用。
方法1：精密量取上述稀释液10ml置已预处理的树脂柱(树脂型号分别：AB-8、HPD100、D101，玻璃柱内径1.5cm，树脂量10g)，先以水150ml洗脱并弃去，再加乙醇100ml洗脱，收集乙醇洗脱液，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml，摇匀，滤过，得到3份供试品溶液。
方法2：以萃取次数为变量制备供试品溶液，萃取次数为3、4、5、6次。精密量取上述稀释液10ml置分液漏斗，加水饱和正丁醇萃取，每次10ml，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml，摇匀，滤过，得到4份供试品溶液。
按照上述方法测定人参皂苷Re、Rg1、Rb1的含量，结果见下表，每组2个平行实验。
表15不同方法制得的供试品溶液中有效成分的含量
在实验中，采用方法1制备供试品溶液耗时长，这两种方法对于皂苷类成分测得的含量的差异不明显，考虑到简化步骤等因素，优选萃取次数为3-5。
稀释倍数和提取溶剂用量的确定
稀释液A：称取大建中汤基准样品80.4g，至250ml量瓶，加水至刻度，摇匀，备用，得到稀释倍数为4倍的稀释液。
稀释液B：称取大建中汤基准样品64.1g，至100ml量瓶，加水至刻度，摇匀，备用，得到稀释倍数为2倍的稀释液。
稀释液C：称取大建中汤基准样品40.2g，至250ml量瓶，加水至刻度，摇匀，备用，得到稀释倍数为8倍的稀释液。
实验1-1：精密量取稀释液A25ml，加水饱和正丁醇等体积萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液A和水饱和正丁醇体积比为1:1。
实验1-2：精密量取稀释液A25ml，加水饱和正丁醇50ml萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液A和水饱和正丁醇体积比为1:2。
实验2-1：精密量取稀释液B10ml，加水饱和正丁醇等体积萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液B和水饱和正丁醇体积比为1:1。
实验2-2：精密量取稀释液B10ml，加水饱和正丁醇20ml萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液B和水饱和正丁醇体积比为1:2。
实验3-1：精密量取稀释液C50ml，加水饱和正丁醇50ml萃取4次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣加70％甲醇溶解并定容为5ml；其中，稀释液C和水饱和正丁醇体积比为1:1。
按照上述方法测定人参皂苷Re、Rg1、Rb1的含量见下表，每组2个平行实验，取平均值。
表16不同稀释倍数和提取溶剂用量得到的供试品中有效成分的含量
上述结果表明正丁醇萃取用量和稀释倍数对皂苷成分含量影响不大。
有效成分含量测定的色谱条件与系统适应性
1.1色谱柱的选择
选择规格均为3.0×150mm，2.7μm的色谱柱1-4，色谱柱1-3为AgilentInfinityLab Poroshell 120EC-C18色谱柱，区别在于批号不同，批号分别为：S.N.USCFW16967、S.N.USCFW17959、S.N.USCFW19792；色谱柱4为CAPCELL CORE C18 A34RB01105。结果表明不同色谱柱的检出效果基本一致，重现性佳。
表17不同色谱柱的考察结果
1.2柱温的选择
以柱温为变量，按照实施例3制备供试品溶液并测定，结果见下表。柱温分别为25℃、30℃、35℃。结果表明：柱温在25-35℃对有效成分含量的测定无影响，本发明柱温优选30℃。
表18不同柱温考察结果
1.3流速的选择
以流速为变量，按照实施例3制备供试品溶液并测定，结果见下表。流速分别为0.35ml/min、0.40ml/min、0.45ml/min。结果表明：流速在0.35-0.45ml/min对指标成分含量的测定结果无影响，流速优选0.40ml/min。
表19不同流速的考察结果
综上所述，在测定人参皂苷Re、Rg1、Rb1时，色谱条件优选为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C18 3.0×150mm 2.7μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.40ml；Alltech ELSD6000检测器，漂移管温度95℃，载气流量2.5L/min。理论板数按人参皂苷Rb1峰应不低于10000。
表20梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～12 | 50 | 50 |
| 12～15 | 50→65 | 50→35 |
| 15～30 | 65→70 | 35→30 |
| 30～35 | 70→80 | 30→20 |
| 35～40 | 80 | 20 |
2 方法学验证
2.1 线性考察
(1)对照品储备液配置：精密称取人参皂苷Re对照品10.78mg(纯度96.0％)，置10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到人参皂苷Re对照品储备液；精密称取人参皂苷Rg1对照品10.79mg(纯度98.50％)，置10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到人参皂苷Rg1对照品储备液；精密称取人参皂苷Rb1对照品11.20mg(纯度94.3％)，置10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到人参皂苷Rb1对照品储备液。
(2)混合对照品溶液配置：分别精密量取人参皂苷Re、Rg1、Rb1对照品储备液各2ml置同一10ml量瓶中，加水稀释至刻度，混合均匀，即得混合对照品溶液1；再精密量取1ml混合对照品溶液1至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，混合均匀，即得混合对照品溶液2。
(3)测定法：分别精密吸取5μl混合对照品稀释液2和1、2、4、6、8、10μl混合对照品稀释液1，照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定，以峰面积对数值(Ln峰面积)为纵坐标Y，进样量(μg)对数(Ln进样量)为横坐标x，绘制标准曲线。
表21不同对照品溶液中人参皂苷的含量、峰面积等结果
表22人参皂苷Re、Rg1、Rb1的标准曲线及线性范围
| 对照品 | 标准曲线 | R2 | 线性范围(μg) |
| 人参皂苷Re | Y＝1.7856x+1.7437 | 0.9998 | 103.50～2070.00 |
| 人参皂苷Rg1 | Y＝1.8077x+1.6121 | 0.9995 | 106.30～2126.00 |
| 人参皂苷Rb1 | Y＝1.8438x+1.3603 | 0.9990 | 105.60～2112.00 |
结果表明：人参皂苷Re、Rg1、Rb1的标准曲线的线性关系良好。
2.2精密度实验
取大建中汤基准样品16g，精密称定，按照实施例3制备供试品溶液，连续进样测定6次，记录峰面积，计算有效成分的RSD值，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的RSD值依次为0.92％、2.58％和0.89％，表明该方法的精密度良好。
2.3重复性实验
取大建中汤基准样品16g，精密称定，共六份，按照实施例3制备供试品溶液，测定峰面积，并计算有效成分的RSD值，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的RSD值分别为0.83％、1.12％和0.96％，表明该方法的重复性良好。
2.4稳定性实验
取大建中汤基准样品16g，精密称定，按照实施例3制备供试品溶液，并分别在制备完成后的0h、1.5h、4h、9h、15h、20h、36h测定有效成分的含量，记录峰面积，并计算有效成分的RSD值，人参皂苷Re、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的RSD值分别为1.73％、4.06％和1.64％。结果表明，供试品溶液在36小时内稳定。
2.5准确度实验
取大建中汤基准样品约8g，至50ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，得到备用的大建中汤基准样品，重复制样6份，该备用的大建中汤基准样品(记为称量量)中人参皂苷Re含量为0.0835mg/g、人参皂苷Rg1含量为0.0606mg/g、人参皂苷Rb1含量为0.0976mg/g。
按照指标成分1:1浓度加样，精密移取人参皂苷Re对照品(浓度为1.03488mg/ml)300μl、人参皂苷Rg1对照品(浓度为1.062815mg/ml)230μl、人参皂苷Rb1对照品(浓度为1.0562mg/ml)370μl至磨口三角瓶，分别制备6份，快速减压蒸干溶剂后，分别精密加入到上述备用的大建中汤基准样品溶液中各25ml，超声助溶10min，全部转移至分液漏斗中，按照实施例3制备供试品溶液并测定指标成分含量，计算回收率，结果如下。结果表明方法符合定量分析的要求。表中加标量为对照品溶液中有效成分的含量；25ml样品量为25ml备用的大建中汤基准样品中有效成分的含量；检测值为按照实施例3制备供试品溶液后指标成分的检测含量。
表23人参皂苷准确度结果
2.6专属性实验
制备缺人参的阴性样品，按照实施例3对阴性样品进行分析，结果表明各成分均能分离，阴性样品无干扰，方法专属性好。
2.7耐用性实验
(1)流速：以流速为变量，流速分别为0.35ml/min、0.40ml/min、0.45ml/min，按照实施例3制备供试品溶液并测定指标成分含量，人参皂苷Re、Rg1和人参皂苷Rb1的RSD分别为1.87％、1.26％、1.22％。
(2)柱温：以柱温为变量，柱温分别为25℃、30℃、35℃，按照实施例3制备供试品溶液并测定指标成分含量，人参皂苷Re、Rg1和人参皂苷Rb1的RSD分别为0.47％、1.66％、2.87％。
(3)色谱柱：以色谱柱为变量，色谱柱1-3分别为Agilent InfinityLab Poroshell120EC-C18色谱柱，三个批号：S.N.USCFW16967、S.N.USCFW17959、S.N.USCFW19792；色谱柱4为CAPCELL CORE C18A34RB 01105色谱柱。按照实施例3制备供试品溶液并测定指标成分含量，人参皂苷Re、Rg1和人参皂苷Rb1的RSD分别为3.23％、1.35％、0.34％。
实施例4
本实施例提供了15批大建中汤基准样品中有效成分含量的测定方法，按照实施例2和实施例3测定15批次大建中汤中有效成分的含量，结果如下：
表24 15批次大建中汤基准样品中有效成分的含量
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种大建中汤特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：将供试品制成供试品溶液；
采用UPLC-UV-ELSD色谱法检测，其中，UPLC-UV-ELSD色谱法的色谱条件包括：以甲醇为流动相A，以甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0-12min，50％流动相A，50％流动相B；12-15min，50％→65％流动相A，50％→35％流动相B；15-30min，65％→70％流动相A，35％→30％流动相B；30-35min，70％→80％流动相A，30％→20％流动相B；35-40min，80％流动相A，20％流动相B。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，UPLC-UV-ELSD色谱法的色谱条件还包括：
检测器：超高效液相色谱仪配置紫外检测器并串联蒸发光散射检测器；和/或，
紫外检测器的检测波长为270nm～290nm；和/或，
蒸发光散射检测器的载气流量2.3～2.8L/min；和/或，
漂移管温度为90～100℃；和/或，
超高效液相色谱仪的柱温为25～35℃；和/或，
流速为0.35～0.45ml/min；和/或，
色谱柱为：Agilent Infinity Lab Poroshell 120EC-C18，规格：内径为3.0mm，柱长为150mm，粒径为2.7μm；和/或，
以0.05～0.1％甲酸水溶液作为流动相B；和/或，
取样量为2～4μL。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，UPLC-UV-ELSD色谱法的色谱条件：以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B；柱温为30℃，流速为0.4ml/min，取样量为3μL；紫外检测器的检测波长为280nm，理论板数以6-姜辣素峰计算应不低于10000；蒸发光散射检测器的载气流量2.5L/min，漂移管温度为95℃，理论板数以人参皂苷Rb1峰计算应不低于10000。
4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法得到特征图谱1和/或特征图谱2；
所述特征图谱1具有8个特征峰，以1号峰为参照物峰，2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰和8号峰的相对保留时间的规定值分别为：1.138、1.177、1.219、1.393、1.467、1.580、1.651；相对保留时间在规定值的±8％；
所述特征图谱2具有8个特征峰，以5号峰为参照物峰，3号峰、4号峰、6号峰、7号峰和8号峰的相对保留时间的规定值分别为：0.680、0.928、1.030、1.129、1.253；相对保留时间在规定值的±8％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述特征图谱1中，1号峰为6-姜辣素；
优选地，所述特征图谱2中1号峰为人参皂苷Re，2号峰为人参皂苷Rg1，5号峰为人参皂苷Rb1。
6.根据权利要求1-5任一项所述的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品，稀释，加提取溶剂，提取，得到供试品溶液；
优选地，所述提取溶剂为水饱和的正丁醇；
优选地，所述提取的次数为3-5次；
优选地，所述稀释的倍数为2-4倍。
7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述供试品为大建中汤汤剂或煎膏剂。
8.根据权利要求1-7任一项所述的构建方法，其特征在于，还包括制备对照品溶液的步骤；
优选地，以6-姜辣素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1中的至少一种作为对照品；
优选地，每1ml对照品溶液中含0.15～0.25mg 6-姜辣素、0.25～0.35mg羟基-α-山椒素、0.025～0.035mg羟基-β-山椒素、0.15～0.25mg人参皂苷Rg1、0.15～0.25mg人参皂苷Re和0.15～0.25mg人参皂苷Rb1的对照品。
9.一种测定大建中汤中有效成分含量的测定方法，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的构建方法，采用外标法测定有效成分含量。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述有效成分包括6-姜辣素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1中的至少一种。
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