CN110389177A - 一种药物组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的之一是提供一种药物组合物的检测方法，采用高效液相色谱分离，以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，乙腈和水为流动相，进行梯度洗脱；其中，所述药物组合物中含有刺五加提取物和淫羊藿提取物。本发明的药物组合物检测方法基线平稳、分离效果好、检测效率高，具有快速、准确、灵敏等优点。

Description

一种药物组合物的检测方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种药物组合物的检测方法。

背景技术

中药刺五加为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)灌木植物刺五加(Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms.)的根、根茎和茎，其药用历史悠久，应用广泛，具有益气健脾、补肾安神的功能，用于脾肾阳虚、体虚乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多梦等。刺五加中含有多种化学成分，如木脂素类、三萜类及三萜皂苷类、香豆素类、有机酸类、黄酮类及黄酮苷类等[刺五加化学成分及药理作用研究进展，中医药学报，2011年第39卷第3期]。

中药淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicomum Maxim.)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescensMaxim.)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T.S.Ying)、或朝鲜淫羊藿(Epimediumkoreanum Nakai)的干燥地上部分，具有补肾壮阳、祛风除湿的功效，用于治疗阳痿不举、小便淋沥、筋骨挛急、半身不遂、腰膝无力、风湿痹痛、四肢不仁等症。淫羊藿中含有多种化学成分，其茎、叶含淫羊藿苷，叶尚含挥发油、蜡醇、三十一烷、植物甾醇、鞣质、油脂、亚油酸等[淫羊藿有效成分的药理作用与临床应用研究进展，中外医疗，2007第19期]。

CN105311083A中公开了一种由淫羊藿、刺五加等药材组成的药物组合物，可用于治疗老年痴呆，具有组方精简、疗效确切等优点，具有极大的临床应用价值。但目前尚未公开能同时对刺五加、淫羊藿中有效成分进行精确定性和定量的检测方法。因此，开发一种快速、简便、准确、分离度高、重复性好的检测方法用于药物组合物的质量控制是十分必要的。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种药物组合的检测方法，其包括以下技术方案：

一种药物组合物的检测方法，采用高效液相色谱分离，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，乙腈和水为流动相，采用梯度洗脱；其中，所述药物组合物中活性成分由含有刺五加和淫羊藿的原料药制备而成。

本发明所述药物组合物的检测方法中，梯度洗脱条件为：

本发明所述药物组合物的检测方法的色谱条件中，检测波长为270nm；柱温在20-35℃范围内均可实现较好的分离效果，优选为30℃。

本发明药物组合物的检测方法中，供试品溶液的制备方法为：取药物组合物适量，加入甲醇后超声提取，过滤，即得。

本发明检测方法中，药物组合物中活性成分优选由含有淫羊藿、刺五加和茯苓的原料药制备而成。

本发明进一步提供一种药物组合物的检测方法，包含以下步骤：

1)供试品溶液制备：取药物组合物适量，加入甲醇，超声，过滤即得；

2)色谱分离：采用高效液相色谱分离，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，乙腈和水作为流动相，检测波长为270nm，柱温30℃，梯度洗脱条件如下：

；

其中所述药物组合物中活性成分由含有刺五加和淫羊藿的原料药制备而成，优选所述药物组合物中活性成分由含有淫羊藿、刺五加和茯苓的原料药制备而成。

本发明人在实验研究中发现，淫羊藿和刺五加中化学成分复杂，对目标成分如紫丁香苷、淫羊藿苷等存在较大的干扰，现有技术公开的检测方法均不适用于本发明中药物组合物的分离检测，部分实验结果如下：

实验方法

供试品溶液的制备：取实施例一中制备得到的药物组合物约0.1g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml，超声10min，功率350W，频率40KHz，放冷，甲醇定容，过滤，即得。

对照品溶液的制备：取紫丁香苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含8ug紫丁香苷、8ug朝藿定A、20ug朝藿定B、40ug朝藿定C、80ug淫羊藿苷，超声溶解，过滤，即得。

使用岛津LC-2010C/A型高效液相色谱仪进行分离，色谱条件：Kromasil EternityXT 5-C18(4.6*250mm，5um)色谱柱，柱温：30℃，流速：1ml/min，进样量：5μL，流动相：乙腈-水，检测波长：270nm，采用不同梯度洗脱条件进行分离检测，具体如下：

梯度一

检测结果：紫丁香苷峰(峰1)不能与杂峰(峰a)基线分离；淫羊藿苷(峰5)与前面小峰(峰b)形成肩峰，无法分离(见图1)。

梯度二

检测结果：紫丁香苷峰(峰1)不能与杂峰(峰c)基线分离；淫羊藿苷峰(峰5)与后面小峰(峰d)形成肩峰，无法分离(见图2)。

梯度三

结果：该色谱条件下，样品色谱图中，在紫丁香苷的出峰位置出现一个峰面积明显大于紫丁香苷实际峰面积的色谱峰，推测应该是紫丁香苷与邻近的一个较大的杂峰重叠产生的色谱峰(峰1’)，且该色谱峰与另一杂峰(峰e)未实现基线分离；淫羊藿苷峰(峰5)虽能与前面小峰(峰f)有一定分离，但分离度只有1.28(见图3)，不满足分离要求(分离度不低于1.5)。

梯度四

结果：该色谱条件下，样品色谱图中，在紫丁香苷的出峰位置出现一个峰面积明显大于紫丁香苷实际峰面积的色谱峰，推测应该是紫丁香苷与邻近的一个较大的杂峰重叠产生的色谱峰(峰1’)，且该色谱峰与另一杂峰(峰g)未实现基线分离；淫羊藿苷峰(峰5)虽能与前面小峰(峰h)有一定分离，但分离度只有1.28(见图4)，不满足分离要求(分离度不低于1.5)。

梯度五

结果：该色谱条件下，样品色谱图中，在紫丁香苷的出峰位置出现一个峰面积明显大于紫丁香苷实际峰面积的色谱峰，推测应该是紫丁香苷与邻近的一个较大的杂峰重叠产生的色谱峰(峰1’)，且该色谱峰与另一杂峰(峰i)未实现基线分离；且色谱图中未见朝藿定C(峰4)与淫羊藿苷(峰5)之间的小杂峰，推测其应该是被朝藿定C或淫羊藿苷色谱峰包裹(见图5；可见，该方法分离效果较差，不能满足定性及定量需求。

梯度六

结果：紫丁香苷(峰1)与前面峰(峰j)形成肩峰；朝藿定B(峰3)、C(峰4)分离度小于1.5，朝藿定C与后面杂峰(峰k)分离度小于1.5，均不达标，且基线不平稳，不利于准确定量(图6)。

梯度七

结果：紫丁香苷峰(峰1)不能与前面杂峰(峰m)基线分离；且色谱图中未见朝藿定C(峰4)与淫羊藿苷峰(峰5)之间的小杂峰，推测其应该是被朝藿定C或淫羊藿苷色谱峰包裹；可见，该方法分离效果较差，不能满足定性及定量需求(见图7)。

梯度八

结果：紫丁香苷(峰1)与前面杂质峰(峰n)无法基线分离；此方法中淫羊藿苷(峰5)与前面小杂峰(峰q)分离度大于1.5，但朝藿定C与杂峰(峰p)分离度只有1.31，不达标(见图8)。

梯度九

结果：紫丁香苷(峰1)与前面杂质峰(峰r)无法基线分离；在梯度洗脱时间内，未见淫羊藿中各指标峰出峰(见图9)，本发明人在该梯度程序结束后增加了洗脱时间，至约45min时，将淫羊藿指标成分洗脱出来，但四个指标成分均未达到分离要求，可见该方法不适用于本发明药物组合物的分离检测。。

梯度十

结果：紫丁香苷(峰1)与前面小峰(峰s)分离度为1.37，整体且色谱图中未见朝藿定C(峰4)与淫羊藿苷峰(峰5)之间的小杂峰，推测其应该是被朝藿定C或淫羊藿苷色谱峰包裹；可见，该方法分离效果较差，不能满足定性及定量需求(见图10)。

本发明人经过大量的试验研究发现，现有技术公开的检测条件应用于本发明所述的药物组合物时，存在分离不达标、基线不平稳、包峰、出峰时间长等问题，不能用于本发明所述药物组合物中活性成分的定性和定量。

本发明的药物组合物检测方法与现有技术相比，基线平稳、分离效果好、检测效率高，具有快速、准确、灵敏等优点。

附图说明

图1梯度一条件下标准品与样品色谱图

图2梯度二条件下标准品与样品色谱图

图3梯度三条件下标准品与样品色谱图

图4梯度四条件下标准品与样品色谱图

图5梯度五条件下标准品与样品色谱图

图6梯度六条件下标准品与样品色谱图

图7梯度七条件下标准品与样品色谱图

图8梯度八条件下标准品与样品色谱图

图9梯度九条件下标准品与样品色谱图

图10梯度十条件下标准品与样品色谱图

图11实施例二中标准品与样品色谱图

图12实施例四中标准品与样品色谱图

图13实施例五中标准品与样品色谱图

其中：A代表标准品色谱曲线，B代表样品色谱曲线，1代表紫丁香苷色谱峰，2代表朝藿定A色谱峰，3代表朝藿定B色谱峰，4代表朝藿定C色谱峰，5代表淫羊藿苷色谱峰，1’代表紫丁香苷与杂峰重叠后的色谱峰，a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、m、n、p、q、r、s均代表杂质干扰峰。

具体实施方式

本发明中所用实验材料如下：

乙腈(色谱纯，4L/瓶，lot:L8C0P128，北京百灵威科技有限公司)；

甲醇(分析纯，500ml/瓶，批号2016110201，成都市科龙化工试剂厂)；

刺五加(购自四川双成医药有限责任公司，批号161001)

茯苓(购自四川双成医药有限责任公司，批号161001)

淫羊藿(购自安国市金康迪中药饮片有限公司，批号160801)

刺五加浸膏粉(购自陕西森弗天然制品有限公司，批号170801)

淫羊藿浸膏粉(购自陕西森弗天然制品有限公司，批号170901)

紫丁香苷(20mg/支，批号120991-201109，中国食品药品检定研究院，纯度94.9％)；

淫羊藿苷(20mg/支，批号11037-201516，中国食品药品检定研究院，纯度94.2％)；

朝藿定A(20mg/支，批号PCL-#EP095，PCL公司，纯度99.81％)；

朝藿定B(20mg/支，批号PCL-#EP096，PCL公司，纯度99.48％)；

朝藿定C(20mg/支，批号11780-201503，中国食品药品检定研究院，纯度95.6％)；

Sartorius MS204S型万分之一电子天平；Sartorius BP211D型十万分之一电子天平；JA31002型百分之一电子天平(厂家：上海精密科学仪器有限公司)；KQ500VDE型超声仪(厂家：昆山市超声仪器有限公司)；岛津LC-2010C/A型高效液相色谱仪；KromasilEternity XT-5-C18(250*4.6mm，5um)色谱柱(厂家：瑞典Kromasil公司)。KJO-4282型C184*3mm预柱(厂家：费罗门)；TST101A-2B型干燥箱(厂家：成都特思特仪器有限公司)。

实施例一 药物组合物的制备

取淫羊藿加入13倍体积量的50％乙醇回流提取1小时，提取液过滤，药材残渣加11倍体积量50％乙醇回流提取1小时，提取液滤过，合并两次滤液，浓缩至相对密度约1.10-1.20(60℃-80℃)的浸膏；刺五加、茯苓加8倍体积量水煎煮1小时，煎液滤过，药材残渣加6倍体积量水煎煮6小时，煎液滤过，合并两次煎液，浓缩至相对密度约1.10-1.20(60℃-80℃)的浸膏；将刺五加、茯苓混合浸膏合并淫羊藿浸膏，干燥，即得药物组合物。

实施例二 药物组合物的分离检测

供试品溶液的制备：取实施例一中制备得到的药物组合物约0.2g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml，超声10min，功率350W，频率40KHz，放冷，甲醇定容，过滤，即得。

对照品溶液的制备：取紫丁香苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含8μg紫丁香苷、8μg朝藿定A、20μg朝藿定B、40μg朝藿定C、80μg淫羊藿苷，超声溶解，过滤，即得。

取供试品溶液和样品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按如下色谱条件进行分析检测：Kromasil Eternity XT 5-C18(4.6*250mm，5um)色谱柱，柱温：30℃，流速：1ml/min，进样量：5μL，流动相：乙腈-水，检测波长：270nm，洗脱梯度条件为：

结果：紫丁香苷峰周边无杂峰干扰，5个目标峰分离度均大于1.5，基线平稳，能满足准确定性和定量的要求，且所有目标峰在30min左右全部出峰，耗时较短，检测效率较高，适合于产业推广应用(见图11)。

实施例三 药物组合物的制备

取淫羊藿药材加入13倍体积量的50％乙醇回流提取1小时，提取液过滤，药材残渣加11倍体积量50％乙醇回流提取1小时，提取液滤过，合并两次滤液，浓缩至相对密度约1.10-1.20(60℃-80℃)的浸膏；取刺五加药材加8倍体积量水煎煮1小时，煎液滤过，药材残渣加6倍体积量水煎煮6小时，煎液滤过，合并两次煎液，浓缩至相对密度约1.10-1.20(60℃-80℃)的浸膏；将刺五加浸膏和淫羊藿浸膏合并，干燥，即得药物组合物。

实施例四 药物组合物的分离检测

供试品溶液的制备：取实施例三中制备得到的药物组合物约0.2g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml，超声10min，功率350W，频率40KHz，放冷，甲醇定容，过滤，即得。

对照品溶液的制备：取紫丁香苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含150μg紫丁香苷、200μg朝藿定A、200μg朝藿定B、250μg朝藿定C、100μg淫羊藿苷，超声溶解，过滤，即得。

取供试品溶液和样品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按如下色谱条件进行分析检测：Kromasil Eternity XT 5-C18(4.6*250mm，5um)色谱柱，柱温：30℃，流速：1ml/min，进样量：5μL，流动相：乙腈-水，检测波长：270nm，洗脱梯度条件为：

结果：紫丁香苷峰周边无杂峰干扰，5个目标峰分离度均大于1.5，基线平稳，能满足准确定性和定量的要求，且所有目标峰在30min左右全部出峰，耗时较短，检测效率较高，适合于产业推广应用(见图12)。

实施例五 药物组合物的分离检测

供试品溶液的制备：取市售淫羊藿浸膏粉和刺五加浸膏粉，混合，精密称取混合后的浸膏粉约0.2g，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml，超声10min，功率350W，频率40KHz，放冷，甲醇定容，过滤，即得。

对照品溶液的制备：取紫丁香苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含8μg紫丁香苷、8μg朝藿定A、20μg朝藿定B、40μg朝藿定C、80μg淫羊藿苷，超声溶解，过滤，即得。

取供试品溶液和样品溶液，分别注入高效液相色谱仪(岛津LC-2010C/A型)，按如下色谱条件进行分析检测：Kromasil Eternity XT 5-C18(4.6*250mm，5um)色谱柱，柱温：30℃，流速：1ml/min，进样量：5μL，流动相：乙腈-水，检测波长：270nm，洗脱梯度条件为：

结果：紫丁香苷峰周边无杂峰干扰，5个目标峰分离度均大于1.5，基线平稳，能满足准确定性和定量的要求，且所有目标峰在30min左右全部出峰，耗时较短，检测效率较高，适合于产业推广应用(见图13)。

实施例六 准确度试验

精密称取实施例一制备的药物组合物0.1g，按照表1中加样浓度水平进行加样，参照实施例二的方法制备供试品溶液，每个加样水平平行制备3组，随后参照实施例二的色谱检测条件进样检测，记录峰面积，计算加样回收率。结果如下表1：

表1准确度试验结果

根据上表结果可知，本发明的药物组合物检测方法准确度高，可用于药物组合物中多种指标成分的准确定性及定量。

实施例七 重复性试验

精密称取实施例一制备的药物组合物0.2g，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml，超声10min，功率350W，频率40KHz，放冷，甲醇定容，过滤，即得。平行制备6组供试品溶液，参照实施例二的色谱条件进行检测，计算各指标成分含量RSD，结果如下表2：

表2重复性试验结果

根据表中结果可知，本发明的药物组合物检测方法重现性(RSD值显著低于中国药典的标准，即不超过2％)良好，适于产业推广应用。

Claims (9)

1.一种药物组合物的检测方法，采用高效液相色谱分离，其特征在于所述检测方法的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，乙腈和水为流动相，采用梯度洗脱；其中，所述药物组合物中活性成分由含有刺五加和淫羊藿的原料药制备而成。

2.根据权利要求1所述的药物组合物的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱条件为：

3.根据权利要求1所述的药物组合物的检测方法，其特征在于所述色谱条件中检测波长为270nm。

4.根据权利要求1所述的药物组合物的检测方法，其特征在于所述色谱条件中柱温为20-35℃。

5.根据权利要求4所述的药物组合物的检测方法，其特征在于所述色谱条件中柱温为30℃。

6.根据权利要求1所述的药物组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法中供试品溶液的制备方法为：取药物组合物适量，加入甲醇后超声提取，过滤，即得。

7.根据权利要求1所述的药物组合物的检测方法，其特征在于，所述药物组合物中活性成分由含有淫羊藿、刺五加和茯苓的原料药制备而成。

8.一种药物组合物的检测方法，包含以下步骤：

1)供试品溶液制备：取药物组合物适量，加入甲醇，超声，过滤即得；

2)色谱分离：采用高效液相色谱分离，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，乙腈和水作为流动相进行梯度洗脱，检测波长为270nm，柱温30℃，梯度洗脱条件如下：

；

其中所述药物组合物中活性成分由含有刺五加和淫羊藿的原料药制备而成。

9.根据权利要求8所述的药物组合物的检测方法，其特征在于所述药物组合物中活性成分由含有淫羊藿、刺五加和茯苓的原料药制备而成。