CN115472236A - 一种利用“印迹模板”成分簇动力学与热力学平衡原理确定、表征与评价药效物质的方法 - Google Patents

一种利用“印迹模板”成分簇动力学与热力学平衡原理确定、表征与评价药效物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用中药“印迹模板”成分簇印迹动力学与热力学平衡原理确定、表征和评价药效物质的方法，属于中医药、分析化学和药理学及超分子化学结合的交叉技术领域；本发明在“印迹模板”成分簇的指纹图谱“物质单元”划分方法基础上，再建立“物质单元”‑色谱行为‑效应三者间的量‑量、量‑效、构‑构、构‑效、构‑印、印‑效、构‑印‑效等的数学模型与参数测算体系，从而获得其活度、效应、作用系数及其作用方向、强度、表观化学势，经排序确定最宜“物质单元”、药效强弱、色谱学表征方法，阐明中药作用的物质基础、机理、表征及评价方法，破解中医药现代化的国际性难题，潜在庞大市场价值。

Description

一种利用“印迹模板”成分簇动力学与热力学平衡原理确定、 表征与评价药效物质的方法
技术领域
本发明属于中医药、分析化学和药理学及超分子化学结合的交叉技术领域，尤其涉及一种利用中药“印迹模板”成分簇印迹动力学与热力学平衡原理确定、表征与评价药效物质及作用规律的方法。
背景技术
中药及其制剂通过成分群、多靶点、多层次，按超分子“印迹模板”作用于机体生物网络产生“气析”作用而发挥其整体药性、药效和毒效，呈方证关联。因此怎样揭示中医药方证关联的物质运行规律是阐明中医药原创性理论，实现中医药现代化关键核心问题，为3个重大前沿科学问题的重中之重问题，目前国内外尚无人破解，严重制约中医药现代化进程，严重制约中医药学科的发展，为公认的国际性难题。
中药作用于人体产生药效分为给药前的原成分群与固定时间点的静态药效学和给药后机体代谢所产生的动态药效学两部分。如用指纹图谱表达中药成分簇，前者为谱效学或网络药理学问题，后者为谱效动力学或网络药效动力学问题。其本质是中药多成分簇与多效应指标的量-时-效关系问题，其中中药多成分的药效物质基础，亦量-效、构-效、印-效关系问题为根本性的“卡脑子”理论问题，目前的研究现状如下：
1.单成分药物量-效、构-效、印-效关系的研究方法成熟、简单明了，但解决不了中药多成分复杂的量-效关系问题：单成分的量-效关系研究属定量药理学研究内容，多采用Hill量效曲线进行研究，体外原成分的剂量与效应的Hill参数可采用Lineweaver-Burk、Scott比值法、Scatchard法、Hill对数法及加权回归法等进行确定。体内成分采用药效动力学/药物动力学数学模型(亦PK/PD模型)进行研究。其研究方法为大家所熟悉，其中PK模型主要有房室乳突模型、非线性动力学模型、统计矩数学模型等。再将中央室当作输入室，靶受体当作处置室建立效应体室的药物浓度动力学曲线，再结合Hill量效等曲线建立PD数学模型。计算时，可先对浓度-时间数据进行模型拟合，求出药物动力学参数，再将效应-时效数据进行模型拟合，推算出药效动力学参数Emax、EC50、K1e和Ke0。这样根据Emax的大小就能确定成分有效性强弱。单成分的构-效关系研究较为详细，常见于各类文献报道，主要是针对具体指标(靶点)结构特征，从定性的角度建立了成分与指标(靶点)构-效关系；或从定量的角度建立分子结构的拓扑指数与指标(靶点)的构-效定量关系，已广泛应用于药品的有效性与安全性研究；由于单成分结构属性明确，在一定色谱条件下的保留时间确定，没必要进行印-效关系。因此，单成分药物给药前、给药后的血药浓度呈相关性，量-效、构-效关系容易研究，其研究方法并不为大家所重视。但用单成分的方法来研中药复方药效物质基础研究却遇到理论上亟待突破的棘手问题。
2.中药复方多成分簇药效物质基础研究艰难，还没有建立普适量-效、构-效、印-效的研究方法：目前，绝大多数中药复方制剂在临床上发挥治疗作用的物质基础尚未阐明，亦即中药复方的有效成分还不清楚，即使是单味中药或复方的有效部位或有效成分群的成分数目也比较多，且不稳定。大量的实验证明若按传统的“一成分一效应；一成分一参数”的化学药物活性筛选研究模式是不可能解决中药多成分作用的药效物质基础研究科学问题：体外原成分群及体内代谢后成分群的有效性问题。近年来对中药复方成分群的有效性研究已采用谱效学、成分敲除、网络药理学等、数据挖掘方法等来研究有效成分群与效应之间内关系，这种研究方法为多成分多靶点的作用关系研究奠定了基础，但没有深入探讨成分与指标(靶点)的超分子作用关系，所获得的中药成分与指标(靶点)的有效性网络过于复杂，同时多为预测性研究，其实验验证困难，如采用网络药理学探讨不换金正气散合麻黄羌活汤和化湿败毒方治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制，得到疾病潜在靶点487个，两种中药汤剂分别得到活性成分92种和247种，潜在药物靶点408个和613个，核心靶点14个和15个，GO生物过程99条和120条，细胞组分各11条，分子功能18条和25条，KEGG信号通路96条和92条，这样的结果难能指导临床应用。同时也不能阐明给药后体内中药复方有效成分簇进入体内量-效关系，也不能阐明体外中药成分簇与效应指标(靶点)的普适量-效作用定量规律，更谈不上中药多成分的构-效和印-效关系研究了。
3.中药成分簇物质基础表征方式难解决成分簇与效应(指标)的变化不对等问题：目前多采用指纹图谱表征中药成分簇的物质单元，分特征峰与非特征峰。现已建立了相关系数法、聚类分析、夹角余弦法、模糊尖T一分布法、欧氏距离法、超信息特征数字化及总量统计矩(相似度)法等方法，主要是针对特征峰进行分析，对于非特征峰尽管总量统计矩法可以应用进行分析，但没有针对非特征峰研究专属性很常的指纹图谱分析方法。这些分析方法的共同特征是强调对目标性有效成分群的定性定量分析，认为只要控制住成分群的含量和构成比，中药及复方疗效就会得到控制。诚然，有相同成分含量与构成比的中药其疗效固然相同，但不同含量和构成比的中药成分群的疗效就未必不同。譬如对417批鱼腥草挥发油与疗效的关系分析；对金银花与山银花的化学成分与疗效的关系分析，发现鱼腥草、金银花与山银花的化学成分变化并不呈对等关系(肖美凤,张雨恬,杨岩涛,等.基于鱼腥草挥发性成分动态性的中药制剂“印迹模板”一致性分析.中国实验方剂学杂志,2019,25(14):150-155.；贺福元,贺红,邓凯文,等.借超分子“印迹模板”的自主作用解开金(山)银花纷争.中国中药杂志,2016,41(06):1152-1160.)：相同或相似的成分含量和构成比，具有相同的药效；而具有不同的成分和构成比不一定药效不同，这就卡住了中药成分簇量-效研究的理论“脑子”，成为举世公认的世界级难题。
因此，中药药效物质基础研究的理论上突破就成为中医药现代化3个重大前沿科学问题和3个重大工程技术难题的重中之重的“卡脑子”难题。
造成这种状况的主要原因是受单成分有效性研究的思路影响深，缺乏对单个中药有效成分量-效、构-效与印-效关系整合成谱量-构-印-效学以及微观超分子运行机理研究；缺乏中药多成分多靶点网络药理学进一步整合简并和验证的研究，缺乏中药多成分色谱学的物质基础“物质单元”表征方法的研究；缺乏中药多成分在体内、在色谱学上的动力学与热力学作用规律的认识，总之还没有建立起一套适应中药多成分作用量-效、构-效与印-效关系研究理论方法，更谈不上适宜中药超分子特征的量-效、构-效与印-效的有效性研究技术了。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用中药“印迹模板”成分簇印迹动力学与热力学平衡原理确定、表征与评价药效物质的方法，具原创新。本发明基于目前中药成分簇间、与经络脏腑间和与色谱柱间都按生物超分子“印迹模板”印迹作用规律，揭示了中药药效物质基础研究的普遍规律，可用于各种中药理论、生产与应用及组合药物研究情况，故具有广阔的市场前景和庞大的经济效益。
本发明提供了一种利用中药“印迹模板”成分簇印迹动力学与热力学平衡原理确定、表征与评价药效物质的方法，包括以下步骤：
1)提取中药成分并进行HPLC、HPLC-MS和/或GC-MS测定，获得指纹图谱，对指纹图谱分析获得对应的化学成分的含量；
2)计算已知化学成分的化学结构拓扑指数；
3)按照频数匹配法将中药提取成分样品中检测到的化学成分进行“印迹模板”成分簇归类，每一类“印迹模板”成分簇为一个“物质单元”，并计算其段带总量统计矩参和拓扑指数；
4)对不同批次的中药成分进行药效学实验，获得药效学数据；
建立动力学平衡关系式，获得各成分簇“物质单元”的线性关系式：
Figure BDA0003898163430000021
式I中的ci为第i个成分簇“物质单元”的浓度、效应、色谱参数、拓扑数据，ki为第i个成分的表观平衡作用系数，s为第i个成分的平衡作用常数的正、负号值，当为正时，取偶数，当为负数取奇数；bi为第i个成分的速度常数，kici为第i个成分的作用强度；
Figure BDA0003898163430000022
为第i个成分的作用方向。对不同批次的中药提取成分样品“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据，进行线性回归分析，获得受动力学控制的“物质单元”的作用系数、作用强度和作用方向；
建立热力学平衡方程式，获得各成分“物质单元”的非线性化学势关系式：
Figure BDA0003898163430000023
式II中R为气体常数，T为绝对温度，fi为第i个成分的活度系数；
Figure BDA0003898163430000024
为第i个成分的标准化学势；
Figure BDA0003898163430000025
为常数；fici ln fici为第i个成分的表观化学势；
Figure BDA0003898163430000026
为第i个成分的作用方向。对不同批次的中药提取成分样品中的“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行化学势非线性回归，获得受热力学控制的“物质单元”的活度系数、表观化学势和作用方向；
建立动力学与热力学的混合关系式，获得各成分“物质单元”的非线性和线性化学势关系式：
Figure BDA0003898163430000031
式III中的第j成分簇“物质单元”与第i成分簇“物质单元”的浓度、效应、色谱参数、拓扑数据呈线性、非线性混合平衡关系。对不同批次的中药提取成分样品中的“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行非线性回归，获得受动力学与热力学混合控制的“物质单元”的作用与活度系数、作用强度与表观化学势、作用方向；
5)对上不同批次的中药提取成分样品获得的动力学和热力学控制的“物质单元”的作用强度和表观化学势、作用系数和活度系数、作用方向按照大小排序，获得以“物质单元”表征的量-量、量-效、构-构、构-效、构-印、印-效、构-印-效的定量关系；
根据动力学平衡关系式对不同批次的中药提取成分样品“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行线性回归，根据线性回归的统计学结果，若回归有显著作用(p<0.05)，说明“物质单元”的成分间、成分与药效指标间、成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间受动力学控制，否则，不以动力学控制为主；
根据热力学平衡方程式对不同批次的中药提取成分样品“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行非线性回归，根据非线性回归的统计学结果，若回归有显著作用(p<0.05)，说明“物质单元”的成分间、成分与药效指标间、成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间受热力学控制，否则不以热力学控制为主；
根据线性动力学与热力学的混合方程式对不同批次的中药提取成分样品“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行非线性回归，根据非线性回归的统计学结果，若回归有显著作用(p<0.05)，说明“物质单元”的成分间、成分与药效指标间、成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间部分受热力学控制，部分受热力学控制，否则，不以动力学与热力学混合控制为主。
6)中药“物质单元”的成分间、成分与药效指标间、成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间有显著性统计学意义的量-量、构-构可解析中药成分间的定量作用关系，表征中药成分间的作用规律，用于成分量变控制；量-效、构-效、构-印-效可解中药成分与药效指标间的定量关系，表征中药药效物质作用规律，用于有效性研究；构-印、印-效、构-印-效可解析中药成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间的定量关系，表征中药药效物质评价规律，用于质量评价。其作用和化学势大小、作用系数和活度系数、作用方向可按排序确定，其作用地位可用同类数据的绝对值归一化排序确定，阐明中药“物质单元”-效应指标-色谱学指标三者之间的作用关系，找到药效物质基础，表征药效物质基础，评价药效物质基础。
优选的，所述步骤2)的成分结构拓扑指数是可用于表征任何主客体分子结构的拓扑指数，包括Wiener、Hosoya、Randic等分子指数量化指数，常用的是分子连接性指数。
优选的，将步骤4)获得的“物质单元”的浓度间进行动力学线性回归、热力学化学势非线性回归、动力学线性与化学势非线性混合关联，用于“物质单元”的量-量关系研究。
优选的，将步骤4)获得的“物质单元”的浓度与效应指标进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”的量变与效应指标量-效关系研究。
优选的，将步骤4)获得的“物质单元”的拓扑指数进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”结构之间的构-构关系研究。
优选的，将步骤4)获得的“物质单元”的结构拓扑指数与效应指标进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”结构与效应指标的构-效关系研究。
优选的，将步骤4)获得的“物质单元”的拓扑指数和色谱学印迹参数进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”结构与色谱学行的构-印关系研究。
优选的，将步骤4)获得的“物质单元”的色谱学参数与效应指标进行动力学线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”色谱学行为与效应指标的印-效关系研究。
优选的，将步骤4)获得的“物质单元”的浓度、拓扑指数和色谱学参数与效应指标进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”结构、色谱学行为与效应指标的构-印-效关系研究。
优选的，按步骤1)～6)获得的中药成分簇“物质单元”的浓度、拓扑指数和色谱学参数、色谱参数与效应指标的作用与活度系数、作用强度与表观化学势、作用方向等确定、表征和评价信息可用于药品说明书的，提高中药产品的科技含量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明基于中药与人体、色谱按超分子“印迹模板”产生“气析”和层析印迹作用，存在化学动力学与热力学平衡的原理，在“印迹模板”成分簇的指纹图谱“物质单元”划分方法基础上，再建立“物质单元”-色谱行为-效应三者间的量-量、量-效、构-构、构-效、构-印、印-效、构-印-效等的数学模型与参数体系，从而获得其作用、活度、效应系数及其强度、方向，经排序确定最宜“物质单元”、药效强弱、色谱学表征方法，阐明中药作用的物质基础、机理、表征及评价方法，破解中医药现代化的国际性难题，解决“卡脑子”的理论与“卡脖子”的技术难题，潜在庞大市场价值。
附图说明
图1为一个“物质单元”节点作用动力学模型图；
图2为二个“物质单元”节点作用动力学模型图；
图3为n个“物质单元”节点网络作用动力学模型图；
图4为任意节点的作用流量动力学平衡图；
图5为58批鱼腥草挥发油指纹图谱；
图6为鱼腥草挥发油浓度对A549细胞的抑制率计量依赖拟合曲线；
图7为不同给药时间的鱼腥草挥发油浓度对A549细胞的抑制率分析。
具体实施方式
本发明的理论与技术基础：
1.基本理论、技术与思路
中药多来源于动植物体，为巨复生物超分子体，中药成分的结构可用拓扑指数进行定量表征，其产生和含量均受“印迹模板”控制，可按色谱峰的匹配频数法划归为以“印迹模板”为基础的“物质单元”，受到生成因素与消除因素的作用，处于动态变化之中，但当环境条件确定，植物的种属确定，经过一定时间后，植物中的每个成分簇达到动力学平衡，存在稳定平衡点的浓度；达到热力学平衡，存在稳定表观的标准化学势和平衡常数，由此可进行量-量研究，揭示成分簇间的变化和稳定性规律。
人体也为巨复生物超分子体，中药按超分子“印迹模板”对人体经络脏腑产生“气析”作用，“印迹模板”为主客体空间结构和结合位点上能完全匹配的模板物，可用拓扑指数表征。中药对人体(动物)的超分子“气析”作用的强弱可以以效应指标进行表征。当实验条件确定，中药经过一定时间作用于人(动物)后，中药成分簇达到动力学平衡，存在稳定平衡点的浓度；达到热力学平衡，存在稳定表观的标准化学势和平衡常数，由此可进行量-效、构-效关系研究，揭示成分簇与效应指标间的变化和稳定性规律。
中药成分簇进行色谱分析时，按“印迹模板”与色谱柱产生印迹作用，存在动力学平衡，可生成色谱峰，获得峰面积、保留时间、调整保留时间等色谱学印迹参数，计算出总量统计矩参数；可按“印迹模板”频数匹配法的划分出“物质单元”，压缩生成新的指纹图谱，获得总量或段带成分簇的色谱学参数，包括峰数目、峰面积；总量和段带保留时间、调整保留时间及其与峰面积乘积；与拓扑指数结合可获得段带拓扑指数；存在热力学平衡原理，可建立中药“印迹模板”成分簇拓扑指数与保留时间、调整保留时间的化学势关系，由此可进行构-印、构-构关系研究，揭示中药成分簇与色谱柱的印迹变化和稳定性规律。
中药成分簇与人体经络脏腑和色谱柱三者间都可通过“印迹模板”的印迹作用方式沟联起来，遵循化学动力学和热力学原理，相互制约实现平衡，据此可建立量-量、量-效、构-构、构-效、构-印、印-效、构-印-效等的定量印迹作用关系式，解析和揭示中药与人体复杂体系的作用模式。
这种定量关系可分为线性、化学势、线性与化学势混合三种情况，可用多元线性回归获得线性关系式的作用系数；可用多元非线性回归获得化学势、线性与化学势混合的非线性关系式的活度系数。
将作用系数乘以浓度获得成分作用强度，其正、负号代表是增加还是降低的作用方向。将活度系数乘以浓度的绝对值取对数再乘以活度系数与浓度之积，获得成分作用表观化学势，其正、负号代表是增加还是降低的作用方向。
将作用强度、表观化学势的绝对值进行归一化计算，排序，获得各成分簇的“物质单元”、效应、色谱学参数、拓扑指数等数据的贡献百分率，正、负号指明该数据作用方向，作用系数和活度系数指明其单位数据的作用大小，其成分簇—药效指标—色谱参数三者间的“印迹模板”的定量印迹关系一目了然。
因此，上述诸理论、技术的综合应用可构建起中药及其复方对人体复杂作用模式的解析体系，阐明中药用复方的复杂作用机理，建立其质量控制体系。
2.具体理论证明和推导及技术创立过程：
在本发明中，中药成分结构可用拓扑指数进行定量表征，若采用分子连接性指数表征，获得各阶的分子连接性指数，表征化学结构的拓扑性，可按式(1)或式(2)进行计算。
对非原子点价的分子连接性指数按式(1)计算。
Figure BDA0003898163430000051
式中mχt为m阶的简单分子连接性指数，t代表子图类型，δ为原子i的非原子点价，即与原子i相连接的其它非氢原子数目，Nm为阶数，为m的t类型子图的数目。随着阶数m的增高，mXt表达的结构信息能力亦增强。
对于原子点价的分子连接性指数按式(2)计算。
Figure BDA0003898163430000052
式中mχt υ为m阶分子连接性指数；υ代表价；δi υ为i原子的原子点价。各阶拓扑指数表征与“印迹模板”对应的原子基团共同产生作用的概率，与成分的理化性质φ，如浓度、印迹量、保留时间等呈相关性，为式(3)。
Figure BDA0003898163430000053
中药多来源于动植物体，可看作一个独立的生物体，其中任一成分的产生和含量均是由生成因素作用平衡常数与消除因素作用决定(图1、图2)，受到网络动力学控制，处于动态平衡之中，平衡点不断向生物热力学方向移动，当环境条件确定，植物的种属确定，经过一定时间后，植物中的每个成分达到平衡，可获得稳态平衡点“印迹模板”成分簇平衡浓度及相互作用活度系数。中药成分簇的“物质单元”间可按网络动力学作用关系(图3、图4)建立多元线性微分方和组为式(4.1)～式(4.n)。
Figure BDA0003898163430000054
Figure BDA0003898163430000055
Figure BDA0003898163430000056
………………
Figure BDA0003898163430000057
………………
Figure BDA0003898163430000061
式中ci为任意i节点的浓度，cj为任意j节点的浓度，其中i节点作用于任意节点j的平衡常数Kij，为负值。而任意节点j作用于节点i的平衡常数Kji，为正值，其生成速度常数为bj。当动力学达到平衡时，则有线性方程组，为式(5.1)～式(5.n)。
(K10+K12+K13+…K1i+K1j…+K1n)c1-K21c2-K31c3-…Kj1cj…-Kn1cn＝b1 (5.1)
-K12c1+(K20+K21+K23+…+K2j…+K2n)c2-K32c3-…-Kj2cj…-Kn2cn＝b2 (5.2)
-K13c1-K23c2+(K30+K31+K32+…K3j…+K3n)c3-…-Kj3cj…-Kn3cn＝b3 (5.3)
………………
(Ki0+Ki1+Ki2+…Kij…+Kin)ci-K1ic1-K2ic3-…Kjicj…-Knicn＝bi (5.i)
………………
-K1nc1-K2nc2-K3nc3…-Kjnci-Kn-1,ncn…+(Kn0+Kn1+Kn3+…Kni+Knj…+Kn,n-1)cn＝bn(5.n)
这是成分簇的“物质单元”浓度ci的多元线性组方程组，其矩阵形式为式(6)：
A(k)C＝B (6)
其中A(k)、C、B矩阵分别为：
Figure BDA0003898163430000062
C＝(c1,c2,c3,…ci,cj…,cn)T
B＝(b1,b2,b3,…,bi,bi…bn)T
根据克莱姆法各成分簇的“物质单元”稳态浓度的解为式(7)。
Figure BDA0003898163430000063
其中Δj(k)为式(8)。
Figure BDA0003898163430000071
由式(8)可知，当生物体处于平衡稳态后，各成分簇“物质单元”的浓度由其作用平衡常数大小共同确定，存在明确的网络动力学平衡浓度。上述的平衡浓度
式(5.1-5.n)相加后可得方程为式(9)。
Figure BDA0003898163430000072
简化为式I：
Figure BDA0003898163430000073
因此，生物化学平衡点就是生成因素的作用速度与消除因素的作用速度相等的状态，此时，成分含量不再升高或降低，其稳态浓度可以由网络动力学算出，各成分间呈线性关系，由生成作用速度常数与消除速度常数共同决定各成分的浓度。通过任一成分簇的“物质单元”浓度对其它“成分簇”的“物质单元”的浓度进行线性回归可得其作用平衡常数Ki0，为正，则表示具产物的作用，为负表为生成物的作用，其与浓度的乘积表示其作用强度，对其绝对值归一化处理，各成分簇的“物质单元”的比率表示其作用大小，排序可知道各成分簇的“物质单元”的作用地位及作用方向，解析中药成分簇的“物质单元”在中药代谢中的地位。
中药成分簇间按“印迹模板”印迹作用还遵守热力学平衡原理，在等温或规律性变温(以平均温度计)等压平衡状态下，其整体化学成分按网络动力学进行量变最终达到化学势变化为零。
对于含n个成分簇“物质单元”的生物体，处于最终稳定态时，可看成各“印迹模板”成分簇的Gibbs自由能由原生态到次生态在等温等压条件下反应的结果，由生物热力学决定，其平衡点为化学势总量改变为零。亦为式(10)：
Figure BDA0003898163430000074
式中ΔG为生物体平衡时的Gibbs自由能的改变，ξ表示各成分簇“物质单元”的反应进度，μi为第i成分化学势，νi第i成分浓度的改变量。当式(10)成立时，各生物次生态化学代谢已达到平衡，各1个单位生物成分簇的“物质单元”的化学势为：
Figure BDA0003898163430000075
式中ai为第i成分活度，
Figure BDA0003898163430000076
为温度为T时的标准化学势。对于含有n个成分簇“物质单元”的化学势的变化为：
Figure BDA0003898163430000077
式中mi为第i成分簇“物质单元”的摩尔质量，MT为总成分簇“物质单元”的摩尔质量，S为奇或偶数，当第i成分簇“物质单元”起反应物作用的取奇数，起产物作用的取偶数。由于：
Figure BDA0003898163430000078
式中Mi为第i成分簇“物质单元”的摩尔质量；VT为生物体体积。故：
Figure BDA0003898163430000079
定义表观活度系数为：
Figure BDA0003898163430000081
则式(14)变为式(16)：
Figure BDA0003898163430000082
在等温等压条件下，达到平衡时，化学热改变为零，则式(16)变为(17)，为式II：。
Figure BDA0003898163430000083
因此，其各成分簇“物质单元”的化学势总和为零，亦中药成分簇“物质单元”的浓度乘上成分簇浓度的对数之和为一个稳定的常数，也就是存在一个稳定的表观平均浓度。成分簇“物质单元”的运行规律就是求出表观活度系数，可按式(18)用各成分簇“物质单元”的浓度进行非线性回归获得。
Figure BDA0003898163430000084
其表观稳定平衡常数K为：
Figure BDA0003898163430000085
式中成分浓度用活度代替，构建成活度化学势的定量关系，取成分簇“物质单元”浓度按多元非线性拟合方法，给定初始值就可以求算最优的各成分的活度系数、活度和化学势。在获得各成分簇“物质单元”表观活度系数后，乘以浓度就可以获得其活度，活度乘以活度的对数为活度的化学势变化量，本专利整合成成分簇“物质单元”的化学势。归一化处理排序比较化学势、活度系数大小和作用方向，可解析各成分簇“物质单元”在中药原植物生长代谢中的地位和作用模式。
中药“印迹模板”成分簇与色谱柱按“印迹模板”产生印迹作用遵守动力学、热力学平衡原理。色谱的动力学平衡可获得色谱峰曲线、数目、保留时间、死时间、调整保留时间、峰面积等色谱学参数。色谱峰为高斯曲线，为式(20)。
Figure BDA0003898163430000086
其中Ri表示第i峰对时间t的响应值，tR,i表示第i峰的保留时间，σi表示第i峰的保留时间标准差，Rmax,i表示第i峰对时间tR,i的最大响应值的2πσi值，其中tR,i为式(21)：
Figure BDA0003898163430000087
式中tm表示溶剂峰的保留时间，亦死保留时间，cs,i表示第i峰所对应成分在固定相的浓度，cm,i表示第i峰所对应成分在流动相的浓度，Vs,i表示固定相体积，cm,i表示流动相的体积，当固定相内容物、流动相的溶剂、仪器管路确定，则tR,i为一常数，这时式(22)为常数。
Figure BDA0003898163430000088
式中ki，m表示第i峰所对应成分在固定相和流动相的浓度分配系数；k′i表示第i峰所对应成分在固定相和流动相的质量分配系数。
色谱峰数目是以色谱学的色谱曲线响应值对保留时间呈凸凹函数状分布来确定，也就是色谱高斯曲线的导数等于零时所对的保留时间取值决定的。
Figure BDA0003898163430000091
色谱峰的峰面积由式(20)从-∞到+∞对时间积分得到；
Figure BDA0003898163430000092
色谱峰面积用于表征所对应成分的含量大小，这时中药“印迹模板”成分簇间量-量关系可用色谱参数进行表征。
保留时间按式(25)积分确定，调整保留时间为tR,i-tm。
Figure BDA0003898163430000093
中药成分在进行色谱分析时，表现为某个分子的“印迹模板”的某一个基团随机与色谱固定相进行结合-迁移-解结合-再结合-再迁移等印迹作用，最终综合印迹特征以保留时间的形式体现出来，因此成分的保留时间是能体现“印迹模板”特征的各阶分子连接性指数综合作用结果，反映到“印迹模板”成分簇的拓扑指数mχ与分配系数线性组合关系，由式(21)可得式(26)
Figure BDA0003898163430000094
Figure BDA0003898163430000095
定义：
Figure BDA0003898163430000096
则式(27)变为式(29)，可化为式I：
Figure BDA0003898163430000097
因此，成分簇“物质单元”受到动学控制时，表现出成分的保留时间与各阶拓扑指数呈线性叠加关系。
而色谱的热力学平衡可建立各阶拓扑指数与保留时间的化学势关系。任一成分在色谱学上的化学势为：
Figure BDA0003898163430000098
式中μi为化学势，μθ i为标准化学势，由于ki与分子连接性指数呈相关性，由n阶分子连接性指数构成的分子的任一m阶分子连接性指数对化学势的贡献为：
Figure BDA0003898163430000101
当各成分簇“物质单元”的n阶分子连接性指数为：
Figure BDA0003898163430000102
若引入分子连接指数活度系数a`m，则：
Figure BDA0003898163430000103
定义：
Figure BDA0003898163430000104
则：
Figure BDA0003898163430000105
当色谱学上达到热力学平衡时，则各成分簇“物质单元”的的各阶分子连接性指数对化学势的贡献为零，为式(36)，可化为式II。
Figure BDA0003898163430000106
因此，从各成分簇“物质单元”的分子连接性指数考虑，各分子连接性指数的化学势之和为常数，据此可获得表观分子连接性指数活度系数，按活度的化学势归一化及排序处理，可获得各阶分子连接性指数对作用大小、强度和方向。
同理，色谱学的热力学也可用调整保留时间来表征，从调整保留时间的解度考虑，任一分子的化学势可以用调整保留时间为表达，可联合式(21)、(22)可得式(37)：
Figure BDA0003898163430000107
任一m阶分子连接性指数对应调整保留时间
Figure BDA0003898163430000108
对化学势的贡献为：
Figure BDA0003898163430000109
各成分簇“物质单元”的n阶分子连接性指数对应调整保留时间
Figure BDA00038981634300001010
对化学势的贡献为：
Figure BDA00038981634300001011
若引入分子连接指数活度系数a`m，则：
Figure BDA00038981634300001012
定义：
Figure BDA00038981634300001013
则：
Figure BDA00038981634300001014
当色谱学上达到热力学平衡时，则各成分簇“物质单元”的各阶分子连接性指数对应调整保留时间的化学势的贡献为零。
Figure BDA0003898163430000111
而此时的色谱峰的保留时间与各阶分子连接性指数整体的贡献关系式为式(44)。
Figure BDA0003898163430000112
由于同一个成分的各种形式的标准化学势相关。
Figure BDA0003898163430000113
则有式(46)：
Figure BDA0003898163430000114
当为指纹图谱时，各成分的分子连接性指数和调整保留时间的关系，可按上式进行叠加。
Figure BDA0003898163430000115
当死时间tm很小，可以忽略不计时，则可直接用保留时间进行计算，可得式(48)，可化为式II。
Figure BDA0003898163430000116
同理，按活度的表观化学势进行处理，可获得保留时间、分子连接性指数的作用大小、系数和方向，表征其在色谱行为中的地位。
综上所述，中药成分簇“物质单元”间、与经络脏腑的药效指标间、与色谱柱的印迹参数间都存在动力学与热力学控制，存在平衡点，其浓度、活度、作用常数、活度系数及作用方向都可通过任一成分簇“物质单元”的浓度对任一成分簇“物质单元”浓度经线性、非线性回归获得。若在平衡中，线性平衡被打破，而向化学势为零的方向移动不到位，可以出现上述线性与化学势混杂关系，相当于数据变量处于不同的两个层次，这时线性与非线性关系混杂，可简化为式III。因此对上述关系总结为：
(1)中药成分簇间“物质单元”的量-量的定量关系，包括：
当中药成分簇“物质单元”的含量间处于同一物质作用层次，受动力学控制时，成分簇间呈现线性关系，为式(49)：
Figure BDA0003898163430000117
ci为第i个成分簇“物质单元”浓度，ki为第i个成分簇“物质单元”的表观平衡作用常数，s为第i个成分簇“物质单元”的平衡作用常数的正、负号值，当为正时，为偶数，当为负数为奇数；bi为第i个成分簇“物质单元”的速度常数，kici为第i个成分的作用强度。
当中药成分簇“物质单元”的含量处于同一物质作用层次，受热力学控制，成分簇“物质单元”间呈现平衡时化学势关联，为式(50)：
Figure BDA0003898163430000118
式中R为气体常数，T为绝对温度，fi为第i个成分簇“物质单元”的活度系数；
Figure BDA0003898163430000119
为第i个成分簇“物质单元”的标准化学势；fici lnfici为第i个成分簇“物质单元”的表观化学势。
当效应指标(靶点)与中药成分簇“物质单元”处于混合物质作用层次，有非同一物质作用层次的，部分动力学、部分受热力学控制，成分簇“物质单元”间呈化学势和线性混合相关性，为式(51)，化为式III：
Figure BDA0003898163430000121
根据量-量关系式，按作用强度大小或表观化学势大小、平衡作用常数或活度系数正负号、活度系数或平衡作用常数大小排序可以获得各成分簇“物质单元”的作用强度、作用和反作用方向、单位作用能力等在中药成分代谢的贡献程度参数，从而解析各成分簇间量-量作用关系。
(2)中药成分簇“物质单元”与人体经络脏腑的病证靶点按“印迹模板”印迹作用，遵守化学动力学与热力学平衡原理，据此可建立定量的量-效的定量关系，包括：
当中药成分簇“物质单元”的含量与效应指标(靶点)处于同一物质作用层次，视效应指标(靶点)为成分簇，受动力学控制时，体内与体外成分簇“物质单元”与指标(靶点)呈现线性关系，为式(52)：
Figure BDA0003898163430000122
cj为第j个效应指标(靶点)浓度，kj为第j个效应指标(靶点)的平衡作用常数，s为第j个效应指标(靶点)的平衡作用常数的正、负号值，当为正时，为偶数，当为负数为奇数；而bj为第j个效应指标(靶点)的速度常数；kjcj为第j个效应指标(靶点)的作用强度。
当中药成分簇“物质单元”的含量与效应指标(靶点)处于同一物质作用层次，视效应指标(靶点)为成分簇，受热力学控制，体内与体外成分簇“物质单元”与指标(靶点)呈平衡时化学势关联，为式(53)：
Figure BDA0003898163430000123
式中fj为第j个效应指标(靶点)的活度系数，
Figure BDA0003898163430000124
为第j个效应指标(靶点)的标准化学势，fjcj lnfjcj为第j个效应指标(靶点)的表观化学势。
当效应指标(靶点)与中药成分簇“物质单元”处于混合物质作用层次，部分动力学、部分受热力学控制，体内与体外成分簇“物质单元”与指标(靶点)呈化学势和线性混合相关性，为式(54)：
Figure BDA0003898163430000125
根据定量的量-效关系式，按作用强度大小或表观化学势大小、平衡作用常数或活度系数正负号、活度系数或平衡作用常数大小排序可以获得各成分簇“物质单元”或效应指标(靶点)的作用强度、作用和反作用方向、单位作用或效应能力等中药对人体作用体系的贡献程度参数，从而解析各成分簇“物质单元”对效应指标(靶点)量-效作用关系。
(3)中药成分簇“物质单元”间按“印迹模板”印迹作用，遵守化学动力学与热力学平衡原理，据此可建立定量的构-构的定量关系，包括：
当中药成分簇“物质单元”的拓扑指数间处于同一物质作用层次，受动力学控制时，拓扑指数间呈现线性关系，为式(55)，可化为式I：
Figure BDA0003898163430000131
mχ为第i阶拓扑指数，ki为第i阶拓扑指数的作用系数，s为第i阶拓扑指数的作用系数正、负号值，当为正时，取偶数，当为负数时，取奇数；而bi为n阶拓扑指数的相关常数；ki mχ为第i阶拓拓指数的作用强度。
当中药成分簇“物质单元”的拓扑指数间处于同一物质作用层次，受热力学控制，拓扑指数与指标(靶点)呈平衡时化学势关联，为式(56),可化为式II：
Figure BDA0003898163430000132
式中fi为第i阶拓扑指数作用系数；
Figure BDA0003898163430000133
为第i阶拓扑指数的标准化学势；fi mχlnfi mχ为第i阶拓扑指数的表观化学势。
当中药成分簇“物质单元”拓扑指数间处于混合物质作用层次，部分动力学、部分受热力学控制，拓扑指数呈化学势和线性混合相关性，为式(57)，可化为式III：
Figure BDA0003898163430000134
根据定量的构-构关系式，按作用强度大小或表观化学势大小、平衡作用常数或活度系数正负号、活度系数或平衡作用常数大小排序可以获得中药各成分间拓扑指数的作用强度、作用和反作用方向、单位作用或效应能力等参数，从而解析各成分簇间的“印迹模板”作用关系。
(4)中药成分簇“物质单元”与人体经络脏腑的病证靶点按“印迹模板”印迹作用，遵守化学动力学与热力学平衡原理，据此可建立定量的构-效的定量关系，包括：
当中药成分簇“物质单元”的拓扑指数与效应指标(靶点)处于同一物质作用层次，受动力学控制时，拓扑指数与指标(靶点)呈现线性关系，为式(58)，可化为式I：
Figure BDA0003898163430000135
cj为第j个效应指标(靶点)浓度，kj为第j个效应指标(靶点)的平衡作用常数，s为第j个效应指标(靶点)的平衡作用常数的正、负号值，当为正时，取偶数，当为负数时，取奇数；而bj为第j个效应指标(靶点)的速度常数；kjcj为第j个效应指标(靶点)的作用强度。
当中药成分簇“物质单元”的拓扑指数与效应指标(靶点)处于同一物质作用层次，受热力学控制，拓扑指数与指标(靶点)呈平衡时化学势关联，为式(59),可化为式II：
Figure BDA0003898163430000141
式中fj为第j个效应指标(靶点)的活度系数；
Figure BDA0003898163430000142
为第j个效应指标(靶点)的标准化学势；fjcj lnfjcj为第j个效应指标(靶点)的表观化学势。
当效应指标(靶点)与中药成分簇“物质单元”拓扑指数处于混合物质作用层次，部分动力学、部分受热力学控制，拓扑指数与指标(靶点)呈化学势和线性混合相关性，为式(60)，可化为式III：
Figure BDA0003898163430000143
根据定量的量-效关系式，按作用强度大小或表观化学势大小、平衡作用常数或活度系数正负号、活度系数或平衡作用常数大小排序可以获得各成分或效应指标(靶点)的作用强度、作用和反作用方向、单位作用或效应能力等中药对人体作用体系的贡献程度参数，从而解析各成分簇对效应指标(靶点)量-效作用关系。
(5)中药成分簇“物质单元”与色谱柱按“印迹模板”印迹作用，遵守动力学、热力学平衡原理。将成分簇“物质单元”的浓度、拓扑指数与色谱学参数进行线性、化学势或线性和化学势混合关联建立构—印定量关系，包括：
中药成分簇“物质单元”的拓扑指数和色谱学参数表现为动力学控制，呈现线性关系，为式(61)，可化为式I：
Figure BDA0003898163430000144
pj为第j个色谱学参数，kj为第j个色谱学参数的作用系数；而B为仪器测定常数。
中药成分簇“物质单元”拓扑指数和色谱学几何统计矩参数受热力学控制，呈现化学势相关，为式(62)可化为式II：
Figure BDA0003898163430000145
fj为第j个色谱学参数的作用系数，
Figure BDA0003898163430000146
为第j个色谱学参数的标准化学势，fjpjlnfjpj为第j个色谱学参数的表观化学势。
中药成分簇“物质单元”的化学势和色谱学参数受动力学与热力学控制，呈混杂相关性，为式(63)，可化为式III：
Figure BDA0003898163430000151
式中i、j可以互转，根据定量的构-印关系式，按作用大小或表观化学势大小、作用系数正负号、作用系数大小排序可以获得各阶拓扑指数和色谱学参数的作用强度、作用和反作用、单位作用强度等在色谱表征体系中的贡献程度，从而解析各成分簇“印迹模板”结构对色谱参数作用关系。当不取色谱参数时，上述(61)～(63)式表现为各成分簇“物质单元”的拓扑指数关系。
(6)当中药成分簇“物质单元”的特性用色谱学表征，原中药成分簇“物质单元”与效应指标(靶点)间的关系可转变为中药成分簇“物质单元”对色谱柱的印迹特征和中药成分簇“物质单元”对人体经络脏腑的病证靶点作用特征，两者均按“印迹模板”印迹作用，应遵守化学动力学与热力学平衡原理。将中药成分簇“物质单元”的色谱学参数和效应指标进行线性、化学势或线性和化学势混合关联建立印—效定量关系，包括：
中药成分簇“物质单元”的色谱学参数和效应指标(靶点)按动力学控制关联，由保留时间—固液相分配系数—分子连接性指数—药效关联，相到呈现线性空间转换关系，为式(64)，可化为式I：
Figure BDA0003898163430000152
式中pi为第i个成分簇“物质单元”的色谱学参数，ki为第i个成分簇“物质单元”色谱学参数的作用系数，s为第i个成分簇“物质单元”色谱学参数的作用系数的正、负号值，当为正时，为偶数，当为负数为奇数；同理Ej为第j个效应指标，kj为第j个效应的拟合系数，而B为仪器测定常数，而bj为第j个效应指标(靶点)的测定常数。
中药成分簇“物质单元”的色谱学参数和效应指标按热力学控制，由保留时间—固液相分配系数—分子连接性指数—药效关联，按式(46)由各种形式化学势相关，为式(65)，可化为式II：
Figure BDA0003898163430000153
式中fi为第i个成分簇“物质单元”的色谱学参数作用系数，fj为第j个效应指标(靶点)的作用系数。
Figure BDA0003898163430000154
为第i成分簇“物质单元”色谱学的标准化学势，
Figure BDA0003898163430000155
为第j个效应指标(靶点)的标准化学势。fipi lnfipi为第i个色谱学参数的表观化学势，fjEj lnfjEj为第j阶拓扑指数的表观化学势。
中药成分簇“物质单元”的色谱学参数和效应指标按动力学和热力学混合控制，呈现化学势和线性混合相关性，为式(66)，可化为式III：
Figure BDA0003898163430000156
根据定量的印-效系式，按作用效应大小或表观化学势大小、作用系数正负号、作用系数大小排序可以获得各成分或效应(靶点)指标的作用强度、作用和反作用、单位作用强度等表征在色谱学和效应体系中的贡献程度，从而解析各成分色谱学行为与效应指标关联性。
(7)将成分簇“物质单元”的含量、结构拓扑指数、色谱学参数、效应指标(靶点)进行线性、化学势或线性和化学势混合关联建立构—印—效定量关系，包括：
中药成分簇“物质单元”拓扑指数、色谱学参数和效应指标按动力学控制，呈现线性关系，为式(67)，可化为式I：
Figure BDA0003898163430000161
式中p(mχ)i为第i个成分簇“物质单元”与第m个拓扑指数对应的色谱学参数函数，ki为其作用系数，s为其作用系数的正、负号值，当为正时，为偶数，当为负数为奇数；Ej为第j个效应指标(靶点)值，kj为第j个效应指标(靶点)的作用系数，而B为仪器测定常数，而bj为第j个效应指标的作用速度常数。
中药成分簇“物质单元”的拓扑指数、色谱学参数和效应指标按热力学控制，呈现化学势相关，为式(68)，可化为式II：
Figure BDA0003898163430000162
式中fi为第i个成分簇“物质单元”第m个拓扑指数的色谱参数函数的作用系数，fj为第j个效应指标(靶点)的作用系数。
Figure BDA0003898163430000163
为第i成分簇“物质单元”，第m个拓扑指数色谱学的标准化学势，
Figure BDA0003898163430000164
为第j个效应指标(靶点)的标准化学势。γip(mχ)ilnγip(mχ)i为第i个成分簇“物质单元”，第m个拓扑指数的色谱学参数表观化学势，γjEj lnγjEj为第j阶拓扑指数的表观化学势。
中药成分簇“物质单元”拓扑指数、色谱学参数和效应指标按动力学和热力学混合控制，呈现化学势和线性混合相关性，为式(69)。
Figure BDA0003898163430000165
根据定量的构-印-效系式，按效应作用大小或表观化学势大小、作用系数正负号、效应作用系数大小排序可以获得各成分或效应指标的拓扑指数、作用强度、作用和反作用、活度系数等表征成分簇结构、色谱学和效应指标作用体系中的贡献程度，从而解析各成分结构、色谱学行为与效应指标关联性。
在本发明中，所得到色谱分析产品：包括体现在中药成分簇“物质单元”印迹性分析、结构拓扑表征、量-效关系、构-印关系、构-效关系、构-印-效关系的形式的色谱学上可接受的形式，如中药成分簇拓扑结构指数、色谱分析系统、计算软件、色谱柱、试剂和用于“印迹模板”构-印-效分析的对照品。所得到的中药产品：其中中药产品标明了超分子“印迹模板”印迹作用动力学与热力学平衡法确定药物物质基础等技术的综合信息，除按药物产品正常要求标明外，还按超分子“印迹模板”印迹作用的动力学和热力学平衡法确定中药物质基础技术，标明了客体成分拓扑指数、结构拓扑表征、量-效关系、构-印关系、构-效关系、构-印-效关系及其参数。
还包括其产品说明书的制订，该说明书标明了通过超分子“印迹模板”印迹作用动力学与热力学平衡原理表征并确定中药药效物质基础等综合技术信息是指在以本技术进行中药研究获得的产品说明书、包装材料与宣传材料中，除按正常标注要求外，还按中药拓扑指数、指纹图谱色谱参数及药效指标(靶点)的定量构-印-效的作用关系，如中药成分种类及构成比、分子连接性指数、几何统计矩参数、构-印-效系数、表观化学势大小或作用效应大小、作用系数正负号、作用系数大小排序可以获得各成分或效应(靶点)指标的拓扑指数、作用强度、作用和反作用、活度系数等拓扑指数、色谱学和效应(靶点)体系中的贡献情况等。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1鱼腥草挥发油成分簇“物质单元”抗肺癌作用的量-量、量-效、构-构、构-印、印-效、构-效、构-印-效关系研究：
1.鱼腥草挥发油成分簇指纹图谱建立与“物质单元”划分
1.1.仪器、试药与药材
1.1.1仪器：气质联用仪(GCMS-QP2010型，日本岛津公司)、超纯水制水机(PINE-TREE，北京湘顺源科技有限公司)、DZTW型调温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)、电子天平(CP-114，奥豪斯仪器上海有限公司)、4℃、-20℃冰箱(BCD-671WDEMU1，青岛海尔股份有限公司)50μL、100μL和1000μL移液枪(上海大龙医疗设备有限公司)挥发油提取器、冷凝管。
1.1.2试药与药材：鱼腥草样品分别从5—8月购自全国7个省(湖南、贵州、广西、浙江、江苏、江西、四川)共58批经本校药学院炮制教研室专家鉴定符合2020版《中国药典》标准。α-蒎烯(批号：897-2000001，中国药品生物制品检定所)、α-萜品醇(111859-201804，中国食品药品检定研究院)、甲基正壬酮(110834-201603，中国食品药品检定研究院)、正已烷(批号：K46764991524，色谱纯，德国默克股份有限公司)、碳酸氢钠(批号：20160220，上海山浦化工有限公司)、丙酮(20190830，国药集团化学试剂有限公司)。
1.2.样品的制备：取新鲜鱼腥草全草，除去坏根烂叶，称取600g，洗净剪碎至2～3cm的小段，置于3000mL圆底烧瓶中加超纯水1500mL，采用水蒸气蒸馏法提取约4h，取挥发油提取器中上层油液，得鱼腥草挥发油样品，置于4℃冰箱避光保存，用于后续GC-MS分析。
1.3.色谱条件：气相色谱条件：色谱柱DB-5(60m×0.25mm×0.25μm，Agilent)；进样口温度250℃，柱温采取程序升温：起始温度80℃，保持2min；以10℃/min升至125℃后保持5min；以10℃/min升至165℃后保持10min；以2℃/min升至185℃后；以10℃/min升至240.0℃，保持20min。分流比为10:1，进样量1μL。质谱条件:接口温度为280℃；离子源温度为250℃；电离方式为电子轰击离子源(EI)；电子轰击能量为70eV；质量扫描范围是35～500(m/z)；数据采集扫描模式为全扫描。
1.4.样品测定：取各批鱼腥草样品按1.2项下进行样品制备，精密吸取总挥发油50μL至2mL进样小瓶内，加正己烷至1mL，制得供GC-MS分析的样品，按1.3项(3项)下色谱条件进样。
1.5.实验结果与分析：
1.5.1 GC-MS测得58批鱼腥草挥发油指纹图谱及化学成分分析：对58批样品的挥发油进行GC-MS分析，指纹图谱如图5。对谱图中所有峰(峰面积>10000μv·sec)进行积分，利用NIST质谱数据库自动匹配检索各成分，经统计处理后，最终得612个成分，出现频次最高的前位10位的成分分别是：2-Undecanone、Camphene、1-Nonanol、Decanal、2-Dodecanone、Bicyclo[3.1.0]hexane、4-methylene-1-(1-methylethyl)-、1,3,6-Octatriene、3,7-dimethyl-,(Z)-、Terpinen-4-ol、alpha.-Terpinyl acetate含量占总挥发油含量的38.51％，出现频率占总批次数的90％以上。若占总挥发油含量60％需测23种成分，若占总含量90％需测134个成分。若不考虑出现频次，含量占总挥发油前10位的成分分别为：2-Undecanone、beta.-Myrcene、Decanal、Dodecanal、n-Decanoic acid、2-Tridecanone、1-Nonanol、2,6-Octadien-1-ol,3,7-dimethyl-,acetate,(Z)-、Bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-(1-methylethyl)-、Terpinen-4-ol，总含量占总挥发油含量的58.7％。
1.5.2. 58批鱼腥草化学成分分子连接性指数及总量统计矩参数及信息熵的计算：通过GC-MS对58批鱼腥草挥发油的分析，解谱得到每一批的分子信息及相对含量等，按式(1)、式(2)可以获得每一批的分子连接性指数；按总量统计矩计算公式计算得到总量统计矩参数及信息熵等参数。其中取612个化学成分的22个非零数据的点价分子连接性指数数据进行计算。
1.6.鱼腥草“印迹模板”成分群“物质单元”的划分：按匹配频数法整合58批鱼腥草挥发性成分簇成34个“物质单元”，相关结果列于表1。
表1.整合后的58批鱼腥草挥发油指纹图谱的保留时间tRpi与峰面积值ARpi(峰面积×104)
Figure BDA0003898163430000171
Figure BDA0003898163430000181
整合前后指纹图谱的总量统计矩参数、信息熵和信息量的结果列于表2。
表2. 58批鱼腥草指纹图谱整合前后的前后的总量统计矩参数及信息熵、信息量比较
Figure BDA0003898163430000182
Figure BDA0003898163430000183
对其进行配对t检验，其t值和t分布累积概率1-α/2见于表3，由表3可知58批鱼腥草指纹图谱整合前后的总量统计矩参数、信息量的1-α/2(置信度)都小于0.975，而峰数目和信息熵的1-α/2(置信度)大于0.99。
对58批鱼腥草指纹图谱整合前后的总量统计矩参数及信息熵、信息量的RSD进行分析，如表4。结果显示，鱼腥草挥发油指纹图谱的原峰数、峰面积、信息量，二阶矩的RSD较大，而总量统计一阶矩和信息熵变化比较小，说明鱼腥草挥发油构成比相对稳定，而成分的含量是波动的，刚好体现出“印迹模板”修饰成单个成分的随机动态性的特性；另外，整合前后的峰数目RSD变化较大，而总量统计矩和信息熵、信息量的RSD整合前后相差不大，进一步说明该划分方法可以在减少峰的同时保持了原来的色谱信息，大大地减轻了中药质量控制分析难度。
表3. 58批鱼腥草指纹图谱整合前后的总量统计矩参数及信息熵、信息量的t值和t分布累积概率
Figure BDA0003898163430000184
Figure BDA0003898163430000191
注：t(0.05,57)＝2.002；t(0.01,57)＝2.665；1-α＝0.95(0.99)；1-α/2＝0.975(0.995)
表4. 58批鱼腥草指纹图谱整合前后的总量统计矩参数及信息熵、信息量的RSD(％)
Figure BDA0003898163430000192
通过对整合前后这些参数的对比，发现成分簇“物质单元”构成新指纹图谱可极大降低峰的数目的同时而总量统计矩等参数变化不大，说明该划分方法可以在减少峰的同时保持了原来的色谱信息，保留了中药成分群“印迹模板”特征，大大地降低了中药物质基础确定、表征与评价研究的难度。
根据整合成的成分簇“物质单元”进行分子连接性指数整合，剔除为零的分子连接性指数单元，共获得由22个分子连接性指数组成的数据集。
2.鱼腥草成分群“物质单元”之间的量-量、量-效、构-构、构-印、印-效、构-效、构-印-效关系
2.1.鱼腥草挥发油“物质单元”的量-量关系研究：
2.1.1.动力学平衡原理分析：根据动力学平衡关系式对58批鱼腥草“物质单元”数据，通过SPSS软件进行线性回归分析，以第7成分簇的回归系数最大，统计结果见表5。各“物质单元”的回归系数，亦表观平衡常数见表5。
表5.鱼腥草第7“物质单元”与其它“物质单元”的线性回归结果
Figure BDA0003898163430000193
从线性回归中R2的值和显著性来看，58批鱼腥草中的第7号“物质单元”与其它33个“物质单元”线性回归较好，鱼腥草中第7号成分簇的“物质单元”受到动力学控制，其作用关系列于表6。
表6.鱼腥草第7号“物质单元”与其它“物质单元”的线性回归系数及作用量
Figure BDA0003898163430000194
Figure BDA0003898163430000201
主要受4、13、10、8、9、33、12、3、14号“物质单元”的控制，占50％作用量以上。
2.1.2.热力学平衡原理分析：根据热力学平衡方程，对58批鱼腥草中第7“物质单元”对其它33个“物质单元”进行化学势非线性回归，采用SPSS软件进行非线性回归，通过多次回归，最后达到较好的回归结果，统计分析结果见表7。
表7.鱼腥草中第7号“物质单元”与其它“物质单元”的非线性回归结果
Figure BDA0003898163430000202
从R2的值和p值来看，58批鱼腥草中的第7号“物质单元”与其它33个“物质单元”化学势关系非常理想。由此可获得34个“物质单元”表观活度系数、化学势、作用方向，并对其排序，见表8。
表8.鱼腥草中34个“物质单元”的表观化学势作用方向和大小
Figure BDA0003898163430000203
Figure BDA0003898163430000211
7号“物质单元”主要受到4、13、29、2、32、33、26、12、22、15号“物质单元”的热力学影响，占50％以上。
2.2鱼腥草抗肺癌的“量-效”研究
2.2.1. 58批鱼腥草挥发油抗癌实验
2.2.1.1实验材料、仪器：(1)实验材料：细胞A549(批号CL-0016)，武汉普诺赛生物科技有限公司；RPMI1640基础培养基(批号AG29643109)，Cytiva公司；胎牛血清(FBS)(批号：20030402)，浙江天杭生物科技股份有限公司；双抗(青霉素+链霉素)(批号69080500)，Biosharp公司；胰酶(EDTA)(批号1944021)，BI公司；PBS磷酸缓冲液(批号AF29496676)，HyClone公司；CCK-8试剂盒(批号20210815)，CryoMedia公司；DMSO(批号C12472742)，上海麦克林生化科技有限公司。②实验仪器：洁净工作台(DJ-CJ-2ND1)，北京东联哈尔仪器制造公司；CO2培养箱(FORMA STERI-CYCLE-i250)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；实验室冷藏箱(FYC-335)飞世尔实验器材(上海)有限公司；超低温冻存箱(DW-HL100)中科美菱低温科技股份有限公司；医用离心机(75007201-C)赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；酶标仪(3001-1758)赛默飞世尔有限公司；倒置显微镜(U-HGLGPS)，OLYMPUS公司；自动消毒锅(HVE-50)，HIRAYAMA公司；恒温鼓风干燥箱(GZX-9145A)，上海双旭电子有限公司；恒温水浴锅(LUX-11)，北京陆希科技有限公司。
2.2.1.2细胞实验操作方法
(1)细胞完全培养基的配置：本实验涉及的细胞系为A549人非小细胞肺癌细胞系，其培养所用完全培养基配置方法如下：RPMI 1640基础培养基(含1％谷氨酰胺)+10％FBS+1％青链霉素混合液。
(2)细胞复苏：将(液氮罐)中保存的人非小细胞肺癌细胞系A549取出后，立即置于37℃水浴锅中，待内容物即将溶解时，立刻将冷冻管从水浴锅转移，并用75％酒精擦拭冷冻管。将冷冻管内容物转移至15mL离心管中，再加入RPMI 1640完全培养基(5mL)，1000rpm/min离心3min后，弃去上清，加入完全培养基制成细胞悬液备用。
(3)细胞培养：将制备得到的人非小细胞肺癌细胞系A549细胞悬液种植于10㎝2培养皿中，通过十字摇匀法将细胞均匀分散在培养皿中，放入温度37℃，5％CO2条件下的培养箱中培养。当细胞培养2天或者培养基颜色由粉红变黄时，进行换液操作，即弃去培养皿中原培养液，向培养皿中加入5mLPBS(刚好没过细胞)清洗1～2次后，再补充10mL完全培养基继续培养。
(4)细胞传代：当在显微镜下观察到细胞培养的生长融合达到70％～80％时，对细胞传代操作。首先弃去培养皿中原培养液，加入5mLPBS(刚好没过细胞)清洗1～2次后，弃去PBS，加入1mL 37℃预热胰蛋白酶消化细胞。随后在显微镜观察。待原本贴壁的梭状细胞中呈球状时，加入3mL完全培养基终止消化，并将消化后的细胞收集，1000rpm/min离心3min，弃去上清，加入完全培养基重新吹散细胞制成细胞悬液，分装至多个新的培养皿中，记录传代细胞名称、时间以及代数(由于细胞传代密度过小将影响细胞正常生长，因此需保证每次传代细胞密度大于5×105个/mL)。
(5)细胞种板：以实验所用的96孔板说明。在1000rpm/min离心3min得到消化完的细胞后，弃去上清，加入基础培养基制成细胞悬液。对细胞悬液进行细胞计数，在加样槽中以基础培养基作稀释液，调整得到细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液。使用多通道移液器吸取100uL细胞悬液加入96孔板孔内(为加样均匀，每次加样重悬细胞)，将铺好细胞的96孔板放入37℃培养箱培养。
(6)CCK-8检测：待96孔板孔内细胞铺满后，吸去孔板内旧培养液，加入100uL PBS清洗1～2次。在加样槽内按每孔培养基总体积的10％配制CCK-8溶液，并使用多通道移液器吸取100uL配制的10％CCK-8溶液加入96孔板孔内，继续培养1h，在450nm波长条件下检测吸光度。
2.2.1.3鱼腥草挥发油抑制肺癌细胞增殖实验
(1)药物配制：鱼腥草挥发油为1.2水蒸气蒸馏法获得，用DMSO配制成鱼腥草挥发油母液，再用RPMI 1640基础培养基稀释成用于实验组的浓度梯度液，现配现用。阳性药物选用吉非替尼，溶解于DMSO中配制成母液，4℃遮光保存，再用RPMI 1640基础培养基稀释成用于阳性药物组的阳性药物液。
(2)鱼腥草挥发油给药浓度探索：在96孔板中以每孔1×104个A549细胞密度接种，CO2培养箱中培养24h后更换培养基。更换培养基时，对照组：加入RPMI 1640基础培养基；实验组：加入含有0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45μL/mL鱼腥草挥发油的浓度梯度液；阳性药物组：加入含有60μM吉非替尼的阳性药物液。每组设置5个复孔，各复孔中液体总量100μL。CO2培养箱中培养24h后，弃去培养基并用PBS清洗一遍，各孔加入10％CCK8，放置CO2培养箱中孵育1h后，酶标仪450nm波长检测各孔吸光度。
(3)鱼腥草挥发油给药时间探索：在96孔板中以每孔1×104个A549细胞密度接种，CO2培养箱中培养24h后更换培养基。更换培养基时，对照组：加入RPMI 1640基础培养基；实验组：加入含有0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25μL/mL鱼腥草挥发油的浓度梯度液。加入药物后，96孔板分别在CO2培养箱中培养24h、48h、72h，弃去培养基并用PBS清洗一遍，各孔加入10％CCK8，放置CO2培养箱中孵育1h后，酶标仪450nm波长检测各孔吸光度。
(4)58批鱼腥草挥发油抑制A549细胞IC50值的测定：选择2.3.1.3项下(2)、(3)探索得到的鱼腥草挥发油给药浓度、给药时间对58批鱼腥草挥发油检测。如果出现某产地鱼腥草挥发油IC50不在实验设计浓度范围内，则按照0.05μL/mL浓度梯度相应0.1μL/mL提高，直至达到IC50。
2.2.1.4数据处理：根据公式：抑制率＝[(对照组吸光度-实验组吸光度)/对照组吸光度]×100％，计算不同产地鱼腥草挥发油的抑制率。采用GraphPadPrism 7进行数据分析，5个复孔中除去最大值以及最小值(n＝3)，计量资料以平均值±标准差表示
Figure BDA0003898163430000221
并使用软件中“Nonlinear Regression”分析挥发油浓度与抑制率关系，得到各批鱼腥草挥发油的IC50。
2.2.1.5实验结果与分析
(1)鱼腥草挥发油给药浓度确定：以浙江7月22日的全草鱼腥草挥发油为例，探索鱼腥草挥发油给药浓度。在鱼腥草挥发油浓度0.05～0.45μL/mL范围内，通过实验所测数据并计算细胞抑制率，发现鱼腥草挥发油对A549细胞抑制率随着药物浓度上升逐渐提高，细胞IC50在0.1μL/mL附近，如图6。由此选择0.05～0.25μL/mL为给药浓度范围，并用于鱼腥草挥发油给药时间探索。
(2)鱼腥草挥发油给药时间确定：在确定鱼腥草挥发油给药浓度的基础之上，以0.05～0.25μL/mL给药浓度进一步探索鱼腥草挥发油的给药时间。在相同浓度处理条件下，分别对24h、48h以及72h的药物处理时间进行分析，结果如图7。通过实验发现，鱼腥草挥发油在3种时间条件下，对A549细胞的IC50分别为0.1613μL/m、0.1627μL/m以及0.1538μL/m，其抑制率随给药处理时间的增加而并无显著变化，因此选择24h为后续实验中鱼腥草挥发油的给药处理时间。
(3)58批鱼腥草挥发油抑制A549细胞IC50值：根据2.3.1.3项下的方法配置各批鱼腥草不同浓度挥发油(0.05μL/mL-0.35μL/mL)按照2.3.1.3项下的方法给药，获得每一批不同浓度鱼腥草挥发油对A549细胞的抑制率，计算得到各批鱼腥草挥发油的IC50，见表9。
表9.不同批次鱼腥草挥发油的IC50值
Figure BDA0003898163430000222
利用58批鱼腥草挥发油的抗肺癌作用作为效应指标，与每一批鱼腥草成分群“物质单元”进行关联，找到其量-效，构-效关系。
(4)鱼腥草挥发性成分簇与A549细胞的抑制率IC50：
1)动力学平衡原理分析：对58批鱼腥草挥发油“物质单元”与抗肺癌效应值进行线性回归处理，统计分析结果见表10。
从线性回归中R方的值(0.722)和p值(0.080)来看，对鱼腥草“物质单元”与药效指标值的线性回归并不理想，说明鱼腥草成分群与效应指标不是处于同一作用层次的“物质单元”，其量-效关系不以动力学控制为主。
表10.腥草挥发油“物质单元”与抗肺癌效应值线性回归结果
Figure BDA0003898163430000231
2)热力学平衡原理分析：以鱼腥草成分群的峰面积与抗肺癌效应值进行化学势关联，采用非线性回归，效果也不理想，若进行面积归一化处理(除以总面积平均值)，其统计分析结果见表11，从R方(0.990)值和p(<0.001)值来看，鱼腥草成分群归一化后的“物质单元”与药效指标非线性回归效果理想，说明归一化后的鱼腥草“物质单元”的量-效关系受热力学控制。效应系数、化学势、效应方向及排序见表12。
表11.归一化后腥草挥发油“物质单元”与抗肺癌效应值非线性回归结果
Figure BDA0003898163430000232
表12.鱼腥草“物质单元”归一化后的量-效关联的表观化学势大小及作用方向
Figure BDA0003898163430000233
按化学势排序主要为第29、4、8、26、13、19、18成分簇“物质单元”。
2.3鱼腥草成分群“构-构”关系：
2.3.1动力学平衡原理分析：对整合后“物质单元”58批×34段×22阶的鱼腥草分子连接性指数(删除各批不出现的成分簇的分子连接性指数)进行线性回归，其中以第二阶分子连接性指数对其它阶分子连接性指数线性回归结果最好，其统计分析结果见表13，其回归系数见表14。
表13鱼腥草成分簇2阶与其它分子连接性指数间的线性回归结果
Figure BDA0003898163430000241
从线性回归中R2的值(1.000)来看，线性关系很好，说明中药成分簇“印迹模板”的各阶分子连接性指数，也就是有效基团的生成受动力学控制的。
表14.鱼腥草成分簇2阶与其它分子连接性指数间线性回归系数
Figure BDA0003898163430000242
主要受2(Xvp一阶)、4(Xvp三阶)、9(Xvc三阶)、14(Xvpc四阶)、1(Xvp零阶)、10号(Xvc四阶)的控制，占90％作用量以上。
2.2.2热力学平衡原理分析：对成分簇2阶与其它分子连接性指数间进行非线性回归，经过多次迭代回归，最后得到很好的回归结果(R2＝1.000，p<0.001)见表15。其指数的作用系数见表16。
表15.鱼腥草成分簇2阶与其它分子连接性指数间化学势回归结果
Figure BDA0003898163430000243
Figure BDA0003898163430000251
通过得到的各阶的拓扑指数作用系数，可以得到“构-印”关联下的，鱼腥草22阶平均分子连接性指数表观化学势，其作用大小等信息列于表16。
表16.鱼腥草成分簇2阶与其它分子连接性指数间表观化学势、回归系数和作用方向
Figure BDA0003898163430000252
由表16的结果中可以看到，鱼腥草22阶平均分子连接性指数化学势排名靠前的7位分子连接性阶数为第2，3，15，7，5、17、14号，对应为Xvp一阶、Xvp二阶、Xvpc五阶、Xvp六阶、Xvp四阶、Xvpc七阶、Xvpc四阶，占80％以上。
2.4鱼腥草成分群“构-印”关系：
7.4.1动力学平衡原理分析：对整合后“物质单元”58批×34段×22阶的鱼腥草分子拓扑数据及分段后新的保留时间tRpi作为数据样本，以保留时间tRpi为变量，各成分簇“物质单元”分子拓扑数据为因变量进行线性回归，统计分析结果见表17，其回归获得的作用系数见表18。
表17.鱼腥草成分簇7阶22种分子连接性指数与保留时间线性回归结果
Figure BDA0003898163430000253
从线性回归中R2的值(0.779)来看，线性回归似乎并不理想，但由于样本数太多，由F值可知其显著性(p)<0.01，说明鱼腥草成分簇“印迹模板”的拓扑指数和色谱学保留时间存在良好的线性关系，色谱行为受到动力学控制。
表18.鱼腥草成分簇7阶22种分子连接性指数与保留时间线性回归系数、作用大小与方向、排序
Figure BDA0003898163430000254
Figure BDA0003898163430000261
主要受3(Xvp二阶)、5(Xvp四阶)、6(Xvp五阶)、2(Xvp一阶)、9(Xvc三阶)、4(Xvp三阶)、14(Xvpc四阶)、1(Xvp零阶)的控制，占80％作用量以上。
2.4.2热力学平衡原理分析：对分子拓扑数据及保留时间进行非线性回归，经过多次迭代回归，最后得到较好的回归结果(R2＝0.997，p<0.001)见表19。
表19.鱼腥草成分簇7阶22种分子连接性指数与保留时间非线性回归结果
Figure BDA0003898163430000262
通过非线性回归，得鱼腥草成分簇7阶22种平均分子连接性指数和保留时间非线性回归方程中的γi拓扑指数作用系数及色谱学参数保留时间的作用系数γj、化学势、作用大小和方向等信息，结果列于表20。主要受2(Xvp一阶)、3(Xvp二阶)、6(Xvp五阶)、4(Xvp三阶)、1(Xvp零阶)、15(Xvpc五阶)、16(Xvpc六阶)、5(Xvp四阶)、14(Xvpc四阶)的控制，占80％作用量以上。因此，鱼腥草成分簇“印迹模板”的变化受到热力学与动力学的控制，可用指纹图谱定性定量表征。
表20.鱼腥草成分簇7阶22种分子连接性指数与保留时间的活度系数、表观化学势及作用主向和排序
Figure BDA0003898163430000263
2.5.鱼腥草抗肺癌的“构-效”研究
2.5.1动力学平衡原理分析：以得到58批×34段的各段带拓扑指数表观化学势乘上段带面积为自变量，并进行归一化处理；用58批挥发油的抗肺癌实验效应值与之进行多元线性回归，得表21。
表21.鱼腥草34段带成分簇表观化学势乘以段带面积与抗肺癌效应值的线性回归结果
Figure BDA0003898163430000271
从线性回归中R2的值(0.729)来看，线性回归似乎并不理想，说明鱼腥草成分簇“印迹模板”的拓扑指数和抗肺癌效应不存在线性关系，不受到动力学控制。
7.5.2热力学平衡原理分析：对鱼腥草34段带成分簇表观化学势乘以段带面积与抗肺癌效应值进行化学势非线性回归，经过多次迭代回归，最后得到较好的回归结果(R2＝0.992，p<0.01)见表22，其活度系数、化学势及作用主向和排序，见表23。
表22.鱼腥草34段带成分簇化学势乘以面积与抗肺癌效应值的非线性回归结果
Figure BDA0003898163430000272
从R方(0.992)值和p(<0.001)值来看，鱼腥草34段成分簇拓扑化学势乘面积之值再经归一化处理，再和进行效应非线性回归，结果较好，说明鱼腥草的“构-效”关系受热力学控制。所得fi拓扑指数化学势作用系数、效应指标的作用系数、各化学势及作用方向列于表23。
表23.鱼腥草34段带成分簇化学势乘以面积与抗肺癌效应值的表观化学势大小、活度系数及作用方向
Figure BDA0003898163430000273
由于23可知，抗癌效果越好的34个“物质单元”中，排在前10位的“物质单元”依次为第2、20、9、24、16、4、25、29、1、5“物质单元”，但各“物质单元”的表观化学势都不大，最大第2“物质单元”与最小第23“物质单元”相差939.4倍，因此鱼腥草成分簇的“印迹模板”控制量在45.8％。其它随种随域随法修饰，动态变化。
2.6.鱼腥草抗肺癌的“印—效”研究
2.6.1.动力学平衡原理分析：以得到58批×34段的各段带保留时间乘上各段带面积为自变量，并进行归一化处理；用58批挥发油的抗肺癌实验效应值与之进行多元线性回归，得表24。
表24.鱼腥草34段带成分簇保留时间乘以面积与抗肺癌效应值的线性回归结果
Figure BDA0003898163430000281
从线性回归中R2的值(0.6596)来看，线性回归并不理想，说明鱼腥草各段带成分簇“印迹模板”的保留时间与面积乘积和抗肺癌效应不存在线性关系，不受到动力学控制。
2.6.2热力学平衡原理分析：对鱼腥草34段带成分簇保留时间乘以段带面积与抗肺癌效应值进行化学势非线性回归，经过多次迭代回归，最后得到较好的回归结果(R2＝0.991，p<0.01)见表25，其活度系数、化学势及作用主向和排序见表26。
表25.鱼腥草34段带成分簇保留时间乘以面积与抗肺癌效应值的非线性回归结果
Figure BDA0003898163430000282
从R2(0.991)值和p(<0.01)值来看，鱼腥草印迹参数化学势和效应非线性回归结果较好，说明鱼腥草的“印-效”关系受热力学控制。所得保留时间化学势作用系数fi、效应指标的作用系数fj、化学势大小、作用方向列于表26。
表26.鱼腥草34段带成分簇保留时间乘以段带面积与抗肺癌效应值的表观化学势大小、活度系数及作用方向
Figure BDA0003898163430000283
从表26可知，按保留时间与面积乘积分析34个“物质单元”的抗癌效果排在前10位的“物质单元”依次为第29、4、8、26、13、19、27、18、30、12“物质单元”，但各“物质单元”的化学势都不大，但最大第29“物质单元”与最小第9“物质单元”仅相差50.5倍，但鱼腥草成分簇的“印迹模板”控制量在40.78％。其它随种随域随法修饰，动态变化。
再结合表23与表26中的各成分簇、效应的表观化学势及常数进行相关性分析，发现“构—效”与“印—效”的相关系数为0.994，然只对成分簇进行相关性分析，发现两进的相关系数为0.1763，说明“物质单元”有40％以上的效应受“印迹模板”热力学稳定控制，而60％成分簇所产生的效应可随种随域随法动态变化，因此不采用“印迹模板”进行成分簇的动力学与热力学分析，很难阐明中药成分簇的“构—印—效”关系，揭示其与效应的超分子“印迹模板”作用规律。
2.6.3动力学与热力学混合平衡分析：以鱼腥草34段带成分簇保留时间乘以段带面积的表观化学势与抗肺癌效应值进行非线性回归，经过多次迭代回归，最后得到较好的回归结果(R2＝0.8730，p<0.01)见表27，其成分簇“物质单元”的活度系数、表观化学势及作用主向和排序见表28。
表27.鱼腥草34段带成分簇保留时间乘以面积与抗肺癌效应值的混合非线性关系的回归结果
Figure BDA0003898163430000291
从R2(0.873)值和p(<0.01)值来看，鱼腥草成分簇“物质单元”的印迹参数化学势和效应非线性回归结果较好，说明鱼腥草的“印-效”关系受动力学和热力学混合控制。所得保留时间表观化学势作用系数fi、表观化学势大小、作用方向列于表28。
表28.鱼腥草34段带成分簇保留时间乘以段带面积与抗肺癌效应值混合非线性回归的表观化学势大小、活度系数及作用方向
Figure BDA0003898163430000292
从表28可知，按保留时间与面积乘积分析34个“物质单元”化学势的抗癌效果排在前10位的“物质单元”依次为第13、22、29、2、33、19、6、28、4、31“物质单元”，与热力学平衡算得的结果一部分重叠，但整体回归系数小于热力学的化学势回归结果，宜采用热力学关系式表征鱼腥草成分簇“物质单元”的印-效关系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用中药“印迹模板”成分簇印迹动力学与热力学平衡原理确定、表征和评价药效物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取中药成分并进行HPLC、HPLC-MS和/或GC-MS测定，获得指纹图谱，对指纹图谱分析获得对应的峰面积和化学成分的含量；
2)计算已知化学成分的化学结构拓扑指数；
3)按照频数匹配法将中药提取成分样品中检测到的化学成分进行“印迹模板”成分簇归类，每一类“印迹模板”成分簇为一个“物质单元”，并计算其段带总量统计矩参和拓扑指数；
4)对不同批次的中药成分进行药效学实验，获得药效学数据；
建立动力学平衡关系式，获得各成分簇“物质单元”的线性关系式：
Figure FDA0003898163420000011
式I中的ci为第i个成分簇“物质单元”的浓度、效应、色谱参数、拓扑数据，ki为第i个成分的表观平衡作用系数，s为第i个成分的平衡作用常数的正、负号值，当为正时，取偶数，当为负数取奇数；bi为第i个成分的速度常数，kici为第i个成分的作用强度；
Figure FDA0003898163420000012
为第i个成分的作用方向；对不同批次的中药提取成分样品“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据，进行线性回归分析，获得受动力学控制的“物质单元”的作用系数、作用强度和作用方向；
建立热力学平衡方程式，获得各成分“物质单元”的非线性化学势关系式：
Figure FDA0003898163420000013
式II中R为气体常数，T为绝对温度，fi为第i个成分的活度系数；
Figure FDA0003898163420000014
为第i个成分的标准化学势；
Figure FDA0003898163420000015
为常数；ficiln fici为第i个成分的表观化学势；
Figure FDA0003898163420000016
为第i个成分的作用方向；对不同批次的中药提取成分样品中的“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行化学势非线性回归，获得受热力学控制的“物质单元”的活度系数、表观化学势和作用方向；
建立动力学与热力学的混合关系式，获得各成分“物质单元”的非线性化学势和线性平衡常数关系式：
Figure FDA0003898163420000017
式III中的第i成分簇“物质单元”与第j成分簇“物质单元”的浓度、效应、色谱参数、拓扑数据呈线性、非线性混合平衡关系；对不同批次的中药提取成分样品中的“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行非线性回归，获得受动力学与热力学混合控制的“物质单元”的作用与活度系数、作用强度与表观化学势、作用方向；
5)对上述不同批次的中药提取成分样品获得的动力学和热力学控制的“物质单元”的作用强度和表观化学势、作用系数和活度系数、作用方向按照大小排序，获得以“物质单元”表征的量-量、量-效、构-构、构-效、构-印、印-效、构-印-效的定量关系；
根据动力学平衡关系式对不同批次的中药提取成分样品“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行线性回归，根据线性回归的统计学结果，若回归有显著作用，说明“物质单元”的成分间、成分与药效指标间、成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间受动力学控制，否则，不以动力学控制为主；
根据热力学平衡方程式对不同批次的中药提取成分样品“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行非线性回归，根据非线性回归的统计学结果，若回归有显著作用，说明“物质单元”的成分间、成分与药效指标间、成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间受热力学控制，否则不以热力学控制为主；
根据线性动力学与热力学的混合方程式对不同批次的中药提取成分样品“物质单元”的含量、效应、色谱、拓扑数据进行非线性回归，根据非线性回归的统计学结果，若回归有显著作用，说明“物质单元”的成分间、成分与药效指标间、成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间部分受热力学控制，部分受热力学控制，否则，不以动力学与热力学混合控制为主；
6)中药“物质单元”的成分间、成分与药效指标间、成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间有显著性统计学意义的量-量、构-构能够解析中药成分间的定量作用关系，表征中药成分间的作用规律，用于成分量变控制；量-效、构-效、构-印-效能够解析中药成分与药效指标间的定量关系，表征中药药效物质作用规律，用于有效性研究；构-印、印-效、构-印-效可解析中药成分与色谱参数间、色谱参数与药效指标间的定量关系，表征中药药效物质评价规律，用于质量评价；“物质单元”的作用和表观化学势大小、作用系数和活度系数、作用方向按排序确定，作用地位用同类数据的绝对值归一化排序确定，阐明中药“物质单元”-效应指标-色谱学指标三者之间的作用关系，找到药效物质基础，表征药效物质基础，评价药效物质基础。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的成分结构拓扑指数是用于表征任何主客体分子结构的拓扑特征的指数，为Wiener、Hosoya或Randic分子指数量化指数，常用分子连接性指数。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤4)获得的“物质单元”的浓度间进行动力学线性回归、热力学化学势非线性回归、动力学线性与化学势非线性混合关联，用于“物质单元”的量-量关系研究。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤4)获得的“物质单元”的浓度与效应指标进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”的量变与效应指标量-效关系研究。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤4)获得的“物质单元”的拓扑指数进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”结构之间的构-构关系研究。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤4)获得的“物质单元”的结构拓扑指数与效应指标进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”结构与效应指标的构-效关系研究。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤4)获得的“物质单元”的拓扑指数和色谱学印迹参数进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”结构与色谱学行的构-印关系研究。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤4)获得的“物质单元”的色谱学参数与效应指标进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”的色谱学行为与效应指标进行印-效关系研究。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤4)获得的“物质单元”的浓度、拓扑指数和色谱学参数与效应指标进行线性、化学势、混合非线性回归，用于“物质单元”结构、色谱学行为与效应指标的构-印-效关系研究。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据步骤1)～6)获得的中药成分簇“物质单元”的浓度、拓扑指数和色谱学参数与效应指标的作用、活度系数、作用强度与表观化学势、作用方向来确定、表征和评价药效物质基础及作用规律。
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