CN108205037A

CN108205037A - 铁皮石斛化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法

Info

Publication number: CN108205037A
Application number: CN201611190853.1A
Authority: CN
Inventors: 邹婷婷; 刘仲健
Original assignee: Beijing Lanbiao Yicheng Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Lanbiao Yicheng Technology Co Ltd
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: CN108205037B

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛的化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法，包括：1)对样本容量为n的样本分别进行色谱检测，获取以化学小分子成分夏佛托苷和/或柚皮素作为参照成分的检测数据；2)对样本分别进行指纹图谱检测，获取以铁皮石斛的全化学成分的指纹图谱峰面积值；3)以色谱数据中夏佛托苷和/或柚皮素的成分含量值作为响应变量，将指纹图谱中其它成分的峰面积值作为自变量建立分析模型，建立小分子成分与指纹图谱线性回归模型；4)通过变量相关系数指标表征自变量对回归建模的贡献程度，建立化学小分子成分的相关特征指纹图谱。本发明实现了化学小分子成分含量的关联性分析，能有效鉴别、控制以及评价铁皮石斛药材的质量。

Description

铁皮石斛化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明属于中药成份检测分析领域，具体涉及一种铁皮石斛的指纹图谱的分析建模方法。

背景技术

石斛是一种常用的滋补中药，主要为石斛属植物。石斛属植物是兰科植物中最大的一个属，包括铁皮石斛、铁皮石斛、密花石斛、鼓槌石斛等多个品种。在全球范围内，约有1100多种石斛，其中在我国发现的有76种。石斛的药用历史悠久。早在古代，石斛在《神农本草经》中就被列为滋补上品，长久以来，随着时代的发展，石斛一直被人们视为珍贵的中草药，具有十分重要的滋补功效。在临床上，石斛被用于治疗多种疾病，具有增强免疫力、抗氧化、降血糖和抑制癌症等药理功效。由于人为长期无节制采挖及不合理利用石斛，其野生资源日趋减少，市场上出现了一些以假乱真、以次充好的现象。此外，由于石斛品种较多，其品种间的杂交使得其近缘的种存在性状交叉现象，分类区别比较困难。因此，有必要建立石斛的特征指纹图谱对石斛鲜品、干品的药材质量进行评价。铁皮石斛(Dendrobium catenatumLindley，Dendrobium of ficinale Kimura&Migo)：又名黑节草。茎直立，少匍匐或斜立，肉质，圆柱形，长9cm～35cm，直径0.2cm～0.4cm，不分枝，具多节，节间长1.3cm～1.7cm；叶基部下延为抱茎的鞘，边缘和中肋常带淡紫色，叶鞘常具紫斑，老时其上缘与茎松离而张开，并且与节留下一个环状铁青色的间隙。总状花序常从落叶的老茎上部发出，具2朵～3朵花；花序柄长0.5cm～1.0cm，基部具2枚～3枚短鞘；花序轴回折状弯曲，长2cm～4cm；花苞片干膜质，浅白色，卵形，长0.5cm～0.7cm，先端稍钝；花梗和子房长2cm～2.5cm；萼片和花瓣黄绿色，近相似，长圆状披针形，长约1.8cm，宽0.4cm～0.5cm，先端锐尖，具5条脉；侧萼片基部较宽阔，宽约1cm；萼囊圆锥形，长约0.5cm，末端圆形；唇瓣白色，浅绿色或浅黄绿色，基部具一个绿色或黄色的胼胝体，卵状披针形，比萼片稍短，中部反折，先端急尖，不裂或不明显3裂，中部以下两侧具紫红色条纹，边缘多少波状；唇瓣密布细乳突状的毛，并且在中部以上具1个紫红色斑块，或2个分离的紫色斑块；蕊柱黄绿色，长约0.3cm，先端两侧各具1个紫点；蕊柱足黄绿色带紫红色条纹，疏生毛；药帽白色，长卵状三角形，长约0.2cm～0.3cm，顶端近锐尖并且2裂。

色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，作为一种全局分析的全景模式，反映的是样品的整体情况，而对单一化学小分子成分的含量解释不具有针对性。迄今为止，有关药用石斛HPLC指纹图谱的专利有1项(CN200810218494.5)，成金乐等对石斛中的酚类和黄酮类成分进行了HPLC指纹图谱分析。此方法适合于酚类和黄酮类这两类成分的质量控制。另一方面，在色谱指纹图谱分析过程中，很多数据都是高维的，即数据包含很多属性或特征，比如有关铁皮石斛色谱指纹图谱，就能更好地对铁皮石斛进行描述，但在实际应用中对高维数据直接进行操作将会面临“维数灾难”的问题，“维数灾难”会导致建模过程所需要的样本数随着维数升高而呈指数级增长。面对高维数据，常规的最小二乘方法不再适用，为了提高模型的可解释性和预测的准确度，变量选择变得很重要。如何高效地从众多的变量中筛选出对响应变量有重要作用的若干个变量，是在对指纹图谱进行分析时亟需解决的问题。

另外，在现有的石斛检测标准中都是检测其中的多糖等大分子药效成分，但是，检测多糖等大分子成分需要的技术、仪器要求高，国内现有的仪器设备通常无法准确检测大分子成分，无法准确评价石斛的质量。

发明内容

本发明建立了铁皮石斛化学小分子成分的相关特征指纹图谱，通过该图谱实现对铁皮石斛药材相关化学小分子成分含量的关联性分析。采用化学小分子成分的相关特征指纹图谱获取反映药用铁皮石斛相关化学小分子成分含量的信息。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种铁皮石斛的化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法，所述相关特征指纹图谱的建立方法包括：

1)对样本容量为n的样本分别进行色谱检测，获取以化学小分子成分夏佛托苷和/或柚皮素作为参照成分的检测数据；

2)对样本容量分别进行该样品的指纹图谱检测，获取以铁皮石斛的全化学成分的指纹图谱峰面积值，所述n取值为不小于10的整数；

3)以色谱数据中夏佛托苷和/或柚皮素的成分含量值作为响应变量，将指纹图谱中其它成分的峰面积值作为自变量建立分析模型，进行主成分提取和回归计算，建立小分子成分与指纹图谱线性回归模型，并得到回归方程；

4)通过变量相关系数指标(Correlation Coefficient)表征自变量对回归建模的贡献程度，对应的相关系数越大的自变量的重要程度越大，获得和小分子成分密切相关的指纹图谱特征峰群，建立化学小分子成分的相关特征指纹图谱。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述的色谱检测还包括铁皮石斛样品处理方法：

所述样品处理方法包括：

精密称取铁皮石斛粉末，置100ml容量瓶中，每1g样品精密加体积比为75∶25的甲醇-水50ml，以250W功率、40kHz频率超声处理30分钟，冷却后过滤，将滤液旋蒸浓缩至干，每1g铁皮石斛粉末对应地用5ml体积比为75∶25的甲醇-水溶解，上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得铁皮石斛的小分子成分含量测定样品。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述的色谱检测的检测条件包括：

含量测定色谱条件：Grace Allitima C18色谱柱；流动相采用二元梯度洗脱系统，A相：0.2％醋酸-水，B相：乙腈；以波长290nm测定柚皮素，以波长334nm测定夏佛托苷；参比波长500nm，柱温30℃；流速1.0mL/min，进样量20μL；洗脱梯度为：

指纹图谱色谱条件：Grace Allitima C18色谱柱，优选为250mm×4.6mm，5μm规格的色谱柱；流动相：A相：0.4％乙酸+20mmol/L醋酸铵水溶液，B相：乙腈；梯度洗脱：0～12min：2％～15％B相，12～35min：15％～24％B相，35～45min：24％～36％B相，45～60min：36％～75％B相，60～80min：75％～95％B相；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量20μL；检测波长280nm。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中所述的建立分析模型包括以下步骤：

a)当色谱数据呈现超高维情形时，采用以下SIS(Sure Independence Screening)方法通过式I将超高维降到d(d≤n)维；其中，d＝n或者

M_γ＝{1≤i≤p：|ω_i|是前|γn|个比较大的}

式I

其中，M_*＝{1≤i≤p：β_i≠0}表示真模型中非零系数的下标集；s＝|M_*|表示非零系数的个数；ω＝(ω₁，ω₂，...，ω_p)^T＝X^Ty；当p＞n且对某个ξ有log p＝O(n^ξ)，M_*与M_γ之间有以下联系：对于任意给定的γ∈(0，1)，ω的p个元素按绝对值从大到小排列并且定义；此时|γn|＜n，选取M_γ中下标对应的自变量，达到降维的目的；

b)在SIS方法降维之后，采用SCAD(Smooth Clipped Absolute Deviation)方法和/或HTR(Hard Thresholding Rule)方法筛选变量。

在根据本发明的一个实施方案中，所述SCAD方法是通过式II计算实现的：

其中，惩罚函数p_λ(β)的导函数p′_λ(β)满足

a＞2，β＞0；优选地，a＝3.7。

y＝(y₁，y₂，...，y_n)^T∈Rⁿ为响应变量向量。以石斛数据为例，每种石斛有两个响应变量序列(夏佛托苷(μg/g)、柚皮素(μg/g))。响应变量受自变量的影响，一般情况下y为连续变量。

x＝(x₁，x₂，...，x_n)^T为n×p的设计矩阵，包含对响应变量有影响的所有候选自变量。

p为样本的维数，n为样本容量。在石斛数据中，维数p远大于样本容量n，因此最小二乘估计不再适用，需要采用变量选择的方法来进行模型估计。

β＝(β₁，β₂，...，β_p)^T是一个p维的参数。

为惩罚函数，λ为调整参数。在变量选择方法中，模型拟合的优良程度与对于入选变量个数惩罚的力度之间的平衡通过不同的准则来体现，而这里是通过直接选取调节参数来实现的，不同的λ值对应不同的惩罚力度。λ越大，压缩的程度越强，最后估计得到的非零参数越少，选择λ最常见的方法是K折交叉验证法：

K-fold CV：

一般，K可取为5或10。

GCV准则是CV准则中的K取n时的一种近似情形，定义为：

其中，SSE_k是含有k个变量的CV子模型的残差平方和，df＝trace{P(λ)}。对于最终最优模型的选择，可以取CV值或GCV值最小的子模型。

惩罚函数p_λ(β)的导函数p′_λ(β)满足

其中参数a＞2，β＞0，可以通过二维广义交叉验证(Generalized Cross-Validation)的方法来估计，但是计算比较复杂。通过模拟分析a取3.7。

SCAD方法满足无偏性、稀疏性和连续性，且在选取了合适的正则化参数后，SCAD方法得到的估计量满足Oracle性质。

在根据本发明的一个实施方案中，所述HTR方法是通过式III计算实现的：

其中，y＝(y₁，y₂，...，y_n)^T∈Rⁿ为响应变量向量。以石斛数据为例，每种石斛有两个响应变量序列(夏佛托苷(μg/g)、柚皮素(μg/g))。响应变量受自变量的影响，一般情况下y为连续变量。

β＝(β₁，β₂，...，β_p)^T是一个p维的参数。

K-fold CV：

一般，K可取为5或10。

GCV准则是CV准则中的K取n时的一种近似情形，定义为：

HTR方法采用L₀惩罚项，具有稀疏性和无偏性的优点，但是不具备连续性。

本发明还提供了上述方法在铁皮石斛质量控制中的应用。

在上述铁皮石斛质量控制中所述铁皮石斛可以为鲜品或干品。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

(a)本发明采用SCAD和HTR方法，对铁皮石斛指纹图谱进行变量选择，有效的解决了“维数灾难”的问题；

(b)本发明对原有指纹图谱进行降维，建立铁皮石斛化学小分子成分的相关特征指纹图谱，对单一化学小分子成分的含量解释针对性和适用性更强；

(c)本发明通过铁皮石斛化学小分子成分的相关特征指纹图谱，实现化学小分子成分含量的关联性分析，能有效鉴别、控制和评价铁皮石斛药材的质量。

附图说明

图1为铁皮石斛指纹图谱色谱图；

图2a为铁皮石斛中夏佛托苷(1号峰)的检测图谱；

图2b为铁皮石斛中柚皮素(2号峰)的检测图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1铁皮石斛的提取方法

取铁皮石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取石斛粉末1.000g(称量误差不能超过0.2％)，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL 75％甲醇(V_水∶V_甲醇＝25∶75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V_水∶V_甲醇＝25∶75)溶解，最后转移至10ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得铁皮石斛样品溶液。

实施例2铁皮石斛提取物的色谱检测方法

1.铁皮石斛的小分子成分含量测定样品提取处理方法：

取本品粉末(过三号筛)1.00g，精密称定，置100ml容量瓶中，精密加甲醇-水(75∶25)50ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用5ml甲醇-水(75∶25)溶解，上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.对照品溶液制备

分别精密称定夏佛托苷4.10mg、柚皮素4.08mg，分别置于10ml容量瓶，加75％甲醇溶解稀释，摇匀，作为储备液。于4℃冰箱内冷藏备用。

再分别精密吸取一定量的对照品储备溶液，加75％甲醇稀释，分别准确配制夏佛托苷、柚皮素对照品溶液。通过不同的稀释比例，稀释制备成分7个浓度点。注入高效液相色谱仪。

3.铁皮石斛小分子成分含量测定色谱条件：

色谱条件

G含量测定色谱条件：Grace Allitima C18色谱柱；流动相采用二元梯度洗脱系统，A相：0.2％醋酸-水，B相：乙腈；以波长290nm测定柚皮素，以波长334nm测定夏佛托苷，参比波长500nm，柱温30℃；流速1.0mL/min，进样量20μL；洗脱梯度如表1所示。

表1洗脱梯度表

图1所示为铁皮石斛全成分指纹图谱色谱图，检测波长280nm；；图2a为铁皮石斛中夏佛托苷(1号峰)的检测图谱；图2b为铁皮石斛中柚皮素(2号峰)的检测图谱。

实施例3铁皮石斛中与夏佛托苷的相关特征指纹图谱的建立。

1.石斛样品溶液制备

取石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取石斛粉末1.000g(称量误差不能超过0.2％)，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL 75％甲醇(V_水∶V_甲醇＝25∶75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V_水∶V_甲醇＝25∶75)溶解，最后转移至10ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。表2为对照品夏佛托苷线性关系。

表2对照品夏佛托苷线性关系表

2.铁皮石斛夏佛托苷的相关特征指纹图谱的建立方法

采用线性模型，p＝2207个，样本量n＝186个，p＞＞n，故变量筛选是较为重要的工作。本研究采用SCAD方法筛选变量。

SCAD方法筛选所得自变量有19个，R-square为0.8775。

SCAD方法筛选所得自变量及其相应系数如表3所示，其中第一列为入选自变量编号，第二列为相应系数，第三列为系数方差，第四列为检验p值。

表3：SCAD方法所得入选自变量及其相应系数

以夏佛托苷为响应变量结果：SCAD方法的R方能达到0.87以上，入选自变量p值均小于0.05。上述自变量的含义：铁皮石斛n批次样本(n不小于10)的指纹图谱根据保留时间对齐后的指纹图谱峰面积值，如X625即是样本容量中的n批次样本(n不小于10)在相同保留时间下的第625项对齐的指纹图谱峰面积值

综合来看，可采用19个自变量如表4所示(按相关系数程度从大到小排)。

表4：19个筛选后的自变量

X1331

X1112

X1288

X952

X1270

X1292

X1768

X1336

X1261

X1818

X625

X1695

X1981

X1524

X1215

X1788

X765

X1082

X988

实施例4铁皮石斛柚皮素的相关特征指纹图谱的建立

1.对照品溶液制备

精密称定柚皮素4.08mg，置于10ml容量瓶，加75％甲醇溶解稀释，摇匀，作为储备液。于4℃冰箱内冷藏备用。再精密吸取一定量的对照品储备溶液，加75％甲醇稀释，准确配制柚皮素对照品溶液。通过不同的稀释比例，稀释制备成分7个浓度点，注入高效液相色谱仪。表5为得到的对照品柚皮素线性关系。

表5对照品柚皮素线性关系表

2.柚皮素相关特征指纹图谱的建立

采用线性模型，由于初始自变量p＝2207个，样本量n＝186个，p＞＞n，故变量筛选是较为重要的工作。本研究采用HTR方法筛选变量。

HTR方法筛选所得自变量有22个，R-square为0.8185。

HTR方法筛选所得自变量及其相应系数如表6所示，其中第一列为入选自变量编号，第二列为相应系数，第三列为系数方差，第四列为检验P值。

表6：HTR方法所得入选自变量及其相应系数

HTR方法的R方能达到0.81以上，入选自变量p值均小于0.05。

综合来看，可采用22个自变量如表7所示。

表7：22个筛选后的自变量

上述自变量的含义：铁皮石斛的n批次样本(n不小于10)的指纹图谱根据保留时间对齐后的指纹图谱峰面积值，如X474即是n批次样本在相同保留时间下的第474项对齐的指纹图谱峰面积值。

实施例5铁皮石斛化学小分子成分的相关特征指纹图谱在铁皮石斛质量评价中的应用

1.供试品测定样品的制备

精密称取铁皮石斛粉末，置100ml容量瓶中，每1g样品精密加体积比为75∶25的甲醇-水50ml，以250W功率、40kHz频率超声处理30分钟，冷却后过滤，将滤液旋蒸浓缩至干，每1g铁皮石斛粉末对应地用5ml体积比为75∶25的甲醇-水溶解，上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得铁皮石斛的小分子成分含量测定样品；

2.色谱检测

色谱条件：

色谱柱：Grace Allitima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：A相：0.4％乙酸+20mmol/L醋酸铵水溶液，B相：乙腈；梯度洗脱：0～12min：2％～15％B相，12～35min：15％～24％B相，35～45min：24％～36％B相，45～60min：36％～75％B相，60～80min：75％～95％B相；

流速1.0mL/min；

柱温30℃；

进样量20μL；

检测波长280nm。

样品制备方法：

在检测时以波长280nm测定全成分指纹图谱，将得到的全成分指纹图谱与图1为对照的指纹色谱图进行相似度比对；；相似度大于0.85为质量合格。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.一种铁皮石斛的化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述相关特征指纹图谱的建立方法包括：

1)对样本容量为n的样本分别进行色谱检测，获取以化学小分子成分夏佛托苷和/或柚皮素作为参照成分的检测数据，所述n为不小于10的整数；

2)对样本分别进行指纹图谱检测，获取以铁皮石斛的全化学成分的指纹图谱峰面积值；

3)以夏色谱数据中夏佛托苷和/或柚皮素的成分含量值作为响应变量，将指纹图谱中其它成分的峰面积值作为自变量建立分析模型，进行主成分提取和回归计算，建立小分子成分与指纹图谱线性回归模型，并得到回归方程；

2.如权利要求1所述的化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1)所述的色谱检测还包括铁皮石斛样品处理方法：

所述样品处理方法包括：

3.如权利要求1或2所述的化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1)所述的色谱检测的检测条件包括：

含量测定色谱条件：Grace Allitima C18色谱柱；流动相采用二元梯度洗脱系统，A相：0.2％醋酸-水，B相：乙腈；以波长290nm测定柚皮素，以波长334nm测定夏佛托苷，参比波长500nm，柱温30℃；流速1.0mL/min，进样量20μL；洗脱梯度为：

4.如权利要求1～3中任一项所述的化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2)中所述的建立分析模型包括以下步骤：

a)当色谱数据呈现超高维情形时，采用以下SIS(Sure IndependenceScreening)方法通过式I将超高维降到d(d≤n)维；其中，d＝n或者

M_γ＝{1≤i≤p：|ω_i|是前|γn|个比较大的}

式I

其中，M_*＝{1≤i≤p：β_i≠0}表示真模型中非零系数的下标集；s＝|M_*|表示非零系数的个数；ω＝(ω₁，ω₂，...，ω_p)^T＝X^Ty；当p＞n且对某个ξ有log p＝O(n^ξ)，M_*与M_γ之间有以下联系：对于任意给定的γ∈(0，1)，ω的p个元素按绝对值从大到小排列并且定义；此时|γn|＜n，选取M_γ中下标对应的自变量；

b)在SIS方法降维之后，采SCAD(Smooth Clipped Absolute Deviation)方法和/或HTR(Hard Thresholding Rule)方法筛选变量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述SCAD方法是通过式II计算实现的：

其中，p为样本的维数，n为样本容量；

β＝(β₁，β₂，...，β_p)^T是一个p维的参数；

当p＞n时，存在其中λ≥0是一个惩罚参数；为惩罚函数；λ为调整参数，所述调整参数通过K折交叉验证法选择。

惩罚函数p_λ(β)的导函数p′_λ(β)满足α＞2，β＞0。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SCAD方法的计算函数中α＝3.7。

7.根据权利要求4所述的化学小分子成分的相关特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述HTR方法是通过式III计算实现的：

其中，其中，p为样本的维数，n为样本容量；

β＝(β₁，β₂，...，β_p)^T是一个p维的参数；

为惩罚函数；λ为调整参数，所述调整参数通过K折交叉验证法选择。

8.一种铁皮石斛质量评价的方法，其特征在于，通过根据权利要求1～7中任一项所述的方法获得的相关特征指纹图谱与供试品的指纹图谱进行相似度比对，相似度大于0.85为质量合格。

9.如权利要求8所述的铁皮石斛质量评价方法，其特征在于，所述供试品的处理方法为：

精密称取铁皮石斛粉末，置100ml容量瓶中，每1g样品精密加体积比为75∶25的甲醇-水50ml，以250W功率、40kHz频率超声处理30分钟，冷却后过滤，将滤液旋蒸浓缩至干，每1g铁皮石斛粉末对应地用5ml体积比为75：25的甲醇-水溶解，上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得铁皮石斛的小分子成分含量测定样品。

10.如权利要求8或9所述的铁皮石斛质量评价方法，其特征在于，所述供试品的色谱检测条件为：

Grace Allitima C18色谱柱，优选为250mm×4.6mm，5μm规格的色谱柱；流动相：A相：0.4％乙酸+20mmol/L醋酸铵水溶液，B相：乙腈；梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量20μL；检测波长280nm；所述梯度洗脱的洗脱条件为：

0～12min，2％～15％B相；

12～35min，15％～24％B相；

35～45min，24％～36％B相；

45～60min，36％～75％B相；

60～80min，75％～95％B相。