CN105138861B - 一种大黄药材真伪及基源种属类别预测模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种大黄药材真伪及基源种属类别预测模型的构建方法，该模型基于气质联用技术结合偏最小二乘判别分析，实现大黄正品与伪品及三个种的分类鉴别，包括以下步骤：（1）样品的收集；（2）样品的制备方法；（3）GC‑MS数据的采集；（4）数据处理及多变量分析，通过比较不同来源大黄色谱行为的差异，进行聚类分析及主成分分析；（5）预测模型的构建；（6）模型的验证。本发明构建的两个类别预测模型，经验证具有100%的识别和预测准确性，本方法通过建模实现大黄真伪及种属鉴别，结论可靠，整体性强，克服了现行方法的缺陷，为大黄药材及饮片的真伪、种属鉴别提供了一种更易行、可靠的新思路。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量控制领域，具体涉及一种通过构建类别预测模型实现多种来源大黄药材及饮片的分类鉴别方法，是基于气质联用方法并结合偏最小二乘判别分析法建立预测模型，实现大黄正品与伪品的分类鉴别及药典收载的三个种大黄的分类鉴别。
背景技术
大黄为常用中药，有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄的功效。大黄为多基源药材，品种较多，2015版《中国药典》一部规定的蓼科植物掌叶大黄Rheumpalmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheumofficinale Baill.的干燥根及根茎，可作为正品大黄使用。藏边大黄(Ｒ. emodi Wall.)，华北大黄(Ｒ. franzenbachiiMunt. )，河套大黄(Ｒ. hotaoense C. Y. Chenget C.T. Kao)，羊蹄(Ｒ. japonicus Houtt.) 等为常见的伪品大黄。大黄分布广泛，化学成分复杂，以蒽醌类成分为主，还含有二苯乙烯苷类、色酮类、萘酚苷类、鞣质类等。现行标准中正品与伪品大黄的鉴别以土大黄苷作为检测指标，但有研究指出，药用大黄也含有一定量的土大黄苷，这种方法已受到质疑。三个种大黄的鉴别，通常采用性状和显微鉴别方法，但由于受显微特征相似度高及基源鉴别经验要求高的影响，应用较困难，市售大黄饮片鉴别难度更大。近年来采用指纹图谱方法整体评价大黄的质量研究较多，通过相似度分析、聚类分析和主成分分析等化学计量学分析手段在一定程度上可区分正品与伪品大黄，但它对多基源药材的质量评价有一定局限性，无法对未知来源的药材做出判断，不能实现大黄3个种的分类鉴别。
发明内容
本发明的目的是通过构建类别预测模型，提供一种用于中药材及饮片来源鉴别的方法，具体是将以统计分析方法为基础的类别预测模型用于中药材及饮片的鉴别研究，构建区分大黄正品与伪品、三个不同种的类别预测模型。
为此，本发明提供的大黄类别预测模型的构建方法，包括以下步骤：
（1）不同来源大黄药材的收集及鉴定，包括三个不同种大黄及常见伪品大黄，用于模型训练和验证。
（2）大黄测试溶液的制备。
（3）气相色谱质谱数据的采集，通过气质联用仪，采集大黄测试溶液的总离子流图。
（4）数据处理：通过NIST AMDIS（自动质谱解卷积和鉴定系统）和Agilent MassProfiler Professional (MPP) 多变量统计分析软件对气相色谱质谱数据进行处理。通过进行丰度过滤、时间对齐和质量数校正、分组匹配、频率过滤、模式识别等，根据不同来源大黄色谱图的差异性比较，进行主成分分析及聚类分析。
（5）类别预测模型的建立：采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）法，通过多变量关系的筛选、离子特征的提取，建立大黄正品与伪品及三个种的区分模型。
（6）预测模型的验证：通过交叉验证方法，对模型的识别和预测准确性进行验证。
根据本发明的方法，步骤（2）中所述大黄样品溶液制备方法具体为：将大黄药材粉碎过5号筛，精密称取1.0g, 用甲醇20mL超声提取0.5h, 离心，取200μL上清液，蒸干，用1mL丙酮溶解，0.22μm滤膜滤过, 得供试品溶液。取大黄对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
根据本发明的方法，步骤（3）中所述的气相色谱质谱数据的采集方法具体为：GC采用DB-5MS 色谱柱，进样量1 μL，分流/不分流进样口温度250 ℃，柱箱程序升温，70 ℃ 保持0.5 min，以8 ℃/min 升至280℃，保持10 min，载气为氦气，恒流，1.0 mL/min，传输线温度270 ℃，MS 条件为离子化模式EI方式，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描范围50 - 800 m/z。
根据本发明的方法，步骤（5）中所述的类别预测模型的建立方法，具体步骤为：（a）质量控制：采用聚类分析（CA）和主成分分析（PCA），对训练集样品进行无监督的统计分析，直观的表征样品的分类情况，并确定有无离群样本。通过筛选数据和质量控制分析的数据用于创建样品预测模型。（b）PLS-DA分类预测模型的建立：通过数据的筛选，采用偏最小二乘判别分析法建立用于类别预测的多变量模型，采用该模型，可以实现大黄的正品与伪品以及3个不同种的分类预测。
根据本发明的方法，步骤（6）中所述的模型验证方法采用交叉验证方法，通过训练集样品和测试集样品进行模型验证。
附图说明
图1为本发明提供的大黄药材及饮片真伪及基源种属类别预测模型构建方法流程图即大黄药材及饮片真伪及基源种属分类预测模型构建方法流程图。
图2为本发明提供的大黄样品的气相色谱质谱总离子流图即样品溶液GC-MS总离子流图。
图3为本发明提供的聚类(CA)分析图即大黄样品聚类分析图。
图4为本发明提供的主成分(PCA)分析得分图即PCA分析得分图。
图5为本发明提供的正品与伪品大黄区分模型的PLS-DA t得分图即正品与伪品大黄区分模型的PLS-DA t得分图(A为伪品大黄，B为正品大黄)。
图6为本发明提供的药典收载的3个不同种大黄区分模型的PLS-DA t得分图即3个不同种大黄区分模型的PLS-DA t得分图(A为唐古特大黄，B为掌叶大黄，C为药用大黄)。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
A 样品、仪器与试药
仪器与试药：Agilent 6890GC/5973MS（Agilent公司）。甲醇、丙酮为Merk公司色谱纯试剂。
样品：本研究共收集大黄药材及饮片共27批（S1-S27），经鉴定，来源包括掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄、藏边大黄、华北大黄等，详见表1。唐古特大黄对照药材（批号120902-200609）、掌叶大黄对照药材（批号121249-201304）、药用大黄对照药材（批号120984-201202），土大黄对照药材（批号121291-201102），华北大黄（批号121676-201201）来自中国食品药品检定研究院。
表1 不同来源的大黄样品
B 试验部分
GC条件：色谱柱：DB-5ms 5%phenyl Methyl Siloxane（30m×0.25m m×0.25 μm）；分流/不分流进样口温度250 ℃，进样量1 μL，柱箱程序升温，70 ℃ 保持0.5 min，以8 ℃/min 升至280℃，保持10 min，载气为氦气，恒流，1.0 mL/min，传输线温度270 ℃。
MS 条件：离子化模式EI，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，采集方式，全扫描，扫描范围50 -800 m/z。
供试品溶液的制备：将大黄药材粉碎过五号筛, 精密称取药材粉末1.0g, 用甲醇20mL超声提取0.5h, 离心，取200μL上清液，蒸干，用1mL丙酮溶解，0.22μm滤膜滤过, 得供试品溶液。取大黄对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
C 数据处理：使用NIST AMDIS（自动质谱解卷积和鉴定系统）将GC-MS数据转换格式，导入MPP系统中。
D 结果
样品S1-S27经鉴别已确认种的归属，因此样品S1-S21用于模型建立，S22-S27用于模型验证。PCA分析和预测模型的建立均使用S1-S21号样品和5个对照药材来完成。
样品质量控制-聚类分析（CA）
将所有样品在三个波长下色谱峰的保留时间和峰面积导入MPP软件，采用Hierarvhical（分层聚类）算法进行无监督的聚类分析，聚类分析结果见图3。
聚类分析图中左侧代表所有差异化合物的信息列表，右侧为部分放大效果差异化合物列表，在横向上表明了各样品与样品之间的亲疏关系，纵向上表明各化合物之间的亲疏关系，不同颜色代表样品中化合物峰面积的高低（红色为高、黄色中等、蓝色低）。从聚类分析图中可以看出，三个华北大黄很明显的聚在一起，而由于藏边大黄与正品和其他伪品大黄成分差异较大，单独聚成一类。正品大黄聚在一起，但种与种之间分类不明显。从聚类分析图左侧图中可以看出所有样品间化合物差异明显。
主成分分析（PCA）：
使用MPP软件对大黄样品各化合物成分进行主成分分析（PCA），图4为PCA分析图。主成分分析结果显示前3个主成分PC1、PC2、PC3的对应特征值累计贡献率为83.92%，其中PC1为39.05%、PC2为26.18%、PC3为19.68%，基本可以表征所涉及化学成分的大部分信息。从PCA分析得分图可直观的看到伪品大黄中的藏边大黄由于与其他样品差异较大，较离散，其他样品观测变量离散较小，由于藏边大黄是典型的伪品大黄的一种，因此本研究未将藏边大黄作为离群样本，所有样本均用于判别分析模型的建立。从主成分分析图也可发现3种不同种大黄及正品、伪品大黄并没有聚合成完全分离的团，由于主成分分析属于无监督的分析模式，聚类时没有考虑类别信息，对类别特征信息区分不明显，因此进一步对这些样本进行有监督的PLS-DA分析。
PLS-DA分类预测模型的建立：
根据聚类分析结果和主成分分析结果，不同来源的大黄化合物差异明显，为了进一步研究不同来源大黄的分类效果，利用MPP软件建立有监督的PLS-DA分类模型，对正品与伪品、三个不同种大黄分别进行模式识别。偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）是一种集主成分分析、典型相关分析和多元回归分析的基本功能为一体多元统计方法，分析过程可以消除众多化学信息中相互重叠的部分，使得分析数据更加准确可靠，同时避免了人为的以大黄主要成分来判断的不精确性和感官性。
a：正品与伪品大黄类别预测模型的构建：
将21批样品和5个对照药材进行分类，唐古特大黄、掌叶大黄和药用大黄归为正品大黄组，共18个样本及3个对照药材，其他归为伪品大黄组，共3个样本及2个对照药材。图3为PLS-DA t得分图。该图以图形化方式能较好的表现每个组别中样品的分离情况。从PLA-DA t得分图中，可以看出，正品与伪品大黄通过t0成分能达到良好分离，正品大黄得分为负，伪品大黄得分为正，其中藏边大黄样品与其他伪品大黄分散明显，与CA和PCA分析结果一致。
大黄3个种（唐古特大黄、掌叶大黄、药用大黄）类别预测模型的构建：
将21个样品和5个对照药材中正品大黄按不同种分类，其中唐古特大黄有6个样本及其对照药材，掌叶大黄有9个样本及其对照药材，药用大黄有3个样本及其对照药材，使用已验证的样本用于建立能区分不同种大黄的类别预测模型。图4为PLS-DA t得分图。从PLA-DA图中可以看出，通过t0成分，掌叶大黄得分为负，唐古特和药用大黄得分为正，能将掌叶大黄和其他两种大黄分离开，通过t1成分，唐古特大黄得分为正，药用大黄得分为负，能将药用大黄和唐古特大黄分离开，因此通过t0和t1成分能区分大黄的3个种。
E 分类预测模型的验证
通过交叉验证方法，采用模型训练集21个样本（S1-S21）及5个对照药材及6个测试集样本（S22-S27）对两个预测模型进行验证，识别和预测能力分别用样品准确归类的百分值来表示，分类结果见表2、表3。结果表明在模型建立和验证的过程中没有发生样品分类错误。正品与伪品大黄、3种正品大黄均得到了很好的区分，识别与预测准确率达到100%。
表2 正品大黄与伪品大黄预测模型的验证
| 样本 | 正品大黄 | 伪品大黄 | 准确度（%） |
| 模型建立 | |||
| 正品大黄 | 21 | 0 | 100 |
| 伪品大黄 | 0 | 5 | 100 |
| 识别能力（%） | / | / | 100 |
| 模型验证 | |||
| S22-S26 | 5 | 0 | 100 |
| S27 | 0 | 1 | 100 |
| 验证能力（%） | / | / | 100 |
表3 大黄3个种类别预测模型的验证
| 样本 | 唐古特大黄 | 掌叶大黄 | 药用大黄 | 准确度（%） |
| 模型建立 | ||||
| 唐古特大黄 | 7 | 0 | 0 | 100 |
| 掌叶大黄 | 0 | 10 | 0 | 100 |
| 药用大黄 | 0 | 0 | 4 | 100 |
| 识别能力（%） | / | / | 100 | |
| 模型验证 | ||||
| 掌叶大黄（S23-S26） | 0 | 4 | 0 | 100 |
| 药用大黄（S22） | 0 | 0 | 1 | 100 |
| 验证能力（%） | / | / | 100 |
Claims (3)
1.一种大黄药材及饮片真伪及基源种属类别预测模型的构建方法，其特征在于，该模型的建立是基于气相色谱质谱联用及偏最小二乘判别分析法，以已知真伪和种属的大黄药材及饮片样品作为模型的训练集和测试集建立模型，该方法包括如下步骤：
(1)不同来源大黄药材及饮片的收集，包括三个不同种大黄及常见伪品大黄，用于模型训练和测试；
(2)大黄测试溶液的制备：将药材粉碎过5号筛，精密称取1.0g，用甲醇20ml超声提取0.5h，离心，取200μl上清液，蒸干，用1ml丙酮溶解，0.22μm滤膜滤过,即得供试品溶液；
(3)气相色谱质谱原始数据的采集：GC采用DB-5MS色谱柱，进样量1μL，分流/不分流进样口温度250℃，柱箱程序升温，70℃保持0.5min，以8℃/min升至280℃，保持10min，载气为氦气，恒流，1.0mL/min，传输线温度270℃，MS条件为离子化模式EI方式，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，扫描范围50-800m/z；
(4)数据处理：数据通过NIST AMDIS自动质谱解卷积和鉴定系统和Agilent MassProfiler Professional(MPP)多变量统计分析软件对气相色谱质谱数据进行处理，将所有样品在三个波长下色谱峰的保留时间和峰面积导入MPP软件，采用Hierarvhical分层聚类算法进行无监督的聚类分析，得到聚类分析图，聚类分析图中左侧代表所有差异化合物的信息列表，右侧为部分放大效果差异化合物列表，在横向上表明了各样品与样品之间的亲疏关系，纵向上表明各化合物之间的亲疏关系，不同颜色代表样品中化合物峰面积的高低；通过丰度过滤、时间对齐和质量数校正、分组匹配、频率过滤、模式识别，根据不同来源大黄色谱图的差异性比较，进行无监督的主成分分析及聚类分析；
(5)类别预测模型的建立：
(a)质量控制：采用聚类分析CA和主成分分析PCA，对训练集样品进行无监督的统计分析，表征样品的分类情况，并确定有无离群样本，通过筛选数据和质量控制分析的数据用于创建样品预测模型：
(b)PLS-DA分类预测模型的建立：通过数据的筛选，采用偏最小二乘判别分析法建立用于类别预测的多变量模型，采用该模型，可以实现大黄的正品与伪品以及3个不同种的分类预测；
(6)模型的验证：通过交叉验证方法，通过训练集和测试集样品、对照药材对预测模型的识别和预测准确性进行验证，识别和预测能力分别用样品准确归类的百分值来表示。
2.如权利要求1所述的大黄药材及饮片真伪及基源种属类别预测模型的构建方法，其特征在于，样品的收集应体现多样性原则，大黄基源复杂、品种较多，混用品、伪品较多，因此建立模型用样品应品种覆盖面广，以保证标准的专属性。
3.如权利要求1所述的大黄药材及饮片真伪及基源种属类别预测模型的构建方法，其特征在于，数据的采集采用气质联用仪全扫描模式。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20181012 Termination date: 20210531 |