CN112505213B

CN112505213B - 一种清热养阴活血祛瘀口服液成分检测方法

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Publication number: CN112505213B
Application number: CN201911316276.XA
Authority: CN
Inventors: 张蕙; 夏云; 崔凌云; 汤茜; 李剑; 徐向阳; 周红燕; 田丽娟; 杨俊�; 刘文一; 蒋舒瑶; 倪洁
Original assignee: Jinling Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jinling Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN112505213A

Abstract

本发明公开了一种清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，包括：取口服液供试品溶液和标准品溶液进行HPLC检测，色谱条件：色谱柱为YMC Meteoric Core C18(100×3.0mm，2.7μm，8nm)，柱温25～40℃；以甲醇为流动相A，酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；二极管阵列检测器，绿原酸检测波长为327nm，肉桂酸检测波长为278nm；记录色谱图，用外标法计算脉络宁口服液中绿原酸和肉桂酸含量。本发明方法大大缩短了检验用时、简便可行、快速准确、减少检验压力，具有良好的精密度、线性关系、稳定性、重复性，回收率高，耐用性良好，可以作为评价脉络宁口服液质量的有效方法。

Description

一种清热养阴活血祛瘀口服液成分检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，特别涉及一种清热养阴活血祛瘀口服液成分检测方法。

背景技术

脉络宁口服液由金银花、山银花、石斛、牛膝、玄参等5味药材制成，具有清热养阴、活血化瘀的作用。用于血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症、静脉血栓形成等病。药理研究显示：脉络宁口服液具有保护心、脑血管组织、抗血栓形成、改善微循环及改善血液流变性等作用。

脉络宁口服液的药学研究相对比较薄弱，现行标准中含量测定只检测玄参中的指标性成分肉桂酸，中国药典一部金银花和山银花均进行了绿原酸的鉴别和含量测定，原剂型脉络宁注射液中也规定检测绿原酸含量。随着检验仪器精密度的提高，可以同时测定多个不同类型成分。因此，申请人拟在测定肉桂酸的同时，增加一个金银花和山银花共有的指标成分绿原酸的测定。目前，相关脉络宁口服液含量测定所用的色谱条件均是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，梯度洗脱，检测时间约为60分钟。实际检验过程中，考虑到多批次同时检测、样品稳定性等因素，存在检测用时过长、测定结果易出现偏差等情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种清热养阴活血祛瘀口服液成分的含量测定方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，包括：取脉络宁口服液供试品溶液以及标准品溶液进行HPLC测定，HPLC检测的色谱条件为：

色谱柱为YMC Meteoric Core C18(100mm×3.0mm，2.7μm，8nm)，柱温为25～40℃；以甲醇为流动相A，酸的水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～7min，15％A；7～8min，15％A→45％A；8～12min，45％A→55％A；12～17min，55％A；流动相流速为0.4～0.6mL/min，优选为0.45～0.55mL/min；二极管阵列检测器，绿原酸检测波长为327nm，肉桂酸检测波长为278nm；理论板数按肉桂酸峰计算均应不低于5000。

记录色谱图，用外标法计算脉络宁口服液中绿原酸和肉桂酸含量。

YMC Meteoric Core C18(长度100mm×内径3.0mm，粒径2.7μm，微孔径8nm)为小粒径、小口径核壳型色谱柱。其填料为核壳型材料，由坚硬的内核和多孔外壳组成，待分析物进入核壳型材料填充的色谱柱后，只需单纯通过环绕在填料颗粒表面的薄的多孔壳层。与整个全多孔填料颗粒相比，待分析物扩散要快，在填料颗粒孔道和流动相二者之间的平衡时间得以减少，即减少传质阻抗。使用YMC Meteoric Core色谱柱对脉络宁口服液中绿原酸、肉桂酸进行含量测定，不仅可以将样品检测时间缩短至20分钟，且绿原酸、肉桂酸分离效果好，大大降低了检测成本。

所述的酸为磷酸、甲酸或冰乙酸中的一种或两种以上的混合；优选为磷酸。

所述的酸水溶液中酸的体积百分数为0.05％～0.2％，优选为0.1％～0.2％。

所述的脉络宁口服液供试品溶液的制备方法：精密量取脉络宁口服液1mL，置于25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

所述的标准品溶液的制备方法：取绿原酸、肉桂酸对照品，精密称定，50％甲醇定容。

所述的标准品溶液为绿原酸、肉桂酸混合溶液。标准品溶液中绿原酸的浓度为20～200μg/mL，肉桂酸的浓度为0.2～20μg/mL。

优选的，所述的HPLC检测的色谱条件为：色谱柱为YMC Meteoric Core C18(100×3.0mm，2.7μm，8nm)，柱温为35℃；以甲醇为流动相A，酸的水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～7min，15％A；7～8min，15％A→45％A；8～12min，45％A→55％A；12～17min，55％A；流动相流速为0.5mL/min；二极管阵列检测器，绿原酸检测波长为327nm，肉桂酸检测波长为278nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于5000。

本发明的有益效果：

本发明含量测定方法具有良好的精密度、线性关系、稳定性、重复性，回收率高，耐用性良好。本发明采用YMC Meteoric Core C18色谱柱进行梯度洗脱程序，可在20分钟内实现对所测成分进行有效分离，选择二极管阵列检测器，同步对口服液中绿原酸、肉桂酸进行含量测定，该方法大大缩短了检验用时、简便可行、快速准确，减少检验压力，可以作为评价脉络宁口服液质量的有效方法。

附图说明

图1为肉桂酸对照品的HPLC色谱图。

图2为绿原酸对照品的HPLC色谱图。

图3为脉络宁口服液的HPLC色谱图。

图4为Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱的HPLC色谱图。

图5为phenomenex Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱的HPLC色谱图。

图6为Merck Chromolith RP-18Endcapped色谱柱的HPLC色谱图。

图7为HALO C18(100×3.0mm，2.7μm)色谱柱的HPLC色谱图。

图8为不同洗脱梯度下脉络宁口服液的HPLC色谱图。

图9为阴性溶液(缺金银花与山银花)HPLC色谱图。

图10为阴性溶液(缺玄参)HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明清热养阴活血祛瘀的脉络宁口服液成分的含量测定方法。特别需要指出的是，本发明的技术方案已经通过较佳实施例进行描述，本领域技术人员可以借鉴本文内容，在不脱离本发明内容、精神和范围内适当改进工艺参数实现，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；DAD检测器；BT-125D十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO)。

试药：脉络宁口服液(批号：150603)，金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂；肉桂酸对照品(批号：110786-200503)，中国食品药品检定研究院；绿原酸对照品(批号：110753-201415)，中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯)，Tedia；磷酸(分析纯)南京化学试剂股份有限公司；纯化水，自制。

实施例1

对照品溶液制备：参照脉络宁注射液及脉络宁口服液现行质量标准中对照品溶液制备方法，取肉桂酸对照品、绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶解并稀释，制成每1mL含绿原酸60μg、肉桂酸2μg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：精密量取脉络宁口服液1mL，置于25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液2μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件：色谱柱为YMC Meteoric Core C18(100mm×3.0mm，2.7μm，8nm)，柱温为35℃；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸为流动相B，梯度洗脱程序为：0～7min，15％A；7～8min，15％A→45％A；8～12min，45％A→55％A；12～17min，55％A；流动相流速为0.5mL/min；二极管阵列检测器，绿原酸检测波长为327nm，肉桂酸检测波长为278nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于5000；记录色谱图。

图1为肉桂酸对照品的HPLC色谱图，图2为绿原酸对照品的HPLC色谱图，图3为脉络宁口服液的HPLC色谱图。由图3可见，绿原酸、肉桂酸的出峰时间可缩短至20分钟以内，绿原酸、肉桂酸与相邻峰的分离度较好，可用于脉络宁口服液中绿原酸、肉桂酸的含量测定。

实施例2色谱柱考察

对照品溶液及供试品溶液制备同实施例1。

(1)、Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱

参照原脉络宁注射液质量标准含量测定项下玄参中肉桂酸的含量测定方法，采用Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，流速1.0mL/min，采用下列梯度洗脱程序(表1)进行梯度洗脱。

表1.梯度洗脱程序考察

由图4可见，各峰分离效果较好，但样品检测时间为60分钟以上，与本发明缩短检验用时的目的不符，增加检验成本。

将色谱柱替换为Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，参照实施例1测定法进行梯度洗脱，色谱峰出现堆积，无法实现分离。

(2)、phenomenex Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱

采用phenomenex Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，流速1.0mL/min，采用表1所列梯度洗脱程序进行梯度洗脱。

由图5可见，肉桂酸与相邻峰未能达到基线分离，其余各峰分离效果较好，且样品检测时间为60分钟以上，增加检验成本。

将色谱柱替换为phenomenex Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，参照实施例1测定法进行梯度洗脱，色谱峰出现堆积，无法完成分离。

(3)、Merck Chromolith RP-18Endcapped色谱柱

采用Merck Chromolith RP-18Endcapped色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，除色谱柱外，均与实施例1测定法相同。

由图6可见，出峰时间可缩短至20分钟以内，但绿原酸峰出现拖尾，肉桂酸峰与后面的小峰出现包裹，未能分离。

(4)、HALO C18(100×3.0mm，2.7μm)色谱柱

采用HALO C18(100×3.0mm,2.7μm)色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，除色谱柱外，均与实施例1测定法相同。

由图7可见，出峰时间可缩短至20分钟以内，但肉桂酸与后峰未达基线分离，分离度不符合规定。

由此可知，在其它条件不变的情况下，除了YMC Meteoric Core C18色谱柱外，不同品牌的小粒径十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱会出现峰包裹、分离度不符合药典规定等情况，色谱柱的系统适用性不能满足试验要求，故本发明使用YMC Meteoric Core C18(100mm×3.0mm，2.7μm，8nm)色谱柱。

实施例3梯度考察

对照品溶液及供试品溶液制备同实施例1。除调整梯度洗脱程序(见表2)，其余均与实施例1测定法相同。

表2.梯度洗脱程序考察

由图8可见，调整梯度洗脱程序后，可缩短出峰时间，但因为梯度过渡较快，各峰之间不能完全达到基线分离。

实施例4波长选择

参照脉络宁注射液质量标准含量测定项下玄参的含量测定方法，选择278nm为肉桂酸的测定波长；参照《中国药典》2015版第一部中金银花中绿原酸的含量测定方法，选择327nm为绿原酸的测定波长。

实施例5专属性考察

按脉络宁口服液处方分别制备阴性溶液1(缺金银花与山银花)和阴性溶液2(缺玄参)，按实施例1配制供试品溶液，分别精密量取2μL注入液相色谱仪，参照实施例1测定法，记录色谱图，见图9、图10。阴性溶液1(缺金银花与山银花)在绿原酸峰出峰时间处无吸收；阴性溶液2(缺玄参)在肉桂酸出峰时间处无吸收。

实施例6耐用性考察

(1)溶液稳定性考察

取供试品溶液，室温下保存，分别在0、2、4、6、8、12、18、24小时按实施例1测定法进行测定，考察供试品溶液中肉桂酸、绿原酸的稳定性，见表3。结果表明，样品在24小时内稳定。

表3.肉桂酸、绿原酸溶液稳定性试验结果

(2)不同流速考察

按实施例1测定法，调整流速，分别考察0.45mL/min、0.5mL/min、0.55mL/min的流速，见表4。结果表明，流速为0.5mL/min时分离度可满足要求，增加或减少时对肉桂酸、绿原酸的测定影响较小。

表4.不同流速的试验结果

(3)不同柱温考察

分别考察了色谱柱在32℃、35℃、38℃的分离效果，见表5。结果表明，不同柱温条件下对测定肉桂酸、绿原酸的测定影响较小。

表5.不同柱温的试验结果

(4)保护柱的考察

分别考察色谱柱在接入保护柱、不接入保护柱时的分离效果，见表6。结果表明，保护柱的接入与否对测定肉桂酸、绿原酸的测定影响较小。

表6.保护柱的试验结果

实施例7线性关系考察

取肉桂酸、绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶解并稀释，制成每1mL中含肉桂酸105.2g的溶液为贮备液1、每1mL含绿原酸308.8g的溶液作为贮备液2；分别精密量取不同量的贮备液1、贮备液2混合，加50％甲醇制成不同浓度的对照品溶液。精密量取上述对照品溶液各2μL，进行测定，分别以对照品的浓度为横坐标，肉桂酸、绿原酸峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到肉桂酸、绿原酸的线性回归方程。

各对照品线性范围、回归方程和相关系数见表7。

表7.各对照品线性范围、回归方程和相关系数

成分	线性范围(μg/mL)	回归方程	相关系数R<sup>2</sup>
				绿原酸	15.44～154.4	A＝11.92C-6.423	1.000
肉桂酸	1.052～31.56	A＝31.55C+1.7	1.000

实施例8精密度试验

(1)重复性试验

制备供试品溶液6份，按实施例1项下色谱条件进行测定，计算供试品中肉桂酸、绿原酸含量以及其相对标准偏差，结果见表8。

表8.重复性试验结果(n＝6)

(2)中间精密度试验

在与重复性试验不同日期，不同仪器上，由不同人员制备供试品溶液6份，按实施例1项下色谱条件进行测定，计算供试品中肉桂酸、绿原酸含量及其相对标准偏差，结果见表9。

表9.中间精密度试验结果(n＝6)

将中间精密度试验的6个结果与重复性试验6个结果共12个结果进行统计，样品中肉桂酸含量为0.168mg/mL，RSD为0.63％(n＝12)；绿原酸含量为0.853mg/mL，RSD值为1.23％(n＝12)。

实施例9准确度试验

精密量取脉络宁口服液(批号：150603)1mL，置于25mL量瓶中，共9份，分别加入不同量的肉桂酸、绿原酸对照品溶液，分别加水稀释至刻度，按实施例1项下色谱条件进行测定，计算回收率及相对标准偏差，结果见表10、表11。结果表明，本法的加样回收率符合要求。

表10.肉桂酸加样回收率试验结果(n＝9)

表11.绿原酸加样回收率试验结果(n＝9)

实施例10样品含量测定

分别取30批脉络宁口服液，每批脉络宁口服液精密量取1mL至25mL量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。按实施例1项下色谱条件进行测定，结果见表12。

表12.30批脉络宁口服液中肉桂酸、绿原酸含量

Claims

1.一种清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，其特征在于包括：取脉络宁口服液供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，所述HPLC检测的色谱条件为：

色谱柱为YMC Meteoric Core C18，100mm×3.0mm，2.7μm，8nm；柱温为25～40℃；以甲醇为流动相A，酸的水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～7min，15％A；7～8min，15％A→45％A；8～12min，45％A→55％A；12～17min，55％A；流动相流速为0.4～0.6mL/min；二极管阵列检测器，绿原酸检测波长为327nm，肉桂酸检测波长为278nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于5000；

2.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，其特征在于所述的酸为磷酸、甲酸或冰醋酸中的一种或者两者以上的混合物；酸水溶液中酸的体积百分数为0.05％～0.2％。

3.根据权利要求2所述的清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，其特征在于所述的酸为磷酸。

4.根据权利要求2所述的清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，酸水溶液中酸的体积百分数为0.1％～0.2％。

5.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，其特征在于所述的HPLC检测的色谱条件为：色谱柱为YMC Meteoric Core C18，100mm×3.0mm，2.7μm，8nm；柱温为35℃；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，梯度洗脱程序为：0～7min，15％A；7～8min，15％A→45％A；8～12min，45％A→55％A；12～17min，55％A；流动相流速为0.5mL/min；二极管阵列检测器，绿原酸检测波长为327nm，肉桂酸检测波长为278nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于5000。

6.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，其特征在于所述的脉络宁口服液供试品溶液的制备方法：量取脉络宁口服液1mL，置于25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

7.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，其特征在于所述的标准品溶液的制备方法：取肉桂酸对照品、绿原酸对照品，精密称定，50％甲醇定容。

8.根据权利要求1或7所述的清热养阴活血祛瘀口服液含量测定方法，其特征在于所述的标准品溶液中绿原酸的浓度为20～200μg/mL、肉桂酸的浓度为0.2～20μg/mL。