WO2024140133A1 - 利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，检测方法包括以下步骤：高效液相色谱测定不同浓度的标准品工作液，绘制标准品质量浓度和峰面积的标准曲线；进一步换算标准品摩尔浓度与峰面积的标准曲线；根据当标准品与待测化合物具有相同生色团时，摩尔浓度相同时，吸光度相同，得到待测化合物质量浓度与峰面积的标准曲线；将测得的待测化合物峰面积代入，计算得到待测化合物质量浓度。检测方法使用标准品少，测定结果准确，同时也节省了对每个成分的标曲制定等一系列方法学考察的时间和成本，提升了方法开发效率。
Description
本发明涉及化合物测定方法技术领域，尤其涉及利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法。
复杂体系是经常出现在化学分析研究中的一种研究对象，广泛存在于食品、药品等各个领域。复杂样本往往含有很多结构类似物(包括同分异构体、同系物等)，具有相似的物理化学性质。在对复杂体系样本进行成分分析尤其定量评价时，需要对多成分进行定量分析来全面地表征复杂样本的质量。
多组分定量方法有两种，分别是传统的多标准品定量(多标曲法)和一个标准品定量多组分。实际应用中，多标曲法定量存在工作量大和标准品难以获得的难题，与部分标准品制备困难、结构不稳定、价格昂贵等有关，因此采用一个标准品定量多组分逐步成为研究热点，目前常见的方法是一测多评法。一测多评法于2006年首次被提出，即通过建立不同成分间的内在函数关系实现用一个标准品同时定量多个成分的目的，又称为一标多测法(single standard to determine multi-components，SSDMC)。目前基于液相色谱分析的一测多评法是多成分分析方法中的主要方法。
但是，应用过程中发现一测多评法仍存在着很多问题。比如：1)误差递增：一测多评法多组分定量分析中计算步骤较多，而每一步计算都会产生误差，因此，误差会逐级放大。2)样品中各组分成分之间需要相对校正因子来进行计算，而相对校正因子的影响因素较多，且计算所得值偏差较大，难以避免误差。3)内参物质选择：当内标物为样品中的痕量组分时，不同实验室所得相对校正因子差异较大，即相对校正因子的值波动较大，造成多组分含量测定的误差。因此，怎样简化复杂体系的多成分定量，同时提升方法开发的效率、提升方法准确性，这一问题仍待解决。
发明内容
本发明的目的在于提供利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，使用标准品少，测定结果准确，同时也节省了对每个成分的标曲制定等一系列方
法学考察的时间和成本，提升了方法开发效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，包括以下步骤：
1)高效液相色谱测定不同浓度的标准品工作液，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制得到标准品质量浓度和峰面积的标准曲线；
2)根据标准品质量浓度与摩尔浓度的关系，得到标准品摩尔浓度与峰面积的标准曲线；
3)根据当标准品与待测化合物具有相同生色团时，在标准品摩尔浓度Cr与待测化合物摩尔浓度C测相同时，标准品吸光度yr与待测化合物吸光度y测相同，以及待测化合物质量浓度与摩尔浓度的关系，得到待测化合物质量浓度与峰面积的标准曲线：
y测为待测化合物峰面积，x测为待测化合物质量浓度，Mr为标准品摩尔质量，M测为待测化合物摩尔浓度，a和b为参数；
将测得的待测化合物峰面积y测代入式(5)，计算得到待测化合物质量浓度x测。
优选的，步骤1)所述标准品质量浓度和峰面积的标准曲线为：
yr＝a xr(mg/mL)+b (1)，
yr＝a xr(mg/mL)+b (1)，
yr为标准品峰面积，xr为标准品质量浓度，a和b为参数。
优选的，步骤2)所述标准品质量浓度与摩尔浓度的关系为：
xr(mg/mL)＝1000*Mr*Cr(mmol/L) (2)，
xr(mg/mL)＝1000*Mr*Cr(mmol/L) (2)，
xr为标准品质量浓度，Mr为标准品摩尔质量，Cr为标准品摩尔浓度。
优选的，步骤2)所述标准品摩尔浓度与峰面积的标准曲线为：
yr＝a*1000*Mr*Cr(mmol/L)+b (3)，
yr＝a*1000*Mr*Cr(mmol/L)+b (3)，
yr为标准品峰面积，Cr为标准品摩尔浓度，Mr为标准品摩尔质量，a和b为参数。
优选的，步骤3)所述待测化合物质量浓度与摩尔浓度的关系为：
C测为待测化合物摩尔浓度，x测为待测化合物质量浓度，M测为待测化合物摩尔质量。
本发明提供了单一标准品定量具有相同生色团的多种化合物，也即利用单一标准品定
量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，首先，本发明所述检测方法使用标准品少，标准品大多昂贵，与采用多个标准品的多成分定量法相比，节省了费用，同时也节省了对每个成分的标曲制定等一系列方法学考察的时间和成本，提升了方法开发效率；本发明所述测定方法仅仅需要通过已有标准品的成分的标准曲线推算其余待定量成分的标准曲线，而已有的一测多评法需要测定有标准品的成分与其余各个待定量成分之间的相对校正因子，而相对校正因子受到成分浓度、实验条件等的影响较大，造成含量测定结果误差较大，同时，本发明所建立方法不需要测定不同成分之间的关系，不需要繁琐的校正因子对其他组分进行校正，避免了仪器、实验室等外部因素以及标准物质纯度等的内部因素的影响，节约了测定时间和成分，提升了定量方法开发的效率和准确性；此外，因本发明所述定量的标准曲线换算完全依赖于化合物的物理特征的摩尔质量，待测化合物一旦确定，摩尔质量则不变，因此，减少了不必要的误差，内参物选择自由，不需要考虑该化合物在样品中的含量。
图1为供试品人参药材饮片高效液相色谱仪色谱分析图(图1中1为人参皂苷Rg1；2为人参皂苷Re；3为人参皂苷Rf；4为人参皂苷Rb1；5为人参皂苷Rb2；6为人参皂苷RD)；
图2为人参皂苷结构图；
图3为实施例1与对比例2测定结果比较；
图4为供试品黄芩药材饮片高效液相色谱仪色谱分析图(图4中1为黄芩苷；2为汉黄芩苷；3为黄芩素)；
图5为黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素的分子结构图；
图6为实施例2与对比例4测定结果比较。
本发明提供了利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)高效液相色谱测定不同浓度的标准品工作液，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制得到标准品质量浓度和峰面积的标准曲线；
2)根据标准品质量浓度与摩尔浓度的关系，得到标准品摩尔浓度与峰面积的标准曲线；
3)根据当标准品与待测化合物具有相同生色团时，在标准品摩尔浓度Cr与待测化合
物摩尔浓度C测相同时，标准品吸光度yr与待测化合物吸光度y测相同，以及待测化合物质量浓度与摩尔浓度的关系，得到待测化合物质量浓度与峰面积的标准曲线：
y测为待测化合物峰面积，x测为待测化合物质量浓度，Mr为标准品摩尔质量，M测为待测化合物摩尔质量，a和b为参数；
将测得的待测化合物峰面积y测代入式(5)，计算得到待测化合物质量浓度x测。
在本发明中，步骤1)高效液相色谱测定不同浓度的标准品工作液，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制得到标准品质量浓度和峰面积的标准曲线，优选的，所述标准品质量浓度和峰面积的标准曲线为：
yr＝a xr(mg/mL)+b (1)，
yr＝a xr(mg/mL)+b (1)，
yr为标准品峰面积，xr为标准品质量浓度，a和b为参数。
在本发明中，步骤2)根据标准品质量浓度与摩尔浓度的关系，得到标准品摩尔浓度与峰面积的标准曲线，优选的，步骤2)所述标准品质量浓度与摩尔浓度的关系为：
xr(mg/mL)＝1000*Mr*Cr(mmol/L) (2)，
xr(mg/mL)＝1000*Mr*Cr(mmol/L) (2)，
xr为标准品质量浓度，Mr为标准品摩尔质量，Cr为标准品摩尔浓度；
优选的，步骤2)所述标准品摩尔浓度与峰面积的标准曲线为：
yr＝a*1000*Mr*Cr(mmol/L)+b (3)，
yr＝a*1000*Mr*Cr(mmol/L)+b (3)，
yr为标准品峰面积，Cr为标准品摩尔浓度，Mr为标准品摩尔质量，a和b为参数。
在本发明中，步骤3)根据当标准品与待测化合物具有相同生色团时，在标准品摩尔浓度Cr与待测化合物摩尔浓度C测相同时，标准品吸光度yr与待测化合物吸光度y测相同，以及待测化合物质量浓度与摩尔浓度的关系，得到待测化合物质量浓度与峰面积的标准曲线：
y测为待测化合物峰面积，x测为待测化合物质量浓度，Mr为标准品摩尔质量，M测为待测化合物摩尔质量，a和b为参数；
将测得的待测化合物峰面积y测代入式(5)，计算得到待测化合物质量浓度x测；优选的，步骤3)所述待测化合物质量浓度与摩尔浓度的关系为：
C测为待测化合物摩尔浓度，x测为待测化合物质量浓度，M测为待测化合物摩尔质量。
基于Lambert-Beer定律，摩尔吸光系数ε为1mol/L的溶液，液层厚度为1cm时的吸光度，同样浓度相同生色团的化合物，理论上其吸光度应相同；高效液相色谱法浓度与峰面积成比例，对于具有相同生色团的多个化合物，可用一个化合物的摩尔浓度标准曲线定量分析其他化合物。
用一个标准品建立一条以质量浓度为x，峰面积为y的标准曲线，按照质量浓度与摩尔浓度的换算，将标准曲线换算为以摩尔浓度为C，以峰面积为y的标准曲线，运用具有相同生色团的化合物当摩尔浓度相同时其吸光度相同的原理，对该标准曲线斜率进行换算，得出其他化合物的质量浓度标准曲线，继而利用换算得出的标准曲线实现其他化合物的定量，实现单标曲法定量含有相同生色团的化合物。
具体的公式推导过程如下：
假设某样品中含有i(i＝1,2,3,....,m,....,k)个成分，其结构中均含有相同的生色团，选取一个化合物r为内参物建立质量浓度与含量的标准曲线：
yr＝a xr(mg/mL)+b；
yr＝a xr(mg/mL)+b；
根据质量浓度与摩尔浓度的换算公式：
得出下式：
xr(mg/mL)＝1000*Mr*Cr(mmol/L)；
xr(mg/mL)＝1000*Mr*Cr(mmol/L)；
换算内参物的摩尔浓度与峰面积关系的标准曲线：
yr＝a*1000*Mr*Cr(mmol/L)+b；
yr＝a*1000*Mr*Cr(mmol/L)+b；
具有相同生色团的化合物在同一摩尔浓度下的吸光度值相同，即：
当时，
y测＝yr＝a*1000*Mr*Cr(mmol/L)+b，
换算待测化合物的质量浓度与峰面积的标准曲线：
其中，Mr、M测分别为内参化合物r和待测化合物的摩尔质量；根据此式，可依次计算出其他组分的含量。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
表1实施例1及实验所用原料来源
标准品溶液的制备：取Rg1人参皂苷，精密称定，甲醇溶解配成1mg/mL母液，于4℃保存备用；甲醇稀释Rg1，稀释后Rg1的浓度为：0.008、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5mg/mL；稀释倍数：125、100、20、10、5、2.5、2倍。
供试品溶液的制备：人参药材饮片粉碎过50目筛，取药粉0.5g，加入15mL甲醇，超声提取30min，过滤，滤渣再次加入15mL甲醇超声提取30min，用10mL的甲醇冲洗滤纸，重复3次，合并两次滤液，50℃旋蒸，蒸干，用10mL的甲醇溶解得到提取液，提取液在10000r下离心10min，过0.22微孔滤膜得到供试品溶液。
色谱条件：色谱柱为BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)，以乙腈(A)-水(B)为流动相梯度洗脱：0～8min，19％A；8～13min，19％～29％A；13～16min，29％A；16～23min，29％～40％A；23～26min，40％～19％A；流速0.3mL·min-1，柱温30℃，检测波长203nm，进样量2μL，样品室温度为10℃。
精密吸取供试品及单一标准品(Rg1)系列溶液各2μL注入高效液相色谱仪进行色谱分
析，采用本发明建立的检测方法计算人参药材中六种人参皂苷的含量。
结果：Rg1的标准线性方程为y＝1359.5x+1.9403，根据下述公式转化其余成分的标曲为如表2所示，摩尔系数定量结果如表3所示；
Mr为人参皂苷Rg1、M测为其他五种人参皂苷(Re，Rf，Rb1，Rb2，RD)的摩尔质量；
将仪器测得的峰面积y带入y＝1359.5x+1.9403中，计算得到Rg1的质量浓度x(mg/mL)，再根据对照供试品溶液制备方法，乘最终供试品溶液体积10mL，除以原药材粉末0.5g，得到Rg1在药材粉末中的百分含量，即表3中数据。
表2实施例1计算所得五种人参皂苷的标准曲线方程
表3实施例1本发明所述检测方法定量结果
对比例1
标准品溶液的制备：取Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rd人参皂苷，精密称定，甲醇溶解配成1mg/mL母液，于4℃保存备用；分别对Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、RD人参皂苷配置混合标准溶液进行稀释，混合标准溶液稀释倍数：125、100、20、10、5、2.5、2倍。
供试品溶液的制备：人参药材饮片粉碎过50目筛，取药粉0.5g，加入15mL甲醇，超声提取30min，过滤，滤渣再次加入15mL甲醇超声提取30min，用10mL的甲醇冲洗滤纸，重复3次，合并两次滤液，50℃旋蒸，蒸干，用10mL的甲醇溶解得到提取液，提取液在10000r下离心10min，过0.22微孔滤膜得到供试品溶液。
色谱条件：色谱柱为BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)，以乙腈(A)-水(B)为流动相梯度洗脱：0～8min，19％A；8～13min，19％～29％A；13～16min，29％A；16～23min，29％～40％A；23～26min，40％～19％A；流速0.3mL·min-1，柱温30℃，检测波长203nm，进样量2μL，样品室温度为10℃。
精密吸取供试品及混合标准品(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rd)系列溶液各2μL注入高效液相色谱仪进行色谱分析，采用多标曲法测定人参药材中六种人参皂苷的含量。
结果：各个成分的标准曲线方程如表4所示，对比例1多标曲测定结果与实施例1测定结果比较如表5所示，将仪器测得的峰面积y带入y＝1359.5x+1.9403中，计算得到Rg1的质量浓度x(mg/mL)，再根据对照供试品溶液制备方法，乘最终供试品溶液体积10mL，除以原药材粉末0.5g，得到Rg1在药材粉末中的百分含量，其他人参皂苷在药材粉末中的百分含量计算方法同Rg1，得表5中对比例1中含量数据。RSD％反应实施例1与对比例1多标曲测定结果的差异性。
表4对比例1测定所得六种人参皂苷的标准曲线方程
表5对比例1多标曲测定结果与实施例1测定结果比较
根据上述结果可知，与对比例1所述的传统多标曲法测定结果比较，本发明实施例1所述的测定方法同时检测人参中具有相同生色团的六种化学成分(人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rb2，RD)含量的方法，所得结果与传统的对比例1所述多标曲法测定结果接近，可用于人参中六种成分的准确测定。
对比例2
标准品溶液的制备：取Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rd人参皂苷，精密称定，甲醇溶解配成1mg/mL母液，于4℃保存备用；分别对Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、RD人参皂苷配置混合标准溶液进行稀释，混合标准溶液的稀释倍数：125、100、20、10、5、2.5、2倍。
供试品溶液的制备：人参药材饮片粉碎过50目筛，取药粉0.5g，加入15mL甲醇，超声提取30min，过滤，滤渣再次加入15mL甲醇超声提取30min，用10mL的甲醇冲洗滤纸，重复3次，合并两次滤液，50℃旋蒸，蒸干，用10mL的甲醇溶解得到提取液，提取液在10000r下离心10min，过0.22微孔滤膜得到供试品溶液。
色谱条件：色谱柱为BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)，以乙腈(A)-水(B)为流动相梯度洗脱：0～8min，19％A；8～13min，19％～29％A；13～16min，29％A；16～23min，29％～40％A；23～26min，40％～19％A；流速0.3mL·min-1，柱温30℃，检测波长203nm，进样量2μL，样品室温度为10℃。
精密吸取供试品及混合标准品(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rd)系列溶液各2μL，采用一测多评法测定人参药材中六种人参皂苷的含量。
相对校正因子测定：以Rg1为单一参考标准，根据式①分别计算出Re、Rf、Rb1、Rb2、RD五个成分在每个浓度点下的校正因子(RCF)，然后根据式②取平均值得到每个成分各自的相对校正因子(NRCF)；
其中，Arx和xrx分别代表人参皂苷Rg1的峰面积和质量浓度，A测x和x测x分别代表其他五种人参皂苷的峰面积和质量浓度，计算结果见表6。
将仪器测得的峰面积，表6中的相对校正因子以及计算出来的Rg1的质量浓度x(mg/mL)带入下述的公式：
其中Ar和xr分别代表人参皂苷Rg1的峰面积和质量浓度，A测和x测分别代表其他五种人参皂苷的峰面积和质量浓度，NRCF代表其他五种人参皂苷各自的相对校正因子(见表6)；然后根据以上步骤得到的其他五种人参皂苷各自的质量浓度x测，再根据对照供试品溶液制备方法，乘最终供试品溶液体积10mL，除以原药材粉末0.5g，得到其他五种人参皂苷在药材粉末中的百分含量，即表7中数据。
表6 Re、Rf、Rb1、Rb2、RD的相对校正因子
表7对比例1多标曲法和对比例2一测多评法测定结果比较
由以上对比例2结果(见表7)可知，相较于已有的一测多评法(见表5和图3)，本发明提供的实施例1所述同时检测人参中六种化学成分(人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rb2，RD)的方法测定结果与传统的多标曲法更为接近，即本发明所述的检测方法与多标曲法测定结果的RSD％等于或者小于一测多评法与多标曲法测定结果的RSD％(见表5，7，图3)，即定量结果更为准确，误差更小。且本发明所述的检测方法不用进行相对校正因子的测定，节省了工作量、提高了效率。
实施例2
表8实施例2及实验所用原料来源
标准品溶液的制备：取汉黄芩苷，精密称定，二甲基亚砜(DMSO)溶解配成1mg/mL母液，于4℃保存备用；DMSO稀释汉黄芩苷，稀释后浓度为：1、5、10、20、40、50、80、100、200、300、400μg/mL；稀释倍数：1000、200、100、50、25、20、12.5、10、5、3.33、2.5倍。
供试品溶液的制备：黄芩药材饮片粉碎过60目筛，取药粉0.1g，加入50mL 70％甲醇，超声提取15min(室温，40kHz)，提取液在10000r下离心10min，上清液过0.22微孔滤膜得到供试品溶液。
色谱条件：色谱柱为HSST3(100mm×2.1mm，1.8μm)，以0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相梯度洗脱：0～2min，78％～75％A；2～4min，75％A；4～6min，75％～68％A；6～7min，68％～60％A；7～8min，60％A；8～10min，60％～50％A；10～13min，50％～5％A；13～17min，5％～78％A流速0.35mL·min-1，柱温30℃，检测波长280nm，进样量1μL，样品室温度为10℃。
精密吸取供试品及单一标准品(汉黄芩苷)系列溶液各1μL注入高效液相色谱仪进行色谱分析，采用本发明建立的单标曲法计算黄芩药材中三种黄酮类成分的含量。
结果：汉黄芩苷的标准线性方程为y＝5.5879x-5.2928，根据下述公式，分别计算其余成分的标曲为如表9所示，含量测定结果如表10所示；
Mr为汉黄芩苷、M测为其他两种黄酮类成分(黄芩苷和黄芩素)的摩尔质量；
通过汉黄芩苷峰面积计算汉黄芩苷含量：将仪器测得的峰面积y带入y＝5.5879x-5.2928
中，计算得到汉黄芩苷的质量浓度x(mg/mL)，再对照供试品溶液制备方法，乘最终供试品溶液体积50mL，除以原药材粉末0.1g，得到汉黄芩苷在药材粉末中的百分含量。
计算黄芩苷和黄芩素含量：首先通过汉黄芩苷的标准线性方程y＝5.5879x-5.2928，根据公式(6)转化其余成分的标准曲线(见表9)；然后将仪器测得的黄芩苷和黄芩素峰面积y分别带入表9各自的标曲中，计算得到黄芩苷和黄芩素的质量浓度x(mg/mL)，再对照供试品溶液制备方法，乘最终供试品溶液体积50mL，除以原药材粉末0.1g，得到黄芩苷和黄芩素在药材粉末中的百分含量。
表9实施例2计算所得三种黄酮类成分的标准曲线方程
表10实施例2本发明所述检测方法定量结果
对比例3
标准品溶液的制备：取汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素，精密称定，汉黄芩苷用DMSO溶解，黄芩苷和黄芩素用甲醇溶解，各配成1mg/mL母液，于4℃保存备用；分别对汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素配置标准溶液进行稀释，汉黄芩苷稀释倍数：1000、200、100、50、25、20、12.5、10、5、3.33、2.5倍；黄芩苷稀释倍数：200、100、12.5、5、3.33、2.5倍；黄芩素稀释倍数：1000、500、250、100、66.67、50倍。
供试品溶液的制备：黄芩药材饮片粉碎过60目筛，取药粉0.1g，加入50mL 70％甲醇，超声提取15min(室温，40kHz)，提取液在10000r下离心10min，上清液过0.22微孔滤膜得到供试品溶液。
色谱条件：色谱柱为HSST3(100mm×2.1mm，1.8μm)，以0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相梯度洗脱：0～2min，78％～75％A；2～4min，75％A；4～6min，75％～68％A；6～7min，68％～60％A；7～8min，60％A；8～10min，60％～50％A；10～13min，50％～5％A；13～17min，5％～78％A流速0.35mL·min-1，柱温30℃，检测波长280nm，进样量1μL，样品室温度为10℃。
精密吸取供试品及混合标准品(汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素)系列溶液各1μL注入高效液相色谱仪进行色谱分析，采用多标曲法测定黄芩药材中三种黄酮类成分的含量。
结果：各个成分的标准曲线方程如表11所示，对比例3多标曲测定结果与实施例2本发明所述检测方法测定结果比较如表12所示。
表11对比例3测定三种黄酮类成分的标准曲线方程
表12对比例3多标曲测定结果与实施例2本发明所述检测方法测定结果比较
由对比例3可知，与常规的多标曲法测定结果比较，本发明实施例2提供的检测方法同时检测黄芩中具有相同生色团的三种化学成分(汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素)含量，所得结果RSD％均小于3％，表明该方法用于黄芩中有相同生色团的三种黄酮类成分的测定结果准确。
对比例4
标准品溶液的制备：取汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素，精密称定，汉黄芩苷用DMSO溶解，黄芩苷和黄芩素用甲醇溶解，各配成1mg/mL母液，于4℃保存备用；分别对汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素配置标准溶液进行稀释，汉黄芩苷稀释倍数：1000、200、100、50、25、20、12.5、10、5、3.33、2.5倍；黄芩苷稀释倍数：200、100、12.5、5、3.33、2.5倍；黄芩素稀释倍数：1000、500、250、100、66.67、50倍。
供试品溶液的制备：黄芩药材饮片粉碎过60目筛，取药粉0.1g，加入50mL 70％甲醇，超声提取15min(室温，40kHz)，提取液在10000r下离心10min，上清液过0.22微孔滤膜得到供试品溶液。
色谱条件：色谱柱为HSST3(100mm×2.1mm，1.8μm)，以0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相梯度洗脱：0～2min，78％～75％A；2～4min，75％A；4～6min，75％～68％A；6～7min，68％～60％A；7～8min，60％A；8～10min，60％～50％A；10～13min，50％～5％A；13～17min，5％～78％A流速0.35mL·min-1，柱温30℃，检测波长280nm，进样量1μL，样品室温度为10℃。
精密吸取供试品及混合标准品(汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素)系列溶液各1μL注入高效液相色谱仪进行色谱分析，采用多标曲法测定黄芩药材中三种黄酮类成分的含量。
相对校正因子测定：以汉黄芩苷为单一参考标准，根据下式计算出黄芩苷和黄芩素各自的相对校正因子(RCF)，
其中，kr代表汉黄芩苷的标曲斜率，k测代表黄芩苷和黄芩素的标曲斜率，结果见表13。
将仪器测得的峰面积，表13中的相对校正因子以及计算出来的汉黄芩苷的质量浓度x(mg/mL)带入下述的公式：
其中Ar和xr分别代表汉黄芩苷的峰面积和质量浓度，A测和x测分别代表黄芩素或黄芩苷的峰面积和质量浓度，RCF代表黄芩素和黄芩苷各自的相对校正因子(表13)
然后根据以上步骤得到的黄芩素和黄芩苷各自的质量浓度x测，再对照供试品溶液制备方法，乘最终供试品溶液体积50mL，除以原药材粉末0.1g，得到黄芩素和黄芩苷在药材粉末中的百分含量，即表14中数据。
表13黄芩苷和黄芩素的相对校正因子(RCF)
表14对比例3多标曲法和对比例4一测多评法测定结果比较
由对比例4可知，与常规的多标曲法测定结果对比，已有的一测多评法测定结果的RSD％大于本发明的实施例2所述检测方法的测定结果(见表12、表14和图6)。本发明
提供的同时检测黄芩中具有相同生色团的三种化学成分(汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素)的方法测定结果与多标曲法更为接近，表明定量结果更为准确，误差更小。
由以上实施例可知，本发明实施例2所述检测方法同时检测黄芩中具有相同生色团的三种化学成分(汉黄芩苷、黄芩苷和黄芩素)含量的方法，与多标曲法测定结果比较(表12)，证明本发明所述检测方法用于黄芩中三种成分的测定结果准确。相对于已有的一测多评法，本发明提供的检测方法测定结果与多标曲法更为接近，即定量结果更为准确。如表12，14，图6所示，进一步说明本发明建立的方法比已有的方法准确性更高，且不用进行相对校正因子或者多标曲的测定，节省了工作量提高了效率。
表15实施例1和实施例2各成分峰面积数值
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
- 利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)高效液相色谱测定不同浓度的标准品工作液，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制得到标准品质量浓度和峰面积的标准曲线；2)根据标准品质量浓度与摩尔浓度的关系，得到标准品摩尔浓度与峰面积的标准曲线；3)根据当标准品与待测化合物具有相同生色团时，在标准品摩尔浓度Cr与待测化合物摩尔浓度C测相同时，标准品吸光度yr与待测化合物吸光度y测相同，以及待测化合物质量浓度与摩尔浓度的关系，得到待测化合物质量浓度与峰面积的标准曲线：
y测为待测化合物峰面积，x测为待测化合物质量浓度，Mr为标准品摩尔质量，M测为待测化合物摩尔浓度，a和b为参数；将测得的待测化合物峰面积y测代入式(5)，计算得到待测化合物质量浓度x测。 - 如权利要求1所述利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，其特征在于，步骤1)所述标准品质量浓度和峰面积的标准曲线为：
yr＝axr(mg/mL)+b (1)，yr为标准品峰面积，xr为标准品质量浓度，a和b为参数。 - 如权利要求1所述利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，其特征在于，步骤2)所述标准品质量浓度与摩尔浓度的关系为：
xr(mg/mL)＝1000*Mr*Cr(mmol/L) (2)，xr为标准品质量浓度，Mr为标准品摩尔质量，Cr为标准品摩尔浓度。 - 如权利要求1所述利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，其特征在于，步骤2)所述标准品摩尔浓度与峰面积的标准曲线为：
yr＝a*1000*Mr*Cr(mmol/L)+b(3)，yr为标准品峰面积，Cr为标准品摩尔浓度，Mr为标准品摩尔质量，a和b为参数。 - 如权利要求1所述利用单一标准品定量测定具有相同生色团的多种化合物浓度的方法，其特征在于，步骤3)所述待测化合物质量浓度与摩尔浓度的关系为：
C测为待测化合物摩尔浓度，x测为待测化合物质量浓度，M测为待测化合物摩尔质量。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211726455.2 | 2022-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024140133A1 true WO2024140133A1 (zh) | 2024-07-04 |
Family
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