CN115326955A - 一种维血宁合剂的hplc检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种维血宁合剂及其中间品的HPLC检测方法，它包括如下步骤：1)对照品溶液制备；2)供试品溶液制备；3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪。本发明首次采用HPLC建立维血宁合剂中表儿茶素、木犀草素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、儿茶素和白藜芦醇8种成分的含量测定方法，并且采用外标法和一测多评法对比维血宁合剂的含量差异，验证实验方法的可行性。同时，通过建立3批维血宁合剂提取液、清膏、成品的指纹图谱，并识别出27个共有峰，建立从“中间体‑成品”的质量管理体系，完善了维血宁合剂的质量控制方法。

Description

一种维血宁合剂的HPLC检测方法
技术领域
本发明涉及一种维血宁合剂的HPLC检测方法。
背景技术
维血宁合剂收载于2020版《中国药典》一部，由虎杖、炒白芍、仙鹤草、地黄、鸡血藤、熟地黄、墨旱莲和太子参8味药材组成，具有滋养阴液、益气生血、清热解毒的功效，临床常用于外感风热所致的出血，血小板减少症，化疗后白细胞减少，小儿贫血等。
目前，对维血宁合剂的质量控制还停留在对方中单个成分进行定量研究，主要集中在大黄素、虎杖苷、芍药苷麦角甾苷和白藜芦醇等成分的定量。不能全面反映维血宁合剂整体质量。多组份整体质量控制已成为中药复方制剂质量控制发展的必由之路。
曹瑞等，维血宁的HPLC指纹图谱研究[J]，其只能测定维血宁中的虎杖苷,大黄素-8-O-β-D葡萄糖苷,大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖,大黄素和大黄素甲醚共5种成分，仍然不实现中药复方制剂维血宁合剂的高效的质量控制。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种维血宁合剂及其中间品的HPLC检测方法，它包括如下步骤：
1)对照品溶液制备：取儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和/或木犀草素对照品，加甲醇溶液溶解稀释成溶液，即得对照品溶液；
2)供试品溶液制备：取待检样品，加甲醇溶液溶解，过滤，取滤液作为供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水为流动相B；梯度洗脱程序0～5min，75％B；5～15min，75％B→65％B；15～25min，65％B→55％B；25～35min，55％B→40％B；35～45min，40％B→30％B；45～55min，30％B→20％B；55～60min，20％B→65％B；60～62min，65％B→75％B。
进一步地，步骤1)所述对照品与甲醇溶液的质量体积比为0.5～250μg：1ml。
进一步地，步骤2)所述待检样品和甲醇的体积比为1～5ml：1～50ml。
更进一步地，所述待检样品为维血宁合剂或其中间品。
更进一步地，所述中间品为维血宁合剂的原料药提取液或原料药提取液浓缩的清膏。
进一步地，步骤3)所述色谱条件中色谱柱：Acclaim120 C18，250mm×4.6mm,5μm，柱温30℃，进样量10～50μL，流速为1ml/min，检测波长：210nm。
进一步地，所述维血宁合剂及其中间品的指纹图谱中有应有27个共有特征峰，所述共有特征峰包含与儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和木犀草素相应的色谱峰。
本发明还提供了一种维血宁合剂及其中间品指标成分的含量测定方法，它包括如下步骤：
1)取维血宁合剂及其中间品，以及儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和/或木犀草素对照品，按前述方法检测；
2)按外标法以峰面积计算维血宁合剂及其中间品中儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和/或木犀草素的含量。
或：
1)取维血宁合剂及其中间品，以及儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、木犀草素对照品中的任意一种，按前述方法检测；
2)先按外标法以峰面积计算对照品对应成分含量，再使用相对校正因子计算待测样品中其余成分的含量。
进一步地：所述相对校正因子按照下述方法得到：
取儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和木犀草素对照品，根据前述方法检测，择一对照品为内参物，根据如下公式计算：
fs/i＝fs/fi＝As×Ci/(Ai×Cs)；式中As为内参物s峰面积，Cs为内参物s浓度，Ai为组分i峰面积，Ci为组分i浓度。
进一步地，所述内参物为虎杖苷时，虎杖苷与儿茶素的相对矫正因子为0.3754，虎杖苷与表儿茶素的相对矫正因子为0.3486，虎杖苷与染料木素的相对矫正因子为0.5887，虎杖苷与芒柄花素的相对矫正因子为0.6599，虎杖苷与槲皮素的相对矫正因子为0.5972，虎杖苷与白藜芦醇的相对矫正因子为0.5853，虎杖苷与木犀草素的相对矫正因子为0.5176。
本发明首次采用HPLC建立维血宁合剂中表儿茶素、木犀草素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、儿茶素和白藜芦醇8种成分的含量测定方法，并且采用外标法和一测多评法对比维血宁合剂的含量差异，验证实验方法的可行性。同时，通过建立3批维血宁合剂提取液、清膏、成品的指纹图谱，并识别出27个共有峰，建立从维血宁合剂“中间体-成品”的质量管理体系，完善了维血宁合剂的质量控制方法。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1维血宁合剂色谱图(1儿茶素2表儿茶素3虎杖苷4白藜芦醇5槲皮素6木犀草素7染料木素8芒柄花素A混合对照品ⅠB供试品C阴性样品
图2维血宁合剂指纹图谱(1～8儿茶素、表儿茶素、虎杖苷、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素)
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、试药、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明维血宁合剂中成分含量测定方法(外标法)
1)对照品溶液的制备
分别精确称取儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷和白藜芦醇对照品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，获得浓度为533μg·mL-1、531μg·mL-1、520μg·mL-1、530μg·mL-1、518μg·mL-1、1096μg·mL-1、559μg·mL-1的对照品储备液，再精确称取木犀草素于10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线处，得浓度为554μg·mL-1木犀草素对照品储备液；
分别吸取白藜芦醇、表儿茶素、儿茶素、木犀草素、染料木素、芒柄花素、槲皮素对照品储备液1mL、虎杖苷对照品储备液2mL加入到10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线，制成浓度分别为55.9μg·mL-1、53.1μg·mL-1、53.3μg·mL-1、55.4μg·mL-1、52.0μg·mL-1、53.0μg·mL-1、51.8μg·mL-1、219.2μg·mL-1的混合对照品溶液I
取混合对照品溶液I，用甲醇稀释配制成系列浓度的混合对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
精确吸取维血宁合剂2mL至25mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液过0.22μm微孔有机滤膜，即得；
3)分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
色谱柱：Acclaim120 C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为甲醇(A)-0.2％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～5min，75％B；5～15min，75％B→65％B；15～25min，65％B→55％B；25～35min，55％B→40％B；35～45min，40％B→30％B；45～55min，30％B→20％B；55～60min，20％B→65％B；60～62min，65％B→75％B；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1mL·min-1。
(4)以混合对照品溶液中儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和木犀草素质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，根据标准曲线计算维血宁合剂中各相应成分的含量。
实施例2本发明维血宁合剂中成分含量测定方法(一测多评法)
1)对照品溶液的制备
精确称取虎杖苷对照品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，获得浓度为1096μg·mL-1的对照品储备液；
吸取虎杖苷对照品储备液2mL加入到10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线，制成浓度为219.2μg·mL-1的对照品溶液I
取对照品溶液I，用甲醇稀释配制成系列浓度的对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
精确吸取维血宁合剂2mL至25mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液过0.22μm微孔有机滤膜，即得；
3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
色谱柱：Acclaim120 C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为甲醇(A)-0.2％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～5min，75％B；5～15min，75％B→65％B；15～25min，65％B→55％B；25～35min，55％B→40％B；35～45min，40％B→30％B；45～55min，30％B→20％B；55～60min，20％B→65％B；60～62min，65％B→75％B；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1mL·min-1。
(4)先以对照品溶液中虎杖苷质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算维血宁合剂中虎杖苷的含量；
再根据虎杖苷的含量，使用相对矫正因子计算维血宁合剂中白藜芦醇、表儿茶素、儿茶素、木犀草素、染料木素、芒柄花素和槲皮素的含量；
相对校正因子为：
相对校正因子测定结果
Figure BDA0003786925630000051
实施例3本发明维血宁合剂提取液中成分含量测定方法(外标法)
1)对照品溶液的制备
分别精确称取儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷和白藜芦醇对照品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，获得浓度为533μg·mL-1、531μg·mL-1、520μg·mL-1、530μg·mL-1、518μg·mL-1、1096μg·mL-1、559μg·mL-1的对照品储备液，再精确称取木犀草素于10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线处，得浓度为554μg·mL-1木犀草素对照品储备液；
分别吸取白藜芦醇、表儿茶素、儿茶素、木犀草素、染料木素、芒柄花素、槲皮素对照品储备液1mL、虎杖苷对照品储备液2mL加入到10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线，制成浓度分别为55.9μg·mL-1、53.1μg·mL-1、53.3μg·mL-1、55.4μg·mL-1、52.0μg·mL-1、53.0μg·mL-1、51.8μg·mL-1、219.2μg·mL-1的混合对照品溶液I
取混合对照品溶液I，用甲醇稀释配制成系列浓度的混合对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
精确吸取维血宁合剂提取液1mL至2mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液过0.22μm微孔有机滤膜，即得；
3)分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
色谱柱：Acclaim120 C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为甲醇(A)-0.2％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～5min，75％B；5～15min，75％B→65％B；15～25min，65％B→55％B；25～35min，55％B→40％B；35～45min，40％B→30％B；45～55min，30％B→20％B；55～60min，20％B→65％B；60～62min，65％B→75％B；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1mL·min-1。
(5)以混合对照品溶液中儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和木犀草素质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，根据标准曲线计算维血宁合剂提取液中各相应成分的含量。
实施例4本发明维血宁合剂清膏中成分含量测定方法(一测多评法)
1)对照品溶液的制备
精确称取虎杖苷对照品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，获得浓度为1096μg·mL-1的对照品储备液；
吸取虎杖苷对照品储备液2mL加入到10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线，制成浓度为219.2μg·mL-1的对照品溶液I
取对照品溶液I，用甲醇稀释配制成系列浓度的对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
精确吸取维血宁合剂清膏2mL至25mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液过0.22μm微孔有机滤膜，即得；
3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
色谱柱：Acclaim120 C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为甲醇(A)-0.2％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～5min，75％B；5～15min，75％B→65％B；15～25min，65％B→55％B；25～35min，55％B→40％B；35～45min，40％B→30％B；45～55min，30％B→20％B；55～60min，20％B→65％B；60～62min，65％B→75％B；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1mL·min-1。
(4)先以对照品溶液中虎杖苷质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算维血宁合剂中虎杖苷的含量；
再根据虎杖苷的含量，使用相对矫正因子计算维血宁合剂清膏中白藜芦醇、表儿茶素、儿茶素、木犀草素、染料木素、芒柄花素和槲皮素的含量；
相对校正因子为：
相对校正因子测定结果
Figure BDA0003786925630000061
Figure BDA0003786925630000071
以下通过实验例来说明本发明的有益效果：
试验例1
1实验材料
1.1仪器
LC-2030C 3D Plus高效液相色谱(日本岛津公司)；BP-121S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DL-1万用电炉(北京中兴伟业仪器有限公司)；PL-S40型超声波清洗机(东莞康士洁超声波科技有限公司)；JY3002电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)；XMTD-7000水浴锅(上海科恒实业发展有限公司)。
1.2试药
虎杖苷对照品(MUST-20060702)、白藜芦醇对照品(MUST-20102211)、木犀草素对照品(MUST-20102418)、染料木素对照品(MUST-20041422)、芒柄花素对照品(MUST-20033005)、儿茶素对照品(MUST-20073012)、槲皮素对照品(MUST-20101104)、表儿茶素对照品(MUST-20102910)均购自成都曼斯特生物制品有限公司，色谱甲醇购自赛默飞世尔科技中国有限公司，磷酸(分析纯)购自天津市天力化学试剂有限公司，Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯。
1.3样品
所有样品经陕西中医药大学药学院教授颜永刚鉴定为炒白芍Paeonialactiflora Pall.(20210101)、熟地黄Rehmannia glutinosa(Gaert.)Libosch.exFisch.et Mey.(20201201)、生地黄Rehmannia glutinosa(Gaetn.)Libosch.ex Fisch.etMey.(20210101)、太子参pseudostellaria radix.(20201101)、鸡血藤Spatholobussuberectus Dunn.(20191201)、墨旱莲Eclipta prostrata L.(20201101)、仙鹤草Agrimonia pilosa Ledeb.(20201101)、虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.(20201201),均购自陕西兴盛德药业有限责任公司。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为Acclaim120 C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为甲醇(A)-0.2％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～5min，75％B；5～15min，75％B→65％B；15～25min，65％B→55％B；25～35min，55％B→40％B；35～45min，40％B→30％B；45～55min，30％B→20％B；55～60min，20％B→65％B；60～62min，65％B→75％B；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1mL·min-1。
2.2维血宁合剂的制备
维血宁合剂：参照《中国药典》一部和课题组前期实验制备工艺，称取虎杖28.58g、炒白芍17.83g、仙鹤草35.74g、地黄28.56g、鸡血藤35.72g、熟地黄28.57g、墨旱莲10.74g、太子参14.32g，将以上八味药材称量后，加9倍量水浸泡0.5h，煮沸2h后滤过，得第一次滤液，再加7倍量水，煮沸2h，滤过后得第二次滤液，合并两次滤液，滤液浓缩至相对密度约为1.10(60℃)的稠膏，加入炼蜜99.35g、尼泊金乙酯0.19g、香精0.06mL，磁力搅拌器搅拌5min，滤过，制成270mL，即得维血宁合剂成品。
维血宁合剂提取液：按上述比例称取虎杖、白芍、仙鹤草、地黄、鸡血藤、熟地黄、墨旱莲、太子参等8味药加入9倍量水浸泡0.5h，煮沸2h后滤过，得第一次滤液，向滤渣中加入7倍量水煮沸2h，过滤后得滤液，合并两次滤液，共计5.55L，作为维血宁合剂提取液。
维血宁合剂清膏：按照上述药材比例称取虎杖、白芍、仙鹤草、地黄、鸡血藤、熟地黄、墨旱莲、太子参等8味药加9倍量水浸泡0.5h，煮沸2h，及时滤过后得滤液，再向滤渣中加入7倍量水，煮沸2h，滤过得滤液，弃去药渣，合并两次滤液，将滤液通过分子量为30KD的超滤膜片，控制压力为0.3Mpa，收集膜分离液，再将分离液浓缩即得清膏。
2.3溶液的制备
2.3.1对照品溶液的制备
精确称取适量儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷和白藜芦醇对照品于10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线，获得浓度为533μg·mL-1、531μg·mL-1、520μg·mL-1、530μg·mL-1、518μg·mL-1、1096μg·mL-1、559μg·mL-1的对照品储备液，再精确称取适量木犀草素于10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线处，得浓度为554μg·mL-1木犀草素对照品储备液。分别吸取白藜芦醇、表儿茶素、儿茶素、木犀草素、染料木素、芒柄花素、槲皮素对照品储备液1mL、虎杖苷对照品储备液2mL加入到10mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线，制成浓度分别为55.9μg·mL-1、53.1μg·mL-1、53.3μg·mL-1、55.4μg·mL-1、52.0μg·mL-1、53.0μg·mL-1、51.8μg·mL-1、219.2μg·mL-1的混合对照品Ⅰ。
2.3.2供试品溶液的制备
精确吸取维血宁合剂提取液1mL至2mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液过0.22μm微孔有机滤膜，装于液相小瓶中，放于4℃冰箱中储存以备用。
2.3.3阴性样品溶液
根据处方的比例，制备缺虎杖、仙鹤草、鸡血藤、墨旱莲的阴性样品，按照“2.3.2”项下方法制备，即得阴性样品溶液。
2.4一测多评方法学考察
2.4.1专属性考察
取“2.3”项下取混合对照品Ⅰ、阴性样品溶液、供试品溶液各10μL，注入“2.1”项色谱条件下测定，记录色谱图，如图1。
2.4.2线性关系考察
“2.3.1”项下混合对照品Ⅰ，精密吸取后用甲醇分别稀释1、4、8、10、20和50倍，制成一系列不同浓度的对照品溶液，将对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(Xμg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，计算各自的回归方程和线性范围，结果见表4。8个化合物在各自线性范围内呈良好的线性关系，具有较高的灵敏性。
表4标准曲线回归方程及线性范围
Figure BDA0003786925630000091
2.4.3精密度试验
精密量取“2.3.1”项下的混合对照品Ⅰ，按“2.1”项下色谱条件进样，连续进样6次，结果儿茶素、白藜芦醇、表儿茶素、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素、虎杖苷峰面积RSD值分别1.87％、0.21％、0.21％、0.84％、0.23％、0.49％、0.43％、0.22％符合要求。
2.4.4重复性试验
精密吸取同一样品(提取液)，平行6份，按“2.3.2”项下方法配制供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样，结果儿茶素、白藜芦醇、表儿茶素、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素、虎杖苷峰面积的RSD值分别为0.23％、0.69％、0.48％、1.51％、0.39％、1.22％、1.75％、0.23％，表明实验的重复性好。
2.4.5加样回收率试验
分别取维血宁合剂提取液0.5mL至2mL容量瓶，按照50％、100％、150％比例依次加入儿茶素、表儿茶素、虎杖苷、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素对照品溶液，加甲醇至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液至样品瓶，计算回收率、平均值与RSD值，结果见表5。
表5加样回收实验结果
Figure BDA0003786925630000101
Figure BDA0003786925630000111
Figure BDA0003786925630000121
2.4.6稳定性试验
取“2.3.1”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，于2、4、6、8、12、24h进样并记录8种成分的峰面积，测得表儿茶素、虎杖苷、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素和儿茶素成分峰面积RSD分别为3.39％、1.24％、2.60％、2.22％、1.91％、1.23％、2.54％、1.76％，结果表明，所测溶液在24h内具有良好稳定性。
2.5相对校正因子的计算
以虎杖苷为内参物，精确吸取“2.4.2”项下一系列不同浓度的对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样检测8种成分的峰面积，按照公式：fs/i＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)(式中As表示内参物峰面积，Cs表示内参物浓度，Ai表示其他成分峰面积，Ci表示其他成分浓度)，分别计算7种成分的相对校正因子(fs/i)，并计算相对校正因子的RSD值，结果见表6。最终确定：以虎杖苷为内参物，计算儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、白藜芦醇和木犀草素的相对校正因子分别为0.3754，0.3486，0.5887，0.6599，0.5972，0.5853和0.5176。
表6以虎杖苷为内参物的7种成分的相对校正因子(fs/i)
Figure BDA0003786925630000131
1～7分别为儿茶素、表儿茶素、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素
2.6校正因子的重复性考察
2.6.1不同柱温对相对校正因子的影响
精密量取“2.3.1”项下的混合对照品Ⅰ，参照“2.1”项下色谱条件进样，分别考察各有效成分在不同柱温(25、30和35℃)下的相对校正因子，并计算RSD值，结果见表7。
表7不同柱温对相对校正因子的影响
Figure BDA0003786925630000132
注：1～7分别为儿茶素、表儿茶素、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素
2.6.2不同流速对相对校正因子的影响
精密量取“2.3.1”项下的混合对照品Ⅰ，参照“2.1”项下色谱条件进样，分别考察各有效成分在不同流速(0.8、1.0和1.2mL·min-1)时的相对校正因子，并计算RSD值，结果见表8。
表8不同流速对相对校正因子的影响
Figure BDA0003786925630000141
1～7分别为儿茶素、表儿茶素、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素2.6.3不同色谱柱对相对校正因子的影响
精密量取“2.3.1”项下的混合对照品Ⅰ，参照“2.1”项下色谱条件，分别考察各有效成分使用不同色谱柱[Acclaim 120 C18(4.6×250mm,5μm)和Agilent 5TC-C18(4.6×250mm,5μm)]时的相对校正因子和RSD值，结果见表9。
表9不同色谱柱对相对校正因子的影响
Figure BDA0003786925630000142
注意：1～7分别为儿茶素、表儿茶素、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素
2.7待测组分色谱峰定位
以虎杖苷为内标，将“2.4.2”项下的混合对照品精确吸取后进样，按照“2.1”项下色谱条件测定，记录7种成分色谱峰的保留时间，采用相对保留时间值(ri/s＝tRi/tRs)法对待测化合物色谱峰进行定位，结果见表10。
表10不同色谱柱对相对保留时间值(ri/s)的影响
Figure BDA0003786925630000151
1～7分别为儿茶素、表儿茶素、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素
2.8样品含量测定
按2.2项下维血宁合剂制备工艺，分别制备三批提取液、三批清膏和三批成品。取三批提取液1mL至2mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液过0.22μm微孔有机滤膜，装于液相小瓶中。取三批清膏2.00mL于25mL容量瓶中，用甲醇将其稀释定容至刻度线，摇匀后续滤液过0.22μm微孔有机滤膜，装于液相小瓶中。取三批成品分别2.88mL、2.78mL、2.76mL于25mL容量瓶中，用甲醇将其定容至刻度线处，摇匀后续滤液过0.22μm微孔有机滤膜，装于液相小瓶中。按“2.1”项下方法处理后，进样，比较采用外标法和一测多评法计算待测成分的含量差异，结果见表11。
表11维血宁合剂提取液、清膏、成品各成分含量测定结果
Figure BDA0003786925630000152
Figure BDA0003786925630000161
3指纹图谱的建立和相似度分析
3.1指纹图谱的建立
取“2.8”项下制备3批维血宁合剂提取液、清膏和成品，取续滤液过0.22μm的微孔滤膜，装于液相小瓶中，按照“2.1”项下的色谱条件，进样。并将色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)中，进行全谱峰匹配，建立指纹图谱，结果发现三批样品中有27个共有峰，与对照指纹图谱比较后确认了8个成分的峰，分别为虎杖苷、槲皮素、白藜芦醇、表儿茶素、木犀草素、染料木素、芒柄花素和儿茶素，结果见图2。
3.2相似度分析
对3批维血宁合剂提取液、清膏、成品进行相似度分析，相似度分析结果见表12，3批次维血宁合剂的提取液、清膏、成品与对照指纹图谱相似度为0.909～0.998，均＞0.9，该方法一致性好，可为质量控制提供依据。
Figure BDA0003786925630000181
Figure BDA0003786925630000191
4讨论
取混合对照品溶液，在流动相为甲醇-0.2％磷酸水，流速为1mL/min，柱温30℃条件下，利用LC-2030C 3D Plus高效液相色谱仪在190～560nm范围内进行全波长扫描，结果发现混合对照品在210～215nm处有较大的吸收，出峰较多，因此分别选择了210nm和215nm两种波长进行进样分析，结果发现在210nm处8个峰有较大的吸收，8个峰分离度较好，基线较平稳，因此选择210nm进行进样分析。
对流动相甲醇、乙腈、不同的流动相比例进行了研究，发现以乙腈-水作为作为流动相供试品的待测成分分离度差，在进行7组流动相比例的考察中发现当流动相甲醇-0.2％磷酸水、梯度洗脱，待测成分分离度较好、基线平稳。
选用固定波长210nm，选择不同的进样时间，如62min、42min、30min、40min、60min、53min、50min，结果发现8个峰在62min时儿茶素、表儿茶素、槲皮素、白藜芦醇、木犀草素、染料木素、芒柄花素、虎杖苷能够全部出峰并且峰型与分离度较好，基线平稳。
分别在三批维血宁合剂中提取液、清膏、成品各选择2组数据，共18组数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)中，进行多点校正、全谱峰匹配，发现三批样品中共有27个共有峰，再与对照品比较后，确认了8个成分的峰，分别为儿茶素、表儿茶素、虎杖苷、槲皮素、白藜芦醇、木犀草素、染料木素、芒柄花素，并且三批样品的提取液、清膏、成品与对照指纹图谱相似度均大于0.9，由此可知3批样品与对照指纹图谱相似度较好，为质量控制提供了依据。
本发明采用一测多评法首次建立测定维血宁合剂中儿茶素、表儿茶素、虎杖苷、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素、染料木素、芒柄花素8种成分的质量分析，实现节约成本，简洁方便的目的。通过对8种成分的稳定性、精密度、重复性考察其RSD值均小于3.39％，说明维血宁合剂质量稳定。并且根据色谱图的分离程度、峰面积大小、稳定性、保留时间的对比，选择虎杖苷作为样品含量测定的内参物，结果发现采用外标法和一测多评法对比基本无明显差异。用HPLC建立了3批维血宁合剂提取物、清膏和成品的指纹图谱，共建立了27个共有峰。通过与对照品指纹图谱的比较，确定了8个特征峰。结果表明，一测多评法可用于维血宁合剂中多指标成分的质量控制,有效地降低了检验成本,为全面评价维血宁合剂的质量提供了依据。

Claims (10)

1.一种维血宁合剂及其中间品的HPLC检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)对照品溶液制备：取儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和/或木犀草素对照品，加甲醇溶解稀释成溶液，即得对照品溶液；
2)供试品溶液制备：取待检样品，加甲醇溶液溶解，过滤，取滤液作为供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水为流动相B；梯度洗脱程序0～5min，75％B；5～15min，75％B→65％B；15～25min，65％B→55％B；25～35min，55％B→40％B；35～45min，40％B→30％B；45～55min，30％B→20％B；55～60min，20％B→65％B；60～62min，65％B→75％B。
2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤1)所述对照品与甲醇的质量体积比为0.5～250μg：1ml。
3.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤2)所述待检样品和甲醇的体积比为1～5ml：1～50ml。
4.根据权利要求3所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述待检样品为维血宁合剂或其中间品。
5.根据权利要求4所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述中间品为维血宁合剂的原料药提取液或原料药提取液浓缩的清膏。
6.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤3)所述色谱条件中色谱柱：Acclaim120 C18，250mm×4.6mm,5μm，柱温30℃，进样量10～50μL，流速为1ml/min，检测波长：210nm。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述维血宁合剂及其中间品的指纹图谱中有应有27个共有特征峰，所述共有特征峰包含与儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和木犀草素相应的色谱峰。
8.一种维血宁合剂及其中间品指标成分的含量测定方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)取维血宁合剂或其中间品，以及儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和/或木犀草素对照品，按权利要求1～6任一项所述方法检测；
2)按外标法以峰面积计算维血宁合剂或其中间品中儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和/或木犀草素的含量。
或：
1)取维血宁合剂或其中间品，以及儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、木犀草素对照品中的任意一种，按权利要求1～6任一项所述方法检测；
2)先按外标法以峰面积计算维血宁合剂或其中间品中对照品对应成分含量，再使用相对校正因子计算维血宁合剂或其中间品中其余成分的含量。
9.根据权利要求8所述含量测定方法，其特征在于：所述相对校正因子按照下述方法得到：
取儿茶素、表儿茶素、染料木素、芒柄花素、槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇和木犀草素对照品，根据权利要求1～3、6任意一项所述方法检测，择一对照品为内参物，根据如下公式计算：
fs/i＝fs/fi＝As×Ci/(Ai×Cs)；式中As为内参物s峰面积，Cs为内参物s浓度，Ai为组分i峰面积，Ci为组分i浓度。
10.根据权利要求9所述的含量测定方法，其特征在于：所述内参物为虎杖苷时，虎杖苷与儿茶素的相对矫正因子为0.3754，虎杖苷与表儿茶素的相对矫正因子为0.3486，虎杖苷与染料木素的相对矫正因子为0.5887，虎杖苷与芒柄花素的相对矫正因子为0.6599，虎杖苷与槲皮素的相对矫正因子为0.5972，虎杖苷与白藜芦醇的相对矫正因子为0.5853，虎杖苷与木犀草素的相对矫正因子为0.5176。
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