CN1595141A - 一种中药有效成分的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种利用生物膜与中药中有效成分的相互作用测出中药有效成分的方法，包括将中药提取液与生物膜加入到透析袋中透析，同时进行空白对照，用高效色谱法分别检测中药提取液透析过的液体与空白对照液透析过的液体，比较两者指纹图谱的改变，峰面积改变的峰，即是与生物膜有相互作用的成分，运用LC－MS，NMR等技术，获得与膜有相互作用成分的结构信息，该方法快捷，准确，相对简单，成本较低，从中药中筛选有效成分的效率显著提高，并且可以作为中药质量控制的补充手段。

Description

一种中药有效成分的检测方法

技术领域

本发明属于中药有效成分的检测方法，具体为利用生物膜与中药中有效成分的相互作用检测出中药有效成分的方法。

背景技术

传统的中药活性成分的研究，通常是采用植物化学的方法提取其中的有效部位化合物群或单体化合物，再经药理实验进行确定。中药成分复杂，一味中药就含有几十甚至数百个化合物，而一个由多种中药组成的复方，其中化学成分就更多了，再经过煎煮过程后，其中化学成分又可能产生化合或分解等新的变化。在众多的化学成分中，而有效成分往往含量低微，因此其分离分析操作烦琐，工作量大，周期长，成功率低，并且不能完全阐明中药多成分，多靶点的作用特点。

寻找有效的药物快速筛选的方法和技术一直是国内外制药公司关注的焦点。现代的科学研究表明，药物对细胞膜的通透性对于它的活性起关键作用。因为绝大多数的药物必须首先进入细胞才能表现它的活性，而且内用药物还必须能透过目标细胞的细胞膜才能起作用。简言之，药物的活性、毒性、体内的分布及其它生理过程都与药物在膜上的分配状况有关。所以，考察化合物的细胞膜的通透性是药物活性筛选和评价的首要关键步骤之一。

常用的检测药物细胞膜的通透性的模型有：有机溶剂-水系统如辛醇-水，ODS(十八烷基硅胶)为固定相的反相液相色谱系统及人工培养的单层小肠绒毛细胞模型，参见：毛希琴等模拟生物膜色谱用于预测药物的小肠吸收分析化学，2001(10)：1135-1139。前两种模式都只能模拟药物在膜上的疏水作用，而无法模拟膜磷脂的极性头部与药物的相互作用，而后一种则显得繁琐、费时。

生物膜色谱是用于考察药物对细胞膜的通透性及与膜上蛋白结合情况的一种较新的方法，该方法是以硅胶或凝胶为载体，其上涂敷或键合上人工模拟的细胞膜或活性细胞膜制备而成色谱固定相，根据药物与细胞膜的相互作用的强弱不同而将不同的药物分离开来。该方法亦可用于从中药中筛选与生物膜有相互作用的化学成分，但其在实际使用中存在诸多缺憾。例如：1、生物膜与硅胶等载体结合后其生物学特征会受到一定的影响。2、该方法对色谱流动相有着严格的限制，即必须以生理缓冲液作为流动相，否则会破坏生物膜，这样使色谱利用不同流动相而实现不同性质的化合物的分离的特点难以发挥，化合物在生物色谱上难以实现彼此的相互分离。3，色谱柱上的生物膜随时都有被流动相逐渐洗脱下来的可能，因此难以实现与MS，NMR联用，从而不能提供化合物的结构信息。4，生物色谱的制备程序复杂，严格，成本较高。用涂敷法制备的模拟生物膜色谱方法因为增加了硅胶介质与模拟生物膜的结合过程，因此比较复杂。参见：毛希琴等生物膜色谱及其在药物活性成分分析中的应用分析化学2002(2)：231-236；毛希琴等，卵磷脂涂敷生物膜色谱固定相的制备及其稳定性的考察，色谱，2001(5)：433-435；贺浪冲等固定在硅胶表面细胞膜的酶活性及其色谱特性科学通报，1999(6)：633-637。上述所有文章提供的图谱对药物的分离效果都不好，所有的流动相是用缓冲液，不能与LC-MS联用，且色谱柱寿命只有一个星期左右。硅胶介质价格较高，而通常的模拟生物膜的制备方法很经典，简单。在毛希琴等，三种色谱模式联用在中药活性成分初步筛选中的应用，分析化学2003，31(8)：992-995.的文献中，有川芎在模拟生物膜色谱柱上和反相柱上的分离图谱，显而易见生物膜色谱的分离效能不理想，不如反相色谱柱；而用真正的细胞膜制备而成的生物色谱柱，其分离效能就更差了。赵小娟等淫羊藿根与叶活性成分的分析和比较，分析化学，2002(2)：195-197；高琨等用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分中国药学杂志，2003(1)：14-16。

发明内容

本发明的要解决的问题在于：研究一种快捷，准确，体现中药多成分协同作用的检测中药中与生物膜有相互作用的化学成分的方法，尽可能地避免因生物膜的生物学特征受到影响而影响到有效成分的筛选的准确性，提高有效成分的分离效果，并且在筛选有效成分的同时获得其结构信息，以便快速的从中药中寻找可能具有活性的先导化合物或化合物群。同时该方法相对简单、成本较低，并可以作为中药质量控制的补充手段。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案。

一种中药有效成分检测方法，包括如下步骤：取待测中药，用溶剂提取后，制成中药提取液备用；将中药提取液与生物膜加入到透析袋中透析；用高效色谱法检测中药提取液透析过的液体。所述检测方法中：待测中药是单味中药或中药复方；提取中药的溶剂可以是水和/或有机溶剂；对含有机溶剂或有机溶剂含量高的提取液，浓缩去除全部或一定量的有机溶剂和/或用水稀释后，制成中药提取液备用。

该检测方法中提取中药的溶剂选自水、C₁-C₅的低级醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它们的混合物；中药提取液中加增溶剂。所述C₁-C₅的低级醇是甲醇，乙醇、正丁醇；提取中药的溶剂是中性、酸性或碱性；可选用无机酸、无机碱、有机酸或有机碱中和酸性或碱性的中药提取液；增溶剂选自吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇、曲拉通或它们的混合物；按中药提取液的体积加入0.1-5％体积的增溶剂。

上述检测方法中的优选方法是：中药提取液是用水或含1-30％乙醇提取制备的中药提取液；生物膜为模拟生物膜、人体或动物组织细胞的细胞膜，其中模拟生物膜是用卵磷脂或卵磷脂与天然磷脂的混合物制备而成；细胞膜包括内皮细胞膜，红细胞膜，心肌细胞膜，平滑肌细胞膜。

前述检测方法中包括将装有中药提取液与生物膜的透析袋置于模拟生理条件下的缓冲液中透析，同时将不含生物膜的中药提取液作为空白对照，装入透析袋中透析，透析时温度与时间成反比，温度越低，膜两侧达到平衡所需要的时间越长，待膜两侧平衡后，分别用高效色谱法检测透析过的液体，比较两者指纹图谱，峰面积改变的峰，即是与生物膜有相互作用的成分。生物膜是脂质体；透析用的模拟生理条件的缓冲液是磷酸盐或醋酸盐缓冲液；透析温度为4-25℃时，透析时间为12-24小时。较优选方法中磷酸盐缓冲液pH 2.0-7.4，醋酸盐缓冲液pH 2.0-7.4；用高效色谱法检测中药提取液透析过的液体后，与液相-质谱和/或核磁共振联用，获得与膜有相互作用成分的结构信息。

本发明提供了一种快捷，准确，体现中药多成分协同作用的检测中药中与生物膜有相互作用的化学成分的方法，所述检测包括筛选与测定，避免了因生物膜的生物学特征受到影响而影响到有效成分的筛选的准确性，可与LC-MS(液相-质谱，下文同)联用，提高有效成分的分离效果，并且在筛选有效成分的同时获得其结构信息，可以快速的从中药中寻找可能具有活性的先导化合物或化合物群。同时本发明方法相对简单、成本较低，从中药中筛选有效成分的效率显著提高，并且可以作为中药质量控制的补充手段。中药指纹图谱是现在用于中药质量控制的一个关键技术，但现行指纹图谱存在的一个突出问题就是不能提供该中药的药理信息。例如，图2中表示的当归补血汤的红色线图谱(位置在上方)即是当归补血汤的指纹图谱，它仅仅能提供中药材所含成分的化学信息。应用本发明方法将当归补血汤与模拟生物膜作用后再做指纹图谱，如图2中当归补血汤的蓝色线图(位置在下方)，可以看出共有12个峰的峰面积发生了明显的变化。药物与生物膜的相互作用是药物产生药理活性的前提，在用指纹图谱进行中药质量控制时，这些有变化的峰应该是重点控制的对象，因为他们才可能是该药的活性物质基础。本发明方法将透析技术与液相色谱联用，结果比生物色谱方法更加简便，结论更可靠。本发明图1是当归补血汤在280nm的检测条件下在模拟生物膜色谱柱上的分离图谱，图2是在相同检测波长下的当归补血汤与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱的改变，标号表示峰面积有改变的峰。可见峰面积有改变的峰比模拟生物色谱柱的峰要多。

以下对本发明中药有效成分筛方法的进一步描述：

透析膜的选择。所述的透析膜是指具有一定分子截止量的能允许分子量小于其截止分子量的物质在溶液中自由透过，而分子量大于其截止分子量的物质不能透过的薄膜，亦称为半透膜。可根据用途将之制成一定的形状，如袋状的就叫透析袋。目前市售的透析膜有数十种规格，其型号的划分标准是以其分子截至量为依据，如分子截至量为12000的透析膜允许分子量小于12000的分子自由透过，而分子量大于12000的分子则不能透过。根据实验的需要选择不同分子截止量的透析膜，中药中成分复杂，其有成分可能是各种各样的化合物，如蛋白质，多糖，肽类，及小分子物质等，如果我们的研究对象是中药中的大分子物质，则需要选用分子截至量大一点的半透膜，以保证游离的蛋白质能够自由透过，如仅需要研究其中的小分子物质，则可以选择分子截至量小一些的透析膜，只需要保证小分子物质可以自由透过透析膜就行了，该透析膜能有效的保证中药中与生物膜结合后的分子不能透过透析膜，而没有结合的可以自由透过。

生物膜的制备。生物膜可以是模拟生物膜，所述的模拟生物膜是用指卵磷脂或卵磷脂与组成生物细胞膜的天然磷脂的混合物制备而成；也可以是来自于人体或动物组织细胞的细胞膜，如内皮细胞膜，红细胞膜等。模拟的生物膜是目前研究的国外研究的热点之一，因为它与真的细胞膜结构相似，但是制作和保存比真的细胞膜要简单，方便得多，因此在新药研究的早期常常被拿来考察先导化合物与细胞膜相互作用的情况，以指导进一步的活性筛选工作。脂质体是一种比较简便的模拟生物膜，生物膜的基本结构是相同于脂质体的脂双层结构，但是真正的生物膜还含有其它的物质如胆固醇，蛋白质等，那么越接近于真的生物膜的模拟生物膜，其制备也就越复杂。随着模拟生物膜制备技术的不断改进，其与真的细胞膜的差别将会越来越小。目前还没有商品化的生物膜，一般是根据实验需要自己制备。模拟生物膜的制备方法可参考文献：平其能等现代药剂学第一版，中国医药科技出版社，597-606；细胞膜的制备可参考文献：徐叔云等，药理实验方法学，人民卫生出版社第二版：522-527。

中药的提取。所述的中药包括单味中药以及由数味中药组成的复方。针对不同中药所含有效成分的理化性质，可以任选合适的溶媒进行提取。但是，将与生物膜作用和透析膜接触的提取液，必须是不会破坏生物膜和透析膜的。一般以水或低浓度的醇为宜，例如在30％以下的乙醇条件下，模拟生物膜有一定的稳定性，高浓度的会破坏模拟生物膜的脂双层结构。也就是说，对待筛的中药进行提取时可以用任何溶剂。在提取液是水液或低浓度的醇液的情况下，可以直接将提取液与生物膜作用进行透析。如果是用高浓度的醇或其它可能破坏生物膜结构的有机溶剂、酸性或碱性溶剂提取中药，对该提取液要进行一定的处理，如采用浓缩去除全部或一定量的有机溶剂和/或用水稀释的方法，或者在去除有机溶剂后加入少量的不破坏生物膜结构的增容剂，如1％的吐温等，或者进行中和。原则上，其浓缩去除有机溶剂的程度和/或用水稀释的量和/或加入增容剂的含量，以不破坏生物膜和半透膜结构为适度，在实际操作中，这种适度通过简单测试是容易掌握的。例如：取少量待测提取液与生物膜接触，观察生物膜的变化，如有融溶现象则表明该提取液需要进一步除去有机溶剂和/或用水稀释。提取液中提取物的浓度只要达到可以检测的限度就行，浓度对实验效果并无显著影响。

透析。将中药提取液与生物膜混合后，按常规透析方法进行透析，膜两侧平衡后进行色谱分析。同时，用没有与生物膜结合的中药提取液作一平行的空白对照。可以用模拟生理条件下的不同的PH值的缓冲液进行透析，在不同的PH条件下药物与生物膜结合的情况是不同的，这可根据实验需要来定，人体的不同部位的PH值也是不同的如胃中pH为酸性，肠中为碱性。4℃低温透析时一般达到平衡需要24小时，而25℃室温透析时达到平衡只需要12小时，随着温度的升高，达到平衡的时间将会缩短，但当温度太高时，中药的提取液特别是水提液很容易变质，因此需要调整适宜的温度以保证节省时间和保证中药成分的稳定。一般以4℃平衡24小时为宜。

色谱检测。用高效色谱法分别检测中药提取液透析过的液体和作为空白对照的提取液，比较、分析两者图谱的改变。其中峰面积显著减少的峰即是与生物膜具有相互作用的化学成分，其峰面积的改变的相对百分比表明其与生物膜作用的强弱。如果测试样品是整个中药或复方的提取物，那么说得到的就是整个中药中的成分与生物膜的相互作用情况，如果样品是单一化合物或一类或几类化合物，那么得到的就是单一化合物或一类或几类化合物与生物膜的相互作用情况。至于单一化合物、一类化合物、几类化合物、单味中药提取物，复方中药提取物他们之间与生物膜相互作用有何差异，也可以进一步考察，如：阿魏酸单体，当归提取液中的阿魏酸，当归补血汤提取液中的阿魏酸分别与生物膜作用有何差别，我们可以通过比较他们与生物膜作用后峰面积的改变的百分比是否一致来看出中药中其它成分是否对它与生物膜的相互作用有影响。由于中药中含有许多成分，由于高效液相具有很高的分离效能，中药提取液通过高效液相会出现许多峰，一般而言，在一种洗脱条件下，一个峰就代表一个成分或者结构相似的几个成分。同时，如果在某种洗脱条件下不能分开的成分，可以换一种洗脱条件将之分开。通过本发明的筛选方法，就能快速、简便地发现：在全部的峰中，有的峰与生物膜有相互作用，有的没有相互作用，有的相互作用强，有的相互作用弱。本发明要解决的技术问题就是要从中药中寻找与生物膜有相互作用的峰，因为与膜发生相互作用是药物发挥作用的前提。对于与生物膜没有相互作用的峰，就极有可能是无效成分。

附图说明

图1、是当归补血汤在280nm的检测条件下在模拟生物膜柱上的分离图谱，仅见5个峰在模拟生物膜色谱柱上有明显的保留，并且峰很宽。

图2、是当归补血汤与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有12个峰的峰面积有显著的改变，这些峰面积有改变的峰是与生物膜有相互作用的成分，其中第12号峰经与标准品对照可以确定为藁本内酯。

图3是当归与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱。可见有6个峰的峰面积有显著的改变。其中第6号峰经与标准品对照可以确定为藁本内酯。

图4是黄芪与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有8个峰的峰面积有显著的改变。

图5是当归补血汤与内皮细胞膜结合后与空白对照比较图谱，可见有7个峰的峰面积有显著的改变。

具体实施方式

实施例1筛选黄芪中的有效成分

黄芪为一经典的补气中药，研究表明，其中含有多糖，皂苷，生物碱，挥发油，黄酮等多种成分。如果将其中的成分一个个提取出来进行活性成分的筛选，无疑是个非常复杂的过程，采用本发明筛选方法可以快速的从中寻找其与生物膜有相互作用的可能的活性成分。

黄芪的提取：取粉碎的黄芪20g，加入90％的乙醇200ml浸泡1h，水浴回流提取1h，提取液在45度条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，剩余部分加入20ml pH为7.4的磷酸缓冲液充分溶解，4000rpm/min离心10min，普通滤纸过滤，置负20度冰箱中保存备用。

模拟生物膜(脂质体)的制备：采用经典的注射法(参见平其能等现代药剂学第一版，中国医药科技出版社，597-606)，制备模拟生物膜(脂质体)。脂质体是一种比较简便的模拟生物膜，生物膜的基本结构是相同于脂质体的脂双层结构。

称取卵磷脂(华东师范大学化工厂)0.5g，用4ml无水乙醇溶解，将其装入一个10ml的注射器中，另取一个小烧杯，内装10ml pH值为7.4的磷酸缓冲液，将其置入带磁力搅拌的水浴锅中，小烧杯内放一搅拌子，将水浴锅温度调节至60度左右，开启磁力搅拌，用铁架台固定注射器，使注射器中的卵磷脂溶液自由滴入小烧杯中，滴完后继续搅拌至无醇味即得脂质体溶液。

透析：取长约7cm的分子截止量为12000的透析袋(北京华美生物工程有限公司)1个，将一端用细线扎紧。其中加入1ml上法制备的脂质体溶液和1ml当归提取液；置入20度室温下透析15h使袋内外达到平衡，另取1个透析袋做平行空白对照，即用1ml磷酸缓冲液代替脂质体，其余操作相同。取试管内的溶液1ml，过滤后用高效液相进行分析。

检测条件：C₁₈色谱柱，Angilent系列高效液相色谱系统，DAD紫外检测器，流动相：甲醇：水梯度洗脱。检测波长：280nm，标记有阿拉伯数字的峰表示峰面积有改变的峰，即与模拟生物膜有结合的成分。

结果：图4是黄芪与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有8个峰的峰面积有显著的改变。

实施例2筛选当归的有效成分

当归的提取：取粉碎的当归5g，加入100ml水浸泡1h，100度油浴提取1h，提取液在50度条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，剩余部分加入5ml pH为7.0的醋酸缓冲液充分溶解，4000rpm/min离心10min，普通滤纸过滤，置负20度冰箱中保存备用。

模拟生物膜(脂质体)的制备：称取卵磷脂(华东师范大学化工厂)0.5g，用5ml无水乙醇溶解，将其装入一个10ml的注射器中，另取一个小烧杯，内装10ml pH值为7.0醋酸缓冲液，将其置入带磁力搅拌的水浴锅中，小烧杯内放一搅拌子，将水浴锅温度调节至60度左右，开启磁力搅拌，用铁架台固定注射器，使注射器中的卵磷脂溶液自由滴入小烧杯中，滴完后继续搅拌至无醇味即得脂质体溶液。

透析：取长约7cm的分子截止量为12000的透析袋(北京华美生物工程有限公司)1个，将一端用细线扎紧后加入1ml上法制备的脂质体溶液和1ml当归提取液，然后将另一端用细线扎紧；放入4度的冰箱中透析24h使袋内外达到平衡，另取1个透析袋做平行空白对照，即用1ml醋酸缓冲液代替脂质体，其余操作相同。取试管内的溶液1ml，过滤后用高效液相进行分析。

检测条件：同例1

结果：图3是当归与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有6个峰的峰面积有显著的改变.，其中第6号峰经与标准品对照可以确定为藁本内酯。

实施例3

当归补血汤与模拟生物膜有相互作用的成分的筛选

当归补血汤的提取：取粉碎当归(市售)5g，黄芪(市售)25g，加入10倍量的75％乙醇浸泡1h，回流提取1h，提取液在50度条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，剩余部分加入30ml pH为7.0的磷酸缓冲液30ml充分溶解，4000rpm/min离心10min，普通滤纸过滤，置负20度冰箱中保存备用。

模拟生物膜的制备：称取卵磷脂(华东师范大学化工厂)0.6g和胆固醇0.3g，用6ml无水乙醇溶解，将其装入一个10ml的注射器中，另取一个小烧杯，内装10ml pH值为7.0磷酸缓冲液，将其置入带磁力搅拌的水浴锅中，小烧杯内放一搅拌子，将水浴锅温度调节至60度左右，开启磁力搅拌，用铁架台固定注射器，使注射器中的卵磷脂溶液自由滴入小烧杯中，滴完后继续搅拌至无醇味即得脂质体溶液。

透析：取长约7cm的分子截止量为12000的透析袋(北京华美生物工程有限公司)1个，将一端用细线扎紧。加入1ml上法制备的脂质体溶液和1ml当归补血汤；将另一端扎紧。放入一个装有8ml的pH为7.0的磷酸缓冲液的试管中，放入4度的冰箱中透析24h使袋内外达到平衡，另取1个透析袋做平行空白对照，即用1ml磷酸缓冲液代替脂质体，其余操作相同。取试管内的溶液1ml，过滤后用高效液相进行分析。

检测条件：同实施例1

结果：图2是当归与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有12个峰的峰面积有显著的改变，其中第12号峰经与标准品对照可以确定为藁本内酯。：

实施例4

当归补血汤不同提取工艺的提取液中与模拟生物膜有相互作用的成分的筛选

①取粉碎当归5g，黄芪25g，加入10倍量的水浸泡1h，100度油浴提取1h，提取液在50度条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，剩余部分加入15ml pH为7.0的磷酸缓冲液充分溶解，4000rpm/min离心10min，普通滤纸过滤，置负20度冰箱中保存备用。

模拟生物膜的制备：同实施例3

透析：同实施例3

检测条件：同实施例3

结果：峰的数目与实施例三的基本一致，但部分峰的峰面积有所减小，即用水提的含量有所减小。但实施例三图谱中峰面积减小的峰同样在此例中峰面积减小了。

②取粉碎当归(市售)5g，黄芪(市售)25g，加入10倍量的75％乙醇浸泡1h，回流提取1h，提取液在50度条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，剩余部分加入30ml含0.5％吐温的pH为7.0的磷酸缓冲液30ml充分溶解，4000rpm/min离心10min，普通滤纸过滤，置负20度冰箱中保存备用。

模拟生物膜的制备：同实施例3

透析：取长约7cm的分子截止量为12000的透析袋(北京华美生物工程有限公司)1个，将一端用细线扎紧。加入1ml上法制备的脂质体溶液和1ml当归补血汤；将另一端扎紧，放入一个装有8ml含0.5％吐温的pH为7.0的磷酸缓冲液的试管中，放入4度的冰箱中透析24h使袋内外达到平衡，另取1个透析袋做平行空白对照，即用1ml磷酸缓冲液代替脂质体，其余操作相同。取试管内的溶液1ml，过滤后用高效液相进行分析。

检测条件：同实施例3

结果：峰的数目与实施例三的基本一致，但部分峰的峰面积有所增加，如实施例3中12号峰蒿本内酯的峰面积显著增加，即吐温对某些成分具有增溶作用。但实施例三图谱中峰面积减小的峰同样在此例中峰面积减小了。

实施例5

当归补血汤与内皮膜具有相互作用的有效成分的筛选

当归补血汤的提取：同实施例3

内皮细胞膜的制备：取健康产妇剖腹产术后12小时以内的脐带，立即浸泡在4度无菌脐带采集液中。按Jaffe法加以改良后进行培养。用0.1％的胶原酶消化分离内皮细胞，以2×10⁴/ml细胞接种于96孔培养板中，用含20％小牛血清的M199培养液进行培养。传代至细胞生长稳定后，转入4个500ml的培养瓶中进行培养，合并4瓶细胞，参照文献制备内皮细胞膜：徐叔云等，药理实验方法学，人民卫生出版社第二版：524-525。

透析：取长约7cm的分子截止量为12000的透析袋(北京华美生物工程有限公司)1个，将一端用细线扎紧。加入1ml上法制备的内皮细胞膜溶液和1ml当归补血汤；将另一端扎紧。放入一个装有8ml的pH为7.0的磷酸缓冲液的试管中，放入4度的冰箱中透析24h使袋内外达到平衡，另取1个透析袋做平行空白对照，即用1ml磷酸缓冲液代替内皮细胞膜溶液，其余操作相同。取试管内的溶液1ml，过滤后用高效液相进行分析。

检测条件：C₁₈色谱柱，Angilent系列高效液相色谱系统，DAD紫外检测器，流动相：甲醇：水梯度洗脱。检测波长：313nm，标记有阿拉伯数字的峰表示峰面积有改变的峰，即与内皮细胞膜有结合的成分。

结果：图5是当归补血汤与内皮细胞膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有7个峰的峰面积有显著的改变。

筛选实验的结果分析(参见图1-5)：

图1是当归补血汤在280nm的检测条件下在模拟生物膜柱上的分离图谱，仅见5个峰在模拟生物膜色谱柱上有明显的保留，并且峰很宽。图2是当归补血汤与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有12个峰的峰面积有显著的改变，这些峰面积有改变的峰是与生物膜有相互作用的成分，其中第12号峰经与标准品对照可以确定为有效成分藁本内酯。图3是当归与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有6个峰的峰面积有显著的改变，其中第6号峰经与标准品对照可以确定为藁本内酯。图4是黄芪与模拟生物膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有8个峰的峰面积有显著的改变。图5是当归补血汤与内皮细胞膜结合后透析与空白对照比较图谱，可见有7个峰的峰面积有显著的改变。藁本内酯是当归挥发油中的主要成分，约占当归挥发油的45％，当归挥发油对子宫具有双向调节作用。

Claims (10)

1、一种中药有效成分检测方法，包括如下步骤：

取待测中药，用溶剂提取后，制成中药提取液备用；

将中药提取液与生物膜加入到透析袋中透析；

用高效色谱法检测中药提取液透析过的液体。

2、权利要求1的检测方法，其特征在于：待测中药是单味中药或中药复方；提取中药的溶剂可以是水和/或有机溶剂；对含有机溶剂或有机溶剂含量高的提取液，浓缩去除全部或一定量的有机溶剂和/或用水稀释后，制成中药提取液备用。

3、权利要求2的检测方法，其特征在于：提取中药的溶剂选自水、C₁-C₅的低级醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它们的混合物；中药提取液中加入增溶剂。

4、权利要求3的检测方法，其特征在于：C₁-C₅的低级醇是甲醇，乙醇、正丁醇；提取中药的溶剂是中性、酸性或碱性；选用无机酸、无机碱、有机酸或有机碱中和酸性或碱性的中药提取液；增溶剂选自吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇、曲拉通或它们的混合物；按中药提取液的体积加入0.1-5％体积的增溶剂。

5、权利要求4的检测方法，其特征在于：中药提取液是用水或含1-30％乙醇提取制备的中药提取液。

6、权利要求1的检测方法，其特征在于：生物膜为模拟生物膜、人体或动物组织细胞的细胞膜。

7、权利要求6的检测方法，其特征在于：模拟生物膜是用卵磷脂或卵磷脂与天然磷脂的混合物制备而成；细胞膜包括内皮细胞膜，红细胞膜，心肌细胞膜，平滑肌细胞膜。

8、权利要求1的检测方法，其特征在于：将装有中药提取液与生物膜的透析袋置于模拟生理条件下的缓冲液中透析，同时将不含生物膜的中药提取液作为空白对照，装入透析袋中透析，透析时温度与时间成反比，温度越低，膜两侧达到平衡所需要的时间越长，待膜两侧平衡后，分别用高效色谱法检测透析过的液体，比较两者指纹图谱，峰面积改变的峰，即是与生物膜有相互作用的成分。

9、权利要求8的检测方法，其特征在于：生物膜是脂质体；透析用的模拟生理条件的缓冲液是pH2.0-7.4的磷酸盐或pH2.0-7.4的醋酸盐缓冲液；透析温度为4-25℃时，透析时间为12-24小时。

10、权利要求1的检测方法，其特征在于：用高效色谱法检测中药提取液透析过的液体后，与液相-质谱和/或核磁共振联用，获得与膜有相互作用成分的结构信息。

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