CN101458235A - 苦参碱液相色谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种化学检测技术领域的苦参碱液相色谱测定方法，包括将含苦参碱样品和苦参碱对照品分别用甲醇定容并以包含甲醇、磷酸和三乙胺的水溶液作为流动相注入液相色谱仪后依次进行苦参碱样品的精密度测定、24小时稳定性测定、重现性测定以及回收率测定。本发明方法操作步骤简单，适应性强，分析结果重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种化学检测技术领域的方法，具体是一种苦参碱液相色谱测定方法。
背景技术
高效液相色谱分析方法是药物分析中常用的方法，该法以经典液相色谱为基础，引入气相色谱法的理论和技术，流动相采用高压输送，并使用高效固定相及现代化色谱工作站，可实现在线分离和分析。具有适用范围广、分离效率高、分析速度快、灵敏度高等特点。所以，近年来广泛应用于中草药及其制剂化学成分分离、鉴定及含量测定。
苦参碱为豆科植物苦参、苦豆子和山豆根含有的主要生物碱之一，临床主要用来治疗癌症，病毒性肝炎，心脏病，以及皮肤病牛皮癣和湿疹，还是一种天然植物农药，值得关注开发。苦参碱现行纯度分析方法有薄层色谱法、毛细管电色谱法、高效液相色谱法。其中高效液相法大多使用了离子对试剂或者强酸碱，或者采用氨基柱、离子交换柱，洗脱方式也多为梯度洗脱，这些分析方法的不足之处在于：①离子对试剂或强酸碱的引入容易产生沉淀，使高效液相色谱仪中高压泵的柱塞和密封垫摩擦产生系统漏液，损害较大；②氨基柱、离子交换柱造价高、寿命短、保养困难；③梯度洗脱法溶剂的配比随时间而变化，每次分离都需要重新平衡，分析时间长、操作复杂、重现性不及等度洗脱；④流动相配制相当复杂，不易操作。另外，由于苦参碱的最大吸收波长在210nm左右，而许多试剂在波长210nm左右也有强烈吸收，容易对检测造成干扰，导致紫外检测器灵敏度降低。
经过对现有技术的检索发现，中国专利申请号200610060119.3，公开号CN101046467A，记载了一种“青柏洁身洗液中苦参碱含量的测定方法”，包括下列步骤：称取苦参碱对照品适量，加甲醇配制成0.01～0.1mg/mL的溶液；制备供试品溶液：精密量取本品5～20mL，加浓氨试液0.25～1mL，用氯仿振摇提取3次以上，每次20mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加少量氯仿(约5mL)溶解，装入碱性氧化铝柱(80～200目，1～5g)，氯仿-甲醇(2～10：0～2)10～50m1洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液即得，分别精密吸取对照品溶液5～40μL，供试品溶液5～40μL，注入液相色谱仪，测定，计算得出结果。但是该技术具有操作复杂，成分分离度不佳及分析结果重现性不佳的不足。
又经过检索发现，侯惠婵在《中国新医药》(2004，Vol.3-No.9-P.83)上，发表了《山豆根中氧化苦参碱和苦参碱的含量测定》，记载了一种以RP-HPLC法同时测定山豆根中苦参碱和氧化苦参碱的含量的方法，但是该技术具有流动相配制复杂，线性范围窄的不足。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种苦参碱液相色谱测定方法，操作步骤简单，适应性强，分析结果重现性好。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
①取苦参碱样品10mg，用甲醇定容于容量瓶中，超声溶解得供试品溶液；
②取苦参碱对照品5mg，用甲醇定容于容量瓶中，超声溶解得苦参碱标准液；
所述的甲醇为色谱纯级甲醇。
③各取10μL的供试品溶液和苦参碱标准液注入液相色谱仪进行测定；
所述的液相色谱仪为包含有紫外检测器的高效液相色谱仪和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
所述的液相色谱仪所采用的流动相为包含甲醇、磷酸和三乙胺的水溶液，其中甲醇与磷酸和三乙胺的水溶液的体积比为1：3，该流动相的流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～50℃。
所述的测定时采用的洗脱方式是等度洗脱；检测波长为210±2nm，进样量2～20μL下进行检测。
④记录峰面积，按外标法以峰面积y对苦参碱含量x计算回归方程，获得所述的回归方程为：
y＝1.32×106x-1.16×105，
相关系数为0.9996，线性范围为0.32～1.92μg。
⑤根据上述步骤，依次对步骤①的苦参碱样品进行精密度测定、24小时稳定性测定、重现性测定以及回收率测定。
所述的精密度测定是指：吸取苦参碱标准液6μL，按步骤③和步骤④将溶液注入液相色谱仪进行峰面积测定共6次，然后计算该6次的平均峰面积及相对标准偏差RSD。
所述的24小时稳定性测定是指：吸取供试品溶液6μL，分别在静置4小时后，静置8小时后、静置12小时后以及静置24小时后重复步骤③和步骤④将溶液注入液相色谱仪进行峰面积测定共5次，然后计算该5次的平均峰面积及相对标准偏差RSD。
所述的重现性测定是指：取同一含苦参碱样品共5份，按步骤①方法制备出5份供试品溶液，从每一份供试品溶液中精密吸取6μL后按步骤③和步骤④将溶液注入液相色谱仪进行峰面积测定，并将测定所得结果代入步骤④中的回归方程中，得到供试品溶液中苦参碱的平均含量及相对标准偏差RSD和平均保留时间及相对标准偏差RSD。
所述的回收率测定是指：将苦参碱对照品以不同剂量加入到已知苦参碱含量的样品中并按步骤①方法制备法制备出每一组相同剂量3份的若干份供试品溶液，从每一份供试品溶液中吸取6μL并按步骤③和步骤④将溶液注入液相色谱仪进行峰面积测定并计算回收量与加入量的比值，即回收率，计算平均回收率及相对标准偏差RSD。
本发明能对苦参碱进行有效分离和定量测定，操作简单、省时、专一性强、分析结果重现性好。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施仪器与试剂：
岛津LC—10Avp高效液相色谱仪，YMC公司YMC-Pack ODS-A分析柱。色谱纯甲醇、分析纯磷酸、分析纯三乙胺，苦参碱标准品。
色谱条件：分析柱：YMC-Pack ODS-A(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；流动相：甲醇—0.05mol/L磷酸与0.05mol/L三乙胺等体积混合的水溶液(25:75)；检测波长：210nm；柱温：30℃下检测；理论塔板数以苦参碱计算不低于5000；控制进样量在2～20μl之间。
检测步骤：
①取含苦参碱样品10mg，精密称定，用无水甲醇定容于容量瓶中，超声溶解得供试品溶液；
②取苦参碱对照品5mg，精密称定，用无水甲醇定容于容量瓶中，超声溶解得苦参碱标准液；
③各取10μL的供试品溶液和苦参碱标准液注入液相色谱仪进行测定；
所述的液相色谱仪为包含有紫外检测器的高效液相色谱仪和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
所述的液相色谱仪所采用的流动相为包含甲醇、磷酸和三乙胺的水溶液，其中甲醇与磷酸和三乙胺的水溶液的体积比为1：3，该流动相的流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～50℃。
所述的测定时采用的洗脱方式是等度洗脱；检测波长为210±2nm，进样量2～20μL下进行检测。
④记录峰面积，按外标法以峰面积对苦参碱含量计算回归方程，获得所述的回归方程为：
y＝1.32×106x-1.16×105，
相关系数为0.9996，线性范围为0.32～1.92μg。
⑤精密度测定：精密吸取苦参碱标准液6μL，重复进样6次，测定峰面积，结果具体如下表所示，从表1中可见：平均峰面积为1187830±22557，RSD为1.90％，精密度良好。
表1 精密度测定结果
⑥24小时稳定性测定：取同一供试品溶液6μL，分别于0，4，8，12，24h测定峰面积，结果具体如下表所示，从表2中可见：平均峰面积为1159533±54349，RSD 4.69％，表明供试品溶液在24h内稳定。
表2 24小时稳定性测定结果
⑦重现性测定：取同一样品共5份，按供试品溶液的制备法制备供试液，进样6μL测定，代入回归方程，计算供试品溶液中苦参碱平均含量及相对标准偏差RSD和平均保留时间及相对标准偏差RSD，结果具体如下表所示，从表3中可见：测得供试品溶液中苦参碱平均含量为7.36％，RSD为1.36％；其平均保留时间为17.408min，RSD为0.07％，表明本方法重现性良好。
表3 重现性测定结果
⑧回收率测定：精密称取一定量的苦参碱对照品，加入到已知苦参碱含量的样品中，按供试品溶液的制备法制备供试液，进样6μL测定，设0.90mg、1.50mg以及2.10mg三个剂量，每个剂量平行3次测定，计算回收率(回收量与加入量的比)，平均回收率及相对标准偏差RSD，结果具体如下表所示，从表4可见：平均回收率为99.85％，相对标准偏差RSD<2％。
表4 回收率测定结果
Claims (10)
1、一种苦参碱液相色谱测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
①取含苦参碱样品10mg，用甲醇定容于容量瓶中，超声溶解得供试品溶液；
②取苦参碱对照品5mg，用甲醇定容于容量瓶中，超声溶解得苦参碱标准液；
③各取10μL的供试品溶液和苦参碱标准液注入液相色谱仪进行测定；
④记录峰面积，按外标法以峰面积y对苦参碱含量x计算回归方程，获得所述的回归方程为：
y＝1.32×106x-1.16×105，
相关系数为0.9996，线性范围为0.32～1.92μg；
⑤根据上述步骤，依次对步骤①苦参碱样品的进行精密度测定、24小时稳定性测定、重现性测定以及回收率测定。
2、根据权利要求1所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的甲醇为色谱纯级甲醇。
3、根据权利要求1所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的液相色谱仪为包含有紫外检测器的高效液相色谱仪和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
4、根据权利要求1所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的液相色谱仪所采用的流动相为包含甲醇、磷酸和三乙胺的水溶液，其中甲醇与磷酸和三乙胺的水溶液的体积比为1：3。
5、根据权利要求4所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的流动相的流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～50℃。
6、根据权利要求1所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的测定时采用的洗脱方式是等度洗脱；检测波长为210±2nm，进样量2～20μL下进行检测。
7、根据权利要求1所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的精密度测定是指：吸取苦参碱标准液6μL，按步骤③和步骤④将溶液注入液相色谱仪进行峰面积测定共6次，然后计算该6次的平均峰面积及相对标准偏差。
8、根据权利要求1所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的24小时稳定性测定是指：吸取供试品溶液6μL，分别在静置4小时后，静置8小时后、静置12小时后以及静置24小时后重复步骤③和步骤④将溶液注入液相色谱仪进行峰面积测定共5次，然后计算该5次的平均峰面积及相对标准偏差。
9、根据权利要求1所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的重现性测定是指：取同一含苦参碱样品共5份，按步骤①方法制备出5份供试品溶液，从每一份供试品溶液中精密吸取6μL后按步骤③和步骤④将溶液注入液相色谱仪进行峰面积测定，并将测定所得结果代入步骤④中的回归方程中，得到供试品溶液中苦参碱的平均含量及相对标准偏差RSD和平均保留时间及相对标准偏差。
10、根据权利要求1所述的苦参碱液相色谱测定方法，其特征是，所述的回收率测定是指：将苦参碱对照品以不同剂量加入到已知苦参碱含量的样品中并按步骤①方法制备出每一组相同剂量3份的若干份供试品溶液，从每一份供试品溶液中精密吸取6μL并按步骤③和步骤④将溶液注入液相色谱仪进行峰面积测定并计算回收量与加入量的比值，即回收率，计算平均回收率及相对标准偏差。
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