(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:赤芍提取物制备
取原料赤芍粉末(过40目筛),用8倍质量70%乙醇回流提取2次,每次2h,合并滤液,回收乙醇至无醇味。溶解于原药材4倍量的热水中,过滤,滤液直接上处理好的D101大孔吸附树脂,树脂柱用处离子水洗脱至收集接近无色。用20%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液至洗脱至无色。洗脱液浓缩,干燥即得赤芍提取物,其中赤芍总苷质量含量达60%。
实施例2:赤芍提取物制备
取原料赤芍粉末,用8倍质量甲醇回流提取2次,每次2h,合并滤液,回收甲醇至无醇味。将浸膏溶解于原水中,用等体积水饱和正丁醇萃取三次,取正丁醇层,蒸干正丁醇,干燥即得赤芍提取物,其中赤芍总苷质量含量达90%。
实施例3:赤芍提取物制备
取原料赤芍粉末,用6倍质量正庚醇回流提取2次,每次2h,合并滤液,回收正庚醇至无醇味。将浸膏溶解于原水中,用等体积水饱和正丁醇萃取三次,取正丁醇层,蒸干正丁醇,干燥即得赤芍提取物,其中赤芍总苷质量含量达50%。
实施例4:党参提取物制备
取原料党参粗粉用2.5倍质量石油醚回流提取2次,每次30min,过滤,弃去滤液;滤渣用乙醚照上法处理。滤渣用5倍80%乙醇回流提取2次,每次45min过滤,弃滤液,滤渣5倍水回流提取2次,每次45min过滤,合并水提液减压浓缩至总量四分之一,加入0.1%活性炭脱色15min,过滤,滤液中加入乙醇使含醇为80%,静置过夜,过滤,滤饼用乙醚洗3次,再用无水乙醇洗3次,滤饼60℃真空干燥箱干燥,即得党参提取物,其中党参多糖含量达90%。
实施例5:党参提取物制备
取党参粗粉用5倍质量70%乙醇水溶液回流提取2次,每次45min过滤,合并提取液。提取液上处理好的D101大孔树脂,用去离子水洗脱,收集洗脱液,浓缩洗脱液,60℃真空干燥箱干燥,即得党参提取物,其中党参多糖质量含量达60%。
实施例6:党参提取物制备
取党参粗粉用5倍质量50%丁醇水溶液回流提取2次,每次45min过滤,合并提取液。提取液上处理好的D101大孔树脂,用去离子水洗脱,收集洗脱液,浓缩洗脱液,60℃真空干燥箱干燥,即得党参提取物,其中党参多糖质量含量达50%。
实施例7:赤芍党参共同提取物制备
取质量比为3∶1的赤芍粉末(过40目筛)与党参粗粉,用10倍质量的水回流提取2次,每次1h过滤,合并提取液。提取液上处理好的D101大孔树脂,用去离子水洗脱,收集洗脱液,浓缩洗脱液,60℃真空干燥箱干燥,即得赤芍党参共同提取物,其中赤芍总苷质量含量75%,党参多糖质量含量25%。
实施例8:抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)所致U937细胞泡沫化损伤的药物筛选
实施例8~11中所用试验药物如下:
H1:实施例1所得赤芍提取物;
H2:元胡提取物,提取方法:
取元胡粉末,60%乙醇6倍量,醋酸调PH至4.5,回流提取3次,每次1.5h,合并提取液,减压浓缩至干;加入约600ml水溶解,过滤,上处理好的D101大孔树脂柱,用40%乙醇洗脱,弃去洗脱液;再用95%乙醇洗脱,收集洗脱液;减压浓缩收集液,真空干燥即得。
H3:丹参提取物,提取方法:
取丹参粉末,10倍量水浸泡过夜,回流提取30min,过滤,再用10倍量水,回流提取2h,合并滤液;冷却,调PH至2,用无水乙醚萃取,取乙醚层,减压浓缩,真空干燥即得。
H4:当归提取物,提取方法:
取当归粉末,分别用10倍量、6倍量70%乙醇回流提取2次,每次2h,合并滤液,减压浓缩至无醇味;3倍量水,50℃加热溶解,过滤;滤液上处理好的D101大孔树脂柱,先后用水和30%乙醇洗脱,洗脱液弃去,改用80%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥即得。
H5:川芎提取物,提取方法:
取川芎粉末,10倍量95%乙醇,回流提取3次,每次2h;合并滤液,减压浓缩至干。用水50℃溶解,过滤,上处理好的D101大孔树脂柱,分别用水、30%乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用60%乙醇洗脱,收集洗脱液,洗脱液减压浓缩,40℃真空干燥即得。
B1:实施例4所得党参提取物;
B2:黄芪总苷,制备方法:
取黄芪粉末,10倍量60%乙醇浸泡2h后,回流2次,每次2h,合并滤液,浓缩至无醇味,用水溶解,过滤,上大孔树脂柱,分别用水40%、乙醇洗脱,洗脱液弃去,改用80%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压浓缩至浸膏,真空干燥即得。
HB:实施例11中的HB的制备
将党参(0.625)、当归(1.0416)、生地(0.2083)、川芎(0.5208)、赤芍(0.2083)、丹参(0.3125)、桃仁(0.2083)、红花(0.5208)、丹皮(0.3125)、大腹皮(0.2083)、玄参(0.4166)、泽泻(0.4166)、茯苓(0.5208)、山楂(0.625)、甘草(0.1046)各味中药按各自比例混合,用水为提取溶剂进行提取,干燥即得。
1、目的:通过检测ox-LDL(80mg/ml)对培养的U937细胞泡沫化损伤(细胞生长的抑制)来评价药物是否有保护U937细胞的作用。
2、材料和方法:
U937细胞的培养及处理:U937细胞常规法培养,培养液为10%FBS的RPMI-1640培养基(内含青、链雷素各100u/ml),U937细胞置于37℃,5%CO2和95%空气的培养箱中培养,细胞密度1×106个/L左右,每2d换液1次。
3、实验方法:
制备含药血清。SD大鼠30只,体重200克左右,雌性。随机分为对照组(CK)、及给药组(H1B1、H1B2、H2B1、H2B2、H3B1、H4B1、H4B2、H5B1、H5B2),其中H1为实施例1所得赤芍提取物,B1为实施例4所得党参提取物,共10组。每日依给定剂量灌胃(H药150g/kg.BW,B药50g/kg.BW),连续灌胃3日,第四日灌胃后半小时,腹主动脉取血。4000rpm×20min离心后,取上清,56℃、30min灭活后,-20℃冰箱保存备用。
取指数生长U937细胞经无血清的RPMI-1640培养基培养24h后,用无血清培养液调整细胞密度约为2×105个/ml。将U937细胞分为正常对照组(Group C)、泡沫细胞模型组(Group M)、对照血清组(Group CS)和受试药组(Group drug)。Group C:在无血清的RPMI-1640培养基中培养。Group M:加ox-LDL到无血清的RPMI-1640培养基(ox-LDL终浓度为80mg·L)中培养。Group CS:加对照血清到终浓度为20%(ox-LDL终浓度为80mg·L)的无血清的RPMI-1640培养基中培养。Group drug:加受试药到终末浓度分别为20%(ox-LDL终浓度为80mg·L)的无血清的RPMI-1640培养基中培养。各组培养于96孔板中,每组6孔,12h后收集细胞,检测细胞的增殖活性(WST)。
4、结果:
见表1与图1。9个药物在20%浓度剂量有明显的抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)所致U937细胞泡沫化损伤作用的有6个:H1B1、H2B1、H5B1、H1B2、H4B2、H5B2,其他药物分别在100μg/ml剂量均无效。
表1
H1B1 |
H2B1 |
H3B1 |
H4B1 |
H5B1 |
H1B2 |
H2B2 |
H4B2 |
H5B2 |
√ |
√ |
● |
● |
√ |
√ |
● |
√ |
√ |
√:有效 ●:无效
实施例9:对ox-LDL引起的内皮细胞损伤有保护作用的药物筛选
(一)、实验材料
DMEM培养基(Gibco)、新生牛血清(杭州四季青生物公司)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL,北京协和预科大学)、辛伐他汀(Simvastatin,杭州默沙东制药)、Wst-1kit(Roche);
(二)实验方法
1.制备含药血清。SD大鼠30只,体重200克左右,雌性。随机分为对照组(CK)、及给药组(H1B1、H1B2、H2B1、H2B2、H3B1、H4B1、H4B2、H5B1、H5B2),共10组。每日依给定剂量灌胃(H药150g/kg.BW,B药50g/kg.BW),连续灌胃3日,第四日灌胃后半小时,腹主动脉取血。4000rpm×20min离心后,取上清,56℃、30min灭活后,-20℃冰箱保存备用。
2.实验分组。将人脐静脉内皮细胞培养于96孔板,分为:正常组(normal)、模型组(ox-LDL)、血清组(CK、H1B1、H1B2、H2B1、H2B2、H3B1、H4B1、H4B2、H5B1、H5B2)及阳性药组(Sim)共13组,每组6孔。正常组加入200μl含20%新生牛血清的DMEM培养基,其他各组分别加入17μl 1.2mg/ml的ox-LDL(终浓度100μg/ml),血清组加入40μl相应的血清,阳性药组加入10μl200μmol/ml的辛伐他汀(终浓度10μmol/ml),用含20%新生牛血清的DMEM培养基补足体积至200μl。37℃、5%CO2孵育24hr
3.检测细胞代谢活性。每孔加入20μl Wst-1试剂,37℃、5%CO2孵育1.5hr后,440nm处测定OD值。
(三)实验结果
由图2可见,与对照血清组相比,H1B1、H4B1两组能显著的改善ox-LDL损伤引起的人脐静脉内皮细胞代谢活性降低。由实验数据得出的结论见表2:
表2
H1B1 |
H2B1 |
H3B1 |
H4B1 |
H5B1 |
H1B2 |
H2B2 |
H4B2 |
H5B2 |
√ |
● |
● |
√ |
● |
● |
● |
● |
● |
√:有效;●:无效
实施例10:应用心肌细胞模型药物筛选
【实验目的】:
心肌肥厚是高血压等常见心血管系统疾病引起的一种心肌重构的关键阶段,也是心律失常,心衰等疾病的共同病理通路。心肌肥厚是决定心脏功能进入失代偿期与否的关键阶段。现利用肥大的心肌细胞模型进行药物的初步筛选。
【实验方法】:
1.心肌细胞肥大模型的建立:心肌细胞原代培养接种到96孔培养板,每24hr换液1次,培养最初的48hr内加入BrdU0.1mM抑制成纤维细胞的增殖,第36hr加入低能量培养基(0.4%FBS)继续培养48hr,实验分加药组,空白对照组,血管紧张素II(AngII)组,AngII+ACEI组,AngII+药物组,其中AngII终浓度为10-6M;阳性药:Anti终浓度为10-6M,含药血清分H1B1、H1B2、H2B2、H3B1、H4B1、H4B2、H5B1、H5B2、CK十种依次编号,加药剂量为20%。
2.蛋白含量的测定:
吸出培养基,加入PBS(pH7.3)小心冲洗细胞两次,每孔加入0.25%胰蛋白酶0.1ml消化细胞50度孵育30min,之后用1%SDS每孔0.2ml裂解细胞30min,蛋白含量实验采用Bradford法,100ul细胞裂解液加入1ml染液染色30min,进行酶标仪检测
3.统计学为T检验:P<0.05,说明差异显著,具有统计学意义
【实验结果】:见图3和表3
表3
Ck |
H1B1 |
H1B2 |
H2B2 |
H3B1 |
H4B1 |
H4B2 |
H5B1 |
H5B2 |
● |
√ |
● |
● |
● |
√ |
√ |
√ |
● |
√:有效;●:无效
【实验意义】:
心肌细胞在血管紧张素II的作用下表现为体积增大,细胞总蛋白含量增多,蛋白增殖加快,心肌处于代谢旺盛状态。心肌细胞内总蛋白含量可以初步评价药物对于心肌细胞生长是否存在正性激动或负性抑制作用。综合实施例4~6实验数据,结果见表4:
表4
|
H1B1 |
H2B1 |
H3B1 |
H4B1 |
H5B1 |
H1B2 |
H2B2 |
H4B2 |
H5B2 |
泡沫 |
√ |
√ |
● |
● |
√ |
√ |
● |
√ |
√ |
内皮 |
√ |
● |
● |
√ |
● |
● |
● |
● |
● |
心肌 |
√ |
● |
● |
√ |
√ |
● |
● |
√ |
● |
√:有效;●:无效
其中H1B1对三种模型都有效,H4B1、H4B2、H5B1对两种模型有效,H1B1可以进一步深入进行研究。
实施例11:降血脂药物筛选试验
1材料和仪器
1.1试验药物
试验药物如前所述,为H系列药与B系列药经H:B(3∶1)配伍给药,推荐量(动物):H系列药:150mg/kg,B系列药:50mg/kg,HB为单独一组药物,推荐量为200mg/kg。
试验药1:H1+B1,ig 0.2ml/10g;
试验药2:H2+B1,ig 0.2ml/10g;
试验药3:H3+B1,ig 0.2ml/10g;
试验药4:H4+B1,ig 0.2ml/10g;
试验药5:H5+B1,ig 0.2ml/10g;
试验药6:H1+B2, ig 0.2ml/10g;
试验药7:H2+B2, ig 0.2ml/10g;
试验药8:H3+B2, ig 0.2ml/10g;
试验药9:H4+B2, ig 0.2ml/10g;
试验药10:H5+B2,ig 0.2ml/10g;
试验药11:HB ig 0.2ml/10g。
1.2实验动物
清洁级ICR小鼠130只,体重20±2g,雌雄各半,由浙江省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(浙)2003-0001
1.3药品及试剂
舒降之(杭州默沙东制药有限公司,批号S1059),小鼠20mg/kg,ig0.2ml/10g;
生理盐水(浙江平湖莎普爱思制药有限公司,批号041113-2);
甘油三酯试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司,批号2230060);
胆固醇试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司,批号1300060);
高密度脂蛋白胆固醇试剂盒(威特曼生物科技南京有限公司,批号BD2228);
1.4仪器
LP123型电子天平;SE全自动生化分析仪:GL-20G-II冷冻高速离心机。
2实验方法
2.175%蛋黄乳剂的制备(徐叔云,等.药理实验方法学(第三版).北京:人民卫生出版社,2002;1201~1203)
90mL蛋黄加30mL生理盐水,用电动混匀器混匀,成乳状,4℃贮藏备用。
2.2降血脂筛选试验
将ICR小鼠130只,随机分成14组,即试验药1、试验药2、试验药3、试验药4、试验药5、试验药6、试验药7、试验药8、试验药9、试验药10、试验药11组、阳性对照组(舒降之)、模型对照组、正常对照组,每组10只,雌雄各半。模型对照组和正常对照组给予等体积蒸馏水,其余各组分别灌胃给药,每天1次,连续7d。末次给药2h后,除正常对照组外,其余12组腹腔注入新鲜蛋黄乳剂0.5ml/只。20h后摘眼球、取血,取血前12小时禁食,测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量。
2.3统计学处理
组间显著性差异均采用EXCEL进行分析,结果用X±SD表示。
3结果
3.1对高脂小鼠血清总胆固醇的影响(表5)
从表5可看出,模型对照组与正常对照组比较,TC升高,有极显著性差异(P<0.01),表明小鼠高脂血症模型建立成功。与模型对照组比较,TC降低,有显著性差异(P<0.05)。表明试验药1、试验药3能抑制高脂小鼠血清总胆固醇升高。
表5:血清总胆固醇(TC)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
TC(mmol/L) |
正常对照组 |
10 |
- |
3.51±0.67 |
模型对照组 |
10 |
- |
11.63±2.94<sup>△△</sup> |
试验药1 |
10 |
200 |
8.03±4.06<sup>*</sup> |
试验药2 |
10 |
200 |
10.31±5.32 |
试验药3 |
10 |
200 |
8.62±4.36<sup>*</sup> |
试验药4 |
10 |
200 |
11.45±6.18 |
试验药5 |
10 |
200 |
11.94±8.09 |
试验药6 |
10 |
200 |
9.53±6.77 |
试验药7 |
10 |
200 |
9.89±5.77 |
试验药8 |
10 |
200 |
13.27±5.98 |
试验药9 |
10 |
200 |
11.79±4.64 |
试验药10 |
10 |
200 |
12.22±5.07 |
试验药11 |
10 |
200 |
11.22±4.57 |
阳性对照组 |
10 |
20 |
8.58±4.18<sup>*</sup> |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01;
3.2对高脂小鼠血清甘油三酯的影响(表6)
表6:血清甘油三酯(TG)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
TG(mmol/L) |
正常对照组 |
10 |
- |
1.15±0.29 |
模型对照组 |
10 |
- |
12.81±5.22<sup>△△</sup> |
试验药1 |
10 |
200 |
7.98±4.89<sup>*</sup> |
试验药2 |
10 |
200 |
9.25±6.15 |
试验药3 |
10 |
200 |
8.86±5.45 |
试验药4 |
10 |
200 |
11.35±5.96 |
试验药5 |
10 |
200 |
9.85±6.50 |
试验药6 |
10 |
200 |
7.28±5.90<sup>*</sup> |
试验药7 |
10 |
200 |
8.64±5.94 |
试验药8 |
10 |
200 |
12.34±5.67 |
试验药9 |
10 |
200 |
12.70±5.40 |
试验药10 |
10 |
200 |
12.79±5.60 |
试验药11 |
10 |
200 |
10.98±5.76 |
阳性对照组 |
10 |
20 |
7.78±5.36<sup>*</sup> |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01.
从表6可看出,与正常对照组比较,模型对照组的TG升高,有显著性差异(P<0.01),表明小鼠高脂血症模型建立成功。与模型对照组比较,试验药1、试验药6TG降低,有显著性差异(P<0.05);试验药3、试验药7有降低趋势,无统计学意义。表明试验药1、试验药6可抑制高脂小鼠血清甘油三酯升高。
3.3对高脂小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的影响(表7)
表7:血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
HDL-C(mmol/L) |
HDL-C/TC |
正常对照组 |
10 |
- |
1.67±0.18 |
0.48±0.06 |
模型对照组 |
10 |
- |
2.37±0.27 |
0.22±0.06<sup>△△</sup> |
试验药1 |
10 |
200 |
2.08±0.33 |
0.30±0.09<sup>*</sup> |
试验药2 |
10 |
200 |
2.34±0.31 |
0.28±0.11 |
试验药3 |
10 |
200 |
2.21±0.27 |
0.30±0.10<sup>*</sup> |
试验药4 |
10 |
200 |
2.40±0.32 |
0.27±0.13 |
试验药5 |
10 |
200 |
2.35±0.37 |
0.29±0.16 |
试验药6 |
10 |
200 |
2.14±0.36 |
0.30±0.13 |
试验药7 |
10 |
200 |
2.34±0.24 |
0.30±0.12 |
试验药8 |
10 |
200 |
2.61±0.27 |
0.23±0.09 |
试验药9 |
10 |
200 |
2.56±0.28 |
0.25±0.10 |
试验药10 |
10 |
200 |
2.50±0.23 |
0.24±0.11 |
试验药11 |
10 |
200 |
2.54±0.26 |
0.25±0.10 |
阳性对照组 |
10 |
20 |
1.39±0.23 |
0.18±0.05 |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01
从表7可看出,与正常对照组比较,模型对照组的HDL-C/TC比值下降,有显著性差异(P<0.01)。与模型对照组比较,试验药1、试验药3的HDL-C/TC比值升高,有显著性差异(P<0.05);试验药6、试验药7有升高趋势,但无统计学意义。
4结论
降血脂药物又称血脂调节药,是指一类可以调整脂质代谢的药物,能够降低过高的血清TC或TG和(或)升高过低的血清HDL-C以改善血脂状况。降血脂药物按功效可分为主要降TC兼降TG和主要降TG兼降TC两大类,也有少数药物选择性地降低TC或TG(王海勇,等.降血脂药物的研究进展.国外医学药学分册,2004,31(3):160~166)。
以上试验结果表明:试验药1、试验药3能抑制高脂小鼠血清总胆固醇(TC)升高;试验药1、试验药6可抑制高脂小鼠血清甘油三酯(TG)升高,试验药3、试验药7有降低趋势;试验药1、试验药3能使HDL-C/TC比值升高,试验药6、试验药7有升高趋势。
综上所述,试验药1能同时降低TC、TG,升高HDL-C/TC比值;试验药3能同时降低TC,升高HDL-C/TC比值,有降低TG趋势;试验药6能降低TG,有升高HDL-C/TC比值的趋势;试验药7有降低TG、升高HDL-C/TC比值的趋势。
结论:试验药1降低血脂效果较为理想。
实施例12:降血脂试验
1.材料和仪器
1.1.试验药物
H1-1为实施例1所得赤芍提取物(赤芍总苷质量含量达60%),H1-2为实施例2所得的赤芍提取物(赤芍总苷质量含量达90%),H1-3为实施例3所得赤芍提取物(赤芍总苷质量含量达50%),B1-1为实施例4所得的党参提取物(党参多糖含量达90%),B1-2为实施例5所得的党参提取物(党参多糖质量含量达60%),B1-3为实施例6所得的党参提取物(党参多糖质量含量达50%),H1B1为实施例7所得赤芍党参共同提取物(赤芍总苷质量含量75%、党参多糖质量含量25%),将H1与B1按不同比例配伍(见表8),配成不同的受试药物。
推荐量(动物):HI+B1=200mg/kg体重,ig量为0.2ml/10g体重。
表8:各试验药组分用量
1.2.实验动物
清洁级ICR小鼠100只,体重20±2g,雌雄各半,由浙江省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(浙)2003-0001。
1.3.药品及试剂
舒降之(杭州默沙东制药有限公司,批号S1059),小鼠20mg/kg,ig0.2ml/10g;
生理盐水(浙江平湖莎普爱思制药有限公司,批号041113-2);
甘油三酯试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司,批号2230060);
胆固醇试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司,批号1300060);
高密度脂蛋白胆固醇试剂盒(威特曼生物科技南京有限公司,批号BD2228);
1.4.仪器
LP123型电子天平;SE全自动生化分析仪:GL-20G-II冷冻高速离心机。
2.实验方法
2.1.75%蛋黄乳剂的制备
90mL蛋黄加30mL生理盐水,用电动混匀器混匀,成乳状,4℃贮藏备用。
2.2.降血脂筛选试验
将ICR小鼠230只,随机分成26组:即试验药1~23共23组、阳性对照组(舒降之)、模型对照组、正常对照组,每组10只,雌雄各半。模型对照组和正常对照组给予等体积蒸馏水,其余各组分别灌胃给药,每天1次,连续7d。末次给药2h后,除正常对照组外,其余9组腹腔注入新鲜蛋黄乳剂0.5ml/只。20h后摘眼球、取血,取血前12小时禁食,测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量。
2.3.统计学处理
组间显著性差异均采用t检验,结果用X±SD表示。
3.结果
3.1.对高脂小鼠血清总胆固醇的影响(见表9)
表9:血清总胆固醇(TC)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
TC(mmol/L) |
正常对照组 |
10 |
- |
3.42±0.49 |
模型对照组 |
10 |
- |
11.26±4.58△△ |
试验药1 |
10 |
200 |
10.97±4.52 |
试验药2 |
10 |
200 |
9.83±4.24 |
试验药3 |
10 |
200 |
8.63±2.77<sup>*</sup> |
试验药4 |
10 |
200 |
7.73±3.46<sup>*</sup> |
试验药5 |
10 |
200 |
8.53±3.57<sup>*</sup> |
试验药6 |
10 |
200 |
6.72±2.99<sup>**</sup> |
试验药7 |
10 |
200 |
8.73±2.88<sup>*</sup> |
试验药8 |
10 |
200 |
8.93±3.75<sup>*</sup> |
试验药9 |
10 |
200 |
10.77±5.52 |
试验药10 |
10 |
200 |
11.02±4.32 |
试验药11 |
10 |
200 |
8.73±4.56<sup>*</sup> |
试验药12 |
10 |
200 |
8.23±3.88<sup>*</sup> |
试验药13 |
10 |
200 |
6.84±3.79<sup>**</sup> |
试验药14 |
10 |
200 |
8.93±4.47<sup>*</sup> |
试验药15 |
10 |
200 |
11.57±4.82 |
试验药8 |
10 |
200 |
8.93±3.75<sup>*</sup> |
试验药16 |
10 |
200 |
10.68±4.47 |
试验药17 |
10 |
200 |
11.87±5.62 |
试验药18 |
10 |
200 |
10.97±5.82 |
试验药19 |
10 |
200 |
8.53±4.45<sup>*</sup> |
试验药20 |
10 |
200 |
8.23±4.57<sup>*</sup> |
试验药21 |
10 |
200 |
8.67±4.42<sup>*</sup> |
试验药22 |
10 |
200 |
10.89±5.67 |
试验药23 |
10 |
200 |
11.77±4.82 |
阳性对照组 |
10 |
20 |
8.03±3.12<sup>*</sup> |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01;
从表9可看出,模型对照组与正常对照组比较,TC升高,有极显著性差异(P<0.01),表明小鼠高脂血症模型建立成功。与模型对照组比较,试验药3、4、5、7、8、11、12、14、19、20、21及阳性组的TC降低有显著性差异(P<0.05),试验药6、13的TC降低,有极显著性差异(P<0.01)。表明以上试验药能抑制高脂小鼠血清总胆固醇升高。
3.2.对高脂小鼠血清甘油三酯的影响(见表10)
表10:血清甘油三酯(TG)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
TG(mmol/L) |
正常对照组 |
10 |
- |
0.85±0.52 |
模型对照组 |
10 |
- |
12.68±5.27<sup>△△</sup> |
试验药1 |
10 |
200 |
12.78±5.23 |
试验药2 |
10 |
200 |
10.75±5.54 |
试验药3 |
10 |
200 |
8.98±3.18<sup>*</sup> |
试验药4 |
10 |
200 |
8.78±4.68<sup>*</sup> |
试验药5 |
10 |
200 |
8.69±4.37<sup>*</sup> |
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
TG(mmol/L) |
试验药6 |
10 |
200 |
8.79±3.79<sup>*</sup> |
试验药7 |
10 |
200 |
8.97±4.57<sup>*</sup> |
试验药8 |
10 |
200 |
9.11±4.32<sup>*</sup> |
试验药9 |
10 |
200 |
10.68±5.35 |
试验药10 |
10 |
200 |
12.11±5.27 |
试验药11 |
10 |
200 |
9.15±4.28<sup>*</sup> |
试验药12 |
10 |
200 |
9.04±4.72<sup>*</sup> |
试验药13 |
10 |
200 |
8.68±3.86<sup>*</sup> |
试验药14 |
10 |
200 |
9.11±5.11<sup>*</sup> |
试验药15 |
10 |
200 |
12.67±4.35 |
试验药16 |
10 |
200 |
10.57±5.23 |
试验药17 |
10 |
200 |
11.64±5.34 |
试验药18 |
10 |
200 |
10.32±4.26 |
试验药19 |
10 |
200 |
8.89±4.54<sup>*</sup> |
试验药20 |
10 |
200 |
8.93±4.47<sup>*</sup> |
试验药21 |
10 |
200 |
9.08±4.55<sup>*</sup> |
试验药22 |
10 |
200 |
11.88±5.22 |
试验药23 |
10 |
200 |
10.34±5.28 |
阳性对照组 |
10 |
20 |
8.57±4.20<sup>*</sup> |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01。
从表10可看出,与正常对照组比较,模型对照组的TG升高,有显著性差异(P<0.01),表明小鼠高脂血症模型建立成功。与模型对照组比较,试验药3、4、5、6、7、8、11、12、13、14、19、20、21及阳性组的TG降低,有显著性差异(P<0.05)。表明上试验药可抑制高脂小鼠血清甘油三酯升高。
3.3对高脂小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的影响(见表11)
表11:血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
HDL-C(mmol/L) |
HDL-C/TC |
正常对照组 |
10 |
- |
1.36±0.14 |
0.40±0.04 |
模型对照组 |
10 |
- |
1.71±0.15 |
0.18±0.07<sup>△△</sup> |
试验药1 |
10 |
200 |
1.89±0.12 |
0.22±0.10 |
试验药2 |
10 |
200 |
1.67±0.15 |
0.20±0.08 |
试验药3 |
10 |
200 |
1.65±0.08 |
0.24±0.10<sup>*</sup> |
试验药4 |
10 |
200 |
1.62±0.12 |
0.26±0.08<sup>*</sup> |
试验药5 |
10 |
200 |
1.64±0.16 |
0.28±0.09<sup>**</sup> |
试验药6 |
10 |
200 |
1.85±0.11 |
0.25±0.08<sup>*</sup> |
试验药7 |
10 |
200 |
1.86±0.08 |
0.24±0.07<sup>*</sup> |
试验药8 |
10 |
200 |
1.72±0.12 |
0.24±0.10<sup>*</sup> |
试验药9 |
10 |
200 |
1.82±0.13 |
0.19±0.10 |
试验药10 |
10 |
200 |
1.86±0.14 |
0.20±0.10 |
试验药11 |
10 |
200 |
1.68±0.13 |
0.24±0.09<sup>*</sup> |
试验药12 |
10 |
200 |
1.65±0.15 |
0.24±0.08<sup>*</sup> |
试验药13 |
10 |
200 |
1.62±0.09 |
0.26±0.10<sup>*</sup> |
试验药14 |
10 |
200 |
1.82±0.15 |
0.24±0.10<sup>*</sup> |
试验药15 |
10 |
200 |
1.87±0.13 |
0.20±0.09 |
试验药16 |
10 |
200 |
1.71±0.16 |
0.20±0.07 |
试验药6 |
10 |
200 |
1.85±0.11 |
0.25±0.08<sup>*</sup> |
试验药17 |
10 |
200 |
1.69±0.13 |
0.20±0.07 |
试验药18 |
10 |
200 |
1.64±0.10 |
0.20±0.08 |
试验药19 |
10 |
200 |
1.84±0.14 |
0.26±0.10<sup>*</sup> |
试验药20 |
10 |
200 |
1.65±0.12 |
0.27±0.07<sup>**</sup> |
试验药21 |
10 |
200 |
|
0.24±0.08<sup>*</sup> |
试验药22 |
10 |
200 |
|
0.19±0.10 |
试验药23 |
10 |
200 |
|
0.20±0.08 |
阳性对照组 |
10 |
20 |
1.59±0.13 |
0.22±0.08 |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01
从表11可看出,与正常对照组比较,模型对照组的HDL-C/TC比值下降,有显著性差异(P<0.01)。与模型对照组比较,试验药3、4、5、6、7、8、11、12、13、14、19、20、21的HDL-C/TC比值升高,有显著性差异(P<0.05)。
4.结论
降血脂药物主要通过降低过高的血清TC或TG和(或)升高过低的血清HDL-C以改善血脂状况。降血脂药物按功效可分为主要降TC兼降TG和主要降TG兼降TC两大类,也有少数药物选择性地降低TC或TG。
试验数据表明:多数试验药能同时降低TC、TG,升高HDL-C/TC比值好。
结论:多数试验药均有一定的降低血脂效果。
实施例13:降血脂药物筛选试验
1材料和仪器
1.1试验药物
H1为按照实施例1方法所得赤芍提取物,B1为按照实施例4方法所得党参提取物,为H1∶B1=4∶1(赤芍总皂苷与党参总多糖的质量之比为2.7∶1)比例,给药剂量见表12,ig 0.2m1/10g。
表12:试验药给药剂量
1.2实验动物
清洁级ICR小鼠80只,体重20±2g,雌雄各半,由浙江省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(浙)2003-0001
1.3药品及试剂
舒降之(杭州默沙东制药有限公司,批号S1242),小鼠20mg/kg,ig0.2ml/10g;
生理盐水(国营张家港市制药厂,批号05101503);
甘油三酯试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司,批号P051021);
胆固醇试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司,批号P051221);
高密度脂蛋白胆固醇试剂盒(威特曼生物科技南京有限公司,批号BD2228);
1.4仪器
LP123型电子天平;SE全自动生化分析仪:GL-20G-II冷冻高速离心机。
2实验方法
2.175%蛋黄乳剂的制备
90mL蛋黄加30mL生理盐水,用电动混匀器混匀,成乳状,4℃贮藏备用。
2.2降血脂筛选试验
将ICR小鼠80只,随机分成8组,即试验药1、试验药2、试验药3、试验药4、试验药5、阳性对照组(舒降之)、模型对照组、正常对照组,每组10只,雌雄各半。模型对照组和正常对照组给予等体积蒸馏水,其余各组分别灌胃给药,每天1次,连续7d。末次给药2h后,除正常对照组外,其余9组腹腔注入新鲜蛋黄乳剂0.5ml/只。20h后摘眼球、取血,取血前12小时禁食,测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量。
2.3统计学处理
组间显著性差异均采用t检验,结果用X±SD表示。
3结果
3.1对高脂小鼠血清总胆固醇的影响(表13)
表13:血清总胆固醇(TC)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
TC(mmol/L) |
正常对照组 |
10 |
- |
3.59±0.65 |
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
TC(mmol/L) |
模型对照组 |
10 |
- |
8.54±4.30<sup>△△</sup> |
试验药1 |
10 |
50 |
8.14±3.17 |
试验药2 |
10 |
100 |
5.62±1.67* |
试验药3 |
10 |
200 |
5.41±1.62* |
试验药4 |
10 |
400 |
5.57±1.57* |
试验药5 |
10 |
800 |
5.19±1.82* |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01;
从表13可看出,模型对照组与正常对照组比较,TC升高,有极显著性差异(P<0.01),表明小鼠高脂血症模型建立成功。与模型对照组比较,试验药2、试验药3、试验药4、试验药5的TC降低均有显著性差异(P<0.05),表明本品灌胃给予小鼠100、200、400、800mg/kg,均能抑制高脂小鼠血清总胆固醇升高。
3.2对高脂小鼠血清甘油三酯的影响(表14)
表14:血清甘油三酯(TG)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
TG(mmol/L) |
正常对照组 |
10 |
- |
0.97±0.24 |
模型对照组 |
10 |
- |
8.89±7.70<sup>△△</sup> |
试验药1 |
10 |
50 |
5.62±3.85 |
试验药2 |
10 |
100 |
4.24±3.06* |
试验药3 |
10 |
200 |
4.30±2.60* |
试验药4 |
10 |
400 |
3.99±2.56* |
试验药5 |
10 |
800 |
3.67±2.68* |
阳性对照组 |
10 |
20 |
4.31±3.28* |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01.
从表14可看出,与正常对照组比较,模型对照组的TG升高,有显著性差异(P<0.01),表明小鼠高脂血症模型建立成功。与模型对照组比较,试验药2、试验药3、试验药4、试验药5的TG降低,有显著性差异(P<0.05)。表明本品灌胃给予小鼠100、200、400、800mg/kg,均可抑制高脂小鼠血清甘油三酯升高。
3.3对高脂小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的影响(表15)
表15:血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量
组别 |
动物数(只) |
剂量(mg/kg) |
HDL-C(mmol/L) |
HDL-C/TC |
正常对照组 |
10 |
- |
1.17±0.11 |
0.33±0.04 |
模型对照组 |
10 |
- |
1.40±0.15 |
0.21±0.08<sup>△△</sup> |
试验药1 |
10 |
50 |
1.44±0.08 |
0.19±0.05 |
试验药2 |
10 |
100 |
1.34±0.14 |
0.25±0.06* |
试验药3 |
10 |
200 |
1.35±0.12 |
0.26±0.05* |
试验药4 |
10 |
400 |
1.34±0.11 |
0.25±0.05* |
试验药5 |
10 |
800 |
1.30±0.15 |
0.27±0.06* |
阳性对照组 |
10 |
20 |
1.35±0.15 |
0.26±0.06* |
注:与正常对照组比,△P<0.05,△△P<0.01;
与模型对照组比,*P<0.05,**P<0.01
从表15可看出,与正常对照组比较,模型对照组的HDL-C/TC比值下降,有显著性差异(P<0.01)。与模型对照组比较,试验药2、试验药3、试验药4、试验药5的HDL-C/TC比值升高,有显著性差异(P<0.05)。表明本品灌胃给予小鼠100、200、400、800mg/kg,均可升高高脂小鼠血清HDL-C/TC比值。
4结论
降血脂药物又称血脂调节药,是指一类可以调整脂质代谢的药物,能够降低过高的血清TC或TG和(或)升高过低的血清HDL-C以改善血脂状况。降血脂药物按功效可分为主要降TC兼降TG和主要降TG兼降TC两大类,也有少数药物选择性地降低TC或TG。
试验结果表明:本品灌胃给予小鼠100、200、400、800mg/kg,均可降低高脂小鼠血清TC、TG,升高HDL-C/TC比值。