CN110496179A - 一种快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，该方法包括如下步骤：以新鲜槟榔果实为原料，清洗沥干，破碎后研磨，磨细后加入提取剂继续研磨，充分研磨后离心，分离上清液；所述的提取剂选自如下的一种：(1)70％甲醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)；(2)95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)；(3)磷酸缓冲液(pH＝7.4)。本发明提高了槟榔中抗氧化物质的提取率和提取效率，可产生良好的社会效益和可观的经济效益，进而有助于促进槟榔产业的持续健康发展。

Description

一种快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法及应用
技术领域
本发明属于植物活性成分提取技术领域，具体而言，涉及一直槟榔果实抗氧化物质的快速高效提取方法及应用。
背景技术
槟榔(Areca catechu L.)属棕榈科多年生常绿乔木，为热带地区珍贵药用植物，在中国台湾、海南等省以及印度、马来西亚等国家产量较大，消费者众多。在国内外，槟榔果作为槟榔嚼块的主料而被广泛食用。槟榔果实可药用，在我国被列为四大南药之首。由于槟榔具有的麻醉作用以及使人兴奋的作用，因而在千年以前就己经被人们所认知。近年来，随着槟榔副产品加工产业的发展，市场对槟榔需求量显著增加，其巨大的需求量推动了槟榔加工企业的迅速发展，而槟榔因其广泛的药理活性也日益受到广大学者的研究与开发。
槟榔含有多种化学成分，主要含有生物碱、黄酮、鞣质、脂肪酸、萜类和甾体等多种化学成分。其中，脂肪酸和鞣质的含量较高，而生物碱作为槟榔中主要的生物活性成分报道较多，如槟榔碱，槟榔次碱，表儿茶素，儿茶素，柚皮素等。多种成分的存在使得槟榔生物活性较为多样，相关研究表明，槟榔提取物具有抗菌、抗抑郁、抗氧化、抗老化及抗溃疡等作用。研究表明，植物的抗氧化能力与总酚含量之间有直接的关系，总酚含量越高，其显示的抗氧化能力越强。槟榔提取物总体反映出较好的抗氧化能力及对羟自由基的清除能力。
抗氧化即为抗氧化自由基。化合物的分子在光、热等外界条件作用下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团即为自由基。自由基又称为游离基，其化学反应活性强，是许多反应的活性中间体，也是人体在进行新陈代谢过程中产生的代谢产物。人体内自由基的产生和清除处于动态平衡，但如果产生的自由基在细胞中过度累积，并失去控制时，其会破坏细胞膜，导致细胞代谢紊乱，从而诱发多种疾病，如癌症、老年痴呆、动脉硬化、糖尿病、心血管病、关节炎等。因此，抗氧化活性的研究是目前保健品、化妆品、药品等领域主要的研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。
CN109674916A公开了一种从槟榔鲜果中制备槟榔提取物的方法，经预处理、蒸汽爆破、强电场萃取、蒸发浓缩、冷冻干燥得到富含多酚的槟榔提取物。该方法需2.2-2.4Mpa蒸汽爆破，1.9-2.1kV强电场萃取，对仪器的安全性要求较高。
CN108516995A公开了一种槟榔多酚的提纯方法，包括以下步骤：取干制槟榔原料，去核粉碎，加入氢氧化钙作为pH调节剂，加入体积分数2030％乙醇溶液作为提取液，回流提取，经离心过滤得到槟榔提取液，加入大孔树脂吸附，洗脱，蒸发浓缩，经冷冻干燥得到槟榔多酚。该方法所需乙醇溶液体积分数较高，同时需要经回流提取、大孔树脂吸附等操作，步骤较为繁琐。
CN108112855A公开了一种从槟榔叶中提取天然食品抗氧剂的方法，该方法将槟榔叶清洗、干燥后进行粉碎，然后与酸类物质、醇类物质及水混合，加入提取罐中进行超声波辅助萃取得到提取液，再将提取液进行浓缩、红外线干燥，即可制得天然食品抗氧剂。该方法超声破碎处理时需辅助浸泡2-4h，红外干燥时间为30-60min，操作时间较长。
CN102389149A公开了一种从槟榔嫩果中提取纯化多酚的方法，该方法包括如下步骤：(1)将洗净的的槟榔嫩果打浆，立刻加入热去离子水提取，过滤，得槟榔多酚粗提液；(2)将槟榔多酚粗提液上大孔树脂柱，并进行洗脱分离纯化。该方法要求提取时保持95℃的温度，间接增加了提取成本。
通过检索相关技术发现，现有的槟榔抗氧化物质提取方法均存在步骤繁琐、工艺复杂和成本较高的缺点，不利于促进槟榔产业的持续健康发展。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种槟榔果实抗氧化物质的快速高效提取方法，该方法方法简单易行，安全无毒，短时间内即可获得高抗氧化活性的槟榔果实提取液。
为了实现上述技术目的，本发明提供了如下技术方案：一种快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，该方法包括如下步骤：以新鲜槟榔果实为原料，清洗沥干，破碎后研磨，磨细后加入提取剂继续研磨，充分研磨后离心，分离上清液；所述的提取剂选自如下的一种：
(1)70％甲醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)，配制方法为：将70％甲醇(每升溶液中含700ml甲醇)与pH7.4的磷酸盐水溶液以1:1的体积比混合。
(2)95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)，配制方法为：将95％乙醇(每升溶液中含950ml乙醇)与pH7.4的磷酸盐水溶液以1:1的体积比混合。
(3)磷酸缓冲液(pH＝7.4)，配制方法为：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g，溶于去离子水，定容至1L，调pH＝7.4。
优选地，如上所述快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其中研磨前经液氮速冻或冷冻干燥处理。
优选地，如上所述快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其中加入所述提取剂后继续研磨1-10min。
优选地，如上所述快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其中离心温度为3-6℃，离心速度为10000-12000rpm，离心时间为4-8min。
另外，本发明还提供了一种槟榔果实中抗氧化物质的抗氧化活性的检测方法，其以上述方法提取得到的上清液为待检样品溶液，取96孔板，每孔分别加入10-20μL不同浓度的所述样品溶液和90-180μL ABTS工作液，反应体系200μL，反应8-10s，静置8-12min；将96孔板放入酶标仪中，在734nm波长处检测样品的吸光度Ai；空白组采用pH＝7.4磷酸缓冲液代替所述样品溶液，其他步骤和参数不变，测得空白吸光度A0，按照如下公式计算，活性氧清除率＝[(A0-Ai)/A0]×100％，Ai为734nm波长处样品反应液的吸光度，A0为734nm波长处空白组反应液的吸光度，以上数据均采用Tecan 200Pro多功能酶标仪测量。
进一步优选地，如上所述槟榔果实中抗氧化物质的抗氧化活性的检测方法，其中的ABTS工作液的制备方法为：将7.4mmol/L ABTS水溶液与2.6mmol/L过硫酸钾水溶液混合，将混合液在室温避光条件下放置12～16h，形成ABTS储备液；将所述ABTS储备液与乙醇按照约1:40的体积比混合，在734nm下调吸光度为0.700±0.02，即得ABTS工作液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：采用最优的95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)提取溶剂作为提取剂，该提取剂配制容易，所需试剂稳定性好，成本低，槟榔中抗氧化物质的提取率和提取效率较高，可产生良好的社会效益和可观的经济效益，进而有助于促进槟榔产业的持续健康发展。
附图说明
图1为不同提取方法提取的槟榔果实提取液氧化物质清除率示意图。
以新鲜槟榔果实为原料，分成九个处理，每个处理称取槟榔果实样品1.3g，置于研钵中加液氮研磨，磨碎后分别加入不同提取液3mL继续研磨，充分研磨后将其转移至离心管中，4℃，12000rpm离心5min，吸取上清获得槟榔果实提取液。将上清液与ABTS工作液充分反应，计算其氧化物质清除率，进而比较不同提取液的抗氧化能力。实验结果显示，采用95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)、磷酸缓冲液(pH＝7.4)、70％甲醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)为提取剂的三种提取方法，获得的槟榔果实提取液抗氧化活性居于前三。
图2为提取效率最高三种提取方法槟榔果实提取液氧化物质清除率示意图。
根据图1结果，筛选活性氧清除率较高的前三种提取方法，将样品提取液梯度稀释至200倍、4000倍、80000倍，与ABTS工作液充分反应，计算其氧化物质清除率，比较其不同提取液的抗氧化能力，进一步筛选最佳提取方法。通过筛选，发现采用95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)提取溶剂提取获得的槟榔果实提取液抗氧化活性最高。
图3为提取效率最高三种提取方法槟榔果实提取液氧化物质清除率表观图。
根据图1结果，筛选活性氧清除率较高的前三种提取方法，将样品提取液梯度稀释至200倍、4000倍、80000倍，与ABTS工作液充分反应，通过比较各管颜色深浅，比较其不同提取液的抗氧化能力，进一步筛选最佳提取方法。通过筛选，发现采用95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)提取溶剂提取获得的槟榔果实提取液抗氧化活性最高。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于该实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1：槟榔果实中抗氧化物质的提取
1、提取剂的制备：
配置提取剂：70％甲醇、70％甲醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)、95％乙醇、95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)、磷酸缓冲液(pH＝3.0)、磷酸缓冲液(pH＝5.0)、磷酸缓冲液(pH＝6.5)、磷酸缓冲液(pH＝7.4)、磷酸缓冲液(pH＝9.0)，磷酸缓冲液选用无菌超纯水配置，浓度为0.5mM，将配置好的提取剂保存备用。
2、ABTS工作液的制备：
将7.4mmol/LABTS水溶液(每升水含4.06gABTS)与2.6mmol/L过硫酸钾水溶液(每升水含0.70g过硫酸钾)混合，将混合液在室温避光条件下放置12～16h，形成ABTS储备液。将此工作液与乙醇按照约1:40(v/v)比例混合，在734nm下调吸光度为0.700士0.02即得ABTS工作液。
3、样品的制备：
以新鲜槟榔果实为原料，洗净擦干水分，切碎，置于液氮中备用。
4、槟榔果实提取液的获得：
每个处理称取槟榔果实样品1.3g，置于研钵中加液氮研磨，磨碎后分别加入3mL提取液继续研磨，充分研磨后将其转移至离心管中，4℃，12000rpm离心5min，吸取上清获得槟榔果实提取液，-80℃，保存备用。
5、抗氧化活性检测：
在96孔板中，每孔分别入20μL不同浓度的样品溶液和180μLABTS工作液，反应体系200μL，反应10s，静置10min，将96孔板放入酶标仪中在734nm波长处检测样品的吸光度(Ai)；空白组采用pH＝7.4磷酸缓冲液代替所述样品溶液，其他步骤和参数不变，测得空白吸光度(A0)。
6、最佳提取方法的筛选：
计算活性氧清除率，筛选活性氧清除率较高的前三种提取方法。实验结果显示，采用95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)、磷酸缓冲液(pH＝7.4)、70％甲醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)为提取剂的三种提取方法，获得的槟榔果实提取液抗氧化活性居于前三(图1)。
梯度稀释样品提取液，重复步骤5，以及通过比较各管颜色深浅，比较其不同提取液的抗氧化能力，以进一步筛选最佳提取方法。实验结果显示，采用95％乙醇+磷酸缓冲液(pH＝7.4)提取溶剂提取获得的槟榔果实提取液抗氧化活性最高(图2、图3)。

Claims (8)

1.一种快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：以新鲜槟榔果实为原料，清洗沥干，破碎后研磨，磨细后加入提取剂继续研磨，充分研磨后离心，分离上清液；所述的提取剂选自如下的一种：
(1)70％甲醇与pH7.4磷酸缓冲液按照体积比为1:1配制的混合溶液；
(2)95％乙醇与pH7.4磷酸缓冲液按照体积比为1:1配制的混合溶液；
(3)磷酸缓冲液，pH＝7.4。
2.根据权利要求1所述快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其特征在于，研磨前经液氮速冻或冷冻干燥处理。
3.根据权利要求1所述快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其特征在于，加入所述提取剂后继续研磨1-10min。
4.根据权利要求1所述快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其特征在于，离心温度为3-6℃，离心速度为10000-12000rpm，离心时间为4-8min。
5.根据权利要求1所述快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其特征在于，所述的70％甲醇或95％乙醇为体积浓度。
6.根据权利要求1所述快速高效提取槟榔果实中抗氧化物质的方法，其特征在于，。所述的磷酸缓冲液的配制方法为：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.42 g，KH2PO40.27g，溶于去离子水，定容至1L，调pH＝7.4。
7.一种槟榔果实中抗氧化物质的抗氧化活性的检测方法，其特征在于，以权利要求1所述方法提取得到的上清液为待检样品溶液，取96孔板，每孔分别加入10-20μL不同浓度的所述样品溶液和90-180μL ABTS工作液，反应体系200μL，反应8-10s，静置8-12min；将96孔板放入酶标仪中，在734nm波长处检测样品的吸光度Ai；空白组采用pH7.4磷酸缓冲液代替所述样品溶液，其他步骤和参数不变，测得空白吸光度A0，按照如下公式计算，活性氧清除率＝[(A0-Ai)/A0]×100％。
8.根据权利要求7所述槟榔果实中抗氧化物质的抗氧化活性的检测方法，其特征在于，所述的ABTS工作液的制备方法为：将7.4mmol/L ABTS水溶液与2.6mmol/L过硫酸钾水溶液混合，将混合液在室温避光条件下放置12～16h，形成ABTS储备液；将所述ABTS储备液与乙醇按照约1:40的体积比混合，在734nm下调吸光度为0.700±0.02，即得ABTS工作液。
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