CN106290686B - Hplc-ms-ms测定王老吉凉茶成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种HPLC‑MS‑MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，属于凉茶植物饮料质量控制技术领域。该方法包括以下步骤：供试品溶液的制备：取供试品，溶解定容后过微孔滤膜，制得供试品溶液；对照品溶液的制备：精密称取对照品，以有机溶剂溶解定容，制得对照品溶液；检测：将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱质谱联用仪中，对王老吉凉茶中成分进行定量检测。上述HPLC‑MS‑MS测定王老吉凉茶成分的方法，通过液相色谱质谱联用技术，可同时测定王老吉凉茶中多种成分的含量，从而用以对王老吉凉茶的质量进行监测，实现全面保证王老吉凉茶质量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及凉茶植物饮料质量控制技术领域，特别是涉及一种HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法。
背景技术
岭南凉茶文化拥有悠久的历史积蕴和民俗内涵。古时岭南为百越之地，多瘴气，染者无有不死。岭南人民在与恶劣自然环境的不断抗争中，积累了调理保健、防病治病的宝贵经验。他们根据本地的气候、水土特性，以一些具有清热解毒、生津止渴、祛火除湿等功效的岭南特色中草药为基础，在中医养生理论指导下经过长期实践，创造出各种各样的″凉茶″，用于防病治病，形成了一条岭南文化的独特风景线。
王老吉凉茶是历史最早的广东凉茶，始创于1828年(清道光八年)，至今已有180多年历史，被公认为凉茶始祖，有″药茶王″之称。最近几十年，随着现代化生产设备和先进管理理念的引入，凉茶业发生了大变革，过去守着凉茶铺喝凉茶的局面被打破，凉茶被加工成饮用更方便的颗粒剂、袋泡茶、利乐包、罐装等多种规格。
王老吉凉茶以水、白砂糖、仙草、蛋花、菊花、夏枯草、甘草、金银花、布渣叶为原料，经提取、浓缩、配制、灭菌、包装等主要加工工艺制成，其口感清凉爽口，冷热饮用皆宜，受到消费者的喜爱。为全面的反映及监测该品种的内在质量，促进该品种的发展，应开展该品种中各成分检测方法的研究。
发明内容
本发明提供一种HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，用以对王老吉凉茶的质量进行监测，能够对其中的多种成分进行定量检测，实现全面保证王老吉凉茶质量的目的。
一种HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取供试品，溶解定容后过微孔滤膜，制得供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取水仙苷、原儿茶醛、川续断皂苷乙、咖啡酸、绿原酸、甘草苷、异绿原酸A、原儿茶酸、三叶豆苷、迷迭香酸、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、芦丁、和咖啡酰鸡蛋花苷对照品中的至少一种，以有机溶剂溶解定容，制得对照品溶液；
检测：将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱质谱联用仪中，对王老吉凉茶中成分进行定量检测。
上述HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，通过液相色谱质谱联用技术，可同时测定王老吉凉茶中多种成分的含量，从而以对王老吉凉茶的质量进行监测，实现全面保证王老吉凉茶质量的目的。
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，所述质谱为三重四极杆型质谱。采用三重四极杆型质谱，具有串级功能，不但具有较强的定性能力，在测试中可用做确认检测的手段，还具有非常好的定量能力，信噪比较佳。
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，按照下述质谱条件进行检测：
离子化方式：电喷雾离子化；
检出模式：多反应监测方式，负离子模式；
毛细管电压：3200-3800V；
喷嘴电压：450-550V；
雾化气体、干燥气体、和鞘气气体：氮气；
干燥气体温度：250-350℃；
干燥气流：4-6L/min；
雾化气压：40-50psi；
鞘气温度：300-400℃；
鞘气流速：9-13L/min。
采用上述质谱条件，能够提高样品离子化效率，进一步提高信噪比，进而提高检测灵敏度和稳定性。
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，按照下述质谱条件进行检测：
离子化方式：电喷雾离子化；
检出模式：多反应监测方式，负离子模式；
毛细管电压：3500V；
喷嘴电压：500V；
雾化气体、干燥气体、和鞘气气体：氮气；
干燥气体温度：300℃；
干燥气流：5L/min；
雾化气压：45psi；
鞘气温度：350℃；
鞘气流速：11L/min。
采用上述质谱条件，能够使样品具有最佳的离子化效率，
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，水仙苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为623.0±0.5m/z，子离子为315.1±0.5m/z，碎裂电压为268V，碰撞能量为29V；
原儿茶醛的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为137.0±0.5m/z，子离子为108.0±0.5m/z，碎裂电压为112V，碰撞能量为25V；
川续断皂苷乙的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为1074.0±0.5m/z，子离子为749.4±0.5m/z，碎裂电压为354V，碰撞能量为29V；
咖啡酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为179.0±0.5m/z，子离子为135.1±0.5m/z，碎裂电压为81V，碰撞能量为13V；
绿原酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为353.0±0.5m/z，子离子为191.0±0.5m/z，碎裂电压为77V，碰撞能量为9V；
甘草苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为417.0±0.5m/z，子离子为255.1±0.5m/z，碎裂电压为147V，碰撞能量为17V；
异绿原酸A的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为515.0±0.5m/z，子离子为353.0±0.5m/z，碎裂电压为143V，碰撞能量为9V；
原儿茶酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为153.0±0.5m/z，子离子为109.1±0.5m/z，碎裂电压为76V，碰撞能量为13V；
三叶豆苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为447.0±0.5m/z，子离子为284.1±0.5m/z，碎裂电压为226V，碰撞能量为25V；
迷迭香酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为359.0±0.5m/z，子离子为161.0±0.5m/z，碎裂电压为148V，碰撞能量为9V；
山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为593.0m/z±0.5，子离子为285.1±0.5m/z，碎裂电压为266V，碰撞能量为29V；
芦丁的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为609.0±0.5m/z，子离子为300.1±0.5m/z，碎裂电压为261V，碰撞能量为37V；
咖啡酰鸡蛋花苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为763.0±0.5m/z，子离子为213.0±0.5m/z，碎裂电压为285V，碰撞能量为29V。
以上述条件对各成分进行多反应监测，所获得的离子对具有信噪比高、稳定性好的优点，能够准确反映王老吉凉茶中各成分的含量。
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，按照下述液相色谱条件进行检测：
固定相：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式；
流速：0.2-0.3mL/min。
以上述色谱条件进行分离、检测，能够将王老吉凉茶中多种成分很好的分离，使各成分具有较好的分离度，利于后序的检测和鉴定。
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，按照下述液相色谱条件进行检测：
进样量：5μL；
固定相：填料粒径为2.7μm，直径、长度分别为3.0mm和50mm的Aglient Poroshell120 EC-C18色谱柱；
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱梯度为：0-3min，流动相B的体积百分数为由13％变化至25％；3-7min，流动相B的体积百分数为25％；7-8min，流动相B的体积百分数为由25％变化至40％；8-12min，流动相B的体积百分数为由40％变化至54％；12-16min，流动相B的体积百分数为13％；
柱温：20-30℃；
流速：0.25mL/min。
以上述色谱条件进行分离、检测，具有最佳的分离效果。
在其中一个实施例中，所述对照品溶液的制备步骤中，将各对照品以甲醇溶解定容，制得混合对照品溶液，其中，水仙苷的浓度为0.15-0.25μg/ml、原儿茶醛的浓度为0.6-0.8μg/ml、川续断皂苷乙的浓度为0.15-0.25μg/ml、咖啡酸的浓度为0.3-0.5μg/ml、绿原酸的浓度为2.0-3.0μg/ml、甘草苷的浓度为8-12μg/ml、异绿原酸A的浓度为5-7μg/ml、原儿茶酸的浓度为1.5-2.5μg/ml、三叶豆苷的浓度为1.5-2.5μg/ml、迷迭香酸的浓度为1.5-2.5μg/ml、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷的浓度为12-20μg/ml、芦丁的浓度为8-12μg/ml、咖啡酰鸡蛋花苷的浓度为1.2-1.5μg/ml。将对照品溶液的浓度限定在该范围内，与供试品溶液中各成分的浓度相适应，具有较好的参照性。
在其中一个实施例中，所述供试品溶液的制备步骤中，取王老吉凉茶，以体积百分含量为10-60％的甲醇稀释4-6倍，过0.22μm微孔滤膜，即得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，通过液相色谱质谱联用技术，可同时测定王老吉凉茶中水仙苷、原儿茶醛、川续断皂苷乙、咖啡酸、绿原酸、甘草苷、异绿原酸A、原儿茶酸、三叶豆苷、迷迭香酸、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、芦丁、和咖啡酰鸡蛋花苷等多种成分的含量，从而对王老吉凉茶的质量进行监测，实现全面保证王老吉凉茶质量的目的。并且，为王老吉凉茶谱效学的研究奠定了基础。
并且，该检测方法还对其中的液相条件和质谱条件进行了优化，能够将王老吉凉茶中多种成分很好的分离，使各成分具有较好的分离度和灵敏度，并且选取了能够准确反映王老吉凉茶中各成分的含量的离子对和子离子碎裂碰撞条件，进一步提高了定量检测的灵敏度和稳定性。
附图说明
图1为实施例1中混合对照品的总离子流图；
图2为实施例1中王老吉凉茶的总离子流图；
图3A-图3B为实施例1中各对照品的提取离子流图；
图4A-图4B为实施例1中王老吉凉茶中各目标化合物的提取离子流图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
以下实施例中的仪器与试药如下：
仪器：
Agilent 1260 HPLC高效液相色谱仪，配备二元梯度泵(1260 Bin Pump，G1312B)；
自动进样器(1260 Hip ALS，G1367E)；
柱温箱(1260 TCC，G1316A)；
Agilent 6460三重四极杆HPLC-MS-MS仪，Chemstation在线工作站；
Agilent Poroshell 120 EC-C18快速分离型高效液相色谱柱(3.0×50mm，2.7μm)；
SI-114型电子天平(丹佛仪器有限公司，北京)。
试药：
王老吉凉茶，配方所用药材、王老吉凉茶阴性样品均由王老吉药业股份有限公司提供；
川续断皂苷乙、咖啡酰鸡蛋花苷、水仙苷、芦丁、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(以下简称山奈酚糖苷)、异绿原酸A、三叶豆苷、甘草苷、迷迭香酸、绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸和原儿茶醛等对照品均为实验室自制，所有对照品经HPLC面积归一化法检测，纯度均高于98％；
甲醇和乙腈为色谱纯(默克)；甲酸为分析纯(广州化学试剂厂)；
实验用水为超纯水。
实施例1
一种HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，包括以下步骤：
一、供试品溶液的制备。
精密吸取王老吉凉茶0.2ml，30％甲醇稀释至1ml，过0.22μm微孔滤膜，作为王老吉成品供试品溶液。
二、对照品溶液的制备。
单一对照品溶液的制备：分别取各个对照品适量，精密称定，加甲醇定容至2ml，作为对照品储备液，于-4℃储存备用。
混合对照品溶液的制备：分别精密吸取上述单一对照品储备液，配置成混标储备液(各对照品浓度见下表)。
表1.混合对照品溶液浓度
三、检测。
(一)、检测条件筛选。
1、色谱条件的优化。
对甲醇-水和乙腈-水流动相进行了考察，结果发现乙腈的洗脱效果优于甲醇，各色谱峰分离效果好且分析时间较短。另外，加入0.1％甲酸可以有效的改善有机酸成分色谱峰的拖尾现象，并且能提高负离子模式的质谱响应，因此采用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相。
2、质谱条件的优化。
分别对比了正离子和负离子检测模式，发现在实验条件下有机酸类成分在负离子模式下检测灵敏度高，故选择负离子模式扫描。在MRM模式下，对选定的各待测物的母离子和定量子离子进行各种参数的优化。
(二)、检测条件确定。
分别将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱质谱联用仪中检测，具体条件确定如下：
液相色谱条件如下：
进样量：5μL；
固定相：Aglient Poroshell 120 EC-C18(3.0×50mm，2.7μm)色谱柱；
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱梯度为：0-3min，流动相B的体积百分数为由13％变化至25％；3-7min，流动相B的体积百分数为25％；7-8min，流动相B的体积百分数为由25％变化至40％；8-12min，流动相B的体积百分数为由40％变化至54％；12-16min，流动相B的体积百分数为13％；
柱温：25℃；
流速：0.25mL/min。
三重四极杆型质谱的质谱条件如下：
离子化方式：电喷雾离子化(ESI)；
检出模式：多反应监测(MRM)方式，负离子模式；
毛细管电压：3500V；
喷嘴电压：500V；
雾化气体、干燥气体、和鞘气气体：氮气；
干燥气体温度：300℃；
干燥气流：5L/min；
雾化气压：45psi；
鞘气温度：350℃；
鞘气流速：11L/min。
上述各对照品质谱分析的条件参数见下表。
表2.各对照品质谱分析的条件
按上述色谱和质谱条件对对照品溶液和供试品溶液中各成分进行测定，记录色谱图。
四、结果。
按上述色谱和质谱条件对对照品溶液和供试品溶液中各成分进行测定，记录色谱图。得到混合对照品的总离子流图(TIC)和王老吉凉茶的总离子流图(TIC)，分别如图1、图2所示；各对照品的MRM提取离子流图和王老吉凉茶的MRM提取离子流图，分别如图3A-B、图4A-B所示。
按上述色谱和质谱条件对供试品溶液(不同批次王老吉凉茶)中各成分进行测定分析，用外标法计算各样品中14个目标化合物的含量，结果如下表所示。
表3.王老吉凉茶中各目标化合物的含量(μg/ml，n＝2)
表4王老吉凉茶中各目标化合物占总量的比例(％)
五、方法学考察。
1、线性关系及检出限、定量限。
分别精密吸取混标储备液6，12，36，100，300，600，900，1200μL，甲醇定容至2ml，进样5μL，记录峰面积。以浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，计算回归方程。以信噪比(S/N)等于3及10为标准，分别测得各组分的检出限与定量限，并计算线性方程(见下表)。
表5线性方程及检出限、定量限
| 成分 | 线性方程 | 相关系数 | 线性范围(ng/ml) | 检测限(ng/ml) | 定量限(ng/ml) |
| 川续断皂苷乙 | Y＝2184.1x+3.8435 | 0.9992 | 3.6～120 | 1 | 2 |
| 咖啡酰鸡蛋花苷 | Y＝24665x+78.310 | 0.9998 | 4.08～408 | 1 | 4 |
| 水仙苷 | Y＝16622x+33.444 | 0.9996 | 3.6～150 | 0.5 | 1 |
| 芦丁 | Y＝13077x+369.10 | 0.9996 | 30～3000 | 0.5 | 1 |
| 山奈酚糖苷 | Y＝13603x+559.91 | 0.9992 | 48～2400 | 0.5 | 1 |
| 异绿原酸A | Y＝7453.0x-121.38 | 0.9994 | 36～2700 | 10 | 20 |
| 三叶豆苷 | Y＝27716x+277.58 | 0.9997 | 6～900 | 0.2 | 1 |
| 甘草苷 | Y＝52008x+417.68 | 0.9991 | 2.4～480 | 0.2 | 0.5 |
| 迷迭香酸 | Y＝12867x-23.768 | 0.9996 | 12～1200 | 5 | 10 |
| 绿原酸 | Y＝15805x+137.776 | 0.9992 | 14.4～1440 | 5 | 10 |
| 咖啡酸 | Y＝20031x+1383.5 | 0.9995 | 30～3000 | 20 | 30 |
| 原儿茶酸 | Y＝8599.2x+128.19 | 0.9995 | 36～900 | 6 | 30 |
| 原儿茶醛 | Y＝37255x+254.11 | 0.9990 | 2.1～315 | 1 | 5 |
从上述结果中可以看出，各化合物的响应值与浓度间均呈现良好的线性关系。
2、精密度试验。
精密吸取同一混合对照品溶液5μL，连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，测得各目标化合物的相对标准偏差(RSD)为0.95％-3.78％，结果表明该方法有较好的精密度。
3、重复性试验。
取同一王老吉成品供试液6份，按上述检测方法，稀释5倍后进样5μL进行测定，测得各成分含量的RSD值为0.56％-4.93％，结果表明供试样品重复性良好。
4、稳定性试验
取同一王老吉成品供试液分别于0，4，8，12，18，24h进样分析，记录峰面积，计算得RSD值为2.26％-4.82％，结果表明供试样品溶液在24h内稳定。
5、加样回收试验
分别取已知各目标化合物含量的王老吉成品供试液0.1ml，6份，分别加入各化合物，按上述检测方法，进样分析，计算回收率，结果见下表。
表6加样回收试验
从上述结果中可以看出，该方法的回收率较好，能够准确测定王老吉凉茶中各目标化合物的含量。
实验例1指标成分的代表性与专属性试验
王老吉凉茶是由凉粉草、鸡蛋花、菊花、金银花、夏枯草、布渣叶和甘草等七味药材提取加工制成的，其成分复杂多样，本实验在前期化学成分的基础上，按照上述检测方法，对王老吉凉茶与各阴性样品进行逐一分析，具体如下：
一、供试品溶液的制备。
王老吉凉茶阴性样品的供试品溶液：分别精密吸取各阴性药材王老吉凉茶0.2ml，30％甲醇稀释至1ml，过0.22μm微孔滤膜，作为王老吉凉茶阴性样品的供试品溶液。
上述王老吉凉茶阴性样品指的是，在制备凉茶过程中，分别不投料布渣叶、甘草、鸡蛋花、金银花、菊花、夏枯草、或仙草，制得分别不合布渣叶、甘草、鸡蛋花、金银花、菊花、夏枯草、仙草的七种凉茶成品。
二、对照品溶液的制备。
参照实施例1。
三、检测。
参照实施例1。
四、结果。
按上述色谱和质谱条件对供试品溶液(王老吉凉茶阴性样品的供试品)中各成分进行测定分析，用外标法计算各样品中6个目标化合物，结果如下表所示。
表7.王老吉凉茶阴性样品中各目标化合物的检测结果
注：″+″表示检出，″-″表示未检出。
通过上述结果，我们可以分析出，这6个指标成分是单药味来源化合物：川续断皂苷乙、水仙苷、咖啡酰鸡蛋花苷、甘草苷、迷迭香酸和三叶豆苷，如下表所示。
表8. 13个指标成分的化学信息
| 化合物名称 | 分子式 | 分子量 | 主要来源 |
| 甘草苷 | C21H12O9 | 418 | 甘草 |
| 川续断皂苷乙 | C53H86O22 | 1074 | 金银花 |
| 水仙苷 | C29H34O16 | 638 | 布渣叶 |
| 迷迭香酸 | C18H16O8 | 360 | 凉粉草 |
| 三叶豆苷 | C21H20O11 | 448 | 凉粉草 |
| 咖啡酰鸡蛋花苷 | C35H40O19 | 764 | 鸡蛋花 |
由于单药味来源的化合物具有较强的专属性，提示在制定王老吉凉茶成品及原料药质量标准时，应优先考虑将该类化合物作为质量控制指标。
实验例2王老吉凉茶指标成分的分析
根据上述实施例1的测定结果，分析得到样品中13个目标化合物的相对含量归属，如下表所示。
表9.样品中13个目标化合物的相对含量归属(mean±SD)
| 成分 | 相对含量％(n＝9) |
| 迷迭香酸 | 29.84±0.40％ |
| 绿原酸 | 19.16±0.32％ |
| 异绿原酸A | 9.29±0.25％ |
| 咖啡酸 | 8.69±0.36％ |
| 三叶豆苷 | 8.37±0.19％ |
| 甘草苷 | 7.20±0.60％ |
| 水仙苷 | 4.77±0.42％ |
| 山奈酚糖苷 | 3.62±0.14％ |
| 原儿茶酸 | 3.47±0.11％ |
| 芦丁 | 3.24±0.21％ |
| 原儿茶醛 | 2.06±0.16％ |
| 咖啡酰鸡蛋花苷 | 0.24±0.04％ |
| 川续断皂苷乙 | 0.03±0.02％ |
研究结果发现：
对13个目标化合物的相对含量进行分析，发现迷迭香酸含量最高，在20％以上；相对含量小于20％的成分有绿原酸、异绿原酸A、咖啡酸、三叶豆苷、甘草苷、水仙苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、原儿茶酸、芦丁、原儿茶醛；相对含量在1％以下的成分为：咖啡酰鸡蛋花苷、川续断皂苷乙。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取供试品，溶解定容后过微孔滤膜，制得供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取水仙苷、原儿茶醛、川续断皂苷乙、咖啡酸、绿原酸、甘草苷、异绿原酸A、原儿茶酸、三叶豆苷、迷迭香酸、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、芦丁、和咖啡酰鸡蛋花苷对照品中的至少两种，以有机溶剂溶解定容，制得对照品溶液；
检测：将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱质谱联用仪中，对王老吉凉茶中成分进行定量检测；
所述检测步骤中，按照下述液相色谱条件进行检测：
固定相：填料粒径为2.7μm，直径、长度分别为3.0mm和50mm的Aglient Poroshell 120EC-C18色谱柱；
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；
洗脱梯度为：0-3min，流动相B的体积百分数为由13％变化至25％；3-7min，流动相B的体积百分数为25％；7-8min，流动相B的体积百分数为由25％变化至40％；8-12min，流动相B的体积百分数为由40％变化至54％；12-16min，流动相B的体积百分数为13％；
所述检测步骤中，所述质谱为三重四极杆型质谱；
按照下述质谱条件进行检测：
离子化方式：电喷雾离子化；
检出模式：多反应监测方式，负离子模式；
毛细管电压：3200-3800V；
喷嘴电压：450-550V；
雾化气体、干燥气体、和鞘气气体：氮气；
干燥气体温度：250-350℃；
干燥气流：4-6L/min；
雾化气压：40-50psi；
鞘气温度：300-400℃；
鞘气流速：9-13L/min。
2.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，其特征在于，所述检测步骤中，按照下述质谱条件进行检测：
离子化方式：电喷雾离子化；
检出模式：多反应监测方式，负离子模式；
毛细管电压：3500V；
喷嘴电压：500V；
雾化气体、干燥气体、和鞘气气体：氮气；
干燥气体温度：300℃；
干燥气流：5L/min；
雾化气压：45psi；
鞘气温度：350℃；
鞘气流速：11L/min。
3.根据权利要求2所述的HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，其特征在于，所述检测步骤中，水仙苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为623.0±0.5m/z，子离子为315.1±0.5m/z，碎裂电压为268V，碰撞能量为29V；
原儿茶醛的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为137.0±0.5m/z，子离子为108.0±0.5m/z，碎裂电压为112V，碰撞能量为25V；
川续断皂苷乙的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为1074.0±0.5m/z，子离子为749.4±0.5m/z，碎裂电压为354V，碰撞能量为29V；
咖啡酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为179.0±0.5m/z，子离子为135.1±0.5m/z，碎裂电压为81V，碰撞能量为13V；
绿原酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为353.0±0.5m/z，子离子为191.0±0.5m/z，碎裂电压为77V，碰撞能量为9V；
甘草苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为417.0±0.5m/z，子离子为255.1±0.5m/z，碎裂电压为147V，碰撞能量为17V；
异绿原酸A的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为515.0±0.5m/z，子离子为353.0±0.5m/z，碎裂电压为143V，碰撞能量为9V；
原儿茶酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为153.0±0.5m/z，子离子为109.1±0.5m/z，碎裂电压为76V，碰撞能量为13V；
三叶豆苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为447.0±0.5m/z，子离子为284.1±0.5m/z，碎裂电压为226V，碰撞能量为25V；
迷迭香酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为359.0±0.5m/z，子离子为161.0±0.5m/z，碎裂电压为148V，碰撞能量为9V；
山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为593.0m/z±0.5，子离子为285.1±0.5m/z，碎裂电压为266V，碰撞能量为29V；
芦丁的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为609.0±0.5m/z，子离子为300.1±0.5m/z，碎裂电压为261V，碰撞能量为37V；
咖啡酰鸡蛋花苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为763.0±0.5m/z，子离子为213.0±0.5m/z，碎裂电压为285V，碰撞能量为29V。
4.根据权利要求1-3任一项所述的HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，其特征在于，所述检测步骤中，按照下述液相色谱条件进行检测：
流速：0.2-0.3mL/min。
5.根据权利要求4所述的HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，其特征在于，所述检测步骤中，按照下述液相色谱条件进行检测：
进样量：5μL；
柱温：20-30℃；
流速：0.25mL/min。
6.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS测定王老吉凉茶成分含量的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备步骤中，将各对照品以甲醇溶解定容，制得混合对照品溶液，其中，水仙苷的浓度为0.15-0.25μg/ml、原儿茶醛的浓度为0.6-0.8μg/ml、川续断皂苷乙的浓度为0.15-0.25μg/ml、咖啡酸的浓度为0.3-0.5μg/ml、绿原酸的浓度为2.0-3.0μg/ml、甘草苷的浓度为8-12μg/ml、异绿原酸A的浓度为5-7μg/ml、原儿茶酸的浓度为1.5-2.5μg/ml、三叶豆苷的浓度为1.5-2.5μg/ml、迷迭香酸的浓度为1.5-2.5μg/ml、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷的浓度为12-20μg/ml、芦丁的浓度为8-12μg/ml、咖啡酰鸡蛋花苷的浓度为1.2-1.5μg/ml。
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