CN109856280A - 一种同时测定防己药材中粉防己碱和防己诺林碱含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时测定防己药材中粉防己碱和防己诺林碱含量的方法，具体步骤包括：A、提取液制备：防己药材粉碎，称取适量药粉，2％盐酸甲醇提取，常温超声，中速滤纸初滤，取滤液用微孔滤膜过滤，得提取液。提取液以粉防己碱和防己诺林碱为对照品；B、调节高效液相色谱仪检测条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Extend‑C18(4.6×250mm，5μm)，流动相乙腈‑0.08％三乙胺水(75∶25)，等度洗脱，进样量8μl，流速1.0mL·min‑1，柱温25℃，检测波长282nm；C、进样，等待供试品及对照品结果，按外标法以峰面积计算，分别计算各供试品中粉防己碱和防己诺林碱组分的含量。经过长期反复验证，确证本方法准确度、精密度、专属性高，色谱条件耐用性良好。
Description
技术领域
本发明属中药的含量测定方法领域，具体涉及一种同时测定防己药材中粉防己碱和防己诺林碱含量的方法。
背景技术
防己，为防己科植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根，具有利水消肿、祛风止痛的功效。粉防己碱和防己诺林碱为防己药材的主要化学成分。研究表明，粉防己碱具有抗尘肺、抗癌、抗类风湿性关节炎、抗肿瘤、抗多药耐药等多种药理作用。防己诺林碱在抗肿瘤、抗癌、抑制增生性瘢痕等方面有显著的生物活性。目前，中药市场上防己存在一个严重的问题，即流通的防己药材存在质量参差不齐，含量水平的高低可能会直接影响防己药材的质量和疗效，建立防己中主要成分的定量分析方法可为防己药材质量的检测提供方法。
2015版《中国药典》提供了有关防己药材中粉防己碱和防己诺林碱含量的测定方法，但该法流动相含有十二烷基磺酸钠，起泡多，消除泡沫时间长，且溶解温度要求严格，操作复杂。流动相混合可有效减少消除泡沫的时间，但混合流动相适合单通道进样，对于新的多通道进样液相色谱仪，该操作方法已不具优势。鉴于《中国药典》方法所存在的缺陷，许多人对流动相进行改进试验，但不同文献报道的方法具有差异，且都存在流动相复杂的缺陷。
鉴于以上问题，本发明的目的旨在减少色谱条件中流动相的数量，简化流动相配制程序，为防己药材中粉防己碱和防己诺林碱含量的同时测定提供高效、低耗、简便的方法，也为防己人工种植药材的良种选育、品种改良、资源利用等提供检测方法。
发明内容
本发明提供了一种同时测定防己药材中粉防己碱和防己诺林碱含量的高效液相色谱方法。该方法在原有的2015版药典法和历年文献报道测定粉防己碱和防己诺林碱含量方法的基础上进行整合和改良，大大缩短了提取时间，减少提取溶剂的使用，降低了提取成本；测定时一针多测，高效快速；经过反复验证后，本方法准确度、精密度、专属性高，色谱条件耐用性良好。
本发明通过以下技术方案实现：
1.本发明原料为防己药材，其制备方法为：采集防己根，洗净，除去粗皮，晒至半干，切成片状，60℃烘箱干燥，置于密封袋保存。药材通过粉碎机粉碎后过三号筛，置冰箱保存备用。
本发明使用的提取液为：2％盐酸甲醇。
本发明采用的提取方法为：取防己药材粉末约0.5g，精密称定，精密加入2％盐酸甲醇溶液25ml，称定重量，常温超声30min，取出，放冷，再称定重量，用提取液液补足减失的重量，摇匀。
本发明粉防己碱和防己诺林碱含量测定方法为：高效液相色谱测定法。
本发明高效液相色谱法待测溶液的制备方法为：上述摇匀后的提取液，采用中速滤纸进行初滤，精密量取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。后用0.45μm微孔滤膜过滤，制成待测溶液。
2.调节高效液相色谱仪检测条件
色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18。
流动相为乙腈(A相)-三乙胺的缓冲水溶液(B相)。
等度洗脱：75∶25。
其中，各检测条件为：
流动相B三乙胺的缓冲水溶液百分比为0.05％～1％。
优选地，三乙胺的缓冲水溶液百分比为为0.08％。
流动相流速为0.5ml/min～1ml/min。
优选地，流速为1ml/min。
色谱柱柱温控制在25～35℃。
优选地，柱温为25℃。
进样量为5μl～10μl。
优选地，进样量为8μl。
检测波长为282nm。
3.进样，等待供试品及对照品结果，按外标法以峰面积计算，分别计算各供试品中防己诺林碱和粉防己碱组分的含量。
本发明高效液相色谱法采用纯度≥98％的粉防己碱和防己诺林碱为对照品。
本发明高效液相色谱法标准曲线制作方法为：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含粉防己碱0.3mg、防己诺林碱0.15mg的混合溶液，即得混合对照品溶液。取混合对照品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，设置仪器自动进样0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20μl，以对照品的进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程。
本发明含量计算方法为：外标法计算样品的含量。计算公式如下：
各组分含量(％)＝(供试品峰面积×对照品浓度×稀释倍数×100)/(对照品峰面积×对照品称样量×1000)。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
一、以下结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
1.仪器
仪器设备：Agilent1260 Inifinal II高效液相色谱仪(包括G7111A四元泵、G7116A柱温箱、G7129A自动进样器、G7114AVWD检测器、Control panel化学工作站)、色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18(4.6×250mm，5μm)、Sartorius BP211D十万分之一电子天平、超声波清洁机(宁波芝新科技有限责任公司)。
2.试剂
乙腈(色谱纯试剂)、甲醇(分析纯试剂)、水(超纯水机制备)、三乙胺(分析纯试剂)。粉防己碱和防己诺林碱对照品纯度大于98％。
3.检测流程
防己根，洗净，除去粗皮，晒至半干，切成片状，60℃烘箱干燥后，用粉碎机粉碎，过三号筛。取药材粉末约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入相应浓度的盐酸甲醇25ml，称定重量，常温超声30min，取出，放冷，再称定重量，用相同浓度的盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，中速滤纸过滤，精密量取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
供试品溶液以粉防己碱和防己诺林碱为对照品，采用在色谱柱Agilent ZORBAXExtend-C18、流动相乙腈-0.08％三乙胺水(75∶25)，等度洗脱，柱温25℃、流速1.0ml/min、进样量8μl、检测波长282nm条件下，用高效液相色谱测定其含量。外标法计算样品的含量。
计算公式如下：
各组分含量(％)＝(供试品峰面积×对照品浓度×稀释倍数×100)/(对照品峰面积×对照品称样量×1000)。
二、实施例1至实施例5提取条件见表1
表1.实施例1至实施例5提取条件
| 实施例 | 提取溶剂及浓度 | 超声时间 |
| 实施例1 | 2％盐酸甲醇 | 超声30分钟 |
| 实施例2 | 70％乙醇 | 超声30分钟 |
| 实施例3 | 50％甲醇 | 超声30分钟 |
| 实施例4 | 70％甲醇 | 超声30分钟 |
| 实施例5 | 100％甲醇 | 超声30分钟 |
三、实施例1至实施例5含量测定结果见表2
表2.实施例1至实施例5含量测定结果
| 实施例 | 防己诺林碱含量 | 粉防己碱含量 |
| 实施例1 | 1.15％ | 1.44％ |
| 实施例2 | 1.05％ | 1.28％ |
| 实施例3 | 0.88％ | 1.13％ |
| 实施例4 | 1％ | 1.27 |
| 实施例5 | 0.77％ | 1.04％ |
四、结果分析
由实施例1至实施例5的含量测定结果可知，当提取溶剂为2％盐酸甲醇、70％乙醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇，采用超声提取30分钟时，均可有效提取防己药材中药用有效成分防己诺林碱和粉防己碱，通过高效液相色谱检测，其含量标准达到国家药典规定的总量不低于1.6％的标准。但是2％盐酸甲醇提取效率高于其他溶剂，故2％盐酸甲醇为最优提取溶剂。
Claims (10)
1.一种同时测定防己药材中粉防己碱和防己诺林碱含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提取液制备：防己药材粉碎，称取适量药粉，有机溶剂提取，常温超声，过滤得提取液；
B、调节高效液相色谱仪检测条件；C、进样，等待供试品及对照品结果，按外标法以峰面积计算，分别计算各供试品中粉防己碱和防己诺林碱组分的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤A中，所述的防己药材为防己根干燥后所得药材。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤A中，其有机溶剂浓度为2％盐酸甲醇或50％～100％甲醇或70％乙醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其有机溶剂为2％盐酸甲醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤A中，其提取方法为常温超声30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤B中，其含量测定的方法采用高效液相色谱测定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，流动相为乙腈(A相)-0.08％三乙胺的缓冲水溶液(B相)，A相与B相的比例为75∶25。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，流动相流速为1ml/min，色谱柱柱温为25℃，进样量为8μl，检测波长为282nm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤C中，外标法为各组分含量(％)＝(供试品峰面积×对照品浓度×稀释倍数×100)/(对照品峰面积×对照品称样量×1000)。
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