CN109633019B - 一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于脂肪乳注射液纯度技术领域，更具体地，本发明涉及一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法。本发明提供一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪乳注射液纯度技术领域，更具体地，本发明涉及一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法。
背景技术
脂肪乳注射液，白色乳状液体，是静脉营养的组成部分之一，脂肪乳机体提供能量和必须脂肪酸，用于胃肠外营养补充能量及必须脂肪酸，预防和治疗人体必需脂肪酸缺乏症，也为经口服途径不能维持和恢复正常必需脂肪酸水平的病人提供必需脂肪酸。
抗氧剂168是一种性能优异的亚磷酸酯抗氧剂，其抗萃取性强,对水解作用稳定，并能显著提高制品的光稳定性，可以与多种酚类抗氧剂复合使用。如美国Cyanamid公司开发的Cyanox2777即是由抗氧剂168和酚类抗氧剂1790的复配物。将亚磷酸酯与酚类抗氧剂复合使用，可充分发挥协同效应，组分中的亚磷酸酯为辅助抗氧剂，不能起到长期稳定作用，但与受阻酚复配后，却获得了较好的复配效果，可用于多种聚合物中。
了解脂肪乳注射液中抗氧剂168的含量对临床应用有着重大意义，因此，本领域有待开发出一种操作简单且测试结果精确的，对脂肪乳注射液中抗氧剂168的分析方法。
发明内容
为了精确检测脂肪乳注射液中抗氧剂168的含量，本发明提供了一种脂肪乳注射液中抗氧剂168的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证；
所述步骤(1)和步骤(2)中溶剂为乙腈和甲醇；
所述乙腈和甲醇的体积比为(5-7)：1；
所述样品检测过程中的洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1-0.3％的甲酸；流动相B：甲醇；
所述流动相A和流动相B的体积比为(2-3):(97-98)。
所述样品检测过程中质谱条件：扫描模式：MRM；离子喷雾电压：4500V，雾化温度：500℃。
作为一种优选的技术方案，所述样品母液为力能20％脂肪乳注射液。
作为一种优选的技术方案，所述乙腈和甲醇的体积比为6：1。
作为一种优选的技术方案，所述待测样品溶液的制备过程为：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容，充分混匀后静置，待测。
作为一种优选的技术方案，所述抗氧剂168标准工作溶液浓度分别为2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明提供的测试方法采用了对提取样品进行有效萃取的办法，即采用乙腈和甲醇复配溶剂提高了提取效率，样品用量少，溶剂消耗量少，稳定可靠，对抗氧剂168的选择性好，采用液相色谱质谱联用的检测手段，操作简便、灵敏度高，使用的色谱条件使抗氧剂168的色谱峰与杂质色谱峰分离效果较好，回收率优异，样品测试结果的相对标准偏差小。
具体实施方式
为了精确检测脂肪乳注射液中抗氧剂168的含量，本发明提供了一种脂肪乳注射液中抗氧剂168的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证；
所述步骤(1)和步骤(2)中溶剂为乙腈和甲醇；
所述乙腈和甲醇的体积比为(5-7)：1；
所述样品检测过程中的洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1-0.3％的甲酸；流动相B：甲醇；
所述流动相A和流动相B的体积比为(2-3):(97-98)。
所述样品检测过程中质谱条件：扫描模式：MRM；离子喷雾电压：4500V，雾化温度：500℃。
在一些实施方式中，本发明所述检测方法通过以下详述实现：
1.仪器：液相色谱质谱联用仪(美国AB Sciex ExionLC-4500型)
2.试剂：力能20％脂肪乳注射液(250mL)，费森尤斯卡比华瑞制药有限公司；抗氧剂168(98.5％)；乙腈(HPLC，99.9％)；甲醇(HPLC，99.9％)。
3.待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容。
在一种优选的实施方式中，所述样品母液为力能20％脂肪乳注射液。
在一种优选的实施方式中，所述乙腈和甲醇的体积比为6：1。
在一种优选的实施方式中，所述待测样品溶液的制备过程为：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容，充分混匀后静置，待测。
在一种优选的实施方式中，所述待测样品溶液的制备步骤包括：
取样品母液10μL于容量瓶中，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min，取1mL待测，同法平行制备2份；其中，所述样品母液为力能20％脂肪乳注射液；所述溶剂为乙腈和甲醇的体积比为(5-7)：1的混合溶剂。
本申请发明人在研究的过程中发现由于在脂肪乳中含有多种抗氧剂，其极性微大于抗氧剂168，因此，在采用LCMS时，会有多种其他抗氧剂的杂质峰对抗氧剂168的峰出现干扰，且单独使用甲醇，容易有沉淀析出，因此发明人将溶剂调整为乙腈和甲醇的混合溶剂，且当两者的体积比为(5-7)：1时，能够有效的将抗氧剂168分离出来，避免其他抗氧剂的干扰，从而增加检测的准确度。
4.标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液。
在一种优选的实施方式中，所述抗氧剂168标准工作溶液浓度分别为2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L。
在一种优选的实施方式中，所述标准工作溶液的制备步骤包括：分别取20μL、40μL、50μL、80μL、100μL抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容至10mL，配置成浓度分别为2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L的5种抗氧剂168标准工作溶液；其中，所述溶剂为乙腈和甲醇的体积比为(5-7)：1的混合溶剂。
5.液相色谱质谱分析为利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和含待测样品的残留物进行检测分析。
液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH，C8，1.7μm，2.1×50mm；柱温：35℃；样品室温度：15℃；流速：0.3ml/min；进样体积：1μL；分析时间：6min。
洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1-0.3％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为(2-3):(97-98)。
质谱条件：扫描模式：MRM；离子喷雾电压：4500V，雾化温度：500℃。
在一种更优选的实施方式中，所述样品检测过程中的洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1-0.3％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为(2-3):(97-98)。
在一种更优选的实施方式中，所述样品检测过程中的洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为2:98。
本申请发明人在研究的过程中发现在上述参数设置下，检测方法的精密度和重现性较好，准确度高；同时通过参数的合理控制，完全符合RSD低于8％的要求。发明人推测可能的原因是：通过控制流动相A和流动相B以及柱温的控制，能够使得样品分散均匀，出峰均匀，不拖尾，从而确保了高精密度和准确度。此外，本申请通过等度洗脱的形式，大大节约了时间与成本。
此外，发明人在研究的过程中发现选择乙腈和甲醇复配的溶剂，能够将大多数抗氧剂与抗氧剂158分离开，然而，在最终出现的谱图中，还是会在抗氧剂168的峰附近出现杂峰，干扰判断，可能是由于氧化剂168的同分异构体导致，申请人发现，当控制了LC-MS的参数后，通过流动相的选择、使用量比例以及温度的控制，让即使很接近的杂质也能够与抗氧剂168分离开，不需要采用梯度洗脱的方式就可以去除杂质峰，操作简单，结果精确。然而，若仅仅采用乙腈作为溶剂，即使控制参数，也会出现一些杂峰影响判断。
6.结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
本发明所述RSD表示为相对标准偏差。如下所述样品母液为力能20％脂肪乳注射液；所述溶剂为乙腈和甲醇的体积比为(5-7)：1的混合溶剂。
1)绘制标准曲线：将抗氧剂168标准工作溶液，以对照品浓度为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，仪器自动计算回归方程，标准曲线回归方程为y＝5552.55296x-808.25071，相关系数为R＝0.99937。
2)准确度试验：
低浓度水平：取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液20μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得准确度溶液，取1mL待测，同法平行制备3份；其中，抗氧剂168加标浓度为2μg/L；
中浓度水平：取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液50μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得准确度溶液，取1mL待测，同法平行制备3份；其中，抗氧剂168加标浓度为5μg/L；
高浓度水平：取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液80μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得准确度溶液，取1mL待测，同法平行制备3份；其中，抗氧剂168加标浓度为8μg/L；
取样品溶液和准确度溶液进样分析，计算平均回收率和RSD。
3)重复性试验：取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液50μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得重复性溶液，取1mL待测，同法平行制备6份；其中，抗氧剂168加标浓度为5μg/L；取重复性溶液进样分析，计算RSD。
4)中间精密度试验：于第二天，不同分析员，取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液50μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得中间精密度溶液，取1mL待测，同法平行制备6份；其中，抗氧剂168加标浓度为5μg/L；取中间精密度溶液进样分析，计算RSD。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
所述步骤(1)待测样品溶液的制备步骤包括：取样品母液10μL于容量瓶中，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min，取1mL待测，同法平行制备2份；其中，所述样品母液为力能20％脂肪乳注射液；所述溶剂为乙腈和甲醇的体积比为6：1的混合溶剂。
所述步骤(2)标准工作溶液的制备步骤包括：分别取20μL、40μL、50μL、80μL、100μL抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容至10mL，配置成浓度分别为2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L的5种抗氧剂168标准工作溶液；其中，所述溶剂为乙腈和甲醇的体积比为6：1的混合溶剂。
所述步骤(3)液相色谱质谱分析为利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和含待测样品的残留物进行检测分析。
液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH，C8，1.7μm，2.1×50mm；柱温：35℃；样品室温度：15℃；流速：0.3ml/min；进样体积：1μL；分析时间：6min。
洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为2:98。
质谱条件：扫描模式：MRM；离子喷雾电压：4500V，雾化温度：500℃。
所述步骤(4)结果分析过程如下所述，其中，所述样品母液为力能20％脂肪乳注射液；所述溶剂为乙腈和甲醇的体积比为6：1的混合溶剂。
1)绘制标准曲线：将抗氧剂168标准工作溶液，以对照品浓度为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，仪器自动计算回归方程，标准曲线回归方程为y＝5552.55296x-808.25071，相关系数为R＝0.99937。
2)准确度试验：
低浓度水平：取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液20μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得准确度溶液，取1mL待测，同法平行制备3份；其中，抗氧剂168加标浓度为2μg/L；
中浓度水平：取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液50μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得准确度溶液，取1mL待测，同法平行制备3份；其中，抗氧剂168加标浓度为5μg/L；
高浓度水平：取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液80μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得准确度溶液，取1mL待测，同法平行制备3份；其中，抗氧剂168加标浓度为8μg/L；
取样品溶液和准确度溶液进样分析，计算平均回收率和RSD。
3)重复性试验：取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液50μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得重复性溶液，取1mL待测，同法平行制备6份；其中，抗氧剂168加标浓度为5μg/L；取重复性溶液进样分析，计算RSD。
4)中间精密度试验：于第二天，不同分析员，取样品母液10μL于容量瓶中，加入抗氧剂168对照品母液50μL，用溶剂定容至10mL，充分混匀后静置5min得中间精密度溶液，取1mL待测，同法平行制备6份；其中，抗氧剂168加标浓度为5μg/L；取中间精密度溶液进样分析，计算RSD。
实施例2
实施例2提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例2的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述步骤(1)、(2)、(4)中溶剂为乙腈和甲醇的体积比为5：1的混合溶剂。
实施例3
实施例3提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例3的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述步骤(1)、(2)、(4)中溶剂为乙腈和甲醇的体积比为7：1的混合溶剂。
实施例4
实施例4提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例4的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为3:97。
实施例5
实施例5提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例5的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述洗脱程序：流动相A：体积分数为0.3％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为2:98。
实施例6
实施例6提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例6的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述步骤(1)、(2)、(4)中溶剂为乙腈和甲醇的体积比为1：5的混合溶剂。
实施例7
实施例7提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例7的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述步骤(1)、(2)、(4)中溶剂为乙腈和甲醇的体积比为20：1的混合溶剂。
实施例8
实施例8提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例8的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述洗脱程序：流动相A：体积分数为0.01％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为2:98。
实施例9
实施例9提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例9的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述洗脱程序：流动相A：体积分数为0.8％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为2:98。
实施例10
实施例10提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例10的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为5:95。
实施例11
实施例11提供了一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证。
实施例11的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1％的甲酸；流动相B：甲醇；流动相A和流动相B的体积比为1:99。
检测结果：
按照本发明提供的性能验证方法，测定实施例1～11检测方法的线性、准确度、定量限、重复性、中间精密度检测相关性能。
表1
Claims (4)
1.一种脂肪乳注射液中添加剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液制备：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容；
(2)标准工作溶液制备：取抗氧剂168对照品母液，用溶剂定容，经逐级稀释后，配制成5种抗氧剂168标准工作溶液；所述样品母液为力能20％脂肪乳注射液；
(3)液相色谱质谱分析：利用液相色谱质谱联用仪对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)结果分析：标准曲线绘制及方法验证；
所述步骤(1)和步骤(2)中溶剂为乙腈和甲醇；
所述乙腈和甲醇的体积比为(5-7)：1；
所述样品检测过程中的洗脱程序：流动相A：体积分数为0.1-0.3％的甲酸；流动相B：甲醇；
所述流动相A和流动相B的体积比为(2-3):(97-98)；
所述样品检测过程中质谱条件：扫描模式：MRM；离子喷雾电压：4500V，雾化温度：500℃。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述乙腈和甲醇的体积比为6：1。
3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述待测样品溶液的制备过程为：于容量瓶中加入样品母液，用溶剂定容，充分混匀后静置，待测。
4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述抗氧剂168标准工作溶液浓度分别为2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L。
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