CN117092238A - 内源性大麻素生物标志组合物及其检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种内源性大麻素生物标志组合物及检测方法，该生物标志组合物包括以下组分：AEA、OEA、LEA、PEA或SEA，其检测方法包括以下步骤：(1)提供样品，所述样品包括来自于检测对象的血液或组织；(2)对样品进行前处理，得到待检测样本；(3)对待检测样本采用超高效液相色谱‑三重四极杆串联质谱系统进行分离和分析检测，获得所述样品中AEA、OEA、LEA、PEA或SEA含量。本发明检测方法无需进行衍生化处理，减少基质效应，提高检测准确度，能够实现生物样品中的痕量检测，提高检测的灵敏度，通过一次操作即可实现多种内源性大麻素的定性和定量检测，分析时间短，检测结果准确，重复性强，具有可预期的临床应用前景。

Description

内源性大麻素生物标志组合物及其检测方法和应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种内源性大麻素生物标志组合物及其检测方法和应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种以肝脏脂质蓄积为特征的慢性疾病。大量研究揭示了内源性大麻素系统(ECs)在非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化等多种疾病中的重要作用。内源性大麻素作为内源性脂质介质，是两种大麻素受体(CB1与CB2)的激动剂，在各种不同的生理和病理过程中具有重要作用，例如，与神经保护、记忆、肿瘤、肥胖、免疫功能调节和心血管系统疾病等均有关。内源性大麻素主要成分是N-花生四烯酸氨基乙醇以及2-花生四烯酸甘油，这两种成分均从突触后末梢合成并释放，传递逆行信号并作用于突触前末梢的CB1和CB2。研究表明花生四烯酸乙醇(AEA)可干预神经退行性病变，如阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿病(HD)和多发性神经硬化症(NIS)等的发展过程。
除了AEA外，类内源性大麻素油酰乙醇胺(OEA)，亚油酰乙醇酰胺(LEA)，棕榈酰乙醇胺(PEA)，硬脂酰乙醇胺(SEA)在内源性大麻素系统中也有一定的作用，可通过间接方式增强AEA的作用效果。AEA、OEA、LEA、PEA和SEA有着类似的合成途径和结构，它们被统称为酰基乙醇胺类。其中，PEA是一种内源性脂质神经调节剂，通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)介导广谱药理作用，包括镇痛、抗炎、抗惊厥和抗增殖作用。OEA和LEA都是内源性合成的，但也可以来自饮食和补充剂，并且都是PPAR-α的激活配体。通过合成花生四烯酸乙醇(AEA)、十六酰胺乙醇(PEA)和油酰乙醇胺(OEA)可以直接或者间接的方式减少皮质醇的含量，因此这几个成分也被用来衡量人的生理压力状态。
在样本的前处理方法上，目前国内外多采用的是固相萃取法或蛋白沉淀后进行固相萃取，这样造成前处理复杂，费用较高，因此需要对前处理进行改进，以降低成本，减少操作的步骤。目前检测方法包括有HPLC-UV/荧光，GC-FID，GC-MS和LC-MS。其中最为常用的方法为GC-MS/MS，但样品必须经过衍生化处理来增加挥发性和提高检测的响应，这种脂肪酸甘油的各种衍生物具有不稳定性，并且也比较耗时。因此，如何提供一种既能利用较少样品量、又能确保高通量、高选择性和高灵敏度的生物检测方法，以便能够为非酒精性脂肪肝检测提供帮助，仍是需要解决的问题。
基于此，完成本发明。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种内源性大麻素生物标志组合物及其检测方法和应用，本发明提供的UPLC-MS/MS结合了超高效液相和质谱，灵敏度高、分析时间快，检测脂类成分无需采用衍生化的方法，检测结果更稳定。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种内源性大麻素生物标志组合物，该生物标志组合物包括以下组分中的至少三种：AEA、OEA、LEA、PEA或SEA。
优选地，所述生物标志组合物为AEA、OEA、LEA；
进一步优选地，所述生物标志组合物为AEA、OEA、LEA、PEA和SEA的组合。
发明人研究发现，相比正常对照组，脂肪肝模型组大鼠血浆中AEA的含量显著上升，肝组织中SEA的含量显著上升，PEA、LEA和AEA的含量显著降低，因此通过检测样本中的这几组物质的水平，可以准确评估生理健康状况。
本发明正是基于该发现，将上述内源性大麻素生物标志组合物用于非酒精性脂肪肝的鉴别诊断，可以将其制成相应诊断试剂或应用在诊断仪器中，通过检测待测组织样品中的AEA、OEA、LEA、PEA和SEA的含量，与标准值比较，以此判断脂肪肝患病状况。
但发明人进一步发现，精准、高效、稳定的检测组织样品中的AEA、OEA、LEA、PEA和SEA等含量并非易事，目前在样本的处理上，大多采用固相萃取法或蛋白沉淀后进行固相萃取，处理复杂，费用高。且目前常用的GC-MS/MS方法，必须经过衍生化处理来增加挥发性和提高检测的响应，脂肪酸甘油的各种衍生物具有不稳定性，比较耗时。
为此，本发明提供一种内源性大麻素生物标志组合物的检测方法，属于可以利用较少样品量、确保高通量、高选择性和高灵敏度的生物检测方法，包括以下步骤：
(1)提供样品，所述样品包括来自于检测对象的血液或组织；
(2)对步骤(1)中的样品进行前处理，得到待检测样本；
(3)对步骤(2)待检测样本采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱系统进行分离和分析检测，获得所述样品中AEA、OEA、LEA、PEA或SEA含量。
待测内源性大麻素包括N-花生四烯酸氨基乙醇(anandamine，AEA)、油酰乙醇胺(Oleoyl Ethanolamide，OEA)、亚油酰乙醇酰胺(Linoleoyl Ethanolamide，LEA)、榈酰乙醇胺(Palmitoyl Ethanolamide，PEA)、硬脂酰乙醇胺(Stearyl Ethanolamide，SEA)，内标包括AEA-d8、OEA-d4和LEA-d4。
作为本发明优选的实施方式，步骤(2)通过液液萃取法对样品进行前处理，具体操作为，将样品与溶剂充分混合，离心、取上层溶液浓缩，吹干后加入溶液中保存待测。
作为本发明优选的实施方式，所述溶剂包括甲基叔丁基醚、甲醇和纯水，所述溶液为乙腈水溶液。
进一步地，所述甲基叔丁基醚与样品的体积比为8-12：1，所述甲醇与样品的体积比为2-5：1，所述纯水与样品的体积比为2-5：1，例如，在某一具体实施方式中，取100μL组织匀浆液，分别加入1000μL甲基叔丁基醚、300μL甲醇和290μL纯水。
进一步地，所述乙腈水溶液与样品的体积比为1-3：1，例如，在某一具体实施方式中，100μL组织匀浆液，加入100μL乙腈水溶液。所述乙腈水溶液中，乙腈与水的体积比为1:1-3。
本发明通过研究，确定使用甲基叔丁基醚(MTBE)和甲醇的液液萃取，可以更好的提取AEA等低含量成分，实现较少样品量和高灵敏度的检测。
作为本发明优选的实施方式，样品离心时间为5～15min，转速为3000～6000r/min。
作为一种典型的实施方式，样品前处理可按以下步骤进行：
组织样本制备：4度条件下解冻后，将组织切碎，按1:2～1:3(g/v)的比例加入10％～30％甲醇后，用电动匀浆器匀浆，再取适量组织匀浆液，加入一定比例的甲基叔丁基醚、甲醇和纯水，震荡混匀。
血清样本制备：取适量4度条件下解冻的血浆溶液，加入一定比例的甲基叔丁基醚、甲醇和纯水，震荡混匀。
将上述样品离心5～15min，转速为3000～6000r/min，取出上层溶液离心浓缩,并吹干。
吹干后的样品加入适量复溶液(乙腈：水)，乙腈与水的体积比为1:1～3，震荡1～2min，离心5～10min(8000～12000r/min)，取上清40μL～80μL于进样小瓶待测。
作为本发明优选的实施方式，步骤(3)采用超高效液相色谱仪，使用C18色谱柱(2.1mm×10mm，1.7μm)，进样体积为1μL～10μL，柱温35℃～45℃，采用梯度洗脱法。
作为本发明优选的实施方式，所述的梯度洗脱法，以0.01％～0.1％甲酸乙腈为有机相，以0.01％～0.1％甲酸水为水相，梯度洗脱程序具体为：
(1)体积比例为16％～24％的甲酸乙腈等度洗脱0.5～1.5min；
(2)甲酸乙腈体积比例从16％～24％匀速增至50％～60％，梯度洗脱0.5～1.5min；
(3)甲酸乙腈体积比例从50％～60％匀速增至60％～70％，梯度洗脱8.0～9.0min；
(4)甲酸乙腈体积比例从60％～70％匀速增至85％～95％，梯度洗脱0.5～1.0min；
(5)甲酸乙腈体积从85％～95％瞬时切换至16％～24％后等度洗脱1.0～2.0min。
本发明优化了一系列色谱条件，包括色谱柱和流动相，可以在更短的时间内分离目标分析物，色谱柱的分离度和峰形更好。
作为本发明优选的实施方式，步骤(3)采用三重四极杆串联质谱仪，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描模式为正、负离子模式；
离子源喷雾电压：4.5kV～5.5kV；
离子源气帘气：206.8～241.3kPa；
碰撞气：41.4～48.3kPa；
离子源温度：450℃～600℃；
雾化气：379.2～413.7kPa；
辅助气：379.2～413.7kPa；
多反应监测模式(MRM)。
离子对条件包括：AEA的监测离子对为348.0/62.0，OEA的监测离子对为326.4/309.2，LEA的监测离子对为324.4/62.1，PEA的监测离子对为300.3/62.1，SEA的监测离子对为328.5/311.3；内标AEA-d8的监测离子对为356.1/294.0，OEA-d4的监测离子对为330.6/66.1，LEA-d4的监测离子对为328.1/66.0。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过检测样品中内源性大麻素AEA、OEA、LEA、PEA和SEA的含量，能够准确的判断脂肪肝患病状况，具有可预期的临床应用前景。
本发明采用液液萃取的前处理方法，液质联用同时测定血清和/或组织样品中内源性大麻素，实现进样分析，能一次性检测组织样品中多个内源性大麻素，并采用定量更为准确的同位素内标法来检测生物样本中内源性大麻素的含量，检测效率高、检测精度高。样品前处理方法无需进行衍生化处理，也大大减少了基质效应，提高了检测的准确度。
本发明采用的前处理方法中，最低定量限比已报道的文献更低，能够实现生物样品中的痕量检测，提高检测的灵敏度。本发明方法通过一次操作即可实现血浆和/或组织中5种内源性大麻素的定性和定量检测，分析时间短，检测结果准确，且重复性强，具有可预期的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中5个内源性大麻素(N-花生四烯酸氨基乙醇AEA、油酰乙醇胺OEA、亚油酰乙醇酰胺LEA、榈酰乙醇胺PEA、硬脂酰乙醇胺SEA)及内标(AEA-d8、OEA-d4和LEA-d4)的多反应离子检测色谱图。
图2为大鼠血浆中榈酰乙醇胺PEA多反应离子检测色谱图。
图3为大鼠血浆中亚油酰乙醇酰胺LEA多反应离子检测色谱图。
图4为大鼠血浆中硬脂酰乙醇胺SEA多反应离子检测色谱图。
图5为大鼠血浆中N-花生四烯酸氨基乙醇AEA多反应离子检测色谱图。
图6为大鼠血浆中油酰乙醇胺OEA多反应离子检测色谱图。
图7为大鼠血浆中内标AEA-d8多反应离子检测色谱图。
图8为大鼠血浆中内标OEA-d4多反应离子检测色谱图。
图9为大鼠血浆中内标LEA-d4多反应离子检测色谱图。
图10为实施例2中5个内源性大麻素(N-花生四烯酸氨基乙醇AEA、油酰乙醇胺OEA、亚油酰乙醇酰胺LEA、榈酰乙醇胺PEA、硬脂酰乙醇胺SEA)及内标(AEA-d8、OEA-d4和LEA-d4)的多反应离子检测色谱图。
图11为大鼠组织中榈酰乙醇胺PEA多反应离子检测色谱图。
图12为大鼠组织中亚油酰乙醇酰胺LEA多反应离子检测色谱图。
图13为大鼠组织中硬脂酰乙醇胺SEA多反应离子检测色谱图。
图14为大鼠组织中N-花生四烯酸氨基乙醇AEA多反应离子检测色谱图。
图15为大鼠组织中油酰乙醇胺OEA多反应离子检测色谱图。
图16为大鼠组织中内标AEA-d8多反应离子检测色谱图。
图17为大鼠组织中内标OEA-d4多反应离子检测色谱图。
图18为大鼠组织中内标LEA-d4多反应离子检测色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，并不对其内容进行限定。
实施例1
本实施例建立一种基于液质联用法测定血浆中5种内源性大麻素的检测方法。
标准溶液的配制：精密称取AEA、OEA、LEA、PEA、SEA对照品，并用甲醇溶解，分别配制成浓度为1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、5mg/mL和1.6mg/mL的单标储备液，存于-20℃。
内标溶液的配制：精密称取AEA-d8及OEA-d4和LEA-d4对照品，并用甲醇溶解，分别配制成浓度为2.5μg/mL和1μg/mL的单标储备液，存于-20℃。
血清样本制备：取100μL大鼠血浆溶液，分别加入1000μL甲基叔丁基醚、300μL甲醇和290μL纯水，震荡混匀1min，搅拌至均匀。将上述样品离心10min，转速为3000r/min，取出上层溶液离心浓缩，并吹干。吹干后的样品加入100μL复溶液(乙腈：水；30:70)，震荡1～2min，4℃离心10min(10000r/min)，取上清80uL于进样小瓶待测。
液相色谱条件：Waters Acuity超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相：乙腈(B)-0.2％甲酸水溶液(A)；梯度洗脱(0→0.5min：16％B；0.5→1.0min：16％→55％B；1.0→9.5min：55％→61％B；9.5→12.5min：61％-95％B,12.5-13.5min，16％B)；柱温为35℃，流速为0.35mL/min，进样量为5μL。
质谱条件：API5500三重四极杆串联质谱仪(美国AB Sciex公司)；离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描模式为正、负离子模式；离子源喷雾电压：4.5kV；离子源气帘气：241.3kPa；碰撞气：48.3kPa；离子源温度：560℃；雾化气：413.7kPa；辅助气：413.7kPa；分析时间(duration)：8.0min；多反应监测模式(MRM)，仪器参数及监测离子对见表1。所得内源性大麻素标准品及内标的多反应离子监测色谱图，见附图1-9。
表1
绘制标准曲线：取100uL组织匀浆液，加入标准系列液(20μL)，再加入混合内标(14μL)，依照“样本制备”项下操作并配制成系列浓度的组织样品。再按液相色谱条件及质谱条件进行液质联用分析。以待测物峰面积扣除空白峰面积后与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，以待测物浓度为横坐标(X)，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归计算，得到相应的回归方程，S/N≥3确定检出限，S/N≥10确定定量限，结果见表2。
表2
由上表可知，各个成分的标准曲线在相应的线性范围内，待测物峰面积与待测物浓度线性关系良好。
精密度与准确度：采用空白组织液制备各成分的低、中、高浓度生物样品，每个浓度平行制备6份，进样分析；连续测定3天，代入当日的标准曲线方程，计算得到批间、批内精密度及准确度，准确度的计算需要扣除空白样品。结果见表3。
表3
由上表可知，生物样品中各个脂肪酸成分的低、中、高浓度的批内及批间精密度和准确度良好，均满足生物分析方法的要求。
提取回收率和基质效应：取100uL空白组织匀浆液，加入低、中、高3个浓度混合对照品溶液经过前处理，进样得峰面积A；另取经过前处理的空白组织匀浆液，加入相应的低、中、高3个浓度混合对照品溶液，进样得峰面积B；取低、中、高3种不同浓度的混合对照品溶液，直接进样分析，记录峰面积C。以上三种制备方法，每个浓度平行5份，计算得到5种内源性大麻素的提取回收率和基质效应，结果见表4。提取回收率(R)和基质效应(ME)的计算公式如下：
R(％)＝[(A-Apooled)/(B-Apooled)]×100
ME(％)＝[(B-Apooled)/(C-Apooled)]×100
Apooled是未加标的混合生物样品的峰面积。
表4
样品稳定性：取低、中、高3个浓度的质控样本，考察样本在室温中放置4h，自动进样器中放置12h，冻融3次条件下的稳定性和在-80℃保存20天的长期稳定性，每个浓度平行5份。稳定性结果表明样品在上述不同的环境下均较稳定，RSD范围均小于15％。
实施例2
本实施例建立一种基于液质联用法测定组织中内源性大麻素的检测方法。
标准溶液的配制：精密称取AEA、OEA、LEA、PEA、SEA对照品，并用甲醇溶解，分别配制成浓度为1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、5mg/mL和1.6mg/mL的单标储备液，存于-20℃。
内标溶液的配制：精密称取AEA-d8及OEA-d4和LEA-d4对照品，并用甲醇溶解，分别配制成浓度为2.5μg/mL、1mg/mL和1mg/mL的单标储备液，存于-20℃。
组织样本制备：取100μL肝脏组织匀浆液，分别加入1000μL甲基叔丁基醚、300μL甲醇、290μL纯水、14μL混合内标，震荡混匀1min，搅拌至均匀。将上述样品离心10min，转速为3000r/min,取出上层溶液离心浓缩，并吹干。吹干后的样品加入100μL复溶液(乙腈：水；30:70)，震荡1～2min，4℃离心10min(10000r/min),取上清80uL于进样小瓶待测。
液相色谱条件和质谱条件同实施例1。所得内源性大麻素标准品及内标的多反应离子监测色谱图见图10-18。
绘制标准曲线：取100uL组织匀浆液，加入标准系列液(20μL)，再加入混合内标(14μL)，依照“样本制备”项下操作并配制成系列浓度的组织样品。再按液相色谱条件及质谱条件进行液质联用分析。以待测物峰面积扣除空白峰面积后与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，以待测物浓度为横坐标(X)，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归计算，得到相应的回归方程，S/N≥3确定检出限，S/N≥10确定定量限，结果见表5。
表5
由上表可知，各个成分的标准曲线在相应的线性范围内，待测物峰面积与待测物浓度线性关系良好。
精密度与准确度：采用空白组织液制备各成分的低、中、高浓度生物样品，每个浓度平行制备6份，进样分析；连续测定3天，代入当日的标准曲线方程，计算得到批间、批内精密度及准确度，准确度的计算需要扣除空白样品。结果见表6。
表6
由上表可知，生物样品中各个脂肪酸成分的低、中、高浓度的批内及批间精密度和准确度良好，均满足生物分析方法的要求。
提取回收率和基质效应：取100uL空白组织匀浆液，加入低、中、高3个浓度混合对照品溶液经过前处理，进样得峰面积A；另取经过前处理的空白组织匀浆液，加入相应的低、中、高3个浓度混合对照品溶液，进样得峰面积B；取低、中、高3种不同浓度的混合对照品溶液，直接进样分析，记录峰面积C。以上三种制备方法，每个浓度平行5份，计算得到5种内源性大麻素的提取回收率和基质效应，见表7。
提取回收率(R)和基质效应(ME)的计算公式如下：
R(％)＝[(A-Apooled)/(B-Apooled)]×100
ME(％)＝[(B-Apooled)/(C-Apooled)]×100
表7
样品稳定性：取低、中、高3个浓度的质控样本，考察样本在室温中放置4h，自动进样器中放置12h，冻融3次条件下的稳定性和在-80℃保存20天的长期稳定性，每个浓度平行5份。稳定性结果表明样品在上述不同的环境下均较稳定，RSD范围均小于15％。
实施例3
本实施例是利用建立的检测方法研究脂肪肝大鼠血浆和肝组织中内源性大麻素的含量测定。
大鼠分为脂肪肝模型组(测试数量n＝15)和正常对照组(测试数量n＝11)，其中脂肪肝组给予高脂饲料喂养16周后采集血浆用于检测，正常对照组采用常规饲料。
按照实施例1建立的检测方法测试血浆和肝组织中5种内源性大麻素代谢物含量。样品经上述方法前处理后按实施例1中仪器方法进样检测，血浆和肝组织中5种内源性大麻素代谢物含量结果见表8。
表8
结果显示，由显著性水平(P值)分析可知，相比正常对照组，脂肪肝模型组大鼠血浆中AEA的含量显著上升，肝组织中SEA的含量显著上升，肝组织中PEA、LEA和AEA的含量显著降低，这表明通过检测内源性大麻素AEA、OEA、LEA、PEA和SEA这些组分，能够判断脂肪肝患病状况，具有潜在的临床应用前景。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种内源性大麻素生物标志组合物，其特征在于，该生物标志组合物包括以下组分中的至少三种：AEA、OEA、LEA、PEA或SEA。
2.如权利要求1所述的一种内源性大麻素生物标志组合物在制备非酒精性脂肪肝鉴别诊断试剂的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测待测组织样品中的AEA、OEA、LEA、PEA和SEA的含量，并与标准值比较，判断脂肪肝患病状况。
4.如权利要求1所述的一种内源性大麻素生物标志组合物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供样品，所述样品包括来自于检测对象的血液或组织；
(2)对步骤(1)中的样品进行前处理，得到待检测样本；
(3)对步骤(2)待检测样本采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱系统进行分离和分析检测，获得所述样品中AEA、OEA、LEA、PEA或SEA含量。
5.根据权利要求4所述的一种内源性大麻素生物标志组合物的检测方法，其特征在于，步骤(2)通过液液萃取法对样品进行前处理，具体操作为，将样品与溶剂充分混合，离心、取上层溶液浓缩，吹干后加入溶液中保存待测。
6.根据权利要求5所述的一种内源性大麻素生物标志组合物的检测方法，其特征在于，所述溶剂包括甲基叔丁基醚、甲醇和纯水，所述溶液为乙腈水溶液。
7.根据权利要求5所述的一种内源性大麻素生物标志组合物的检测方法，其特征在于，样品离心时间为5～15min，转速为3000～6000r/min。
8.根据权利要求5所述的一种内源性大麻素生物标志组合物的检测方法，其特征在于，步骤(3)采用超高效液相色谱仪，使用C18色谱柱(2.1mm×10mm，1.7μm)，进样体积为1μL～10μL，柱温35℃～45℃，采用梯度洗脱法。
9.根据权利要求8所述的一种内源性大麻素生物标志组合物的检测方法，其特征在于，所述的梯度洗脱法，以0.01％～0.1％甲酸乙腈为有机相，以0.01％～0.1％甲酸水为水相，梯度洗脱程序具体为：
(1)体积比例为16％～24％的甲酸乙腈等度洗脱0.5～1.5min；
(2)甲酸乙腈体积比例从16％～24％匀速增至50％～60％，梯度洗脱0.5～1.5min；
(3)甲酸乙腈体积比例从50％～60％匀速增至60％～70％，梯度洗脱8.0～9.0min；
(4)甲酸乙腈体积比例从60％～70％匀速增至85％～95％，梯度洗脱0.5～1.0min；
(5)甲酸乙腈体积从85％～95％瞬时切换至16％～24％后等度洗脱1.0～2.0min。
10.根据权利要求5所述的一种内源性大麻素生物标志组合物的检测方法，其特征在于，步骤(3)采用三重四极杆串联质谱仪，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描模式为正、负离子模式；
离子源喷雾电压：4.5kV～5.5kV；
离子源气帘气：206.8～241.3kPa；
碰撞气：41.4～48.3kPa；
离子源温度：450℃～600℃；
雾化气：379.2～413.7kPa；
辅助气：379.2～413.7kPa。
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