CN108717093A - 茶叶中蔗糖的离子色谱-串联质谱联用检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茶叶中蔗糖的离子色谱‑串联质谱联用检测方法，茶汤提取物以C₁₈固相萃取小柱净化、净化后的样液注入离子色谱系统，使用CarboPac^TM PA10糖分析专用柱色谱柱分离，NaOH溶液洗脱，柱后流出液注入串联四极杆质谱系统，在负离子模式下用多反应监测模式检测其中含有的蔗糖，以保留时间和离子对比例进行定性确证，标准溶液外标法定量。本方法具有样品前处理简便快速、净化效果好、灵敏度高、可同时进行定量和定性确证的特点。

Description

茶叶中蔗糖的离子色谱-串联质谱联用检测方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，涉及离子色谱-串联质谱联用法，具体是指一种茶叶中蔗糖的离子色谱-串联质谱联用检测方法。

背景技术

蔗糖是光合作用的主要产物，广泛分布于植物体内，特别是甜菜、甘蔗和水果中含量极高。蔗糖由一分子葡萄糖和一分子果糖脱水缩合形成，易溶于水较难溶于乙醇，甜味仅次于果糖。茶叶是我国传统的出口和内销经济作物之一，近年来随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，茶叶这一集营养性、功能性以及文化品位于一体的特殊饮品越来越受到人们的喜爱。茶叶中包括蔗糖在内的可溶性糖是茶汤滋味和香气的成分之一，是茶汤的主要甜味成分。

按照茶叶相关的产品标准，茶叶加工过程中不应添加任何外源性的物质。然而，在茶叶中添加蔗糖会增加茶叶重量并改善茶汤口感，有被不法生产商滥用的可能性。建立准确、简便的茶叶中蔗糖的检测方法并用于茶叶中蔗糖含量的准确定量，对于打击非法掺杂使假有重要意义。

目前，GB 5009.8-2016规定了包括蔗糖在内的食品中果糖等4种糖类的测定，采用液相色谱-蒸发光散射或示差折光检测器，标准中适合的样品基质未包含茶叶。蔗糖的测定已有的文献报道也主要采用离子色谱-脉冲安培、液相色谱-蒸发光散射、液相色谱-示差折光检测器，涉及的样品基质很少包含茶叶。茶汤提取物基质复杂，以上三种检测器易受杂质干扰，灵敏度和选择性差。近年来，有关离子色谱-质谱联用技术在水质阴离子、水质和茶叶高氯酸盐、食品有机酸等领域已有报道。该联用技术弥补了离子色谱法或液相色谱法仅凭保留时间作为定性依据的不足，能提供目标物的结构信息，而多反应监测模式（MRM）能大大提高目标物的灵敏度和抗干扰能力。将离子色谱-质谱联用技术用于食品尤其是茶叶中蔗糖的测定目前还未见有报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供茶叶中蔗糖的离子色谱-串联四极杆质谱联用检测方法，该方法结合C₁₈固相萃取小柱净化-离子色谱-串联质谱联用法，能够对茶叶中蔗糖同时进行定性和定量测定，该方法具有准确、快速、灵敏度高的优点，为蔗糖的快速检测提供了可靠的分析方法。

本发明提供一种茶叶中蔗糖的离子色谱-串联质谱联用检测方法，包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：取0.5g茶叶于100mL具塞比色管中，加沸水至刻度，摇匀后静置60min，获得待净化液；

（二）待净化液的净化：取C₁₈固相萃取小柱，加入1.5 mL步骤（一）中的待净化液，并弃去流出物，再加入步骤（一）中1.0 mL的待净化液，并收集流出液，并经0.22μm尼龙滤膜过滤后获得待测样品溶液；

（三）标准溶液的配制：配制蔗糖标准工作溶液，该蔗糖标准工作溶液浓度梯度分别为0.1μg/mL,0.25μg/mL,1.0μg/mL,5.0μg/mL,20.0μg/mL,50.0μg/mL；

（四）待测样品溶液的检测：将步骤（二）中的待测样品溶液和蔗糖标准工作溶液在离子色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中蔗糖的浓度为横坐标，再以标准溶液中蔗糖定量离子对的峰面积为纵坐标的绘制工作曲线，然后用工作曲线计算获得待测样品溶液中蔗糖的浓度。

本发明进一步设置为所述步骤（二）中包括固相萃取小柱的活化，每1000mg固相萃取小柱预先用6ml甲醇溶液和6ml超纯水活化。

本发明进一步设置为所述的离子色谱-串联质谱仪条件如下，离子色谱条件：

色谱柱：2×250mm Dionex CarboPac^TM PA10糖分析专用柱；

流速：200μL/min；

抑制器条件：AERS 500型阴离子抑制器，4mm；抑制电流75mA；

淋洗液：NaOH；

淋洗浓度为：0至2.00min时采用浓度为45mmol/L的NaOH溶液淋洗，2.01至6.00min时采用浓度为45~75mmol/L的NaOH溶液淋洗，6.01~15.00min采用浓度为75~150mmol/L的NaOH溶液淋洗，15.01至20.00min时保持浓度为150mmol/L的NaOH溶液淋洗，20.01至28.00min时采用浓度为45mmol/L的NaOH溶液淋洗；

进样量：25μL；

色谱柱温度：30ºC；

色谱柱后注入质谱前的有机溶剂补充剂：乙腈，50μL/min；

质谱条件为：

电喷雾离子源：负离子扫描，电压为-2500V；

离子传输管温度：275ºC；

氮气雾化气压力：25psi；

氮气辅助气压力：8psi ；

氩气碰撞气压力：1.5mTorr；

多反应监测离子对：定量离子对，387.1→341.2，碰撞电压15V、定性离子对387.1→179.2， 碰撞电压20V。

本发明这样设置的有益效果是，采用上述方案，首先，本发明通过加入开水浸泡茶叶，提取其中含有的蔗糖。其次，本发明使用C₁₈固相萃取小柱对茶汤提取物进行净化处理，该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。再次，本发明对于茶叶中蔗糖的定性定量检测是通过离子色谱-串联质谱仪(IC-MS/MS)分析，采用Dionex CarboPac^TM PA10糖分析专用柱分离蔗糖和样品基质。先配制一组阶梯浓度的蔗糖标准工作溶液，然后将标准工作液和经净化后的待测样液在离子色谱-串联质谱仪上分别进样。待测样液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±5 %，该色谱峰所对应的质谱定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待测样液中含有蔗糖。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1为本发明实施例中0.25μg/mL蔗糖标准溶液的TLC图；

图2为本发明实施例中含蔗糖的龙井茶样品的TLC图；

图3为本发明实施例中的标准工作曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明公开了一种茶叶中蔗糖的离子色谱-串联质谱联用检测方法，包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：各取0.5g绿茶，其中眉茶、蒸青茶、龙井茶、珠茶各1份，分别置于100mL具塞比色管中，并加沸水至刻度，摇匀后静置60min，提取液待净化；

（二）待测样品的净化：取C₁₈固相萃取小柱，其中固相萃取小柱，预先用6mL甲醇、6mL超纯水活化，加入1.5 mL（一）中的待净化液，弃去流出物，再加入1.0 mL（一）中的待净化液，收集流出液，过0.22μm尼龙滤膜过滤后获得待测样品溶液；

（三）标准溶液的配制：配制蔗糖标准工作溶液，该蔗糖标准工作溶液浓度梯度分别为0.1μg/mL,0.25μg/mL,1.0μg/mL,5.0μg/mL,20.0μg/mL,50.0μg/mL；

（四）蔗糖质谱MRM条件的优化：取10μg/mL的蔗糖标准溶液用注射器直接推入质谱，获得可以确定母离子的蔗糖的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，并进行碰撞能量等质谱参数的优化，确定定量离子对和定性离子对。

（五）待测样品的检测：将步骤（二）中的已净化待测样液和步骤（三）中的标准工作溶液在离子色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中蔗糖的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标的工作曲线，用工作曲线进行计算获得待测茶叶样液中蔗糖的浓度。结果表明，蔗糖在0.10-50μg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数R²≥0.999，0.10μg/mL的标准溶液在质谱上响应信噪比（S/N）33.8，大于10，满足定量限的要求，以0.5g样品最终定容至100mL计，故本方法测定茶叶中蔗糖的定量限为20mg/kg，即0.002%。

*定量离子对

表1 蔗糖的MRM检测条件

表2 蔗糖线性方程、相关系数、方法定量限

表3 眉茶、蒸青茶、龙井茶、珠茶中蔗糖检测含量检测结果

Claims (3)

1.一种茶叶中蔗糖的离子色谱-串联质谱联用检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤（一）待测样品的制备：取0.5g茶叶于100mL具塞比色管中，加沸水至刻度，摇匀后静置60min，获得待净化液；

步骤（二）待净化液的净化：取C₁₈固相萃取小柱，加入1.5 mL步骤（一）中的待净化液，并弃去流出物，再加入步骤（一）中1.0 mL的待净化液，并收集流出液，并经0.22μm尼龙滤膜过滤后获得待测样品溶液；

步骤（三）标准溶液的配制：配制蔗糖标准工作溶液，该蔗糖标准工作溶液浓度梯度分别为0.1μg/mL,0.25μg/mL,1.0μg/mL,5.0μg/mL,20.0μg/mL,50.0μg/mL；

步骤（四）待测样品溶液的检测：将步骤（二）中的待测样品溶液和蔗糖标准工作溶液在离子色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中蔗糖的浓度为横坐标，再以标准溶液中蔗糖定量离子对的峰面积为纵坐标的绘制工作曲线，然后用工作曲线计算获得待测样品溶液中蔗糖的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种茶叶中蔗糖的离子色谱-串联质谱联用检测方法，其特征在于：所述步骤（二）中包括固相萃取小柱的活化，每1000mg固相萃取小柱预先用6ml甲醇溶液和6ml超纯水活化。

3.根据权利要求1所述的一种茶叶中蔗糖的离子色谱-串联质谱联用检测方法，其特征在于：所述的离子色谱-串联质谱仪条件如下，离子色谱条件：

色谱柱：2×250mm Dionex CarboPac^TM PA10糖分析专用柱；

流速：200μL/min；

抑制器条件：AERS 500型阴离子抑制器，4mm；抑制电流75mA；

淋洗液：NaOH；

淋洗浓度为：0至2.00min时采用浓度为45mmol/L的NaOH溶液淋洗，2.01至6.00min时采用浓度为45~75mmol/L的NaOH溶液淋洗，6.01~15.00min采用浓度为75~150mmol/L的NaOH溶液淋洗，15.01至20.00min时保持浓度为150mmol/L的NaOH溶液淋洗，20.01至28.00min时采用浓度为45mmol/L的NaOH溶液淋洗；

进样量：25μL；

色谱柱温度：30ºC；

色谱柱后注入质谱前的有机溶剂补充剂：乙腈，50μL/min；

质谱条件为：

电喷雾离子源：负离子扫描，电压为-2500V；

离子传输管温度：275ºC；

氮气雾化气压力：25psi；

氮气辅助气压力：8psi ；

氩气碰撞气压力：1.5mTorr；

多反应监测离子对：定量离子对，387.1→341.2，碰撞电压15V、定性离子对387.1→179.2， 碰撞电压20V。