CN114026251A - 装置、系统与方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种DNA纳米装置(2)和制造用于检测生物标志物的DNA纳米装置(2)的方法。其中DNA纳米装置(2)包括DNA形成物的集合。该形成物包括：检测器(4)，用于接纳靶标生物标志物，从而释放出引发DNA序列；放大器(6)，用于与引发DNA序列杂交，从而释放出钥匙DNA序列及引发DNA序列或者另一引发DNA序列；和响应器(8)，用于与钥匙DNA序列杂交，从而导致产生一信号。该DNA纳米装置(2)因此响应于对靶标生物标志物的探测，产生出对于观察者可检测的信号。

Description

装置、系统与方法
技术领域
本发明涉及DNA纳米结构及产生DNA纳米结构的方法。
背景技术
循环肿瘤脱氧核糖核酸（ctDNA）是血流中循环的DNA，该DNA对于肿瘤及其进展状态是特定的，并能指示肿瘤及其进展状态。虽然这可以不需要对患者进行活检就能得到关于肿瘤状态的有价值的信息，但血液样品中的ctDNA的问题在于复杂样品中的被分析物稀少。血液样品还含有不与肿瘤缔合的DNA，即无细胞DNA （cfDNA），因此另外有必要将ctDNA与这种cfDNA区分开来。为了同时以高特异性和高灵敏度检测痕量的DNA，人们在探索新的方法。
发明内容
根据第一方面，提供了用于检测生物标志物的DNA形成物的集合（ensemble ofDNA formations），DNA形成物包括：检测器，其被适配成接纳靶标生物标志物，从而释放出引发DNA序列；放大器，其被适配成与该引发DNA序列杂交，从而释放出钥匙DNA序列及该引发DNA序列或者另一引发DNA序列；和响应器，其被适配成与该钥匙DNA序列杂交，从而导致产生出对于观察者可检测的信号。
凭借形成检测途径的DNA序列的集合，可以对该途径的运作进行工程改造并进行精确控制。通过将检测、放大和响应结合在一起，可以实现非常灵敏的检测。
优选地，DNA形成物中的两个或者更多个连接于共同主体（common body）。通过这样将形成物并置在一起，可以实现形成物之间的有效相互作用。优选地，检测器、放大器的至少一部分和响应器连接于共同主体。形成物可通过系接物（tether）或者锚着物（anchor）连接于共同主体。系接物可被适配成使得不同的DNA形成物能够相互接近。作为另一种选择，DNA形成物可在DNA形成物的锚着部分连接于共同主体。
为了通用性，并且为了实现精确设计和装配，共同主体可以是DNA形成物。为了简易起见，共同主体可以是纳米颗粒。为了与另外的宏观特征物（feature）结合，共同主体可以是基材。
为了控制相互作用，形成物中的两个或者更多个可按预定的布置连接于共同主体。例如，可将放大器定位在检测器和响应器之间。
检测器可被适配成接纳靶标DNA序列，从而释放出引发DNA序列。将靶标DNA序列作为生物标志物进行检测，可以容许非常具有选择性的检测，并提供高特异性。靶标DNA序列可以是循环肿瘤DNA。检测器可被适配成接纳靶标RNA序列（优选循环肿瘤RNA），从而释放出引发DNA序列。可将检测器适配成接纳靶标蛋白（优选循环肿瘤蛋白），从而释放出引发DNA序列。
为了更大的特异性，可将检测器适配成与多个生物标志物杂交，从而释放出一个或者多个引发DNA序列。
优选地，检测器包含一个或者多个探针DNA序列，该探针DNA序列连接（优选地按预定的布置连接，任选地通过系接物连接）于DNA主体，并被适配成与靶标DNA序列杂交并释放出引发DNA序列。
探针DNA序列可被配置成与靶标DNA序列杂交，并通过竞争性杂交释放出引发DNA序列，优选地通过立足点（toe-hold）介导的链置换或者通过立足点交换释放出引发DNA序列。优选地，使探针DNA序列与引发DNA序列杂交，并将探针DNA序列适配成优先与靶标DNA序列杂交，从而释放出引发DNA序列。
为了更高的特异性和更少的假阳性，DNA形成物的集合可进一步包含封闭物（blocker），该封闭物被适配成与干扰性DNA序列杂交，任选地从而释放出非相互作用性DNA序列。干扰性DNA序列优选地为无细胞DNA。封闭物可以是封闭性DNA序列，其被配置成与干扰性DNA序列杂交，并任选地，通过竞争性杂交释放出非相互作用性DNA序列，优选地通过立足点介导的链置换或者通过立足点交换释放出非相互作用性DNA序列。
优选地，放大器包含多个放大器亚单位，每个放大器亚单位被适配成与引发DNA序列杂交，并释放出钥匙DNA序列及该引发DNA序列或者另一引发DNA序列。该另一引发DNA序列优选地具有与该引发DNA序列相同的DNA序列。该多个放大器亚单位优选地在功能上互相等同，并优选地释放出同一钥匙DNA序列的拷贝。多个第一放大器亚单位可被适配成释放出多个第一钥匙DNA序列，并且多个第二放大器亚单位可被适配成释放出多个第二钥匙DNA序列。
放大器可包含被适配成与引发DNA序列杂交的一个或者多个放大器DNA序列的一个或者多个例子（instance）（任选地锚着于共同主体，优选DNA主体，优选地按预定的布置锚着，任选地通过系接物锚着）；及被适配成释放出钥匙DNA序列的钥匙座DNA序列的一个或者多个例子（任选地锚着于共同主体，优选DNA主体，优选地按预定的布置锚着，任选地通过系接物锚着）。
第一放大器DNA序列可被适配成在与引发DNA序列杂交时改变构象。第二放大器DNA序列可被适配成在与第一DNA序列杂交时改变构象（conformation），从而释放出引发DNA序列。第一放大器DNA序列可被配置成与第二放大器DNA序列杂交，并通过竞争性杂交（优选地通过立足点介导的链置换或者通过立足点交换）和/或一个或者多个构象改变（优选地通过第一放大器DNA序列的构象改变和第二放大器DNA序列的构象改变）释放出引发DNA序列。
可将钥匙座DNA序列与钥匙DNA序列杂交。可将钥匙座DNA序列适配成优先与放大器DNA序列或其一部分杂交，从而释放出钥匙DNA序列，这优选地通过竞争性杂交（优选地通过立足点介导的链置换或者通过立足点交换）和/或构象改变（优选地通过一个或者多个放大器DNA序列的构象改变）来释放。
为了鲁棒性起见，并且为了避免假阳性，放大器可包含多个放大途径，用于释放出不同种类的钥匙DNA序列。可将多个第一放大器亚单位适配成释放出第一钥匙DNA序列，并可将多个第二放大器亚单位适配成释放出第二钥匙DNA序列。为了通过前馈回路得到高放大率，可将多个放大途径适配成相互放大。
优选地，响应器包含DNA捕获形成物，其被适配成在第一构型（configuration）时围闭着报道物（reporter），并在第二构型时释放出该报道物。这可实现条件性释放。
为了便于产生对于观察者可检测的信号，报道物可为具有启动子部分的报道基因，并且可将DNA捕获形成物适配成在第一构型时至少部分地围闭着该启动子部分。
可将DNA捕获形成物适配成在至少一个钥匙DNA序列与DNA形成物的至少一个锁头DNA序列杂交时，从第一构型改变成第二构型。可将锁头DNA序列配置成通过竞争性杂交（优选地通过立足点介导的链置换或者通过立足点交换）与钥匙DNA序列杂交。
根据另一方面，提供一种检测靶标生物标志物的方法，该方法包括将前述DNA形成物的集合引入到体液的样品，所述体液优选为血液，优选地在体外引入。
根据另一方面，提供一种检测靶标生物标志物的方法，该方法包括：使靶标生物标志物与探针杂交，从而释放出引发DNA序列；使该引发DNA序列与放大器DNA序列杂交，从而造成该放大器DNA序列的一个或者多个构象改变，释放出钥匙DNA序列，并释放出该引发DNA序列或者释放出某个引发DNA序列（任选地通过被适配成与该放大器DNA序列杂交的第二放大器DNA序列来进行）；和使该钥匙DNA序列与DNA捕获形成物的锁头DNA序列部分杂交，从而导致产生对于观察者可检测的信号（任选地通过改变该DNA捕获形成物的构型以释放出报道物来进行）。
放大器DNA序列可包含被适配成与引发物DNA序列杂交的一个或者多个放大器DNA序列的一个或者多个例子；及被适配成释放出钥匙DNA序列的钥匙座DNA序列的一个或者多个例子。
探针、放大器DNA序列和/或DNA捕获形成物可如前所述。该方法可使用如前所述的DNA形成物的集合。
可将探针、放大器DNA序列和/或DNA捕获形成物并置于共同主体，该共同主体优选DNA结构。
该方法可进一步包括将该DNA结构引入到体液的样品，体液优选为血液，优选在体外引入。
根据另一方面，提供一种计算机程序产品，该计算机程序产品包含软件代码，该软件代码被适配成当被执行时产生如前所述的DNA形成物的集合的模拟。
根据另一方面，提供一种产生如前所述的DNA形成物的集合的方法，该方法包括模拟该DNA形成物的集合；基于该模拟，确定这些DNA形成物的DNA序列；并基于所确定的DNA序列产生该DNA形成物的集合。
本文所用的术语“DNA序列”和“DNA链”优选地可互用，并优选地指具有给定的序列的DNA链。
本文所用的术语“放大”优选地指这样一个过程，其中某个输入种类（inputspecies）的多个例子（instance）的输入导致某个输出种类（output species）的更多个例子的释放。“放大器”优选地指这样的功能单位，其被适配成接纳某个输入种类的多个例子，并因此释放出某个输出种类的更多个例子。
本文所用的术语“DNA形成物的集合”优选地指位于共同溶液中、连接于共同基材或者连接于共同主体的多个DNA形成物。本文所用的术语“DNA形成物”优选地指DNA序列，其优选地具有特定的序列和/或形成特定的结构。这种DNA链可以具有或者不具有与其杂交的另一DNA链。这种DNA链可以处于不同的可能构象中的一个。
本发明还延伸到与本文参考附图所描述的方法和/或设备实质上相同的方法和/或设备。
根据另一方面，提供一种用于执行本文描述的任何方法和/或用于体现本文描述的任何设备特征物的计算机程序和计算机程序产品。根据另一方面，提供一种非暂时性计算机可读介质，在该非暂时性计算机可读介质上储存有用于执行本文描述的任何方法和/或用于体现本文描述的任何设备特征物的程序。根据另一方面，提供一种包含用于执行本文描述的任何方法的软件代码的计算机程序产品。在硬件中实施的特征物通常可以在软件中实施，反之亦然。本文中对软件和硬件特征物的任何提及均应作相应的解释。
本文还提供一种体现用于执行本文描述的任何方法和/或用于体现本文描述的任何设备特征物的计算机程序的信号、一种传输这种信号的方法、以及具有支持用于执行本文描述的任何方法和/或用于体现本文描述的任何设备特征物的计算机程序的操作系统的计算机产品。
本文描述的任何设备特征物也可作为方法特征物提供，反之亦然。
本发明一个方面的任何特征物可以按任何适当的组合应用于本发明的其他方面。具体地，方法方面可以应用于设备方法，反之亦然。此外，一个方面中的任何、一些和/或所有特征物可以按任何适当的组合应用于任何其他方面中的任何、一些和/或所有特征物。
还应认识到，本发明任何方面中描述和定义的各种特征物的具体组合，可以独立地进行实施和/或供应和/或使用。
本文所用的“手段加功能”特征物可以另外地按其相应的结构进行表述，如适当编程的处理器及相关的存储器。
附图说明
由下文参考以下附图描述的示例性实施例，本发明的这些方法和其他方面将变得清楚明白：
图1是一种DNA纳米装置的示意图；
图2的(a)到(c)是一种DNA纳米装置的检测器部分在不同状态下的图示；
图3的(a)到(d)是一种DNA纳米装置的放大器部分在不同状态下的图示；
图4的(a)和(b)是一种DNA纳米装置的响应器部分在不同状态下的图示；
图5的(a)到(d)是一种DNA纳米装置的一种替代放大器部分在不同状态下的图示；
图6是一种DNA纳米装置的另一种替代放大器部分的图示；
图7是一种具有封闭部分的DNA纳米装置的图示；
图8是一种DNA纳米装置的封闭部分的图示；
图9示出生产一种DNA纳米装置的一种方法的一个实例。
具体实施方式
图1显示一种DNA纳米装置2（也称为纳米机器人）。DNA纳米装置2被设计成容许使用血液样品进行癌症的早期检测。该DNA纳米装置具有足够的灵敏度，能区分同时存在于血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）和无细胞DNA（cfDNA）；ctDNA靶标片段与cfDNA相比，可能仅仅携带单点突变19。当检测到ctDNA时，该DNA纳米装置引起一种可被使用者观察到的信号（例如荧光信号），从而使临床医生可以作出快速响应，以作诊断。由于该DNA纳米装置鉴定的是起源于肿瘤细胞的特定遗传突变，其可令人洞悉该疾病的类型和阶段。
DNA纳米装置2由寡核苷酸（即短的单链的DNA分子）通过本领域公知的自组装过程形成。
DNA纳米装置2包括多个功能性DNA形成物，这些功能性DNA形成物锚着于更大的共同DNA结构，在示例性的实例中该共同DNA结构为矩形的主体3。在一些实例中，功能性DNA形成物的长度可在10至90个碱基对之间，但它们也可以更长（或者更短），例如长度100个碱基对、250个碱基对、300个碱基对、400个碱基对，或者更长。
在图示中，构成功能性DNA形成物的DNA链用线条表示，其中DNA链的3'端用钩形表示，并且DNA形成物于主体3的锚着点用图1的图例中所示的符号表示。靶标cfDNA链上的点突变的位置用图1的图例中所示的符号表示。在更详细地显示DNA链的附图中，DNA碱基组（也称结构域）用小写字母表示，如a、b、c等。用星号标记的字母表示互补结构域，例如结构域a*与结构域a互补。在图示中，互补结构域的杂交用互补结构域之间的连接线阵列表示。结构域是一种有助于理解DNA链的行为和相互作用的构建物。结构域中的DNA碱基的序列可以是给定的（例如对于特定的靶标），或者可以对其进行选择以对DNA链的行为（例如形成发夹环的倾向）进行工程改造。在一个实例中，结构域的长度可在5至30个碱基对之间，例如10个碱基对、15个碱基对、20个碱基对、25个碱基对、30个碱基对或者40个碱基对。同一链上的不同结构域可具有不同的长度。
有很多种二维和三维形状和形式可用于纳米装置2的主体3，例如管状、不规则形状或者如图所示的DNA片（DNA sheet）。DNA纳米装置2包括多个被设计成与环境（包括样品）发生相互作用或者相互间发生相互作用的功能性形成物（functional formations）。这些功能性形成物锚着于主体3的适当位置。这可使得能够将人们想要其相互间发生相互作用的功能性特征物（functional features）并置在一起，从而促进它们的相互作用。对于主体3，DNA是一种特别有利的材料，因为其可容许高度可控地将功能性特征物相对于彼此锚着于特定的位置。功能性形成物包括各个部分（portion），这些部分可被释放、被交换，或者可接纳其他部分。这可使得功能性特征物能够与环境发生相互作用并且相互间发生相互作用。由于前述的并置在一起，并且由于能够将执行不同功能的形成物合并在一起，可以对导致可观察的信号的分子事件进行工程改造以优化DNA纳米装置2的性能。
图1所示的DNA纳米装置2包括三个功能部分或者模块：
- 检测器4，
- 放大器6和
- 响应器8。
每个模块执行特定的功能，并且通过相互作用，它们执行预期的检测和信号传导。
功能性DNA形成物根据竞争性杂交的原理发生相互作用，以自发地相互接纳和释放，尤其是通过立足点（toehold）介导的链置换和立足点交换的方式相互接纳和释放。一些功能性DNA形成物包括具有双稳态构型的部分，可响应于相互间的相互作用而改变构型（这也被称为分子逻辑（molecular logic））。
检测器模块4和放大器模块6基于DNA计算原理，如立足点介导的链置换、立足点交换和分子逻辑门（基于一种或多种物理或化学输入和单一输出进行逻辑运算的分子）。
响应器8基于动态DNA纳米技术原理（DNA折纸（DNA origami））和用于产生荧光信号的无细胞表达系统。
现将更详细地描述各个模块及其相互作用。
图2的(a)到(c)更详细地显示不同操作状态下的检测器4。图2的(a)和(b)显示暴露于靶标T之前和之后的检测器4，图2的(c)更详细地显示检测器4的DNA链。
检测器4包括充当探针P的DNA链。探针P锚着于DNA纳米装置2的主体3的锚着点12处（图示通常以图1的图例中所示的符号显示锚着点）。图2的(a)中显示暴露于靶标T（待检测的ctDNA序列）之前的探针P。在初始构型中，输出链O（也称为“引发”DNA链或DNA序列）与探针链P（部分地）杂交。
在图2的(b)中，靶标T通过立足点介导的链置换的方式置换了输出O。靶标T与探针P杂交，从而输出O被释放。
在使用时，靶标DNA链T附着于探针P的立足点区域并在与输出链O的竞争中胜出，从而将其从探针P上置换下来。
探针P和输出O被设计成使得探针P可区分靶标T ctDNA（携带癌症突变）和cfDNA。探针P与靶标T互补，而输出O与探针的亲和力比其与cfDNA的亲和力高，但与靶标T的互补性较低。
输出O引发下游模块，即放大器6。
图3的(a)、(b)、(c)和(d)更详细地显示不同操作状态下的放大器6的亚单位。
所示的放大器6亚单位包括三条链：两条链充当放大器A1和A2，第三条链充当钥匙座（key holder）H。放大器A1和A2及钥匙座H均通过系接物13系接于DNA纳米装置2的主体3，而系接物13连接于主体3的锚着点12处。
在图3的(a)中显示的放大器6亚单位处于其在暴露于输出O之前的初始构型。在该初始构型中，钥匙DNA链（key DNA strand）与钥匙座H杂交。两条放大器链A1、A2各自包括分子逻辑门；即，各自具有发夹环亚稳态构型，可根据情况打开或者关闭。
图3的(b)中显示的放大器6亚单位是在暴露于输出O（来自检测器模块4）之后。引发链O促进第一放大器链A1的逻辑门的构象（conformation）改变，即O与A1杂交，从而改变A1的构型（configuration）（打开发夹环）。
图3的(c)中显示的放大器6亚单位处于放大程序的进一步的阶段。A1的暴露部分然后与A2杂交，此时A2的发夹环打开，并且A置换O。随后或者同时，H与A1杂交，从而K被释放。
图3的(d)显示放大器6亚单位中，第二放大器链A2和钥匙座链H均与第一放大器链A1杂交，并且钥匙K和引发链O已被释放。
由于放大器6亚单位的操作，两条链被释放：单条钥匙链K和原始引发链O。引发链O然后被循环到另一个类似的放大器6亚单位。所释放的输出O继续到达处于如图3的(a)所示的初始条件的另一个放大器亚单位，并且在该亚单位通过类似的步骤顺序，另一钥匙K以及该输出链O被释放。
钥匙K激活下游模块即响应器8。
以催化的方式，单条输出O可被重复使用，以从多个放大器亚单位释放多条钥匙链K。每个放大器6亚单位获取一条输出O，并且输出一条钥匙K及一条输出O供进一步消耗。在图1所示的实例中，显示了三个放大器亚单位6（每个放大器亚单位包括两条放大器链和一条钥匙座），但是在放大器6中可以包括任何数目的亚单位。可以改变放大器亚单位的数目以改变所需的放大，也即，对于每条激活链（来自检测器的输出O），所释放的钥匙链的数目。如果包括n个放大器亚单位，则释放n条钥匙K。一条初始单一输出链O被扩大成n条钥匙链K。这样，通过对于单条靶标链T提供n条钥匙链K形式的放大响应，可以检测低浓度的靶标ctDNA。
其他特定的放大过程（通常称为发夹DNA级联放大）也可用于以催化的方式从单条引发链（来自检测器的输出链O）产生多条钥匙链。
图4的(a)和(b)更详细地显示不同操作状态下的响应器8。图4的(a)显示暴露于钥匙K之前的响应器8。
在图4的(a)显示的初始构型中，所示的响应器8包括捕获盒C和被捕获盒C捕获的报道基因R。
捕获盒C包括多条能形成围闭物（enclosure）的DNA链，该围闭物限制报道基因R并防止被围闭的部分暴露出来。报道基因的被围闭部分是启动子序列，因此报道基因的表达被防止至报道基因R从捕获盒C释放下来并且启动子部分被暴露出来之时为止。报道基因R编码荧光蛋白如绿色荧光蛋白，该荧光蛋白可通过本领域知道的无细胞蛋白表达法产生。
捕获盒C是具有关闭构型和开放构型的双稳态DNA形成物。响应器8包括锁头DNA链L。钥匙链K与锁头链L的杂交造成捕获盒C发生从关闭构型向开放构型的改变。
在图4的(b)中，钥匙链K与锁头链L杂交，捕获盒C处于开放构型，报道基因R被释放。
所释放的报道基因被表达，所表达的蛋白质的荧光可向观察者指示靶标ctDNA在样品中的存在。
该响应器可包括捕获盒C的多个例子，各具有报道基因R。每个捕获盒C可被其中一个钥匙序列K打开，从而为痕量的被分析物产生可观察的荧光信号。
图5的(a)到(d)示出另一种放大器6亚单位，其中每个放大亚单位包括放大器链A和钥匙座链H，两者均锚着于DNA主体3的锚着点12处。图5的(a)到(c)显示不同操作状态下的放大器6亚单位，图5的(d)更详细地显示放大器6亚单位的DNA链。
图5的(a)显示初始构型，其中两条DNA链与放大器A（部分地）杂交：另一拷贝的输出链O，及中间DNA链I。在所示的实例中，输出链O处于发夹环亚稳态构型。
在图5的(b)中，输出O通过立足点介导的链置换的方式与放大器A发生杂交。输出O连接到放大器A的立足点区域，在与中间I的竞争中胜出，从而将其从放大器A上置换下来。{中间体I+输出O}杂合物被释放。
在图5的(c)中，中间体I通过立足点介导的链置换的方式与钥匙链H发生杂交。输出O被释放，钥匙K也被释放。
在下一步骤，所释放的输出O继续到达处于如图4的(a)所示的初始条件的另一个放大器亚单位，并且输出O与另一放大器A发生杂交，从而置换出另一{中间体I+输出O}杂合物，并且通过类似的步骤顺序，另一钥匙K被释放。
图6显示上文参考图3的(a)到(d)描述的放大器亚单位的一个变型。在这个变型中，响应器需要两条钥匙K1、K2进行操作（即，从关闭构型向开放构型改变以释放报道基因）。放大器包括两个途径：右手途径和左手途径（对应于被检测的初始ctDNA）；对于每个途径，探针PR、PL提供适当的引发物（trigger）OR、OL。由于在这个实例中，响应器需要两条钥匙，响应器在初始构型中的高稳定性可以得到实现，并且响应器的自发激活可以得到防止，从而使假阳性发生率低。在一个相关的变型中，单个探针P携带两个引发物OR和OL，并且两者均在靶标T与探针P杂交时被释放。
在又一变型中，两个途径（右手和左手）均被适配成互相放大，从而产生前馈回路。在这种情况下，单个靶标ctDNA分子的检测可引起链式反应，其效果是灵敏度高，DNA纳米装置的响应时间非常短。
图7显示上述DNA纳米装置的一个变型。DNA纳米装置50包括如上所述的检测器4、放大器模块6和响应器8。此外，DNA纳米装置50包括封闭部分（或模块）40，其用于捕获cfDNA（在血液中天然存在）并释放不与该装置的其余部分发生相互作用的链。封闭模块40包括多个封闭探针B。封闭探针B类似于上述检测器4的探针P，不同的是它们与干扰性cfDNA链X的杂交最佳，而探针P与靶标ctDNA链T的杂交最佳。
图8更详细地显示如上针对检测器4描述的探针P，及封闭探针B。封闭探针B是一条DNA链，其锚着于DNA纳米装置50的主体30的锚着点处。在初始的构型中，非相互作用性链N与封闭探针B（部分地）杂交。干扰性链X（如cfDNA链）与封闭探针B杂交，通过立足点介导的链置换的方式置换出非相互作用性链N。从封闭探针B上释放下来的非相互作用性链N不与DNA纳米装置50的其余部分发生相互作用。通过捕获干扰性链X（如cfDNA链），封闭探针40可防止非靶标DNA链X导致非预期地释放出引发DNA序列O，从而可减少或者防止交叉效应（cross-talk），提高检测器的特异性。
封闭部分40可包括与图7所示的封闭探针同种类的封闭探针的多个例子，或者封闭部分40可包括多个不同种类的封闭探针（每个种类的封闭探针有一个或者多个例子）。
在以上所示的实例中，参与所设计的杂交的功能性DNA链或者直接锚着于DNA主体3的锚着点12处（例如图2的(a)中所示），或者通过系接物13锚着，该系接物将功能性DNA链连接于主体3的锚着点12处（例如图3的(a)中所示）。在一个变型中，一些功能性DNA链直接锚着，一些通过系接物锚着。任选地，一些（或者全部）功能性DNA链可作为未系接的功能性DNA链在包围DNA纳米装置的自由溶液中提供（例如，放大器亚单位的第二放大器链A2）。直接锚着可以很好地控制不同种类的功能性DNA链的位置和并置，以促进它们的相互作用。系接对位置的控制性较低，但可以使运动自由度更大，构型改变更大，与其他功能性DNA链的相互作用（杂交）更大，并且可以使功能性DNA链更好地暴露。提供自由溶液可要求相对较高的浓度，以确保充分的可用性（availability）。系接物可以是这样的DNA序列，其被选择用于阻碍与系统的其他部分的相互作用，并且阻碍二级结构如发夹环的形成。系接物可以是DNA以外的材料，如生物聚合物（例如肌动蛋白、木质素、微管蛋白）。可选择系接物的长度以赋予上述功能性DNA链一定的运动范围。
在一个变型中，功能性单位（DNA链）所连接的主体不是上述DNA结构，而是另一材料。例如，该主体可以是纳米颗粒（有机的或无机的）、碳纳米管、胶束或者脂质体。在一个变型中，该主体是可构成更大的装置（如微流控装置、流通池、微孔板、比色皿、测试条或者其他测定装置）的一部分的基材（例如玻璃、硅、聚合物、陶瓷）。可用微细加工技术（如光刻工艺或者软刻蚀工艺）在基材上图案化作出不同的功能单位。共价键合例如可将功能性单位锚着或系接于该主体。
为设计如上所述的DNA纳米装置，使用计算机程序产品。DNA纳米装置的设计是一个多变量问题，构造合适的DNA纳米装置所需要的DNA链的精确序列取决于很多因素。这些因素包括但不限于：
- 所需的靶标DNA序列，其由对于医疗诊断或者其他目的有意义的遗传突变或者生物标志物决定；
- 纳米机器人作为一个整体在样品环境中的化学稳定性；
- 反应速率；
- 各个模块的结构，即所需的灵敏度和所需的输出/输入之间的转换机制所要求的探针和放大器数目；
- 交叉效应最小化：例如，检测器部分的特异性，封闭探针数目多少和结构如何，同一DNA纳米装置的各功能性部分和单位之间的交叉效应，以及预期用于检测不同靶标的不同途径（无论是在共同的DNA纳米装置上还是在分别的DNA纳米装置上）之间的交叉效应。例如，类型X的引发物（由类型X的检测ctDNA释放）应仅与类型X的放大器发生相互作用。它不应与表示其他类型的突变并且可能表示其他类型的癌症的类型Y和类型Z的放大器发生相关作用。
可就这些因素对DNA纳米装置的性能进行优化。提供机器学习系统，以进行这种多变量优化并根据所需的特性和给定的待检测癌症突变集合（pool）设计DNA纳米装置。
用于AI的训练数据可通过模拟数据、实验数据或者这两种数据提供。
图9显示一组输入输出的实例及所得的DNA纳米装置2。软件62依靠输入模拟DNA纳米装置2的性能60。为得到最优模拟的DNA纳米装置2，软件62输出用于形成该DNA纳米装置的DNA序列，并且潜在地输出特征布局（feature layout）和/或进一步的制造信息。
按输出所指示，产生DNA纳米装置2。对DNA纳米装置2的性能进行测试，并反馈到软件62以验证模拟60。
在上述的实例中，DNA纳米装置用于血液样品的体外分析；应认识到，血液样品可能经历血浆成分的制备（例如分离）、DNA扩增、试剂的添加或者其他处理。在一个变型中，DNA纳米装置可类似地用于另一种体液或者分泌物，如淋巴液、脑脊髓液、胰液、胆汁、尿液、唾液、痰、粪便、胸水、羊水、泪液或汗液。在一个变型中，DNA纳米装置可用于体内检测。
在上述实例中，DNA纳米装置用于ctDNA的检测；在一个变型中，DNA纳米装置被适配成检测循环肿瘤RNA。
在其他实例中，DNA纳米装置被适配成检测循环肿瘤蛋白质，或者其他生物标志物，如甲胎蛋白、离子通道蛋白或炎症标志物。在这个实例中，上述的探针可被适配成在暴露于生物标志物时释放出引发DNA序列，并且该引发DNA序列造成放大和响应如上所述进行。在一个实例中，上文参考图1所述的检测器包括被适配成（通过选择合适的序列）形成能够结合靶标分子（如生物标志物）的适体的探针DNA序列。适体是一种单链寡核苷酸，具有独特的3维结构，能够以高选择性和特异性结合靶标（通常是配体）。选择适体，使得其与靶标分子的结合造成其构象发生改变（例如，适体的二级结构发生改变）。适体的构象改变于是造成引发DNA序列的释放，该引发DNA序列造成放大和响应如上所述进行。在另一个变型中，DNA纳米装置的检测器模块除了包括参考图1所述的探针DNA序列P和引发DNA序列O杂合物之外，还包括被适配成结合靶标生物标志物的适体（任选地系接于DNA主体）。在初始的构型中，适体不结合探针P。适体被适配成在结合靶标生物标志物时改变构象，从而暴露出某个区域，该区域然后与探针P杂交，从而造成引发DNA序列O从探针P上释放下来；该引发DNA序列O然后造成放大和响应如上所述进行。
在另一个实例中，DNA纳米装置用于检测其他痕量DNA、RNA或者其他生物标志物，例如在法医分析中。
虽然上述实例涉及用于检测单个ctDNA靶标种类的DNA纳米装置，但是在一个变型中，DNA纳米装置携带探针文库，其中每种探针用于某种不同的ctDNA种类。这些探针可都使用相同的途径，或者每个探针可引发DNA纳米装置中供应的某个独特途径，并且可产生某种探针类型特定的可观察信号。
在上述实例中，DNA纳米装置的响应方式为报道基因进行荧光蛋白的无细胞表达。在变型中，可以执行其他的信号转导手段，例如通过以下方式：
- 荧光，其中放大阶段的钥匙K输出被适配成将猝灭剂从合适的荧光标签上置换下来；
- 荧光共振能量转移（FRET），其中放大阶段的钥匙K输出被适配成包括FRET供体或者接纳体分子，并且报道链包括互补的FRET供体或者接纳体并被适配成接纳钥匙K链；
- 放射性标记，磁珠装饰，表面增强拉曼光谱（SERS），金或银纳米颗粒装饰。
应认识到，以上纯粹是通过举例的方式描述了本发明，可以在本发明的范围内对细节作出修改。
权利要求中出现的附图标记仅用于说明目的，不应对权利要求的保护范围造成限制。
本说明书和权利要求中使用的术语“包含”优选地意指“至少部分地由……组成”。

Claims (25)

1.用于检测生物标志物的DNA形成物的集合，其特征在于，所述形成物包括：
检测器，所述检测器被适配成接纳靶标生物标志物，从而释放出引发DNA序列；
放大器，所述放大器被适配成与所述引发DNA序列杂交，从而释放出钥匙DNA序列及所述引发DNA序列或者另一引发DNA序列；和
响应器，所述响应器被适配成与所述钥匙DNA序列杂交，从而导致产生出对于观察者可检测的信号。
2.根据权利要求1所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述形成物中的两个或者更多个连接于共同主体。
3.根据权利要求2所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述检测器、所述放大器的至少一部分和所述响应器连接于所述共同主体。
4.根据权利要求2或3所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述共同主体是DNA形成物、纳米颗粒或者基材。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述形成物中的两个或者更多个按预定的布置连接于所述共同主体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述检测器被适配成接纳靶标DNA序列，从而释放出引发DNA序列。
7.根据权利要求6所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述靶标DNA序列是循环肿瘤DNA。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述检测器被适配成与多个生物标志物杂交，从而释放出一个或多个引发DNA序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述检测器包含一个或者多个探针DNA序列，所述探针DNA序列连接于DNA主体，并且被适配成与靶标DNA序列杂交，从而释放出引发DNA序列。
10.根据权利要求9所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述探针DNA序列被配置成与所述靶标DNA序列杂交，并通过竞争性杂交释放出所述引发DNA序列，优选地通过立足点介导的链置换或者通过立足点交换释放出所述引发DNA序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述DNA形成物的集合还包含封闭物，所述封闭物被适配成与干扰性DNA序列杂交，任选地从而释放出非相互作用性DNA序列。
12.根据权利要求11所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述干扰性DNA序列是无细胞DNA。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述放大器包含多个放大器亚单位，每个放大器亚单位被适配成与引发DNA序列杂交，并释放出钥匙DNA序列及所述引发DNA序列或者另一引发DNA序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述放大器包含被适配成与引发DNA序列杂交的一个或者多个放大器DNA序列的一个或者多个例子；及被适配成释放出钥匙DNA序列的钥匙座DNA序列的一个或者多个例子。
15.根据权利要求14所述的DNA形成物的集合，其特征在于，第一放大器DNA序列被适配成在与所述引发DNA序列杂交时改变构象。
16.根据权利要求15所述的DNA形成物的集合，其特征在于，第二放大器DNA序列被适配成在与所述第一DNA序列杂交时改变构象，从而释放出所述引发DNA序列。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述钥匙座DNA序列与所述钥匙DNA序列杂交，并且被适配成与所述放大器DNA序列或其一部分杂交，从而释放出所述钥匙DNA序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述放大器包含多个放大途径，用以释放出不同种类的钥匙DNA序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述响应器包含DNA捕获形成物，所述DNA捕获形成物被适配成在第一构型时围闭着报道物，并在第二构型时释放出所述报道物。
20.根据权利要求19所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述报道物是具有启动子部分的报道基因，并且所述DNA捕获形成物被适配成在所述第一构型时至少部分地围闭着所述启动子部分。
21.根据权利要求19或20所述的DNA形成物的集合，其特征在于，所述DNA捕获形成物被适配成在至少一个钥匙DNA序列与所述DNA形成物的至少一个锁头DNA序列杂交时，从所述第一构型改变成所述第二构型。
22.一种检测靶标生物标志物的方法，其特征在于，所述方法包括将根据权利要求1至21中任一项所述的DNA形成物的集合引入到体液的样品，所述体液优选为血液，优选地在体外引入。
23.一种检测靶标生物标志物的方法，其特征在于，所述方法包括：
使靶标生物标志物与探针杂交，从而释放出引发DNA序列；
使所述引发DNA序列与放大器DNA序列杂交，从而造成所述放大器DNA序列的一个或者多个构象改变，释放出钥匙DNA序列，并释放出所述引发DNA序列或者释放出某个引发DNA序列；和
使所述钥匙DNA序列与DNA捕获形成物的锁头DNA序列部分杂交，从而导致产生出对于观察者可检测的信号，这优选地通过改变所述DNA捕获形成物的构型以释放出报道物来进行。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述探针、所述放大器DNA序列的至少一部分和/或DNA捕获形成物并置于共同主体上，所述共同主体优选为DNA结构。
25.一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包含软件代码，其特征在于，所述软件代码被适配成当被执行时产生根据权利要求1至21中任一项所述的DNA形成物的集合的模拟。
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