CN116515962B - 一种三叶草结构自延伸等温扩增方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三叶草结构无引物快速自延伸等温扩增方法及其应用。对CSIA扩增机制进行探究，以该扩增产物作为CuNCs的合成模板，生成红色荧光的CSIA‑CuNCs，基于此开发一种基于CSIA扩增的铜纳米簇通用检测方法，具体检测步骤包括（1）CSIA扩增模板的合成；（2）CSIA恒温扩增体系；（3）CSIA‑CuNCs生成体系；（4）荧光信号检测。实现了T4 DNA连接酶、T4 PNK和MicRNA 21的通用检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸恒温扩增方法和核酸铜纳米簇的荧光可视化快速检测方法。
背景技术
变温核酸扩增技术通常受限于实验条件和仪器设备，而恒温核酸扩增技术可以在单一温度下即可实现指数放大，因此常被用于现场快速检测，包括环介导等温扩增技术（LAMP）、滚环扩增技术（RCA）、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、解旋酶依赖性扩增技术(HDA)、杂交链式反应等。段忆翔团队开发了一种DNA介导的自扩展恒温扩增反应，即在聚合酶和模板DNA的自发折叠，可以实现重复单元的指数扩增。该技术与LAMP相比降低了模板序列的要求和引物设计的复杂性，且解决了LAMP非核酸靶标检测的局限。但是该方法目前处于概念验证阶段，扩增原理、信号放大稳定性以及传感器检测的准确性还有待进一步验证。
T4多核苷酸激酶(T4 Polynucleotide kinases，T4 PNK)和T4 DNA连接酶（T4 DNAligase）是两种重要的修复酶，在维持基因组的稳定性和完整性方面发挥重要作用。T4 PNK通过转移腺嘌呤上的γ-磷酸基团到寡核苷酸5’羟基端形成寡核苷酸5’-PO4，T4 DNA连接酶催化两条DNA链的5’-PO4基团和3’羟基形成磷酸二酯键。DNA修复酶参与多个修复、复制、重组过程，其活性与疾病的发病机制密切相关，例如沃纳综合症，布鲁姆综合症，还有Rothmund-Thomson综合症。它们被用作疾病的生物标志物和潜在的治疗靶点。因此，开发T4PNK和T4 DNA连接酶的分析策略对于疾病诊断和治疗评估具有重要意义。MicRNA是长度在18~24 nt的非编码小RNA，通常具有增殖、分化、迁移和凋亡等生物学功能。其中MicRNA 21是研究最广泛的MicRNA之一，常被用于肝脏疾病诊断的标志物。由于MicRNA的长度短，且各成员之间的序列相似高，因此MicRNA的准确检测一直是生物医学和生物学研究的一个挑战。本申请开发了一种基于CSIA扩增的铜纳米簇通用检测方法，用于实现T4 DNA连接酶、T4PNK和MicRNA 21的通用检测。
发明内容
本发明的目的是开发一种恒温核酸扩增方法，以满足现场快速检测领域的需要，降低设备依赖性，缩短检测时间。
本发明采用的技术方案是：
本发明的第一方面，开发一种CSIA恒温扩增方法。即以一条三叶草结构的核酸序列为模板，在恒温条件下，无需引物，通过聚合酶作用即可发生指数扩增反应。
其中三叶草结构的核酸序列是指5’端和3’端均能形成发卡结构，且中间通过连接区域连接；
其中5’端发卡序列的GC含量在0%~20%；
其中3’端发卡序列的GC含量在0%~50%，；
其中连接区域为富AT序列或富T序列或富A序列；
所述聚合酶是指具有5’→3’聚合酶活性，且能够催化dNTP加入核苷酸链的3'-OH末端并形成新的核酸链；优选聚合酶选择Bst 2.0 DNA聚合酶。
反应条件是：在65℃~70℃反应温度范围内，大于20 min反应时间；
优选的，70℃，反应30 min。
具体的CSIA恒温扩增反应体系包括：0.1μM 模板、 1×Isotherma buffer、 0.2mM dNTPs、0.05 U Bst 2.0 DNA聚合酶、1M 甜菜碱。
本发明的第二方面，开发一种基于CSIA扩增的铜纳米簇通用检测方法，检测步骤包括（1）CSIA扩增模板的合成；（2）CSIA恒温扩增体系；（3）CSIA-CuNCs生成体系；（4）荧光信号检测；
其中CSIA扩增模板的合成是指在待测靶标存在的条件下能够促探针形成三叶草结构的核酸模板；
其中CSIA恒温扩增体系是指以上述模板为基础，进行CSIA恒温扩增；
其中CSIA-CuNCs生成体系是指以CSIA扩增产物为模板通过化学还原法生成CuNCs；具体的，将恒温扩增产物作为CuNCs的模板，然后在Cu2+、抗坏血酸钠还原剂和葡萄糖稳定剂的作用下合成CuNCs。
其中荧光信号检测是指利用345 nm的激发光照射CSIA-CuNCs反应体系，实现靶标的定量检测。
具体的，一种T4 DNA连接酶的检测方法，T4 DNA连接酶连接SEQ ID NO.31序列和5’端修饰磷酸基团的SEQ ID NO.32序列，成功合成CSIA扩增模板，并进行CSIA恒温扩增体系、CSIA-CuNCs生成体系、荧光信号检测，实现T4 DNA连接酶的高灵敏度检测。
具体的，一种T4 PNK的检测方法，T4 PNK与T4 DNA连接酶共同连接SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32两条探针，成功合成CSIA扩增模板，并进行CSIA恒温扩增体系、CSIA-CuNCs生成体系、荧光信号检测，实现T4 PNK的高灵敏度检测。
具体的，一种MicRNA 21的检测方法，MicRNA 21连接SEQ ID NO.31序列和5’端修饰磷酸基团的SEQ ID NO.32序列，成功合成CSIA扩增模板，并进行CSIA恒温扩增体系、CSIA-CuNCs生成体系、荧光信号检测，实现MicRNA 21的高灵敏度检测。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明公开一种CSIA扩增方法，该方法可以在70℃ 30 min内完成指数扩增并获得大量产物。CSIA扩增产物更适合用于CuNCs的合成模板。利用CSIA-CuNCs的荧光特性，成功构建了三种生物标记物的检测方法，进一步验证了CSIA-CuNCs这种放大和信号输出具有通用性。
附图说明
图1 三叶草结构自延伸等温扩增。
图2 CSIA扩增体系优化。注：A-D为反应温度优化；E-H为MgSO4浓度优化；I-L为dNTPs浓度优化；M-P为Bst 2.0 DNA 聚合酶浓度优化；Q-T为甜菜碱浓度优化；其中A,E,I,M,Q为CSIA扩增实时荧光曲线，B,F,J,N,R为CSIA扩增归一化荧光曲线，C,G,K,O,S为CSIA扩增的跑胶结果，D,H,L,P,T为CSIA扩增跑胶结果的灰度值；U为不同浓度甜菜碱扩增产物合成CuNCs的荧光光谱；V为CuNCs的照片；W为反应时间优化；X为W的灰度值；选择Self-T-10AT模板作为优化过程中的模板序列，M为marker 2000。
图3 CSIA扩增的模板偏好性探究。注：A为CSIA 扩增实时荧光曲线；B为CSIA 扩增归一化荧光曲线；C为CSIA 扩增产物的溶解曲线；D为跑胶图；E为D图的灰度分析；F为扩增产物CuNCs的荧光光谱图，M为marker 2000。
图4 不同长度连接区域的三组模板对CSIA扩增效果的影响。注：A-E为第一组模板序列的荧光图、归一化处理结果、溶解曲线图、跑胶图和灰度分析图；F-J为第二组模板序列的荧光图、归一化图、溶解曲线图、跑胶图和灰度分析图；K-O为第三组模板序列的荧光图、归一化图、溶解曲线图、跑胶图和灰度分析图；M为marker 2000。
图5 CSIA扩增产物合成CuNCs的结果。注：A为第一组模板合成CuNCs的荧光光谱；B为第一组模板在葡萄糖稳定剂存在下合成CuNCs的紫外照射图；C为第二组模板合成CuNCs的荧光光谱；D为第三组模板合成CuNCs的荧光光谱，其中MOPS是指MOPS buffer，GLU是指葡萄糖稳定剂。
图6 CSIA扩增模板的GC%含量优化。注：A-D为5’端的GC%含量优化，A为CSIA扩增实时荧光曲线；B为A的归一结果；C为溶解曲线；D为跑胶结果；E-H为3’端的GC%含量优化，E为CSIA扩增实时荧光曲线；F为E的归一化结果；G为溶解曲线；H为跑胶结果；I为低GC%含量模板的CSIA 扩增实时荧光曲线；J为I的归一化结果；K为溶解曲线；L为跑胶结果；M为Maker2000。
图7 CSIA扩增产物形貌表征。注：A为CSIA扩增产物的AFM分析；B为CSIA网状结构的高度分析位置；C为测量数据。
图8 二代测序结果。注：A为双端测序质量分布图；B为reads单元序列人工分析结果，下划线碱基为模板序列，斜体加粗碱基为突变碱基，灰色衬底为连接序列。
图9 T4 DNA连接酶检测方法。注：A为T4 DNA 连接酶检测原理；B为T4 DNA连接酶连接结果的琼脂糖电泳图，M是marker2000，泳道1-5分别是CSIA-Mic-L、CSIA-Mic-R-PO4、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R-PO4、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R-PO4+MicDNA 21；C为连接产物的CSIA扩增实时荧光曲线；D为归一化荧光曲线；E为CSIA扩增产物的电泳图，泳道1-4分别是对照组、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R-PO4、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R-PO4+MicDNA 21的CSIA扩增结果；F为CSIA扩增产物的溶解曲线；G为CSIA扩增产物合成CuNCs的荧光光谱。
图10 T4 DNA连接酶检测条件优化。注：A为归一化的CSIA-CuNCs激发和发射光谱；B为Bst 2.0 DNA聚合酶优化；C为CuSO4浓度优化；D为SA 浓度优化。
图11 T4 DNA连接酶检测的灵敏度和特异性。注：A为T4 DNA连接酶响应的荧光曲线（0.001 U~5 U）；B为T4 DNA连接酶与荧光强度关系曲线； C为T4 DNA连接酶检测的特异性实验；D为T4 DNA连接酶检测特异性的柱状图，插图为荧光图片CSIA-CuNCs。
图12 T4 PNK检测方法。注：A为T4 PNK检测原理；B为T4 PNK连接结果的琼脂糖电泳图，M是marker2000，泳道1-4分别是CSIA-Mic-L + CSIA-Mic-R、CSIA-Mic-L + CSIA-Mic-R-PO4、CSIA-Mic-L + CSIA-Mic-R-PO4+MicRNA 21、CSIA-Mic-L + CSIA-Mic-R+PNK+MicRNA 21；C为连接产物的CSIA扩增实时荧光曲线；D为归一化荧光曲线；E为CSIA扩增产物的电泳图，泳道1-4分别是对照组、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R+PNK、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R+PNK+MicDNA 21的CSIA扩增结果；F为CSIA扩增产物的溶解曲线；G为CSIA扩增产物合成CuNCs的荧光光谱。
图13 T4 PNK检测的灵敏度和特异性。注：A为T4 PNK响应的荧光曲线（0.0001 U~1.0 U）；B为T4 PNK与荧光强度关系曲线； C为T4 PNK检测的特异性实验；D为T4 PNK检测特异性的柱状图，插图为荧光图片CSIA-CuNCs。
图14 MicRNA 21检测的灵敏度和特异性。注：A为MicRNA 21响应的荧光曲线（0.1pM~600 pM）；B为MicRNA 21与荧光强度的线性关系； C为MicRNA 21检测的特异性实验；D为MicRNA 21检测特异性的柱状图，插图为荧光图片CSIA-CuNCs。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验过程中用到的实验材料包括dNTP mixture、T4 DNA ligase、T4 PNK、Bst 2.0DNA聚合酶、Taq polymerase、Nt. Bst NBI、T7 RNA polymerase、T4 RNA ligase、10000×SYBR Green Ⅰ、MOPS、硫酸铜、甜菜碱、硫酸镁、抗坏血酸钠（SA）、葡萄糖、氯化钠、焦碳酸二乙酯（DEPC）等。
实施例1 三叶草结构自延伸等温扩增(Cloverleaf Structure Self-extendingIsothermal Amplification, CSIA)原理
CSIA的反应过程如图1所示，模板序列是由三个发卡结构组成的，其中发卡1和发卡3是为了维持该特殊结构所设计，发卡2是为了提高产物的AT含量。每轮反应可以简单分为三个步骤，第一步是依靠Bst 2.0 DNA聚合酶的5’→3’的聚合酶活性，将核苷酸碱基通过脱磷酸连接到DNA序列上（DNAN+dNTPs——DNAN+1+4H++P2O7 4-）实现模板的延伸；第二步在高温条件下延伸产物发生构象变化，为下一步的恒温扩增提供模板；第三步则是以构象变化的结构为模板开始新一轮的扩增，其扩增产物又通过构象变化作为下一轮的模板，如此反复实现模板序列的指数放大。具体的，假设模板序列是由X1、X2、Y1、Y2和Z单元组成，总长度为S=2X1+Y1+Z+2X2+Y2，在第一步扩增结束后其长度L0=4X1+2Y1+2Z+2X2+Y2=20×(S+Z)+ (2X1+Y1)，在完成第三步后其完成了第一轮扩增，长度L1=6X1+3Y1+4Z+4X2+2Y2=21×(S+Z)+(2X1+Y1)，因此理论上推测其扩增产物长度为LN=2N×(S+Z)+ (2X1+Y1)。基于上述扩增原理即可实现核酸序列的体外人工可控放大。
实施例2 CSIA扩增体系优化
为了获得更高的CSIA扩增效率，首先以Self-T-10AT（SEQ ID NO.2）为模板对CSIA扩增体系进行优化，实验的反应体系如表1所示。实验条件为70 ℃ 10 s；60个循环，70 ℃30 s，记录荧光；溶解曲线为50℃至95℃逐渐升温，升温速度为0.2℃/s。
表 1 恒温扩增的反应体系
试验过程中分别对反应温度，Bst 2.0 DNA聚合酶、MgSO4、dNTPs、甜菜碱的浓度以及反应时间进行优化，结果如图2所示。随着温度的升高，产物逐渐增多，但当温度达到75℃时扩增产物降低，这是由于温度超过了Bst 2.0 DNA聚合酶的最适反应温度，因此选择70℃进行后续实验（图2，A-D）。Mg2+可以调控Bst 2.0 DNA聚合酶活性和模板的二级结构，由图2E-H实验结果可知添加Mg2+不仅不会促进CSIA的扩增，反而会抑制扩增效率，这可能是由于1×Isotherma buffer中已经包含了2 mM MgSO4，过高的MgSO4不利于模板的结构变化，因此无需额外添加。dNTPs作为Bst 2.0 DNA聚合酶扩增的底物原料，由图2 I-L可知0.2 mMdNTPs浓度最适合CSIA扩增。由图2 M-P可知，0.05 U的Bst 2.0 DNA聚合酶即可以获得较好的扩增结果；此外进一步研究表明将Bst 2.0 DNA聚合酶浓度继续降低，但孵育时间延长至过夜，0.01 U浓度的Bst 2.0 DNA聚合酶同样可以扩增出大量的扩增产物（数据没有显示），因此如果考虑成本问题，也可以采用低浓度Bst 2.0 DNA聚合酶延长反应时间的办法。此外，甜菜碱在恒温扩增反应中能够对一些复杂二级结构提升DNA-酶复合物的稳定性进而提升扩增性能，因此本研究添加了0 ~ 2 M浓度的甜菜碱进行实验，由实时CSIA扩增结果和归一化结果可知0 M甜菜碱反应速率最快（图2 Q-R），增加的甜菜碱不能提高反应速率。但跑胶图和灰度分析可知1M的甜菜碱扩增产物最多，因此要想确定甜菜碱的浓度，需要进一步确定甜菜碱对CuNCs荧光的影响。将恒温扩增产物作为CuNCs的模板，然后在Cu2+、抗坏血酸钠还原剂和葡萄糖稳定剂的作用下合成CuNCs，在Ex：345 nm，Em：460~660 nm条件下测量其荧光光谱，用凝胶成像系统对CuNCs体系进行拍照。由图2 U,V可知甜菜碱会影响CuNCs荧光，当浓度为1 M时既可以获得较好的扩增产物，又可以获得较高的CuNCs荧光，综合考虑选择1M的甜菜碱进行后续实验。最后对反应时间进行优化，由图2 W,X可知反应时间为30 min时基本达到饱和状态。
数据处理中分别采用Graphypad prism软件对实时荧光数据进行归一化处理，采用ImageJ对跑胶图进行灰度分析。每组试验三组平行。
实施例3 CSIA扩增机制研究
首先对CSIA扩增模板的偏好性进行研究，以Self-T-10AT、Self-T2-10AT、Self-T-15AT、Self-T-10C、Self-T-10T、Self-T-10G、Self-T-10A、Self-T-10gC为模板序列（表2）分别进行扩增。根据图3 A、B、D、E的荧光图和跑胶图可知，按照模板扩增效果进行排序：Self-T-15AT > Self-T2-10AT > Self-T-10AT ~ Self-T-10A > Self-T-10T > Self-T-10C >Self-T-10gC ~ Self-T-10G；按照扩增产物的溶解温度进行排序：Self-T-15AT < Self-T-10AT < Self-T2-10AT ~ Self-T-10A ~ Self-T-10T < Self-T-10C ~ Self-T-10gC ~Self-T-10G；上述结果表明模板的碱基组成不同，CSIA扩增效果不同，即CSIA扩增对模板具有偏好性。进一步分析可知Self-T-10G、Self-T-10C、Self-T-10gC的CSIA扩增效果较差，溶解温度高；Self-T-15AT、Self-T2-10AT、Self-T-10AT、Self-T-10A、Self-T-10T的扩增效果较好，溶解温度低。表明CSIA扩增中的连接区域为富AT序列、富A和富T序列时扩增效果好，进而以CSIA扩增产物为模板合成CuNCs，根据图3 F的CuNCs荧光曲线可知，只有Self-T-15AT、Self-T-10AT、Self-T2-10AT能够产生明显的CuNCs荧光，且CuNCs的合成能力为Self-T-15AT > Self-T-10AT > Self-T2-10AT；其他模板序列虽然能够产生扩增产物却不能作为CuNCs的合成模板。比较Self-T2-10AT与Self-T-10AT核酸序列（表2），二者的区别在于扩增模板两端发卡序列不同。二者的扩增曲线、溶解曲线、跑胶结果显示两端发卡的改变几乎不影响CSIA扩增，但是从产物合成的CuNCs荧光来看Self-T2-10AT不如Self-T-10AT的效果好，表明模板两端的发卡序列与后续CuNCs结合过程中可以发挥重要作用。综上所述CSIA扩增与模板具有明显的偏好性，包括连接区域碱基组成以及模板两端的发卡序列。
其次，在以富AT或富A碱基连接的模板中，进一步确定连接区域的长度对CSIA扩增的影响。分别选择三组模板序列进行试验，第一组为Self-E、Self-T-10AT、Self-T-15AT、Self-T-20AT，该组的连接区域为长度不同的富AT序列；第二组为Self-T-AA、Self-T-10A、Self-T-15A、Self-T-20A，该组的连接区域为长度不同的富A序列；第三组为Self-T2-TT、Self-T2-10AT、Self-T2-15AT、Self-T2-20AT，该组与第一组序列不同于模板两端的发卡区域。由图4可知，随着连接区域的延长，第一组和第三组模板的扩增效率增长较明显，第二组模板的扩增效率则没有明显变化。进而说明连接区域为富AT区域时连接区域增加有利于CSIA的扩增。需要注意的是第一组的扩增产物在跑胶图中显示随着连接序列的增加，扩增产物的琼脂糖扩散速度更快，结合扩增效果和溶解曲线的结果，因此我们推测Self-T-20AT的扩增产物形成了更高级的二级结构，所以在琼脂糖中迁移速度更快。而第三组模板的连接区域也是富AT序列，但是其扩增效果并没有第一组模板好，且琼脂糖凝胶结果显示也没有高级结构出现，这可能是由于模板两端的发卡区域与连接区域不易形成更高级结构的结果。同时由于连接序列选择是的富A和AT碱基，因此扩增产物的GC含量会明显降低，进而产物的溶解温度也随着连接区域的延长而降低（图4 C,H,M）。同时采用CuNCs荧光对其扩增产物进行验证，结果如图5所示。试验结果表明，只有第一组模板在长连接区域时能够产生CuNCs模板，而第二组模板不能产生CuNCs模板，这主要是由于双链的AT序列更有利于CuNCs的合成。第三组的模板也是以AT碱基作为连接区域，但是其产生的CuNCs荧光却比第一组模板的CuNCs荧光低大约6.1倍，因此我们推测CuNCs的合成除了与富AT序列有关，也与模板的二级结构直接相关（Self-T-20AT的跑胶图显示其具有更紧凑的二级结构）。此外，在葡萄糖作为稳定剂的条件下，Self-T-20AT模板的荧光与MOPS缓冲液条件下合成的CuNCs荧光增加约2.5倍，说明葡萄糖稳定剂能够稳定CuNCs荧光。
接着对模板两端发卡的GC%含量进行优化，分别合成了左右两端GC%含量在10% ~50%的序列（表2），然后进行CSIA扩增。由图6 A-D可知5’端的发卡GC%含量在10%~20%条件下能够进行扩增，随着GC%含量增加扩增效率降低，而≥30%含量时则不会发生扩增。前述Self-T2-TT模板的5’端为30%的GC%含量，因此图4 K-N所示Self-T2-TT模板扩增效率极低，该结果与此处的结果相印证；但是当富AT的连接序列延长时，由图4 K-N可知Self-T2-10AT、Self-T2-15AT、Self-T2-20AT能够进行扩增，因此推测可以通过降低模板总GC%含量来拓宽5’端的GC%含量要求。由图6 E-H可知3’端的发卡GC%含量在10%~50%条件下均能进行扩增，但扩增效率随着GC%含量的增加逐渐降低。综上所述，模板两端的发卡结构对于扩增的效率直接相关，对3’端的GC%含量要求较低，范围宽泛；但对5’端的要求较高。这主要是由于5’端决定了其下一轮扩增的可能性，只有在退火温度较低的情况下，才更易发生构象变化实现模板重排形成碱基互补配对的3’延伸端，而3’端只与第一轮的扩增启动直接相关，只要第一轮顺利扩增，后面的扩增效率与该部分碱基互补配对情况无关，因此3’端的GC%含量要求较低，可以在较宽的范围内实现扩增。由于低GC%含量与高AT%含量成正相关，而富AT序列正好是CuNCs的合成模板，因此CSIA的扩增产物与CuNCs天然匹配，可以作为信号输出探针。同时我们进一步降低5’和3’端发卡的GC%含量，将5’端和3’端的发卡GC%含量降低至0%，发现CSIA扩增仍能进行（图6 I-L），但是当整条模板的GC%含量为0%时其扩增效率极低，且有可能合成更复杂的二级结构（图6 L 泳道3），因此我们认为较低GC%含量是CSIA扩增的必要条件，可以利用上述结果设计CSIA的扩增模板。同时，我们还利用上述设计原则随机设计了一条T序列作为CSIA扩增模板，其5’端的GC%在20%，3’端的GC%在40%，扩增结果表明T模板能够进行CSIA恒温扩增，进一步验证了上述设计原则的可靠性。
为了进一步验证CSIA的扩增产物及其核酸序列情况，以Self-T-20AT为模板的CSIA扩增产物进行了AFM形貌分析。由AFM结果可以看出CSIA的扩增产物的长度大多数大于4 μM（图7A），且形成复杂的网状结构，利用软件描绘出两条核酸扩增产物并测量其长度，结果显示①和②的长度为1.87 μM和3.429 μM，这与L6和L7的理论扩增长度相近（L6=1.748 μM，L7=3.488 μM），进一步证明实际扩增与理论计算LN=2N×(S+Z)+ (2X1+Y1)的一致性。同时在AFM图中选择3处位置进行高度测量（图7 B，C），结果显示网状结构的核酸高度不一致，且极限差距大约在2倍左右，因此根据Self-T-20AT模板中含有多个富AT区域，该区域碱基间相互作用力较弱，推测CSIA的扩增产物处在单、双链动态的状态，易于与扩增产物的富AT序列之间进行交联，进而形成网状结构。同时也可能是CuNCs荧光增强的另一个原因，即CuNCs核酸模板有序排列影响CuNCs荧光。
采用二代测序对于CSIA扩增产物进行测序，测序结果显示了4,361,542个reads，如图8 A为双端测序质量分布图，表明碱基识别正确率能够达到99%以上，但是由于Self-T-20AT模板的AT含量能够达到80%，因此不能实现自动拼接。理论上CSIA扩增产物的长度为60bp，而单个reads的测序长度150 bp，因此单个reads单元也有可能出现CSIA扩增的重复序列。基于此，根据测得的单个reads单元进行人工分析，由图8 B可知在单个reads区域确实可以发现两段重复的CSIA扩增产物，并且发现两段产物之间具有一段连接序列，该序列为20 nt的富AT序列，该段序列与设计的模板不相关，是独立于模板序列的区域，这可能是由于Bst 2.0 DNA聚合酶非特异性扩增的结果，同时发现该连接区域与CuNCs合成所需的富AT序列一致，因此也进一步增加了CSIA扩增产物作为CuNCs模板的优越性。
表 2 恒温扩增反应的核酸序列
综上所述，从五个方面对CSIA扩增机制进行研究，分别是碱基偏好性、连接区域长度、两端发卡区域的GC%含量、形貌分析和测序。结果表明CSIA扩增模板的设计基本遵从以下原则：连接区域最好选择富AT序列和富A序列，且连接区域的增加有利于CSIA的扩增；对模板5’端的发卡序列GC%含量要维持在10%~20%为优，3’端的发卡序列GC%含量在10%~50%均可。结合CuNCs荧光信号，连接区域最好选择其富AT序列，且序列长度越长越有利于CuNCs的合成，同时葡萄糖的稳定剂能提升CSIA-CuNCs荧光，另外富AT区域弱相互作用和丰富的二级结构也有利于CuNCs的有序排列。简而言之，可以通过上述原则可以体外人工调控CSIA扩增产物，促使合成更有利于CuNCs合成的模板。
实施例4 基于CSIA扩增检测T4 DNA连接酶的应用
在上述恒温扩增反应的基础上，设计了两条探针CSIA-Mic-L和CSIA-Mic-R-PO4，其中CSIA-Mic-R-PO4是在CSIA-Mic-R的5’端修饰了-PO4基团，具体的核酸序列如表3所示。T4 DNA连接酶的检测原理为：通过MicDNA 21序列的碱基互补配对拉近两条探针位置，进而在T4 DNA连接酶存在的条件下催化两条探针的结合，并形成CSIA扩增的模板结构，在恒温条件下完成扩增（图9 A），而以该扩增产物为模板则可以实现CuNCs的荧光信号输出。
表3 T4 DNA连接酶检测的序列
具体的T4 DNA连接酶反应体系如表4所示：
表 4 T4连接酶反应体系
首先进行可行性验证，由图9 B可知T4 DNA连接酶能够成功连接两条探针（泳道5），在2%琼脂糖中显示合成了更大的连接产物；进而以CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R、CSIA-Mic-L+CSIA-Mic-R-PO4、CSIA-Mic-L+ CSIA-Mic-R-PO4+ MicDNA 21连接产物为CSIA扩增模板进行恒温扩增，通过CSIA扩增实时荧光曲线、归一化结果、凝胶电泳、溶解曲线，证明在MicDNA21存在下T4 DNA连接酶能够连接CSIA-Mic-L和CSIA-Mic-R-PO4探针，（图9 C-F），并且产物能够合成CuNCs荧光（图9 G）。
T4 DNA连接酶检测方法包括T4 DNA连接酶连接体系以及恒温扩增体系，其CuNCs合成体系可能会受到上一步体系中盐浓度、蛋白酶、酶活保护剂等的影响，因此先对其CuNCs的荧光性质进行测定（图10A），结果显示CSIA扩增产物合成的CuNCs激发波长为345nm，发射波长为596 nm，相较于单链核酸合成的CuNCs其荧光发生了蓝移，对于CuNCs自身的荧光特性影响不大。为了进一步合成更多的CSIA扩增产物，提高CuNCs荧光信号的信噪比，首先优化了Bst 2.0 DNA聚合酶的浓度，由图10 B可知随着Bst 2.0 DNA聚合酶的增多，CSIA扩增产物逐渐增加，当Bst 2.0 DNA聚合酶达到2 U时合成的CuNCs达到最大，因此确定Bst 2.0 DNA聚合酶浓度为2 U。进一步优化了CuNCs合成体系中CuSO4浓度和SA浓度，结果显示0.05 mM CuSO4和3 mM SA为CSIA-CuNCs的最适反应条件（图10 C，D）。
在上述最优条件下，对T4 DNA连接酶检测方法的灵敏度和特异性进行实验。由图11 A可知随着T4 DNA连接酶浓度从0 U增加1 U时荧光强度逐渐增加，当T4 DNA连接酶浓度增加到2 U以上时其CSIA-CuNCs荧光会有一定的降低，这可能是由于高浓度蛋白酶贮存液存在EDTA，可以与Cu2+螯合，导致CuNCs荧光强度降低。T4 DNA连接酶与荧光强度在0.002-0.2 U范围内具有良好的线性范围（图11 B），方程是Y = 411.5*X + 49.53（R2=0.9865），根据3σ原则计算得到最低检出限为9.02×10-4 U。且本检测方法对不同的生物酶和失活的T4DNA连接酶进行实验，来验证T4 DNA连接酶的特异性，结果表明该方法具有良好的特异性，能够满足检测需要（图11 C和D）。
实施例5 基于CSIA扩增检测T4 PNK的应用
合成CSIA-Mic-L和CSIA-Mic-R两条探针序列，CSIA-Mic-R序列只有在T4 PNK的作用下才能将5’端连接上-PO4基团，在T4 DNA连接酶检测的基础上实现连接，并进行CSIA扩增。虽然在T4 PNK检测体系中CSIA-Mic-L和CSIA-Mic-R两条序列均可以实现5’-PO4，但是由于MicDNA 21的存在，CSIA-Mic-L和CSIA-Mic-R-PO4的连接效率会更高。具体的T4 PNK检测体系如表5所示。
表5 T4 PNK反应体系
由图12 B可知， T4 PNK能够成功将CSIA-Mic-R序列的5’端连接上-PO4，并通过T4DNA 连接酶将两条探针连接，且通过CSIA扩增实时荧光曲线（图12 C）、归一化结果（图12D）、电泳图（图12 E）、溶解曲线（图12 F）和CSIA-CuNCs荧光光谱（图12 G）可知两条序列正常连接成CSIA扩增模板所需的二级结构，并成功获得双链核酸模板。
由图13 A可知随着T4 PNK浓度从0 U增加1 U时荧光强度逐渐增加，在0.001-0.1U范围内T4 PNK与荧光强度呈现良好的线性范围（图13 B），方程是Y = 1138*X + 48.75（R2=0.9695），根据3σ原则计算得到最低检出限3.23×10-4 U。且本检测方法通过对不同的酶和失活的T4 PNK进行实验，来验证T4 PNK的特异性，结果表明该方法具有良好的特异性，能够满足检测需要（图13 C和D）。
实施例6 基于CSIA扩增检测MicRNA 21的应用
除了上述的修复蛋白酶能够作为疾病的生物标志物外，MicRNA是一种长度在20nt的寡核苷酸序列，其在细胞内同样具有多种重要的调节功能。因此，在上述研究的基础上，可以将其扩展到MicRNA检测，其检测原理与T4 DNA 连接酶的检测（图9 A）相似，在CSIA-Mic-L和CSIA-Mic-R-PO4两条探针的基础上固定添加0.4 U T4 DNA连接酶，用于检测MicRNA 21。实验中用到的核酸序列和检测体系如表6和表7所示。
表6 MicRNA 21检测所需序列
表7 T4 MciRNA21检测反应体系
由图14 A可知，随着MicRNA 21浓度的增加CSIA-CuNCs荧光也逐渐增加，且在200pM~600 pM和1 pM~100 pM的范围内呈现良好的线性关系（图14 B），方程式为Y=0.6769*X +93.81（R2= 0.9463）和Y=1.281*X + 30.78（R2=0.9848），根据3σ原则计算得到最低检出限为0.12 pM。此外，利用MicRNA 21的突变体和其他MicRNA进行选择性实验，结果表明该方法对其他MicRNA具有良好的选择性，虽然对MicRNA 21的突变体能够产生微弱信号，但可与靶标MicRNA 21显著区分（图14 C-D）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种CSIA恒温扩增方法，其特征在于，以一条三叶草结构的核酸序列为模板，在恒温条件下，无需引物，通过聚合酶、dNTP、甜菜碱、Isotherma buffer等的作用即可发生指数扩增反应；
所述CSIA恒温扩增方法是指三叶草结构自延伸等温扩增方法；
所述三叶草结构的核酸序列是指5’端和3’端均能形成发卡结构，且中间通过连接区域连接；
所述5’端发卡序列的GC含量在0%~20%；
所述3’端发卡序列的GC含量在0%~50%；
所述连接区域为富AT序列或富T序列或富A序列；
所述聚合酶是指具有5’→3’聚合酶活性，且能够催化dNTP加入核苷酸链的3'-OH末端并形成新的核酸链。
2.根据权利要求1所述的一种CSIA恒温扩增方法，其特征在于，聚合酶选择Bst 2.0DNA聚合酶，反应温度在65℃~70℃范围内，反应时间大于20 min。
3.一种基于CSIA扩增的铜纳米簇通用检测方法，其特征在于，（1）CSIA扩增模板的合成；（2）CSIA恒温扩增体系；（3）CSIA-CuNCs生成体系；（4）荧光信号检测；
所述CSIA扩增模板的合成是指在待测靶标存在的条件下能够促探针形成三叶草结构的核酸模板；
所述三叶草结构的核酸模板是指5’端和3’端均能形成发卡结构，且中间通过连接区域连接；
所述5’端发卡序列的GC含量在10%~20%；
所述3’端发卡序列的GC含量在10%~50%；
所述连接区域为富AT序列；
所述CSIA恒温扩增体系是指以上述模板为基础，进行如权利要求1和权利要求2所述的CSIA恒温扩增；
所述CSIA-CuNCs生成体系是指以CSIA扩增产物为模板通过化学还原方法生成CuNCs；
所述荧光信号检测是指利用345 nm的激发光照射CSIA-CuNCs反应体系，实现靶标的定量检测。
4.一种非诊断目的的T4 DNA连接酶检测方法，其特征在于，利用权利要求3所述的检测方法，T4 DNA连接酶连接SEQ ID NO.31序列和5’端修饰磷酸基团的SEQ ID NO.32序列，成功合成CSIA扩增模板，并进行后续反应，实现T4 DNA连接酶的检测。
5.一种非诊断目的的T4 PNK检测方法，其特征在于，利用权利要求3所述的检测方法，T4 PNK与T4 DNA连接酶共同连接SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32两条探针，成功合成CSIA扩增模板，并进行后续反应，实现T4 PNK的检测。
6.一种非诊断目的的MicRNA 21检测方法，其特征在于，利用权利要求3所述的检测方法，MicRNA 21连接SEQ ID NO.31序列和5’端修饰磷酸基团的SEQ ID NO.32序列，成功合成CSIA扩增模板，并进行后续反应，实现MicRNA 21的检测。
7.一种T4 DNA连接酶检测试剂盒，其特征在于，利用权利要求4所述的检测方法构建的检测试剂盒。
8.一种T4 PNK检测试剂盒，其特征在于，利用权利要求5所述的检测方法构建的检测试剂盒。
9.一种MicRNA 21检测试剂盒，其特征在于，利用权利要求6所述的检测方法构建的检测试剂盒。
10.权利要求3所述的通用检测方法在非诊断目的的蛋白酶和MicRNA检测中的应用。
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