JPH10117797A - 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット - Google Patents
遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キットInfo
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- JPH10117797A JPH10117797A JP8284153A JP28415396A JPH10117797A JP H10117797 A JPH10117797 A JP H10117797A JP 8284153 A JP8284153 A JP 8284153A JP 28415396 A JP28415396 A JP 28415396A JP H10117797 A JPH10117797 A JP H10117797A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法を提供す
る。 【解決手段】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活
性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前
記試料に、遺伝子結合性ラマン活性物質を供給し、つい
でこの試料に表面増強ラマン散乱生起基質を供給して遺
伝子に結合しなかった遺伝子結合性ラマン活性物質を捕
捉し、この状態で前記ラマン活性物質に励起光を照射
し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定して遺伝子を
分析する。分析対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡの場
合、前記遺伝子結合性ラマン活性物質としては、４´，
６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
がある。また、前記表面増強ラマン散乱生起基質として
は銀コロイドがある。図１のグラフの曲線（ａ）に示す
ように、ＤＮＡが存在すると表面増強ラマン散乱光が微
弱になる。
る。 【解決手段】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活
性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前
記試料に、遺伝子結合性ラマン活性物質を供給し、つい
でこの試料に表面増強ラマン散乱生起基質を供給して遺
伝子に結合しなかった遺伝子結合性ラマン活性物質を捕
捉し、この状態で前記ラマン活性物質に励起光を照射
し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定して遺伝子を
分析する。分析対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡの場
合、前記遺伝子結合性ラマン活性物質としては、４´，
６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
がある。また、前記表面増強ラマン散乱生起基質として
は銀コロイドがある。図１のグラフの曲線（ａ）に示す
ように、ＤＮＡが存在すると表面増強ラマン散乱光が微
弱になる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子、すなわち
デオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」という）およびリボ
核酸（以下「ＲＮＡ」という）の分析方法に関し、詳し
くは、表面増強ラマン散乱（以下「ＳＥＲＳ」という）
測定により短時間で簡単に遺伝子の分析を行うことが可
能な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用
キットに関する。
デオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」という）およびリボ
核酸（以下「ＲＮＡ」という）の分析方法に関し、詳し
くは、表面増強ラマン散乱（以下「ＳＥＲＳ」という）
測定により短時間で簡単に遺伝子の分析を行うことが可
能な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用
キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学に関する技術の革新は
目覚ましく、特に、ポリメラーゼチェーンリアクション
（ＰＣＲ）法の開発により、目的とするＤＮＡの大量複
製が可能となった。
目覚ましく、特に、ポリメラーゼチェーンリアクション
（ＰＣＲ）法の開発により、目的とするＤＮＡの大量複
製が可能となった。
【０００３】ＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラーゼがプライ
マーなしでは働かないという原理に基づくものであり、
試料中のＤＮＡを熱で変性させて一本鎖とし、ついで温
度を下げてプライマーを結合させ、この状態で耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成するという、一連の
サイクルを繰り返すことにより、ＤＮＡを大量に増幅さ
せるものである。したがって、特定のプライマーを予め
化学合成等により準備して用いれば、目的とするＤＮＡ
を大量に調製することができる。ここで、目的とするＤ
ＮＡが調製されたか否かの判断は、従来、ＰＣＲを行っ
た試料を電気泳動にかけて目的とするＤＮＡのバンドの
確認により行われることが一般的であった。
マーなしでは働かないという原理に基づくものであり、
試料中のＤＮＡを熱で変性させて一本鎖とし、ついで温
度を下げてプライマーを結合させ、この状態で耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成するという、一連の
サイクルを繰り返すことにより、ＤＮＡを大量に増幅さ
せるものである。したがって、特定のプライマーを予め
化学合成等により準備して用いれば、目的とするＤＮＡ
を大量に調製することができる。ここで、目的とするＤ
ＮＡが調製されたか否かの判断は、従来、ＰＣＲを行っ
た試料を電気泳動にかけて目的とするＤＮＡのバンドの
確認により行われることが一般的であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、電気泳
動による分析は、その操作に時間がかかり、かつ煩雑で
あるという問題があった。すなわち、電気泳動の担体と
なるゲルを予め調製する作業があり、ＰＣＲを行った試
料を、ＤＮＡの大きさにより予め選択する必要がある。
また、電気泳動法は、通常、約７５分の長時間を必要と
し、迅速性に欠ける。そして、遺伝子を迅速かつ簡単に
検出し測定することは、ＰＣＲ法のみならず、ＤＮＡ等
の遺伝子を分析する分野に共通する課題となっている。
動による分析は、その操作に時間がかかり、かつ煩雑で
あるという問題があった。すなわち、電気泳動の担体と
なるゲルを予め調製する作業があり、ＰＣＲを行った試
料を、ＤＮＡの大きさにより予め選択する必要がある。
また、電気泳動法は、通常、約７５分の長時間を必要と
し、迅速性に欠ける。そして、遺伝子を迅速かつ簡単に
検出し測定することは、ＰＣＲ法のみならず、ＤＮＡ等
の遺伝子を分析する分野に共通する課題となっている。
【０００５】そこで、本発明は、前記従来の問題を解決
し、迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法およびそれに用い
る遺伝子分析用キットの提供をその目的とする。
し、迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法およびそれに用い
る遺伝子分析用キットの提供をその目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と、遺
伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起
基質とを準備し、前記試料に、前記遺伝子結合性ラマン
活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給
し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活
性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質により捕捉
し、この状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起
光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定する
という構成をとる。
に、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と、遺
伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起
基質とを準備し、前記試料に、前記遺伝子結合性ラマン
活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給
し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活
性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質により捕捉
し、この状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起
光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定する
という構成をとる。
【０００７】このように、本発明は、遺伝子結合性ラマ
ン活性物質が発生するＳＥＲＳ光を測定することによ
り、迅速かつ簡単な遺伝子の分析を可能にするものであ
る。ラマン活性物質の中には、ＤＮＡ等の遺伝子に特異
的に結合するものがある。この遺伝子結合性ラマン活性
物質を、分析対象試料に添加すると、前記試料中に遺伝
子が存在すれば、これに前記ラマン活性物質が結合する
ことになる。そして、この試料にＳＥＲＳ生起基質を添
加すれば、遺伝子と結合していない前記ラマン活性物質
のみが、前記ＳＥＲＳ生起基質に捕捉されることとな
る。この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射す
れば、前記ＳＥＲＳ生起基質に捕捉された前記ラマン活
性物質だけがＳＥＲＳ光を発し、遺伝子に結合した前記
ラマン活性物質は、ＳＥＲＳ光を生じない。したがっ
て、分析対象試料中の遺伝子量に反比例したＳＥＲＳ光
が検出でき、これにより前記試料中の遺伝子の検出およ
びその量を測定することができる。
ン活性物質が発生するＳＥＲＳ光を測定することによ
り、迅速かつ簡単な遺伝子の分析を可能にするものであ
る。ラマン活性物質の中には、ＤＮＡ等の遺伝子に特異
的に結合するものがある。この遺伝子結合性ラマン活性
物質を、分析対象試料に添加すると、前記試料中に遺伝
子が存在すれば、これに前記ラマン活性物質が結合する
ことになる。そして、この試料にＳＥＲＳ生起基質を添
加すれば、遺伝子と結合していない前記ラマン活性物質
のみが、前記ＳＥＲＳ生起基質に捕捉されることとな
る。この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射す
れば、前記ＳＥＲＳ生起基質に捕捉された前記ラマン活
性物質だけがＳＥＲＳ光を発し、遺伝子に結合した前記
ラマン活性物質は、ＳＥＲＳ光を生じない。したがっ
て、分析対象試料中の遺伝子量に反比例したＳＥＲＳ光
が検出でき、これにより前記試料中の遺伝子の検出およ
びその量を測定することができる。
【０００８】なお、本発明の遺伝子の分析方法におい
て、前記試料に対する前記遺伝子結合性ラマン活性物質
および表面増強ラマン散乱生起基質の供給順序は特に限
定するものではなく、前記両者を同時に供給してもよ
く、若しくは前記遺伝子結合性ラマン活性物質を供給し
た後、前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給してもよ
い。
て、前記試料に対する前記遺伝子結合性ラマン活性物質
および表面増強ラマン散乱生起基質の供給順序は特に限
定するものではなく、前記両者を同時に供給してもよ
く、若しくは前記遺伝子結合性ラマン活性物質を供給し
た後、前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給してもよ
い。
【０００９】そして、この分析方法では、前記ラマン活
性物質および前記ＳＥＲＳ生起基質の添加、励起光の照
射およびＳＥＲＳ光の測定という単純な操作により構成
されているため、簡単な分析方法となっている。また、
遺伝子への前記ラマン活性物質の結合および前記ＳＥＲ
Ｓ生起基質による前記ラマン活性物質の捕捉は、極めて
短時間で起り、またＳＥＲＳ光の測定も、約１〜２秒の
極めて短い時間で行うことができるため、本発明の遺伝
子の分析方法は、分析操作全体を短時間に行うことがで
きる。
性物質および前記ＳＥＲＳ生起基質の添加、励起光の照
射およびＳＥＲＳ光の測定という単純な操作により構成
されているため、簡単な分析方法となっている。また、
遺伝子への前記ラマン活性物質の結合および前記ＳＥＲ
Ｓ生起基質による前記ラマン活性物質の捕捉は、極めて
短時間で起り、またＳＥＲＳ光の測定も、約１〜２秒の
極めて短い時間で行うことができるため、本発明の遺伝
子の分析方法は、分析操作全体を短時間に行うことがで
きる。
【００１０】なお、本発明において、「ラマン活性」と
は、励起光を照射すればラマン散乱若しくはＳＥＲＳが
生じることをいい、「遺伝子結合性ラマン活性物質」と
は前記ラマン活性を有する物質のなかで、遺伝子に結合
する性質を有するものをいう。また、「表面増強ラマン
散乱生起基質」とは、その表面に物質を捕捉してラマン
散乱を増強させる性質を有する物質をいう。前記捕捉の
手段としては、例えば、吸着現象を利用する方法や、電
位をかけて電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と
反応結合する官能基を備えたＳＥＲＳ生起基質に反応さ
せる方法がある。
は、励起光を照射すればラマン散乱若しくはＳＥＲＳが
生じることをいい、「遺伝子結合性ラマン活性物質」と
は前記ラマン活性を有する物質のなかで、遺伝子に結合
する性質を有するものをいう。また、「表面増強ラマン
散乱生起基質」とは、その表面に物質を捕捉してラマン
散乱を増強させる性質を有する物質をいう。前記捕捉の
手段としては、例えば、吸着現象を利用する方法や、電
位をかけて電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と
反応結合する官能基を備えたＳＥＲＳ生起基質に反応さ
せる方法がある。
【００１１】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象となる遺伝子としては、例えば、一本鎖ＤＮＡ、二
本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの複合体がある。
そして、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と
して、ＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料
（ＰＣＲ産物）またはＤＮＡ試料を用いる場合に有効な
分析方法となる。先に述べたように、ＰＣＲ法は目的と
するＤＮＡを増幅する方法であるが、試料中に目的とす
るＤＮＡがない場合にはＰＣＲ産物中のＤＮＡ量は微量
なものとなる。したがって、ＰＣＲ産物を分析対象試料
として本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、ＳＥＲ
Ｓ光を測定することにより、短時間で簡単に目的ＤＮＡ
が増幅されたか否かが確認できる。また、予め検量線を
作成しておけば、増幅されたＤＮＡ量を測定することも
できる。
対象となる遺伝子としては、例えば、一本鎖ＤＮＡ、二
本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの複合体がある。
そして、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と
して、ＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料
（ＰＣＲ産物）またはＤＮＡ試料を用いる場合に有効な
分析方法となる。先に述べたように、ＰＣＲ法は目的と
するＤＮＡを増幅する方法であるが、試料中に目的とす
るＤＮＡがない場合にはＰＣＲ産物中のＤＮＡ量は微量
なものとなる。したがって、ＰＣＲ産物を分析対象試料
として本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、ＳＥＲ
Ｓ光を測定することにより、短時間で簡単に目的ＤＮＡ
が増幅されたか否かが確認できる。また、予め検量線を
作成しておけば、増幅されたＤＮＡ量を測定することも
できる。
【００１２】この他に、ストランド ディスプレースメ
ント アンプリフィケーション法（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉ
ｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、
ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、リガ
ーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法によりＤＮＡの
増幅操作を行った試料、Ｑβレプリカーゼを用いたＲＮ
Ａの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操作を行っ
た試料にも、本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、
ＰＣＲ法の場合と同様に、好結果を得ることができる。
ント アンプリフィケーション法（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉ
ｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、
ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、リガ
ーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法によりＤＮＡの
増幅操作を行った試料、Ｑβレプリカーゼを用いたＲＮ
Ａの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操作を行っ
た試料にも、本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、
ＰＣＲ法の場合と同様に、好結果を得ることができる。
【００１３】なお、前記ＳＤＡ法としては、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２０．
Ｎｏ．７ １６９１−１６９６に記載の方法があげられ
る。
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２０．
Ｎｏ．７ １６９１−１６９６に記載の方法があげられ
る。
【００１４】また、前記ＬＣＲ法とは、９４℃でも熱変
性しない耐熱性ＤＮＡリガーゼを使用することに特徴を
有するＤＮＡ増幅法であり、この方法は、ミスマッチを
もたない正常人のＤＮＡ試料の場合には用いた２種類の
オリゴヌクレオチドがＤＮＡリガーゼによって接続さ
れ、つぎの反応サイクルの基質となって次々と増幅され
るのに対し、ミスマッチをもつ場合は接続されないため
そこで反応が止まってしまうという原理に基づく。
性しない耐熱性ＤＮＡリガーゼを使用することに特徴を
有するＤＮＡ増幅法であり、この方法は、ミスマッチを
もたない正常人のＤＮＡ試料の場合には用いた２種類の
オリゴヌクレオチドがＤＮＡリガーゼによって接続さ
れ、つぎの反応サイクルの基質となって次々と増幅され
るのに対し、ミスマッチをもつ場合は接続されないため
そこで反応が止まってしまうという原理に基づく。
【００１５】また、前記Ｑβ法は、ＲＮＡレプリカーゼ
の一種で基質となるＲＮＡと特異性が高いＱβレプリカ
ーゼを用いてＲＮＡを増幅する方法である。具体的に
は、まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの
下流にＭＤＶ−１・ＲＮＡ（ＤＮＡ化したもの）をつな
いだプラスミドベクターを据え、増幅したいＤＮＡ断片
をＭＤＶ−１の間に挿入する（２０〜８００ｂｐ程度が
挿入可能）。つぎに、制限酵素で切断してからＴ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼを働かせ、これをＲＮＡ化する。挿入
断片を含んだＭＤＶ−１・ＲＮＡは、以後のＱβレプリ
カーゼによる複製サイクルを繰り返すことにより増幅さ
せることができる。
の一種で基質となるＲＮＡと特異性が高いＱβレプリカ
ーゼを用いてＲＮＡを増幅する方法である。具体的に
は、まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの
下流にＭＤＶ−１・ＲＮＡ（ＤＮＡ化したもの）をつな
いだプラスミドベクターを据え、増幅したいＤＮＡ断片
をＭＤＶ−１の間に挿入する（２０〜８００ｂｐ程度が
挿入可能）。つぎに、制限酵素で切断してからＴ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼを働かせ、これをＲＮＡ化する。挿入
断片を含んだＭＤＶ−１・ＲＮＡは、以後のＱβレプリ
カーゼによる複製サイクルを繰り返すことにより増幅さ
せることができる。
【００１６】さらに、本発明の遺伝子の分析方法の適用
範囲はこれらの試料に限定されず、３ＳＲ法、ＮＡＳＢ
Ａ法、ＣＰＲ法、ＳＩＲ法等によりＤＮＡあるいはＲＮ
Ａの増幅操作を行った試料についてもＰＣＲ法と同様に
適用することができる。なお、ＮＡＳＢＡ法はＲＮＡの
増幅方法であり、その他の方法はＤＮＡの増幅方法であ
る。
範囲はこれらの試料に限定されず、３ＳＲ法、ＮＡＳＢ
Ａ法、ＣＰＲ法、ＳＩＲ法等によりＤＮＡあるいはＲＮ
Ａの増幅操作を行った試料についてもＰＣＲ法と同様に
適用することができる。なお、ＮＡＳＢＡ法はＲＮＡの
増幅方法であり、その他の方法はＤＮＡの増幅方法であ
る。
【００１７】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡ（前記二本鎖ＤＮＡ増
幅試料を含む）である場合、遺伝子結合性ラマン活性物
質としては、例えば、下記の式（化１）で表される４
´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰ
Ｉ）、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、チアゾール
オレンジ、下記の式（化２）で表されるビスベンゾイミ
ド（ヘキスト３３２５８、ヘキスト社製）およびアクリ
ジンオレンジがあげられる。この他に、ＳＹＢＲＧｒｅ
ｅｎ I（商品名、モレキュラープローブス社製）があげ
られる、このなかでも、ＤＡＰＩが好ましい。これは、
ＤＡＰＩが二本鎖ＤＮＡとより選択的に複合体を形成
し、他の物質、例えばＲＮＡには結合しにくいという性
質を持ち、このため、ＲＮＡ等の他の物質が混在する試
料であっても、二本鎖ＤＮＡを選択的に検出できるから
である。
対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡ（前記二本鎖ＤＮＡ増
幅試料を含む）である場合、遺伝子結合性ラマン活性物
質としては、例えば、下記の式（化１）で表される４
´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰ
Ｉ）、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、チアゾール
オレンジ、下記の式（化２）で表されるビスベンゾイミ
ド（ヘキスト３３２５８、ヘキスト社製）およびアクリ
ジンオレンジがあげられる。この他に、ＳＹＢＲＧｒｅ
ｅｎ I（商品名、モレキュラープローブス社製）があげ
られる、このなかでも、ＤＡＰＩが好ましい。これは、
ＤＡＰＩが二本鎖ＤＮＡとより選択的に複合体を形成
し、他の物質、例えばＲＮＡには結合しにくいという性
質を持ち、このため、ＲＮＡ等の他の物質が混在する試
料であっても、二本鎖ＤＮＡを選択的に検出できるから
である。
【００１８】
【化１】
【００１９】
【化２】
【００２０】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象となる遺伝子がＲＮＡの場合（前記ＲＮＡ増幅試料
を含む）、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例え
ば、ＥｔＢｒ、チアゾールオレンジ、前記式（化２）で
表されるビスベンゾイミド（ヘキスト３３２５８、ヘキ
スト社製）、アクリジンオレンジがあげられる。この他
に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II （商品名、モレキュラー
プローブス社製）もあげられる。このなかで、ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ II が、よりＲＮＡと選択的に複合体を形
成する。
対象となる遺伝子がＲＮＡの場合（前記ＲＮＡ増幅試料
を含む）、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例え
ば、ＥｔＢｒ、チアゾールオレンジ、前記式（化２）で
表されるビスベンゾイミド（ヘキスト３３２５８、ヘキ
スト社製）、アクリジンオレンジがあげられる。この他
に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II （商品名、モレキュラー
プローブス社製）もあげられる。このなかで、ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ II が、よりＲＮＡと選択的に複合体を形
成する。
【００２１】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象の遺伝子が一本鎖ＤＮＡの場合、遺伝子結合性ラマ
ン活性物質としては、前記ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II が
あげられる。
対象の遺伝子が一本鎖ＤＮＡの場合、遺伝子結合性ラマ
ン活性物質としては、前記ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II が
あげられる。
【００２２】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象の遺伝子がＲＮＡとＤＮＡの複合体の場合、遺伝子
結合性ラマン活性物質としては、例えば、先に述べた、
ＤＮＡ結合性ラマン活性物質、ＲＮＡ結合性ラマン活性
物質を使用できる。
対象の遺伝子がＲＮＡとＤＮＡの複合体の場合、遺伝子
結合性ラマン活性物質としては、例えば、先に述べた、
ＤＮＡ結合性ラマン活性物質、ＲＮＡ結合性ラマン活性
物質を使用できる。
【００２３】本発明の遺伝子の分析方法において、ＳＥ
ＲＳ生起基質としては、例えば、銀コロイド、金コロイ
ド、銅コロイド、電極、金属板があげられ、このなかで
も、作製が簡単で取扱いが容易であることから、銀コロ
イド、金コロイド等の金属コロイドが好ましい。
ＲＳ生起基質としては、例えば、銀コロイド、金コロイ
ド、銅コロイド、電極、金属板があげられ、このなかで
も、作製が簡単で取扱いが容易であることから、銀コロ
イド、金コロイド等の金属コロイドが好ましい。
【００２４】そして、本発明の遺伝子分析用キットは、
遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１と、Ｓ
ＥＲＳ生起基質を含有する試薬Ｒ２とを備える。このキ
ットを用いれば、本発明の遺伝子の分析が、さらに迅速
かつ簡単に実施できるようになる。
遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１と、Ｓ
ＥＲＳ生起基質を含有する試薬Ｒ２とを備える。このキ
ットを用いれば、本発明の遺伝子の分析が、さらに迅速
かつ簡単に実施できるようになる。
【００２５】
【発明の実施の形態】つぎに、本発明の遺伝子の分析方
法の実施の形態について説明する。
法の実施の形態について説明する。
【００２６】図７に、本発明を、ＰＣＲを行った試料に
適用した例を示す。この図では、右側にターゲットＤＮ
Ａが存在しない試料についてＰＣＲを行った例を、左側
にターゲットＤＮＡを含む試料についてＰＣＲを行った
例をそれぞれ示す。
適用した例を示す。この図では、右側にターゲットＤＮ
Ａが存在しない試料についてＰＣＲを行った例を、左側
にターゲットＤＮＡを含む試料についてＰＣＲを行った
例をそれぞれ示す。
【００２７】まず、同図（ａ）に示すように、ＤＮＡ試
料を準備する。この試料には、ＤＮＡの他に、２つのプ
ライマー１、２と、ＤＮＡポリメラーゼ（図示せず）お
よびデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄ
ＮＴＰ、図示せず）が添加されている。そして、この試
料を加熱すると、ＤＮＡが熱変性して一本鎖ＤＮＡに解
離する。そして、試料を冷却すると、ターゲットＤＮＡ
にはプライマー１、２が相補的に結合するが、ターゲッ
トＤＮＡ以外には結合しない。そして、ＤＮＡポリメラ
ーゼの作用により、同図（ｂ）に示すように、ターゲッ
トＤＮＡでは伸長反応が起るが、ターゲットＤＮＡ以外
では、プライマーが結合していないため、伸長反応は起
らない。そして、前記の一連の操作を約２０〜３０回繰
り返すと同図（ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡは
大量に増幅されるが、ターゲットＤＮＡを含まない系で
は全く増幅されない。
料を準備する。この試料には、ＤＮＡの他に、２つのプ
ライマー１、２と、ＤＮＡポリメラーゼ（図示せず）お
よびデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄ
ＮＴＰ、図示せず）が添加されている。そして、この試
料を加熱すると、ＤＮＡが熱変性して一本鎖ＤＮＡに解
離する。そして、試料を冷却すると、ターゲットＤＮＡ
にはプライマー１、２が相補的に結合するが、ターゲッ
トＤＮＡ以外には結合しない。そして、ＤＮＡポリメラ
ーゼの作用により、同図（ｂ）に示すように、ターゲッ
トＤＮＡでは伸長反応が起るが、ターゲットＤＮＡ以外
では、プライマーが結合していないため、伸長反応は起
らない。そして、前記の一連の操作を約２０〜３０回繰
り返すと同図（ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡは
大量に増幅されるが、ターゲットＤＮＡを含まない系で
は全く増幅されない。
【００２８】そして、同図（ｃ）に示すように、試料に
遺伝子結合性ラマン活性物質（ＳＥＲＳ活性物質）を加
えると、２本鎖ＤＮＡ中にインターカレートされて結合
する。したがって、図示のように、ターゲットＤＮＡの
試料では、二本鎖ＤＮＡが多数存在し、これに前記ラマ
ン活性物質がほぼ全部結合する。これに対し、ターゲッ
トＤＮＡを含まない試料では、二本鎖ＤＮＡがほとんど
存在しないため、前記ラマン活性物質の大部分は、試料
中において遊離状態で存在している。そして、同図
（ｄ）に示すように、ＳＥＲＳ生起基質の一つである銀
コロイドを試料に添加する。すると、図示のように、タ
ーゲットＤＮＡ試料では、前記ラマン活性物質がＤＮＡ
に結合しているため、前記銀コロイドに捕捉されるもの
がなく、あってもわずかであり無視できる。これに対
し、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、ほとんどの
前記ラマン活性物質が遊離状態で存在し、これが前記銀
コロイドに捕捉される。
遺伝子結合性ラマン活性物質（ＳＥＲＳ活性物質）を加
えると、２本鎖ＤＮＡ中にインターカレートされて結合
する。したがって、図示のように、ターゲットＤＮＡの
試料では、二本鎖ＤＮＡが多数存在し、これに前記ラマ
ン活性物質がほぼ全部結合する。これに対し、ターゲッ
トＤＮＡを含まない試料では、二本鎖ＤＮＡがほとんど
存在しないため、前記ラマン活性物質の大部分は、試料
中において遊離状態で存在している。そして、同図
（ｄ）に示すように、ＳＥＲＳ生起基質の一つである銀
コロイドを試料に添加する。すると、図示のように、タ
ーゲットＤＮＡ試料では、前記ラマン活性物質がＤＮＡ
に結合しているため、前記銀コロイドに捕捉されるもの
がなく、あってもわずかであり無視できる。これに対
し、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、ほとんどの
前記ラマン活性物質が遊離状態で存在し、これが前記銀
コロイドに捕捉される。
【００２９】そして、この状態で、前記ラマン活性物質
に励起光を照射すると、ターゲットＤＮＡ試料では、Ｓ
ＥＲＳ光が微弱あるいは観測されず、一方、ターゲット
ＤＮＡを含まない試料では、強いＳＥＲＳ光が観測され
る。
に励起光を照射すると、ターゲットＤＮＡ試料では、Ｓ
ＥＲＳ光が微弱あるいは観測されず、一方、ターゲット
ＤＮＡを含まない試料では、強いＳＥＲＳ光が観測され
る。
【００３０】換言すると、強いＳＥＲＳ光が観測された
試料中には、ターゲットＤＮＡが存在しないと判断で
き、ＳＥＲＳ光が微弱あるいは観測されない試料中に
は、ターゲットＤＮＡが存在すると判断できる。
試料中には、ターゲットＤＮＡが存在しないと判断で
き、ＳＥＲＳ光が微弱あるいは観測されない試料中に
は、ターゲットＤＮＡが存在すると判断できる。
【００３１】このように、本発明によれば、従来の電気
泳動法のように、泳動ゲルや緩衝液の調製等の繁雑な操
作を必要とせず、短時間で遺伝子の分析を行うことがで
きる。
泳動法のように、泳動ゲルや緩衝液の調製等の繁雑な操
作を必要とせず、短時間で遺伝子の分析を行うことがで
きる。
【００３２】なお、前記励起光の照射およびＳＥＲＳ光
の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用いて行うこ
とができる。また、測定条件は、用いるラマン活性物質
およびその添加量並びに遺伝子の濃度等により適宜決定
されるが、アルゴンイオンレーザーの強度は、通常、５
ｍＷ〜１００ｍＷである。また、ＳＥＲＳ生起基質は、
ラマン活性物質よりも過剰であることが好ましい。
の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用いて行うこ
とができる。また、測定条件は、用いるラマン活性物質
およびその添加量並びに遺伝子の濃度等により適宜決定
されるが、アルゴンイオンレーザーの強度は、通常、５
ｍＷ〜１００ｍＷである。また、ＳＥＲＳ生起基質は、
ラマン活性物質よりも過剰であることが好ましい。
【００３３】そして、本発明の遺伝子の分析方法では、
遺伝子と前記ラマン活性物質との重量比について予め検
討をおこない、目的とする遺伝子が存在する場合のＳＥ
ＲＳ光強度と存在しない場合の強度とが明確に区別でき
るようにすることが好ましい。前記重量比は、分析対象
となる遺伝子および前記ラマン活性物質の種類等により
適宜決定されるものである。例えば、分析対象の遺伝子
が二本鎖ＤＮＡであり前記ラマン活性物質がＤＡＰＩで
ある場合、その重量比は、通常、ＤＮＡ／ＤＡＰＩ＝
０．１〜０．５である。
遺伝子と前記ラマン活性物質との重量比について予め検
討をおこない、目的とする遺伝子が存在する場合のＳＥ
ＲＳ光強度と存在しない場合の強度とが明確に区別でき
るようにすることが好ましい。前記重量比は、分析対象
となる遺伝子および前記ラマン活性物質の種類等により
適宜決定されるものである。例えば、分析対象の遺伝子
が二本鎖ＤＮＡであり前記ラマン活性物質がＤＡＰＩで
ある場合、その重量比は、通常、ＤＮＡ／ＤＡＰＩ＝
０．１〜０．５である。
【００３４】つぎに、本発明の遺伝子分析用キットは、
遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１および
ＳＥＲＳ生起基質を含有する試薬Ｒ２を備える。
遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１および
ＳＥＲＳ生起基質を含有する試薬Ｒ２を備える。
【００３５】前記試薬Ｒ１は、前記ラマン活性物質の他
に、他の成分を含有してもよい。また、前記試薬Ｒ２
も、前記ＳＥＲＳ生起基質の他に、例えば、ポリリン
酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロ
リドン（ＰＶＰ）、界面活性剤等の安定化剤を含有して
もよい。
に、他の成分を含有してもよい。また、前記試薬Ｒ２
も、前記ＳＥＲＳ生起基質の他に、例えば、ポリリン
酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロ
リドン（ＰＶＰ）、界面活性剤等の安定化剤を含有して
もよい。
【００３６】本発明の遺伝子分析用キットの使用方法
は、前述の方法と同様である。このキットを用いれば、
予め必要な成分が適量配合されているため、従来のよう
に分析の度に試薬を調製する必要がなくなり、さらに迅
速かつ簡単な遺伝子の分析が可能となる。
は、前述の方法と同様である。このキットを用いれば、
予め必要な成分が適量配合されているため、従来のよう
に分析の度に試薬を調製する必要がなくなり、さらに迅
速かつ簡単な遺伝子の分析が可能となる。
【００３７】なお、以上の説明において、ＰＣＲにより
増幅された二本鎖ＤＮＡを分析対象遺伝子とした例をと
りあげたが、本発明はこれに限定するものではなく、こ
の他、ＳＤＡ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＬＣＲ
法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｑβ法によ
り増幅されたＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの
複合体にも適用が可能である。これらの遺伝子を分析す
る場合も、分析対象の遺伝子に合わせて遺伝子結合性ラ
マン活性物質を適宜選択して使用する他は、前述と同様
の操作を行えばよく、これにより迅速かつ簡単なＲＮＡ
等の遺伝子の分析ができる。
増幅された二本鎖ＤＮＡを分析対象遺伝子とした例をと
りあげたが、本発明はこれに限定するものではなく、こ
の他、ＳＤＡ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＬＣＲ
法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｑβ法によ
り増幅されたＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの
複合体にも適用が可能である。これらの遺伝子を分析す
る場合も、分析対象の遺伝子に合わせて遺伝子結合性ラ
マン活性物質を適宜選択して使用する他は、前述と同様
の操作を行えばよく、これにより迅速かつ簡単なＲＮＡ
等の遺伝子の分析ができる。
【００３８】
【実施例】つぎに、実施例について比較例と併せて説明
する。
する。
【００３９】（実施例１）まず、以下に示す成分を精製
水に溶解してＰＣＲバッファーを調製した。
水に溶解してＰＣＲバッファーを調製した。
【００４０】（ＰＣＲバッファー組成） Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １００ｍＭ ＫＣｌ ５００ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ
【００４１】そして、このＰＣＲバッファー１０μｌに
下記に示す成分を添加して、ＰＣＲ反応液を調製した。
なお、下記のプライマー１、２は、下記のλＤＮＡに対
し相補的配列を持つものである。
下記に示す成分を添加して、ＰＣＲ反応液を調製した。
なお、下記のプライマー１、２は、下記のλＤＮＡに対
し相補的配列を持つものである。
【００４２】 （配合成分） ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、２．５ｍＭ）：８μｌ プライマー１（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：１μｌ 配列：5´−GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT−3´ プライマー２（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：１μｌ 配列：5´−CCACATCCATACCGGGTTTCAC−3´ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／μｌ）：０．５μｌ ＤＮＡ（λＤＮＡ、１μｇ／ｍｌ）：１μｌ 蒸留水：７８．５μｌ
【００４３】そして、このＰＣＲ反応液を用い、以下の
サイクルでＰＣＲを行った。
サイクルでＰＣＲを行った。
【００４４】（ＰＣＲサイクル） ステップａ（９４℃１０分）：１サイクル ステップｂ（９４℃１分）→ステップｃ（６８℃４
分）：３０サイクル ステップｄ（６８℃７分）：１サイクル
分）：３０サイクル ステップｄ（６８℃７分）：１サイクル
【００４５】つぎに、ＤＮＡ精製を行った。すなわち、
まず、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動
（１５０ｍＡ，２時間）にかけ、目的のＤＮＡ画分を分
離した。そして、目的とするＤＮＡのバンドがあるゲル
部分を切り出した。切り出したゲルを、ＴＢＥバッファ
ーとともに透析チューブに入れてチューブの両端をシー
ラーで閉じた。この透析チューブを、その長軸が電場の
方向と直角方向になるように電気泳動槽内に設置し、槽
内をＴＢＥバッファーで満たし、通電した（１５０ｍ
Ａ、３時間）。通電終了後、透析チューブ内のＴＢＥバ
ッファーを回収し、これを遠心管に移し、エタノール沈
殿を行った。そして得られた沈殿を蒸留水に溶解し、こ
れを精製ＤＮＡ試料とした。
まず、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動
（１５０ｍＡ，２時間）にかけ、目的のＤＮＡ画分を分
離した。そして、目的とするＤＮＡのバンドがあるゲル
部分を切り出した。切り出したゲルを、ＴＢＥバッファ
ーとともに透析チューブに入れてチューブの両端をシー
ラーで閉じた。この透析チューブを、その長軸が電場の
方向と直角方向になるように電気泳動槽内に設置し、槽
内をＴＢＥバッファーで満たし、通電した（１５０ｍ
Ａ、３時間）。通電終了後、透析チューブ内のＴＢＥバ
ッファーを回収し、これを遠心管に移し、エタノール沈
殿を行った。そして得られた沈殿を蒸留水に溶解し、こ
れを精製ＤＮＡ試料とした。
【００４６】つぎに、得られた精製ＤＮＡ試料２５μｌ
にＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０-4ｍｏｌ／ｌ）１５μｌ
を加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液
（濃度：０．１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、測
定試料を調製した。そして、この測定試料について、ア
ルゴンイオンレーザー（レーザー強度：５０ｍＷ）を用
い、励起波長５１４．５ｎｍ、露光時間５秒の条件でＳ
ＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図１のグラフの
曲線（ａ）に示す。
にＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０-4ｍｏｌ／ｌ）１５μｌ
を加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液
（濃度：０．１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、測
定試料を調製した。そして、この測定試料について、ア
ルゴンイオンレーザー（レーザー強度：５０ｍＷ）を用
い、励起波長５１４．５ｎｍ、露光時間５秒の条件でＳ
ＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図１のグラフの
曲線（ａ）に示す。
【００４７】なお、図１において、グラフの縦軸のＳＥ
ＲＳ強度は、ＳＥＲＳ光の強度を示し、横軸の波数は、
ＳＥＲＳ光の波数を示す。図２、図３、図４および図６
のグラフも同様である。
ＲＳ強度は、ＳＥＲＳ光の強度を示し、横軸の波数は、
ＳＥＲＳ光の波数を示す。図２、図３、図４および図６
のグラフも同様である。
【００４８】（比較例１）ＤＮＡに代えて、蒸留水１μ
ｌを用いた他は、実施例１と同様にしてＰＣＲを行い、
実施例１と同様にして、ＳＥＲＳ光の測定を行った。そ
の結果を、図１のグラフの曲線（ｂ）に示す。
ｌを用いた他は、実施例１と同様にしてＰＣＲを行い、
実施例１と同様にして、ＳＥＲＳ光の測定を行った。そ
の結果を、図１のグラフの曲線（ｂ）に示す。
【００４９】（対照１，２）前記混合液に代えて、ＤＡ
ＰＩ水溶液（濃度：１０-5ｍｏｌ／ｌ）４０μｌを用い
た例を対照１とし、また二本鎖ＤＮＡ水溶液４０μｌの
みを用いた例を対照２とした。これら対照１、２のその
他の条件および操作は、前記実施例と同様である。前記
対照１の結果を図３のグラフに、前記対照２の結果を図
４のグラフに示す。
ＰＩ水溶液（濃度：１０-5ｍｏｌ／ｌ）４０μｌを用い
た例を対照１とし、また二本鎖ＤＮＡ水溶液４０μｌの
みを用いた例を対照２とした。これら対照１、２のその
他の条件および操作は、前記実施例と同様である。前記
対照１の結果を図３のグラフに、前記対照２の結果を図
４のグラフに示す。
【００５０】以上の実施例１、比較例１、対照１、２か
らつぎのことがいえる。まず、図１のグラフの曲線
（ａ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅された
実施例１では、ほぼ全部のＤＡＰＩがＤＮＡにインター
カレートされて極微量のＤＡＰＩしか銀コロイドに捕捉
されないため、ＳＥＲＳ光が弱かった。これに対し、同
図のグラフの曲線（ｂ）に示すように、ＰＣＲによりＤ
ＮＡが増幅されなかった比較例１では、ほぼ全部のＤＡ
ＰＩが銀コロイドに捕捉されて、強いＳＥＲＳ光が測定
できた。なお、この比較例１のＳＥＲＳ光のピークは、
図３のグラフに示す対照１のピークと一致した。また、
図４のグラフに示すように、ＤＮＡのみの場合（対照
２）では、ＳＥＲＳ光が測定できなかった。これらの結
果から、本発明の遺伝子の分析方法により、ＰＣＲ法に
よりＤＮＡが複製されたか否かが、迅速かつ簡単に判別
できるといえる。
らつぎのことがいえる。まず、図１のグラフの曲線
（ａ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅された
実施例１では、ほぼ全部のＤＡＰＩがＤＮＡにインター
カレートされて極微量のＤＡＰＩしか銀コロイドに捕捉
されないため、ＳＥＲＳ光が弱かった。これに対し、同
図のグラフの曲線（ｂ）に示すように、ＰＣＲによりＤ
ＮＡが増幅されなかった比較例１では、ほぼ全部のＤＡ
ＰＩが銀コロイドに捕捉されて、強いＳＥＲＳ光が測定
できた。なお、この比較例１のＳＥＲＳ光のピークは、
図３のグラフに示す対照１のピークと一致した。また、
図４のグラフに示すように、ＤＮＡのみの場合（対照
２）では、ＳＥＲＳ光が測定できなかった。これらの結
果から、本発明の遺伝子の分析方法により、ＰＣＲ法に
よりＤＮＡが複製されたか否かが、迅速かつ簡単に判別
できるといえる。
【００５１】（実施例２）実施例１と同様にしてＰＣＲ
を行い、得られたＰＣＲ産物についてＤＮＡ精製を行っ
た。そして、得られた精製ＤＮＡ試料３５μｌにＤＡＰ
Ｉ水溶液（濃度：１０-4ｍｏｌ／ｌ）５μｌを加えて混
合した。この混合液に、銀コロイド水溶液（濃度：０．
１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、測定試料を調製
した。そして、この測定試料について、アルゴンイオン
レーザー（レーザー強度：５０ｍＷ）を用い、励起波長
５１４．５ｎｍ、露光時間５秒の条件でＳＥＲＳ光の測
定を行った。その結果を、図２のグラフの曲線（ａ）に
示す。
を行い、得られたＰＣＲ産物についてＤＮＡ精製を行っ
た。そして、得られた精製ＤＮＡ試料３５μｌにＤＡＰ
Ｉ水溶液（濃度：１０-4ｍｏｌ／ｌ）５μｌを加えて混
合した。この混合液に、銀コロイド水溶液（濃度：０．
１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、測定試料を調製
した。そして、この測定試料について、アルゴンイオン
レーザー（レーザー強度：５０ｍＷ）を用い、励起波長
５１４．５ｎｍ、露光時間５秒の条件でＳＥＲＳ光の測
定を行った。その結果を、図２のグラフの曲線（ａ）に
示す。
【００５２】（比較例２）ＤＮＡに代えて、蒸留水１μ
ｌを用いた他は、実施例２と同様にしてＰＣＲおよびＤ
ＮＡ精製を行い、ついで実施例２と同様にしてＳＥＲＳ
光の測定を行った。その結果を、図２のグラフの曲線
（ｂ）に示す。
ｌを用いた他は、実施例２と同様にしてＰＣＲおよびＤ
ＮＡ精製を行い、ついで実施例２と同様にしてＳＥＲＳ
光の測定を行った。その結果を、図２のグラフの曲線
（ｂ）に示す。
【００５３】以上の実施例２および比較例２の結果から
つぎのことがいえる。まず、図２のグラフの曲線（ａ）
に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅された実施例
２では、ＤＡＰＩがＤＮＡにほぼ完全にインターカレー
トされて銀コロイドに捕捉されないため、ＳＥＲＳ光が
検出できなかった。これに対し、同図のグラフの曲線
（ｂ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅されな
かった比較例２では、ほぼ全部のＤＡＰＩが銀コロイド
に捕捉されて、強いＳＥＲＳ光が測定できた。
つぎのことがいえる。まず、図２のグラフの曲線（ａ）
に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅された実施例
２では、ＤＡＰＩがＤＮＡにほぼ完全にインターカレー
トされて銀コロイドに捕捉されないため、ＳＥＲＳ光が
検出できなかった。これに対し、同図のグラフの曲線
（ｂ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅されな
かった比較例２では、ほぼ全部のＤＡＰＩが銀コロイド
に捕捉されて、強いＳＥＲＳ光が測定できた。
【００５４】（実施例３）混合液として、種々濃度のＤ
ＮＡ水溶液２５μｌにＤＡＰＩ水溶液１５μｌを加えて
混合したものを用いた他は、実施例１と同様にしてＳＥ
ＲＳ光の測定を行った。その結果を図５のグラフに示
す。なお、この図において、縦軸のＳＥＲＳ強度はＳＥ
ＲＳ光の強度であり、横軸はＤＮＡ濃度である。
ＮＡ水溶液２５μｌにＤＡＰＩ水溶液１５μｌを加えて
混合したものを用いた他は、実施例１と同様にしてＳＥ
ＲＳ光の測定を行った。その結果を図５のグラフに示
す。なお、この図において、縦軸のＳＥＲＳ強度はＳＥ
ＲＳ光の強度であり、横軸はＤＮＡ濃度である。
【００５５】図５のグラフに示すように、ＤＮＡの濃度
が増加するにしたがいＳＥＲＳ光の強度が直線的に低下
した。このグラフは、検量線として使用できるため、こ
れを用いれば、例えば、ＰＣＲ法において目的ＤＮＡの
増幅の判別のみならず、ＰＣＲ産物中のＤＮＡ濃度も測
定することが可能となる。
が増加するにしたがいＳＥＲＳ光の強度が直線的に低下
した。このグラフは、検量線として使用できるため、こ
れを用いれば、例えば、ＰＣＲ法において目的ＤＮＡの
増幅の判別のみならず、ＰＣＲ産物中のＤＮＡ濃度も測
定することが可能となる。
【００５６】（実施例４、比較例２）実施例４では、Ｄ
ＮＡの精製を行わないＰＣＲ産物についてＳＥＲＳ光の
測定を行った他は、実施例１と同じ条件で同じ操作を行
った。その結果を、図６のグラフの曲線（ａ）に示す。
ＮＡの精製を行わないＰＣＲ産物についてＳＥＲＳ光の
測定を行った他は、実施例１と同じ条件で同じ操作を行
った。その結果を、図６のグラフの曲線（ａ）に示す。
【００５７】他方、比較例２では、ＤＮＡの精製を行わ
ないＰＣＲ産物についてＳＥＲＳ光の測定を行った他
は、比較例１と同じ条件で同じ操作を行った。その結果
を、図６のグラフの曲線（ｂ）に示す。
ないＰＣＲ産物についてＳＥＲＳ光の測定を行った他
は、比較例１と同じ条件で同じ操作を行った。その結果
を、図６のグラフの曲線（ｂ）に示す。
【００５８】図６のグラフに示すように、ＤＮＡが大量
に存在する実施例４のＳＥＲＳ光とＤＮＡがほとんど存
在しない比較例２のＳＥＲＳ光とを明確に区別すること
ができる。このことから、本発明の遺伝子の分析方法に
よれば、ＤＮＡ精製を行わないＰＣＲ産物であっても、
遺伝子（ＤＮＡ）の分析が可能であるといえる。
に存在する実施例４のＳＥＲＳ光とＤＮＡがほとんど存
在しない比較例２のＳＥＲＳ光とを明確に区別すること
ができる。このことから、本発明の遺伝子の分析方法に
よれば、ＤＮＡ精製を行わないＰＣＲ産物であっても、
遺伝子（ＤＮＡ）の分析が可能であるといえる。
【００５９】
【発明の効果】以上のように、本発明の遺伝子の分析方
法は、電気泳動法等による従来の遺伝子の検出方法と比
べて、迅速かつ簡単に遺伝子の分析を行うことができ
る。このため、本発明の分析方法を、例えば、ＰＣＲ法
に適用すれば、目的とするＤＮＡの増幅を短時間で簡単
に確認することができ、つぎの段階の実験への移行を判
断することができる。また、本発明の分析方法は、精製
を行わないＰＣＲ産物のように、他の物質が混在してい
る試料であっても、遺伝子の分析が可能である。そし
て、本発明の分析方法は、その操作が単純であるため、
分析を自動化することが可能であり、これによりさらに
迅速かつ簡単に遺伝子の分析ができるようになる。
法は、電気泳動法等による従来の遺伝子の検出方法と比
べて、迅速かつ簡単に遺伝子の分析を行うことができ
る。このため、本発明の分析方法を、例えば、ＰＣＲ法
に適用すれば、目的とするＤＮＡの増幅を短時間で簡単
に確認することができ、つぎの段階の実験への移行を判
断することができる。また、本発明の分析方法は、精製
を行わないＰＣＲ産物のように、他の物質が混在してい
る試料であっても、遺伝子の分析が可能である。そし
て、本発明の分析方法は、その操作が単純であるため、
分析を自動化することが可能であり、これによりさらに
迅速かつ簡単に遺伝子の分析ができるようになる。
【図１】本発明の一実施例のＳＥＲＳ光のグラフであ
る。
る。
【図２】本発明のその他の実施例のＳＥＲＳ光のグラフ
である。
である。
【図３】ＤＡＰＩのみのＳＥＲＳ光のグラフである。
【図４】ＤＮＡのみのＳＥＲＳ光のグラフである。
【図５】本発明のさらにその他の実施例におけるＳＥＲ
Ｓ光とＤＮＡ濃度の関係を示すグラフである。
Ｓ光とＤＮＡ濃度の関係を示すグラフである。
【図６】本発明のさらにその他の実施例のＳＥＲＳ光の
グラフである。
グラフである。
【図７】図（ａ）〜（ｂ）は、本発明の遺伝子の分析方
法をＰＣＲに適用した場合の実施例の一連の操作を示す
説明図である。
法をＰＣＲに適用した場合の実施例の一連の操作を示す
説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竇 暁鳴 京都府京都市南区東九条西明田町57番地 株式会社京都第一科学内
Claims (11)
- 【請求項１】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活
性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前
記試料に前記遺伝子結合性ラマン活性物質および前記表
面増強ラマン散乱生起基質を供給し、遺伝子に結合しな
かった前記遺伝子結合性ラマン活性物質を前記表面増強
ラマン散乱生起基質で捕捉し、この状態で前記遺伝子結
合性ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増
強ラマン散乱光を測定する遺伝子の分析方法。 - 【請求項２】 分析対象となる遺伝子が二本鎖デオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）である請求項１記載の遺伝子の分析
方法。 - 【請求項３】 分析対象試料が、ポリメラーゼチェーン
リアクション（ＰＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行
った試料、ストランド ディスプレースメントアンプリ
フィケーション法（ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作
を行った試料およびリガーゼチェーンリアクション（Ｌ
ＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料から選択
された少なくとも一つの試料である請求項１または２記
載の遺伝子の分析方法。 - 【請求項４】 分析対象となる遺伝子が、リボ核酸（Ｒ
ＮＡ）である請求項１記載の遺伝子の分析方法。 - 【請求項５】 分析対象試料が、Ｑβレプリカーゼを用
いたＲＮＡの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操
作を行った試料である請求項１または４記載の遺伝子の
分析方法。 - 【請求項６】 分析対象となる遺伝子が、一本鎖ＤＮＡ
である請求項１記載の遺伝子の分析方法。 - 【請求項７】 分析対象となる遺伝子が、ＲＮＡとＤＮ
Ａの複合体である請求項１記載の遺伝子の分析方法。 - 【請求項８】 遺伝子結合性ラマン活性物質が、４´，
６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、エチジウム
ブロマイド、ビスベンゾイミドおよびアクリジンオレン
ジからなる群から選択された少なくとも一つの物質であ
る請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方
法。 - 【請求項９】 遺伝子結合性ラマン活性物質が、エチジ
ウムブロマイド、チアゾールオレンジ、ビスベンゾイミ
ドおよびアクリジンオレンジからなる群から選択された
少なくとも一つである請求項１、４および５のいずれか
一項に記載の遺伝子の分析方法。 - 【請求項１０】 表面増強ラマン散乱生起基質が、銀コ
ロイド、金コロイド、銅コロイド、電極および金属板か
らなる群から選択された少なくとも一つの基質である請
求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。 - 【請求項１１】 遺伝子結合性ラマン活性物質を含有す
る試薬Ｒ１と、表面増強ラマン散乱生起基質を含有する
試薬Ｒ２とを備える遺伝子分析用キット。
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| US5866430A (en) * | 1996-06-13 | 1999-02-02 | Grow; Ann E. | Raman optrode processes and devices for detection of chemicals and microorganisms |
| US5864397A (en) * | 1997-09-15 | 1999-01-26 | Lockheed Martin Energy Research Corporation | Surface-enhanced raman medical probes and system for disease diagnosis and drug testing |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6849402B1 (en) * | 1998-04-01 | 2005-02-01 | Wolfrum Juergen | Method and device to quantify DNA and RNA |
| JP2003511557A (ja) * | 1999-10-06 | 2003-03-25 | サーロメッド・インコーポレーテッド | 表面増強分光法−活性複合体ナノ粒子 |
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