JPH10117797A - 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット - Google Patents

遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット

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JPH10117797A
JPH10117797A JP8284153A JP28415396A JPH10117797A JP H10117797 A JPH10117797 A JP H10117797A JP 8284153 A JP8284153 A JP 8284153A JP 28415396 A JP28415396 A JP 28415396A JP H10117797 A JPH10117797 A JP H10117797A
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利夫 高間
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かおる 王
Masao Kono
昌雄 河野
Giyoumei Toku
暁鳴 竇
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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法を提供す
る。 【解決手段】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活
性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前
記試料に、遺伝子結合性ラマン活性物質を供給し、つい
でこの試料に表面増強ラマン散乱生起基質を供給して遺
伝子に結合しなかった遺伝子結合性ラマン活性物質を捕
捉し、この状態で前記ラマン活性物質に励起光を照射
し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定して遺伝子を
分析する。分析対象となる遺伝子が二本鎖DNAの場
合、前記遺伝子結合性ラマン活性物質としては、4´,
6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)
がある。また、前記表面増強ラマン散乱生起基質として
は銀コロイドがある。図1のグラフの曲線(a)に示す
ように、DNAが存在すると表面増強ラマン散乱光が微
弱になる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子、すなわち
デオキシリボ核酸(以下「DNA」という)およびリボ
核酸(以下「RNA」という)の分析方法に関し、詳し
くは、表面増強ラマン散乱(以下「SERS」という)
測定により短時間で簡単に遺伝子の分析を行うことが可
能な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用
キットに関する。
【0002】
【従来の技術】近年の遺伝子工学に関する技術の革新は
目覚ましく、特に、ポリメラーゼチェーンリアクション
(PCR)法の開発により、目的とするDNAの大量複
製が可能となった。
【0003】PCR法は、DNAポリメラーゼがプライ
マーなしでは働かないという原理に基づくものであり、
試料中のDNAを熱で変性させて一本鎖とし、ついで温
度を下げてプライマーを結合させ、この状態で耐熱性D
NAポリメラーゼによりDNA合成するという、一連の
サイクルを繰り返すことにより、DNAを大量に増幅さ
せるものである。したがって、特定のプライマーを予め
化学合成等により準備して用いれば、目的とするDNA
を大量に調製することができる。ここで、目的とするD
NAが調製されたか否かの判断は、従来、PCRを行っ
た試料を電気泳動にかけて目的とするDNAのバンドの
確認により行われることが一般的であった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、電気泳
動による分析は、その操作に時間がかかり、かつ煩雑で
あるという問題があった。すなわち、電気泳動の担体と
なるゲルを予め調製する作業があり、PCRを行った試
料を、DNAの大きさにより予め選択する必要がある。
また、電気泳動法は、通常、約75分の長時間を必要と
し、迅速性に欠ける。そして、遺伝子を迅速かつ簡単に
検出し測定することは、PCR法のみならず、DNA等
の遺伝子を分析する分野に共通する課題となっている。
【0005】そこで、本発明は、前記従来の問題を解決
し、迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法およびそれに用い
る遺伝子分析用キットの提供をその目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と、遺
伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起
基質とを準備し、前記試料に、前記遺伝子結合性ラマン
活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給
し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活
性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質により捕捉
し、この状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起
光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定する
という構成をとる。
【0007】このように、本発明は、遺伝子結合性ラマ
ン活性物質が発生するSERS光を測定することによ
り、迅速かつ簡単な遺伝子の分析を可能にするものであ
る。ラマン活性物質の中には、DNA等の遺伝子に特異
的に結合するものがある。この遺伝子結合性ラマン活性
物質を、分析対象試料に添加すると、前記試料中に遺伝
子が存在すれば、これに前記ラマン活性物質が結合する
ことになる。そして、この試料にSERS生起基質を添
加すれば、遺伝子と結合していない前記ラマン活性物質
のみが、前記SERS生起基質に捕捉されることとな
る。この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射す
れば、前記SERS生起基質に捕捉された前記ラマン活
性物質だけがSERS光を発し、遺伝子に結合した前記
ラマン活性物質は、SERS光を生じない。したがっ
て、分析対象試料中の遺伝子量に反比例したSERS光
が検出でき、これにより前記試料中の遺伝子の検出およ
びその量を測定することができる。
【0008】なお、本発明の遺伝子の分析方法におい
て、前記試料に対する前記遺伝子結合性ラマン活性物質
および表面増強ラマン散乱生起基質の供給順序は特に限
定するものではなく、前記両者を同時に供給してもよ
く、若しくは前記遺伝子結合性ラマン活性物質を供給し
た後、前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給してもよ
い。
【0009】そして、この分析方法では、前記ラマン活
性物質および前記SERS生起基質の添加、励起光の照
射およびSERS光の測定という単純な操作により構成
されているため、簡単な分析方法となっている。また、
遺伝子への前記ラマン活性物質の結合および前記SER
S生起基質による前記ラマン活性物質の捕捉は、極めて
短時間で起り、またSERS光の測定も、約1〜2秒の
極めて短い時間で行うことができるため、本発明の遺伝
子の分析方法は、分析操作全体を短時間に行うことがで
きる。
【0010】なお、本発明において、「ラマン活性」と
は、励起光を照射すればラマン散乱若しくはSERSが
生じることをいい、「遺伝子結合性ラマン活性物質」と
は前記ラマン活性を有する物質のなかで、遺伝子に結合
する性質を有するものをいう。また、「表面増強ラマン
散乱生起基質」とは、その表面に物質を捕捉してラマン
散乱を増強させる性質を有する物質をいう。前記捕捉の
手段としては、例えば、吸着現象を利用する方法や、電
位をかけて電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と
反応結合する官能基を備えたSERS生起基質に反応さ
せる方法がある。
【0011】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象となる遺伝子としては、例えば、一本鎖DNA、二
本鎖DNA、RNA、RNAとDNAの複合体がある。
そして、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と
して、PCR法によりDNAの増幅操作を行った試料
(PCR産物)またはDNA試料を用いる場合に有効な
分析方法となる。先に述べたように、PCR法は目的と
するDNAを増幅する方法であるが、試料中に目的とす
るDNAがない場合にはPCR産物中のDNA量は微量
なものとなる。したがって、PCR産物を分析対象試料
として本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、SER
S光を測定することにより、短時間で簡単に目的DNA
が増幅されたか否かが確認できる。また、予め検量線を
作成しておけば、増幅されたDNA量を測定することも
できる。
【0012】この他に、ストランド ディスプレースメ
ント アンプリフィケーション法(Strand di
splacement amplification、
SDA法)によりDNAの増幅操作を行った試料、リガ
ーゼチェーンリアクション(LCR)法によりDNAの
増幅操作を行った試料、Qβレプリカーゼを用いたRN
Aの増幅方法(Qβ法)によりRNAの増幅操作を行っ
た試料にも、本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、
PCR法の場合と同様に、好結果を得ることができる。
【0013】なお、前記SDA法としては、Nucle
ic Acids Research,Vol.20.
No.7 1691−1696に記載の方法があげられ
る。
【0014】また、前記LCR法とは、94℃でも熱変
性しない耐熱性DNAリガーゼを使用することに特徴を
有するDNA増幅法であり、この方法は、ミスマッチを
もたない正常人のDNA試料の場合には用いた2種類の
オリゴヌクレオチドがDNAリガーゼによって接続さ
れ、つぎの反応サイクルの基質となって次々と増幅され
るのに対し、ミスマッチをもつ場合は接続されないため
そこで反応が止まってしまうという原理に基づく。
【0015】また、前記Qβ法は、RNAレプリカーゼ
の一種で基質となるRNAと特異性が高いQβレプリカ
ーゼを用いてRNAを増幅する方法である。具体的に
は、まず、T7 RNAポリメラーゼのプロモーターの
下流にMDV−1・RNA(DNA化したもの)をつな
いだプラスミドベクターを据え、増幅したいDNA断片
をMDV−1の間に挿入する(20〜800bp程度が
挿入可能)。つぎに、制限酵素で切断してからT7 R
NAポリメラーゼを働かせ、これをRNA化する。挿入
断片を含んだMDV−1・RNAは、以後のQβレプリ
カーゼによる複製サイクルを繰り返すことにより増幅さ
せることができる。
【0016】さらに、本発明の遺伝子の分析方法の適用
範囲はこれらの試料に限定されず、3SR法、NASB
A法、CPR法、SIR法等によりDNAあるいはRN
Aの増幅操作を行った試料についてもPCR法と同様に
適用することができる。なお、NASBA法はRNAの
増幅方法であり、その他の方法はDNAの増幅方法であ
る。
【0017】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象となる遺伝子が二本鎖DNA(前記二本鎖DNA増
幅試料を含む)である場合、遺伝子結合性ラマン活性物
質としては、例えば、下記の式(化1)で表される4
´,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAP
I)、エチジウムブロマイド(EtBr)、チアゾール
オレンジ、下記の式(化2)で表されるビスベンゾイミ
ド(ヘキスト33258、ヘキスト社製)およびアクリ
ジンオレンジがあげられる。この他に、SYBRGre
en I(商品名、モレキュラープローブス社製)があげ
られる、このなかでも、DAPIが好ましい。これは、
DAPIが二本鎖DNAとより選択的に複合体を形成
し、他の物質、例えばRNAには結合しにくいという性
質を持ち、このため、RNA等の他の物質が混在する試
料であっても、二本鎖DNAを選択的に検出できるから
である。
【0018】
【化1】
【0019】
【化2】
【0020】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象となる遺伝子がRNAの場合(前記RNA増幅試料
を含む)、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例え
ば、EtBr、チアゾールオレンジ、前記式(化2)で
表されるビスベンゾイミド(ヘキスト33258、ヘキ
スト社製)、アクリジンオレンジがあげられる。この他
に、SYBR Green II (商品名、モレキュラー
プローブス社製)もあげられる。このなかで、SYBR
Green II が、よりRNAと選択的に複合体を形
成する。
【0021】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象の遺伝子が一本鎖DNAの場合、遺伝子結合性ラマ
ン活性物質としては、前記SYBR Green II が
あげられる。
【0022】本発明の遺伝子の分析方法において、分析
対象の遺伝子がRNAとDNAの複合体の場合、遺伝子
結合性ラマン活性物質としては、例えば、先に述べた、
DNA結合性ラマン活性物質、RNA結合性ラマン活性
物質を使用できる。
【0023】本発明の遺伝子の分析方法において、SE
RS生起基質としては、例えば、銀コロイド、金コロイ
ド、銅コロイド、電極、金属板があげられ、このなかで
も、作製が簡単で取扱いが容易であることから、銀コロ
イド、金コロイド等の金属コロイドが好ましい。
【0024】そして、本発明の遺伝子分析用キットは、
遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬R1と、S
ERS生起基質を含有する試薬R2とを備える。このキ
ットを用いれば、本発明の遺伝子の分析が、さらに迅速
かつ簡単に実施できるようになる。
【0025】
【発明の実施の形態】つぎに、本発明の遺伝子の分析方
法の実施の形態について説明する。
【0026】図7に、本発明を、PCRを行った試料に
適用した例を示す。この図では、右側にターゲットDN
Aが存在しない試料についてPCRを行った例を、左側
にターゲットDNAを含む試料についてPCRを行った
例をそれぞれ示す。
【0027】まず、同図(a)に示すように、DNA試
料を準備する。この試料には、DNAの他に、2つのプ
ライマー1、2と、DNAポリメラーゼ(図示せず)お
よびデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート(d
NTP、図示せず)が添加されている。そして、この試
料を加熱すると、DNAが熱変性して一本鎖DNAに解
離する。そして、試料を冷却すると、ターゲットDNA
にはプライマー1、2が相補的に結合するが、ターゲッ
トDNA以外には結合しない。そして、DNAポリメラ
ーゼの作用により、同図(b)に示すように、ターゲッ
トDNAでは伸長反応が起るが、ターゲットDNA以外
では、プライマーが結合していないため、伸長反応は起
らない。そして、前記の一連の操作を約20〜30回繰
り返すと同図(b)に示すように、ターゲットDNAは
大量に増幅されるが、ターゲットDNAを含まない系で
は全く増幅されない。
【0028】そして、同図(c)に示すように、試料に
遺伝子結合性ラマン活性物質(SERS活性物質)を加
えると、2本鎖DNA中にインターカレートされて結合
する。したがって、図示のように、ターゲットDNAの
試料では、二本鎖DNAが多数存在し、これに前記ラマ
ン活性物質がほぼ全部結合する。これに対し、ターゲッ
トDNAを含まない試料では、二本鎖DNAがほとんど
存在しないため、前記ラマン活性物質の大部分は、試料
中において遊離状態で存在している。そして、同図
(d)に示すように、SERS生起基質の一つである銀
コロイドを試料に添加する。すると、図示のように、タ
ーゲットDNA試料では、前記ラマン活性物質がDNA
に結合しているため、前記銀コロイドに捕捉されるもの
がなく、あってもわずかであり無視できる。これに対
し、ターゲットDNAを含まない試料では、ほとんどの
前記ラマン活性物質が遊離状態で存在し、これが前記銀
コロイドに捕捉される。
【0029】そして、この状態で、前記ラマン活性物質
に励起光を照射すると、ターゲットDNA試料では、S
ERS光が微弱あるいは観測されず、一方、ターゲット
DNAを含まない試料では、強いSERS光が観測され
る。
【0030】換言すると、強いSERS光が観測された
試料中には、ターゲットDNAが存在しないと判断で
き、SERS光が微弱あるいは観測されない試料中に
は、ターゲットDNAが存在すると判断できる。
【0031】このように、本発明によれば、従来の電気
泳動法のように、泳動ゲルや緩衝液の調製等の繁雑な操
作を必要とせず、短時間で遺伝子の分析を行うことがで
きる。
【0032】なお、前記励起光の照射およびSERS光
の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用いて行うこ
とができる。また、測定条件は、用いるラマン活性物質
およびその添加量並びに遺伝子の濃度等により適宜決定
されるが、アルゴンイオンレーザーの強度は、通常、5
mW〜100mWである。また、SERS生起基質は、
ラマン活性物質よりも過剰であることが好ましい。
【0033】そして、本発明の遺伝子の分析方法では、
遺伝子と前記ラマン活性物質との重量比について予め検
討をおこない、目的とする遺伝子が存在する場合のSE
RS光強度と存在しない場合の強度とが明確に区別でき
るようにすることが好ましい。前記重量比は、分析対象
となる遺伝子および前記ラマン活性物質の種類等により
適宜決定されるものである。例えば、分析対象の遺伝子
が二本鎖DNAであり前記ラマン活性物質がDAPIで
ある場合、その重量比は、通常、DNA/DAPI=
0.1〜0.5である。
【0034】つぎに、本発明の遺伝子分析用キットは、
遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬R1および
SERS生起基質を含有する試薬R2を備える。
【0035】前記試薬R1は、前記ラマン活性物質の他
に、他の成分を含有してもよい。また、前記試薬R2
も、前記SERS生起基質の他に、例えば、ポリリン
酸、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロ
リドン(PVP)、界面活性剤等の安定化剤を含有して
もよい。
【0036】本発明の遺伝子分析用キットの使用方法
は、前述の方法と同様である。このキットを用いれば、
予め必要な成分が適量配合されているため、従来のよう
に分析の度に試薬を調製する必要がなくなり、さらに迅
速かつ簡単な遺伝子の分析が可能となる。
【0037】なお、以上の説明において、PCRにより
増幅された二本鎖DNAを分析対象遺伝子とした例をと
りあげたが、本発明はこれに限定するものではなく、こ
の他、SDA法により増幅された二本鎖DNA、LCR
法により増幅された二本鎖DNA、RNA、Qβ法によ
り増幅されたRNA、一本鎖DNA、RNAとDNAの
複合体にも適用が可能である。これらの遺伝子を分析す
る場合も、分析対象の遺伝子に合わせて遺伝子結合性ラ
マン活性物質を適宜選択して使用する他は、前述と同様
の操作を行えばよく、これにより迅速かつ簡単なRNA
等の遺伝子の分析ができる。
【0038】
【実施例】つぎに、実施例について比較例と併せて説明
する。
【0039】(実施例1)まず、以下に示す成分を精製
水に溶解してPCRバッファーを調製した。
【0040】(PCRバッファー組成) Tris−HCl(pH8.3) 100mM KCl 500mM MgCl2 15mM
【0041】そして、このPCRバッファー10μlに
下記に示す成分を添加して、PCR反応液を調製した。
なお、下記のプライマー1、2は、下記のλDNAに対
し相補的配列を持つものである。
【0042】 (配合成分) dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP、2.5mM):8μl プライマー1(20pmol/μl):1μl 配列:5´−GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT−3´ プライマー2(20pmol/μl):1μl 配列:5´−CCACATCCATACCGGGTTTCAC−3´ TaqDNAポリメラーゼ(50U/μl):0.5μl DNA(λDNA、1μg/ml):1μl 蒸留水:78.5μl
【0043】そして、このPCR反応液を用い、以下の
サイクルでPCRを行った。
【0044】(PCRサイクル) ステップa(94℃10分):1サイクル ステップb(94℃1分)→ステップc(68℃4
分):30サイクル ステップd(68℃7分):1サイクル
【0045】つぎに、DNA精製を行った。すなわち、
まず、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動
(150mA,2時間)にかけ、目的のDNA画分を分
離した。そして、目的とするDNAのバンドがあるゲル
部分を切り出した。切り出したゲルを、TBEバッファ
ーとともに透析チューブに入れてチューブの両端をシー
ラーで閉じた。この透析チューブを、その長軸が電場の
方向と直角方向になるように電気泳動槽内に設置し、槽
内をTBEバッファーで満たし、通電した(150m
A、3時間)。通電終了後、透析チューブ内のTBEバ
ッファーを回収し、これを遠心管に移し、エタノール沈
殿を行った。そして得られた沈殿を蒸留水に溶解し、こ
れを精製DNA試料とした。
【0046】つぎに、得られた精製DNA試料25μl
にDAPI水溶液(濃度:10-4mol/l)15μl
を加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液
(濃度:0.17mg/ml)360μlを加えて、測
定試料を調製した。そして、この測定試料について、ア
ルゴンイオンレーザー(レーザー強度:50mW)を用
い、励起波長514.5nm、露光時間5秒の条件でS
ERS光の測定を行った。その結果を、図1のグラフの
曲線(a)に示す。
【0047】なお、図1において、グラフの縦軸のSE
RS強度は、SERS光の強度を示し、横軸の波数は、
SERS光の波数を示す。図2、図3、図4および図6
のグラフも同様である。
【0048】(比較例1)DNAに代えて、蒸留水1μ
lを用いた他は、実施例1と同様にしてPCRを行い、
実施例1と同様にして、SERS光の測定を行った。そ
の結果を、図1のグラフの曲線(b)に示す。
【0049】(対照1,2)前記混合液に代えて、DA
PI水溶液(濃度:10-5mol/l)40μlを用い
た例を対照1とし、また二本鎖DNA水溶液40μlの
みを用いた例を対照2とした。これら対照1、2のその
他の条件および操作は、前記実施例と同様である。前記
対照1の結果を図3のグラフに、前記対照2の結果を図
4のグラフに示す。
【0050】以上の実施例1、比較例1、対照1、2か
らつぎのことがいえる。まず、図1のグラフの曲線
(a)に示すように、PCRによりDNAが増幅された
実施例1では、ほぼ全部のDAPIがDNAにインター
カレートされて極微量のDAPIしか銀コロイドに捕捉
されないため、SERS光が弱かった。これに対し、同
図のグラフの曲線(b)に示すように、PCRによりD
NAが増幅されなかった比較例1では、ほぼ全部のDA
PIが銀コロイドに捕捉されて、強いSERS光が測定
できた。なお、この比較例1のSERS光のピークは、
図3のグラフに示す対照1のピークと一致した。また、
図4のグラフに示すように、DNAのみの場合(対照
2)では、SERS光が測定できなかった。これらの結
果から、本発明の遺伝子の分析方法により、PCR法に
よりDNAが複製されたか否かが、迅速かつ簡単に判別
できるといえる。
【0051】(実施例2)実施例1と同様にしてPCR
を行い、得られたPCR産物についてDNA精製を行っ
た。そして、得られた精製DNA試料35μlにDAP
I水溶液(濃度:10-4mol/l)5μlを加えて混
合した。この混合液に、銀コロイド水溶液(濃度:0.
17mg/ml)360μlを加えて、測定試料を調製
した。そして、この測定試料について、アルゴンイオン
レーザー(レーザー強度:50mW)を用い、励起波長
514.5nm、露光時間5秒の条件でSERS光の測
定を行った。その結果を、図2のグラフの曲線(a)に
示す。
【0052】(比較例2)DNAに代えて、蒸留水1μ
lを用いた他は、実施例2と同様にしてPCRおよびD
NA精製を行い、ついで実施例2と同様にしてSERS
光の測定を行った。その結果を、図2のグラフの曲線
(b)に示す。
【0053】以上の実施例2および比較例2の結果から
つぎのことがいえる。まず、図2のグラフの曲線(a)
に示すように、PCRによりDNAが増幅された実施例
2では、DAPIがDNAにほぼ完全にインターカレー
トされて銀コロイドに捕捉されないため、SERS光が
検出できなかった。これに対し、同図のグラフの曲線
(b)に示すように、PCRによりDNAが増幅されな
かった比較例2では、ほぼ全部のDAPIが銀コロイド
に捕捉されて、強いSERS光が測定できた。
【0054】(実施例3)混合液として、種々濃度のD
NA水溶液25μlにDAPI水溶液15μlを加えて
混合したものを用いた他は、実施例1と同様にしてSE
RS光の測定を行った。その結果を図5のグラフに示
す。なお、この図において、縦軸のSERS強度はSE
RS光の強度であり、横軸はDNA濃度である。
【0055】図5のグラフに示すように、DNAの濃度
が増加するにしたがいSERS光の強度が直線的に低下
した。このグラフは、検量線として使用できるため、こ
れを用いれば、例えば、PCR法において目的DNAの
増幅の判別のみならず、PCR産物中のDNA濃度も測
定することが可能となる。
【0056】(実施例4、比較例2)実施例4では、D
NAの精製を行わないPCR産物についてSERS光の
測定を行った他は、実施例1と同じ条件で同じ操作を行
った。その結果を、図6のグラフの曲線(a)に示す。
【0057】他方、比較例2では、DNAの精製を行わ
ないPCR産物についてSERS光の測定を行った他
は、比較例1と同じ条件で同じ操作を行った。その結果
を、図6のグラフの曲線(b)に示す。
【0058】図6のグラフに示すように、DNAが大量
に存在する実施例4のSERS光とDNAがほとんど存
在しない比較例2のSERS光とを明確に区別すること
ができる。このことから、本発明の遺伝子の分析方法に
よれば、DNA精製を行わないPCR産物であっても、
遺伝子(DNA)の分析が可能であるといえる。
【0059】
【発明の効果】以上のように、本発明の遺伝子の分析方
法は、電気泳動法等による従来の遺伝子の検出方法と比
べて、迅速かつ簡単に遺伝子の分析を行うことができ
る。このため、本発明の分析方法を、例えば、PCR法
に適用すれば、目的とするDNAの増幅を短時間で簡単
に確認することができ、つぎの段階の実験への移行を判
断することができる。また、本発明の分析方法は、精製
を行わないPCR産物のように、他の物質が混在してい
る試料であっても、遺伝子の分析が可能である。そし
て、本発明の分析方法は、その操作が単純であるため、
分析を自動化することが可能であり、これによりさらに
迅速かつ簡単に遺伝子の分析ができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施例のSERS光のグラフであ
る。
【図2】本発明のその他の実施例のSERS光のグラフ
である。
【図3】DAPIのみのSERS光のグラフである。
【図4】DNAのみのSERS光のグラフである。
【図5】本発明のさらにその他の実施例におけるSER
S光とDNA濃度の関係を示すグラフである。
【図6】本発明のさらにその他の実施例のSERS光の
グラフである。
【図7】図(a)〜(b)は、本発明の遺伝子の分析方
法をPCRに適用した場合の実施例の一連の操作を示す
説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竇 暁鳴 京都府京都市南区東九条西明田町57番地 株式会社京都第一科学内

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活
    性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前
    記試料に前記遺伝子結合性ラマン活性物質および前記表
    面増強ラマン散乱生起基質を供給し、遺伝子に結合しな
    かった前記遺伝子結合性ラマン活性物質を前記表面増強
    ラマン散乱生起基質で捕捉し、この状態で前記遺伝子結
    合性ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増
    強ラマン散乱光を測定する遺伝子の分析方法。
  2. 【請求項2】 分析対象となる遺伝子が二本鎖デオキシ
    リボ核酸(DNA)である請求項1記載の遺伝子の分析
    方法。
  3. 【請求項3】 分析対象試料が、ポリメラーゼチェーン
    リアクション(PCR)法によりDNAの増幅操作を行
    った試料、ストランド ディスプレースメントアンプリ
    フィケーション法(SDA法)によりDNAの増幅操作
    を行った試料およびリガーゼチェーンリアクション(L
    CR)法によりDNAの増幅操作を行った試料から選択
    された少なくとも一つの試料である請求項1または2記
    載の遺伝子の分析方法。
  4. 【請求項4】 分析対象となる遺伝子が、リボ核酸(R
    NA)である請求項1記載の遺伝子の分析方法。
  5. 【請求項5】 分析対象試料が、Qβレプリカーゼを用
    いたRNAの増幅方法(Qβ法)によりRNAの増幅操
    作を行った試料である請求項1または4記載の遺伝子の
    分析方法。
  6. 【請求項6】 分析対象となる遺伝子が、一本鎖DNA
    である請求項1記載の遺伝子の分析方法。
  7. 【請求項7】 分析対象となる遺伝子が、RNAとDN
    Aの複合体である請求項1記載の遺伝子の分析方法。
  8. 【請求項8】 遺伝子結合性ラマン活性物質が、4´,
    6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、エチジウム
    ブロマイド、ビスベンゾイミドおよびアクリジンオレン
    ジからなる群から選択された少なくとも一つの物質であ
    る請求項1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方
    法。
  9. 【請求項9】 遺伝子結合性ラマン活性物質が、エチジ
    ウムブロマイド、チアゾールオレンジ、ビスベンゾイミ
    ドおよびアクリジンオレンジからなる群から選択された
    少なくとも一つである請求項1、4および5のいずれか
    一項に記載の遺伝子の分析方法。
  10. 【請求項10】 表面増強ラマン散乱生起基質が、銀コ
    ロイド、金コロイド、銅コロイド、電極および金属板か
    らなる群から選択された少なくとも一つの基質である請
    求項1〜9のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
  11. 【請求項11】 遺伝子結合性ラマン活性物質を含有す
    る試薬R1と、表面増強ラマン散乱生起基質を含有する
    試薬R2とを備える遺伝子分析用キット。
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