CN104406952B - 基于滚环扩增技术和核壳纳米金结构的sers基底制备方法 - Google Patents

Abstract

一种基于滚环扩增技术和核壳纳米金结构的SERS基底制备方法，通过滚环扩增技术将小段引物延伸后，核壳纳米金结构组装的互补单链与其相互杂交，弯曲易折的长单链变成伸展双链的过程中核壳纳米金等距离地嵌入到双链中，利用滚环扩增技术的序列延伸实现信号放大、核壳纳米结构自身以及通过DNA杂交实现距离控制所得的纳米金结构之间的拉曼信号叠加，实现信号高效相对均一的SERS基底制备，从而可应用于生物分子的高效灵敏检测、生物传感器领域。该技术的序列延伸实现信号放大、实现距离控制所得的纳米金结构之间的拉曼信号叠加，实现信号高效相对均一的SERS基底制备。

Description

基于滚环扩增技术和核壳纳米金结构的SERS基底制备方法

技术领域

本发明属于DNA纳米技术及纳米材料的功能化及应用领域，涉及一种基于滚环扩增技术及核壳纳米金结构的高效SERS基底的制备方法，可应用于生物分子检测、生物传感器等领域。

背景技术

表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman scattering, SERS）是指位于粗糙金属表面的小分子本身的拉曼信号得到增强的现象。这种现象已在表面科学、分析科学和生物科学等领域得到广泛的应用，为深入表征各种表面（界面）的结构和过程提供分子水平上的信息，如鉴别分子或离子在表面的键合、构型和取向以及材料的表面结构。关于SERS的增强机制，虽然到目前仍存在争议，但较为认可的是电磁场增强机理，而该机理中涉及到的“热点”（hot spot）一般是指在一些纳米粒子组成的聚集体中，相邻的纳米粒子之间的空隙之处的区域。此区域的SERS效应最强。如何能构建高效均一含有更多的“热点”的SERS基底,已成为SERS研究领域的热点和难点。

现在的研究中，构建高效均一基底的常见方法有如下几种：

a: 金属电极活性基底，这是目前使用较为广泛的一种基底。通过电极表面进行适当的粗糙化处理，可以产生粗糙度基本处于宏观粗糙度与亚微观粗糙度范围内。这种方式的缺点是多数金属经过处理后，表面粗糙尺度变化范围较大，造成基底上个点表面增强效应变化很大，这种结构上的不均一性直接影响了吸附分子的SERS光谱的稳定性及数据的重现性。

b: 化学刻蚀和化学沉积的活性基底，是通过强腐蚀性物质把金属表面的原子通过化学反应溶解掉来达到表面粗糙化的目的。这种方式的缺点是反应条件较难控制、沉积的时间、反应的温度、试剂的浓度等都对基底的粗糙度有影响。

另外还有平板印刷技术、自助装技术、有序组装技术等来制备活性基底，但都存在各自的缺点从而限制了SERS技术的发展及应用。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种基于滚环扩增技术及核壳纳米金结构的高效SERS基底的制备方法。

一种基于滚环扩增技术和核壳纳米金结构的SERS基底制备方法，其特征在于，通过滚环扩增技术将小段引物延伸后，核壳纳米金结构组装的互补单链与其相互杂交，弯曲易折的长单链变成伸展双链的过程中核壳纳米金等距离地嵌入到双链中，通过纳米金结构自身以及相互之间的拉曼信号，实现高效SERS基底的制备，从而可应用于生物分子的高效灵敏检测、生物传感器领域；

所述的滚环扩增技术为单引物的滚环扩增技术以及多引物的超分支滚环扩增技术。

所述的小段引物为长度在10-40bp的一段无标记人工合成单链DNA。

所述的核壳纳米金结构为尺寸介于30-50nm的纳米金核壳结构，核壳中间存在1-3nm缝隙，且缝隙里吸附有拉曼小分子，如DTNB（5DO，全称是5，5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，中文名:5，5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)），Cy3（cyanine-3），Cy5（cyanine-5），FITC (fluorescein isothiocyannate)，吡啶。

所述的互补单链为序列上与扩增所用的环模板相同或部分相同的一段经过巯基或生物素标记的一段DNA序列。

所述的弯曲易折的长单链为滚环扩增后所得的数量可达几十kbp，长度可达数微米的单链DNA。

所述的伸展双链为扩增产物长单链与互补链杂交后，单链本身的二级结构等打开，形成的均一双链或是间断性均一双链。

所述的等距离地嵌入到双链为纳米金通过组装巯基的互补链或组装有亲和素的纳米金与生物素标记的互补链连接，实现嵌入。

所述的纳米金结构自身以及相互之间的拉曼信号为核壳纳米金自身拉曼信号以及核壳结构之间形成的拉曼信号的叠加。

利用滚环扩增技术的序列延伸实现信号放大、核壳纳米结构自身以及通过DNA杂交实现距离控制所得的纳米金结构之间的拉曼信号叠加，实现信号高效相对均一的SERS基底制备。

附图说明

附图1为经过滚环扩增之后，得到长单链DNA与互补序列充分杂交后所得的双链结构的AFM成像，图中双链结构较为均一，伸展性良好。图片扫描尺寸为10μm。

具体实施方式

实施例1：

5μL 100μM预成环DNA与10μL 100μM待测核酸序列加入到0.5mL离心管中℃混合均匀，90℃下1min，当管中溶液自然冷却到室温时，加入3μLT4连接酶及2μLT4连接酶缓冲液，25℃环境下连接16小时以上，结束后，65℃条件下酶变性10min，酶作用完全后，用30KD的超滤管超滤（10000rpm/min，5min），收集底部溶液，为环状DNA模板溶液。

8μL milliQ加入以下溶液：环状DNA模板（6μL），dNTPs (2 μL，10 mM)，RCA buffer(2 μL，10×)，phi29 polymerase (2 μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为20μL。然后30℃ 水浴中扩增30 min。90℃条件下酶变性10min，4℃环境下保存待用。

3μL上述扩增产物，milliQ water (12μL )预成环DNA （100μM，3μL），TAE 缓冲液（125mM Mg²⁺，2μL）总体积为20μL混合均匀后，95℃ （5min），37℃降至4℃（每20s降低0.2℃），时间约为1.5h进行DNA杂交反应。杂交溶液2μL 加入18μL milliQ 水，充分混匀后，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。

实施例2：

5μL 100μM预成环DNA与10μL 100μM待测核酸序列加入到0.5mL离心管中混合均匀，90℃下1min，当管中溶液自然冷却到室温时，加入3μLT4连接酶及2μLT4连接酶缓冲液，25℃环境下连接16小时以上，结束后，65℃条件下酶变性10min，酶作用完全后，用30KD的超滤管超滤（10000rpm/min，5min），收集底部溶液，为环状DNA模板溶液。

8μL milliQ加入以下溶液：环状DNA模板（6μL），bio-dNTPs (2 μL，1 mM)，RCAbuffer (2 μL，10×)，phi29 polymerase (2 μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为20μL。然后30℃ 水浴中扩增30 min。90℃条件下酶变性10min，4℃环境下保存待用。

3μL上述扩增产物，milliQ water (12μL )预成环DNA （100μM，3μL），TAE 缓冲液（125mM Mg²⁺，2μL）总体积为20μL混合均匀后，95℃ （5min），37℃降至4℃（每20s降低0.2℃），时间约为1.5h进行DNA杂交反应。

2μL 10mM avidin 加入上述杂交产物中，室温下反应连接1h。后取此溶液2μL 加入18μL milliQ 水，充分混匀后，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。

实施例3：

5μL 100μM预成环DNA与10μL 100μM待测核酸序列加入到0.5mL离心管中混合均匀，90℃下1min，当管中溶液自然冷却到室温时，加入3μLT4连接酶及2μLT4连接酶缓冲液，25℃环境下连接16小时以上，结束后，65℃条件下酶变性10min，酶作用完全后，用30KD的超滤管超滤（10000rpm/min，5min），收集底部溶液，为环状DNA模板溶液。

8μL milliQ加入以下溶液：环状DNA模板（6μL），dNTPs (2 μL，1 mM)，RCA buffer(2 μL，10×)，phi29 polymerase (2 μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为20μL。然后30℃ 水浴中扩增30 min。90℃条件下酶变性10min，4℃环境下保存待用。

3μL上述扩增产物，milliQ water (12μL )，bio-预成环DNA （100μM，3μL），TAE 缓冲液（125mM Mg²⁺，2μL）总体积为20μL混合均匀后，95℃ （5min），37℃降至4℃（每20s降低0.2℃），时间约为1.5h进行DNA杂交反应。

2μL 10mM avidin 加入上述杂交产物中，室温下反应连接1h。后取此溶液2μL 加入18μL milliQ 水，充分混匀后，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。

实施例4：

5μL 100μM预成环DNA与10μL 100μM待测核酸序列加入到0.5mL离心管中混合均匀，90℃下1min，当管中溶液自然冷却到室温时，加入3μLT4连接酶及2μLT4连接酶缓冲液，25℃环境下连接16小时以上，结束后，65℃条件下酶变性10min，酶作用完全后，用30KD的超滤管超滤（10000rpm/min，5min），收集底部溶液，为环状DNA模板溶液。

8μL milliQ加入以下溶液：环状DNA模板（6μL），dNTPs (2 μL，1 mM)，RCA buffer(2 μL，10×)，phi29 polymerase (2 μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为20μL。然后30℃ 水浴中扩增30 min。90℃条件下酶变性10min，4℃环境下保存待用。

3μL上述扩增产物，milliQ water (12μL )，bio-预成环DNA （100μM，3μL），TAE 缓冲液（125mM Mg²⁺，2μL）总体积为20μL混合均匀后，95℃ （5min），37℃降至4℃（每20s降低0.2℃），时间约为1.5h进行DNA杂交反应。

1mL 5nm 金溶液中，加入20μL 1mg/mL streptavidin，充分混匀后，室温下吸附连接1h，加入200μL BSA （10%）溶液，封闭30min后，超滤管过滤，回收100μL Au-streptavidin产物。

10μL Au-streptavidin 加入上述杂交产物中，室温下反应连接1h。后取此溶液2μL 加入18μL milliQ 水，充分混匀后，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。

实施例5

5μL 100μM预成环DNA与10μL 100μM待测核酸序列加入到0.5mL离心管中混合均匀，90℃下1min，当管中溶液自然冷却到室温时，加入3μLT4连接酶及2μLT4连接酶缓冲液，25℃环境下连接16小时以上，结束后，65℃条件下酶变性10min，酶作用完全后，用30KD的超滤管超滤（10000rpm/min，5min），收集底部溶液，为环状DNA模板溶液。

8μL milliQ加入以下溶液：环状DNA模板（6μL），dNTPs (2 μL，1 mM)，RCA buffer(2 μL，10×)，phi29 polymerase (2 μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为20μL。然后30℃ 水浴中扩增30 min。90℃条件下酶变性10min，4℃环境下保存待用。

3μL上述扩增产物，milliQ water (12μL )，bio-预成环DNA （100μM，3μL），TAE 缓冲液（125mM Mg²⁺，2μL）总体积为20μL混合均匀后，95℃ （5min），37℃降至4℃（每20s降低0.2℃），时间约为1.5h进行DNA杂交反应。

1mL 5nm 金溶液中，加入20μL 1mg/mL streptavidin，充分混匀后，室温下吸附连接1h，加入200μL BSA （10%）溶液，封闭30min后，超滤管过滤，回收100μL Au-streptavidin产物。

10μL Au-streptavidin 加入上述杂交产物中，室温下反应连接1h。后取此溶液2μL 加入18μL milliQ 水，充分混匀后，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。

实施例6：

5μL 100μM预成环DNA与10μL 100μM待测核酸序列加入到0.5mL离心管中混合均匀，90℃下1min，当管中溶液自然冷却到室温时，加入3μLT4连接酶及2μLT4连接酶缓冲液，25℃环境下连接16小时以上，结束后，65℃条件下酶变性10min，酶作用完全后，用30KD的超滤管超滤（10000rpm/min，5min），收集底部溶液，为环状DNA模板溶液。

8μL milliQ加入以下溶液：环状DNA模板（6μL），dNTPs (2 μL，1 mM)，RCA buffer(2 μL，10×)，phi29 polymerase (2 μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为20μL。然后30℃ 水浴中扩增30 min。90℃条件下酶变性10min，4℃环境下保存待用。

3μL上述扩增产物，milliQ water (12μL )，bio-预成环DNA （100μM，3μL），TAE 缓冲液（125mM Mg²⁺，2μL）总体积为20μL混合均匀后，95℃ （5min），37℃降至4℃（每20s降低0.2℃），时间约为1.5h进行DNA杂交反应。

1mL 15nm 金溶液中，加入20μL 1mg/mL streptavidin，充分混匀后，室温下吸附连接1h，加入200μL BSA （10%）溶液，封闭30min后，离心洗涤3次 （12500rpm/min，20min）回收100μL Au-streptavidin 产物。

10μL Au-streptavidin 加入上述杂交产物中，室温下反应连接1h。后取此溶液2μL 加入18μL milliQ 水，充分混匀后，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。

实施例7：

5μL 100μM预成环DNA与10μL 100μM待测核酸序列加入到0.5mL离心管中混合均匀，90℃下1min，当管中溶液自然冷却到室温时，加入3μLT4连接酶及2μLT4连接酶缓冲液，25℃环境下连接16小时以上，结束后，65℃条件下酶变性10min，酶作用完全后，用30KD的超滤管超滤（10000rpm/min，5min），收集底部溶液，为环状DNA模板溶液。

8μL milliQ加入以下溶液：环状DNA模板（6μL），dNTPs (2 μL，1 mM)，RCA buffer(2 μL，10×)，phi29 polymerase (2 μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为20μL。然后30℃ 水浴中扩增30 min。90℃条件下酶变性10min，4℃环境下保存待用。

3μL上述扩增产物，milliQ water (12μL )，bio-预成环DNA （100μM，3μL），TAE 缓冲液（125mM Mg²⁺，2μL）总体积为20μL混合均匀后，95℃ （5min），37℃降至4℃（每20s降低0.2℃），时间约为1.5h进行DNA杂交反应。

100μL，10nM粒径为15nm的纳米金中加入4μL，100μM SH-polyA （15个A序列） DNA，室温轻微振荡过夜；后加入老化液0.1M PB（pH7.4）溶液10μL，室温条件350rpm/min振荡30min，后加入2M NaCl 20μL，分四次加入，间隔为30min，室温下350rpm/min振荡过夜；4^oC，12000rpm/min，20min条件下进行离心洗涤三次，洗涤液为10mMPB，后1mL0.1M PBS重悬浮；100μL 0.1M 5DO小分子溶液加入到500μL上述溶液中，室温下350rpm/min振荡，吸附2-3天。取100μL上述溶液然后加入50μL1%PVP，25μL 10mM NH₂OH·HCl，25μL 5mM HAuCl₄，混匀振荡1min后20^oC 4000rpm/min，每次6min离心洗涤三次，洗涤液为MilliQ水，后100μLMilliQ水重悬浮；该方式制备得到的粒径在35nm左右，浓度为1nM，具备5DO高增强特征峰的一种核壳纳米金结构。

1mL核壳纳米金结构中，加入20μL 1mg/mL streptavidin，充分混匀后，室温下吸附连接1h，加入200μL BSA （10%）溶液，封闭30min后，离心洗涤3次 （8000rpm/min，20min）回收100μL 核壳Au-streptavidin 产物。10μL 核壳Au-streptavidin 加入上述杂交产物中，室温下反应连接1h。后取此溶液2μL 加入18μL milliQ 水，充分混匀后，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。取10μL滴到锡箔上，进行TEM成像。取10μL 滴到硅片上，进行SERS信号检测。

Claims (1)

1.一种基于滚环扩增技术和核壳纳米金结构的SERS基底制备方法，其特征在于，通过滚环扩增技术将小段引物延伸后，核壳纳米金结构组装的互补单链与其相互杂交，弯曲易折的长单链变成伸展双链的过程中核壳纳米金等距离地嵌入到双链中，通过纳米金结构自身以及相互之间的拉曼信号，实现高效SERS基底的制备，从而可应用于生物分子的高效灵敏检测、生物传感器领域；

所述的滚环扩增技术为单引物的滚环扩增技术以及多引物的超分支滚环扩增技术；

所述的小段引物为长度在10-40bp的一段无标记人工合成单链DNA；

所述的核壳纳米金结构为尺寸介于30-50nm的纳米金核壳结构，核壳中间存在1-3nm缝隙，且缝隙里吸附有拉曼小分子， 拉曼小分子为5，5'-二硫双(2-硝基苯甲酸) （DTNB），Cy3（cyanine-3），Cy5（cyanine-5），FITC (fluorescein isothiocyannate)，吡啶中的一种；

所述的互补单链为序列上与扩增所用的环模板相同或部分相同的一段经过巯基或生物素标记的一段DNA序列；

所述的弯曲易折的长单链为滚环扩增后所得的数量可达几十kbp，长度可达数微米的单链DNA；

所述的伸展双链为扩增产物长单链与互补链杂交后，单链本身的二级结构打开，形成的均一双链或是间断性均一双链；

所述的等距离地嵌入到双链为纳米金通过组装巯基的互补链或组装有亲和素的纳米金与生物素标记的互补链连接，实现嵌入；

所述的纳米金结构自身以及相互之间的拉曼信号为核壳纳米金自身拉曼信号以及核壳结构之间形成的拉曼信号的叠加。