JP4735860B2

JP4735860B2 - 光電流を用いた被検物質の特異的検出方法、それに用いられる電極、測定用セルおよび測定装置

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Publication number: JP4735860B2
Application number: JP2007340850A
Authority: JP
Inventors: 次允戸; 原仁大; 修司曾根崎; 平幸輝金; 神有美大; 川浩石; 崎有美大; 留弘優徳; 田陽子山; 内雅浩宮
Original assignee: Toto Ltd
Current assignee: Toto Ltd
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2026-09-28
Also published as: JP2008122411A

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、光電流を用いて、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検物質を特異的に検出する方法、それに用いられる電極、測定用セル及び測定装置に関する。

背景技術
生体試料中のＤＮＡを解析する遺伝子診断法が、各種病気の新たな予防および診断法として、有望視されている。このようなＤＮＡ解析を簡便かつ正確に行う技術として、以下のものが提案されている。

被検体ＤＮＡを、これと相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光物質を標識されたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、その際の蛍光シグナルを検出する、ＤＮＡの分析方法が知られている（例えば、特許文献１（特開平７−１０７９９９号公報）および特許文献２（特開平１１−３１５０９５号公報）参照）。この方法にあっては、ハイブリダイゼーションによる二本鎖ＤＮＡの形成を色素の蛍光により検出する。

また、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを、これに相補性を有する一本鎖の核酸プローブとハイブリダイゼーションさせた後、インターカレータ等の二本鎖認識体を添加して電気化学的に検出する方法が知られている（例えば、特許文献３（特許第２５７３４４３号公報）および非特許文献１（表面科学Vol. 24, No. 11. Pp. 671-676, 2003）参照）。

一方、近年、ダイオキシンを始めとする外因性内分泌撹乱物質（環境ホルモン）の生殖系および神経系等への障害が社会問題化している。現在、外因性内分泌撹乱毒性の検出は様々な方法によって行われているが、そのような物質はわずか１０ｐｐｔレベル程度の極めて低い濃度で毒性を示す。このため、そのような低濃度範囲における外因性内分泌撹乱物質の検出方法が望まれている。

特に、外因性内分泌撹乱物質は、受容体等のタンパク質を介して標的ＤＮＡに結合し、それにより当該ＤＮＡの発現等に影響を与え、毒性を生じる。すなわち、外因性内分泌撹乱物質は、ＤＮＡに直接的に結合するのではなく、受容体等のタンパク質を介して間接的ＤＮＡに結合する。そのため、ＤＮＡ結合性を用いたプレスクリーニング等の従来の方法にあっては、その結合の評価は容易ではない。

ところで、増感色素を用いて光から電気エネルギーを発生させる太陽電池が知られている（例えば、特許文献４（特開平１−２２０３８０号公報）参照）。この太陽電池は、多結晶の金属酸化物半導体を有し、かつその表面積に広範囲にわたり増感色素の層が形成されてなるものである。

そして、このような太陽電池の特性を生物化学的な分析に応用しようとする試みとして、色素の光励起により生じる光電流を被検物質（ＤＮＡ、蛋白などの生体分子）を検出に利用する提案がなされている（例えば、非特許文献２（中村他「光電変換による新しいＤＮＡ二本鎖検出法」日本化学会講演予稿集 Vol.81ST NO.2（2002）第947頁）及び特許文献５（特開２００２−１８１７７７号公報）参照）。
特開平７−１０７９９９号公報特開平１１−３１５０９５号公報特許第２５７３４４３号公報特開平１−２２０３８０号公報特開２００２−１８１７７７号公報表面科学Vol. 24, No. 11. Pp. 671-676, 2003 中村他「光電変換による新しいＤＮＡ二本鎖検出法」日本化学会講演予稿集 Vol.81ST NO.2（2002）第947頁

発明の概要

本発明者らは、今般、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出において、電解質媒体として、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒とを含んでなるものを使用することにより、被検物質を光電流を用いて高感度で簡便かつ正確に検出および定量することができるとの知見を得た。

したがって、本発明は、特異的結合性を有する被検物質を光電流を用いて高感度で簡便かつ正確に検出および定量することができる方法、電極、測定用セル、および測定装置の提供をその目的としている。

すなわち、本発明によれば、増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介して固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に光を照射して前記増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出することを含んでなる被検物質の特異的検出方法であって、
前記作用電極が、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プローブ物質が担持され、
前記電子受容物質が、前記増感色素の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸化物半導体であり、
前記電解質媒体が、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒とを含んでなる方法が提供される。

また、本発明によれば、上記方法において作用電極として用いられる電極であって、
導電性基材と、
該導電性基材上に形成される、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層と
を備えたものが提供される。

さらに、本発明によれば、上記方法に用いられる測定用セルであって、
上記作用電極と、
対電極と、
を備えたものが提供される。

また、本発明によれば、上記方法に用いられる測定装置であって、
上記測定用セルと、
前記作用電極の表面に光を照射する光源と、
前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と
を備えたものが提供される。

発明の具体的説明

光電流を用いた被検物質の特異的検出
本発明の方法にあっては、増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介して固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に光を照射して前記増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出する。作用電極は、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プローブ物質が担持される。電子受容物質は、前記増感色素の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸化物半導体である。

このとき、電解質媒体として、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒とを含んでなるものを用いる。このような電解質媒体を用いると、太陽電池において一般的に使用されている電解質を初めとする従来の電解質と比べて、被検物質を光電流による検出感度および精度が飛躍的に向上する。その理由は定かではないが、以下のようなものではないかと考えられる。なお、以下の説明はあくまで仮説であって、本発明を何ら限定するものではない。まず、図１に、色素増感型太陽電池の原理を説明する図を示す。太陽電池に用いる電解質媒体の一般的な組成は、Ｉ_２／Ｎ（Ｃ_３Ｈ_７）_４Ｉ／アセトニトリルである。図１に示されるように、Ｎ（Ｃ_３Ｈ_７）_４Ｉは、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）中で、Ｎ（Ｃ_３Ｈ_７）_４ ^＋とＩ⁻に分離し、また金属Ｉ_２は前記Ｉ⁻と結合してＩ_３ ⁻の形で溶解する。このとき、生成されるＩ_３ ⁻は太陽電池にあってはヨウ素のレドックスサイクルを回して発電を継続するために必要な物質であるが、上記機構を生物化学的な分析においては被検物質の検出精度を低下させるものと考えられる。その結果、太陽電池において一般的に使用されている電解質を使用すると、特に検出の対象がＳＮＰｓの場合、電流値の微弱な差を検出しなければならず、精度の低下が著しくなるのではないかと考えられる。これに対し、本発明に用いる電解質媒体にあっては、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質を用いるため、Ｉ_２のような対電極から電子を受容する酸化剤を含まない。従って、Ｉ_３ ⁻のような測定精度を劣化させる成分を生成しないため、検出感度および精度が飛躍的に向上するのではないかと考えられる。

本発明において用いる電解質媒体は、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒と、所望により添加物とを含んでなる。すなわち、本発明に用いる電解質は、酸化された状態の増感色素に電子を供給する還元剤からなり、対電極から電子を受容する酸化剤を含有しない。電解質の好ましい例としては、Ｉ_２やＢｒ_２を含まないヨウ化物及び／または臭化物、具体的には、ＬｉＩ、ＮａＩ、ＫＩ、ＣｓＩ、ＣａＩ_２などの金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイドなど４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；ＬｉＢｒ、ＮａＢｒ、ＫＢｒ、ＣｓＢｒ、ＣａＢｒ_２などの金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイドなど４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオンなどの金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウムなどのチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウムなどの亜硫酸塩等；およびそれらの混合物が挙げられる。電解質のより好ましい例としては、ＬｉＩやテトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイドなど４級アンモニウム化合物のヨウ素塩、およびそれらの混合物が挙げられ、特に好ましくはＬｉＩまたはテトラアルキルアンモニウムヨーダイドである。

本発明の好ましい態様によれば、電解質媒体の電解質濃度は０．００１〜１５Ｍであるのが好ましく、より好ましくは０．０１〜１０Ｍである。

本発明に用いる溶媒は、非プロトン性溶媒、プロトン性溶媒、またはそれらの混合物である。すなわち、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒系のものや、非プロトン性の極性溶媒を用いることができる。非プロトン性の極性溶媒としては、アセトニトリルなどのニトリル類、炭酸プロピレンや炭酸エチレンなどのカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノンや３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩などの複素環化合物やジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホランなどを用いることができる。電解質媒体に含まれる溶媒は、複数の種類を混合して用いることができ、実使用上、検出対象に応じて溶媒組成を適宜変更可能である。例えば、特に、電解質を、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなるもの、具体的にはＩ_２を含まないヨウ化化合物からなるものとし、上記の非プロトン性極性溶媒を使うことで、微弱な電流値の差を精度よく検出することができ、ＳＮＰの判定に有効である。また、タンパク質の測定には、緩衝液を主体とし、アセトニトリルを含むことで、タンパク質間の結合の保持と、陰イオンの還元能力の低下を抑制することで、精度よい検出が可能となる。

本発明の好ましい態様によれば、電解質媒体はゲル化（固体化）させて使用することもできる。ゲル化の方法の例としては、ポリマー添加、オイルゲル化剤添加、多官能モノマー類を含む重合、ポリマーの架橋反応等の手法により行うことができる。ゲル電解質のマトリクスに使用されるポリマーの例としては、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデンフルオリド等が挙げられる。

ところで、本発明の方法にあっては、まず、被検物質を含む試料液と、作用電極と、対電極とを用意する。本発明に用いる作用電極は、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を表面に備えた電極である。すなわち、プローブ物質は、被検物質と直接、特異的に結合する物質のみならず、被検物質を受容体蛋白質分子等の媒介物質に特異的に結合させて得られる結合体と特異的に結合可能な物質であってよい。次いで、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を作用電極に固定させる。増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子を放出可能な物質であり、被検物質あるいは媒介物質に予め標識させておくか、あるいは被検物質およびプローブ物質の結合体にインターカレーション可能な増感色素を用いる場合には試料液に単に添加すればよい。

そして、作用電極と対電極とを電解質媒体に接触させた後、作用電極に光を照射して増感色素を光励起させると、光励起された増感色素から電子受容物質へ電子移動が起こる。この電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出することにより、被検物質を高い感度で検出することができる。また、この検出電流は試料液中の被検試料濃度との高い相関関係を有しているので、測定された電流量または電気量に基づき被検試料の定量測定を行うことができる。

被検物質およびプローブ物質
本発明の方法における被検物質としては、特異的な結合性を有する物質であれば限定されず、種々の物質であってよい。このような被検物質であれば、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を作用電極表面に担持させておくことにより、被検物質をプローブ物質に直接または間接的に特異的に結合させて検出することが可能となる。

すなわち、本発明の方法にあっては、被検物質およびプローブ物質として互いに特異的に結合可能なものを選択することができる。すなわち、本発明の好ましい態様によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、被検物質と特異的に結合する物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、作用電極上に被検物質を直接、特異的に結合させて検出することができる。この態様における、被検物質およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、一本鎖の核酸および核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸の組合せ、ならびに抗原および抗体の組合せが挙げられる。

本発明のより好ましい態様によれば、被検物質を一本鎖の核酸とし、プローブ物質を核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸とするのが好ましい。この態様における被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図２（ａ）および（ｂ）に示す。これらの図に示されるように、被検物質としての一本鎖の核酸１は、作用電極３上に担持されたプローブ物質としての相補性を有する一本鎖の核酸４とハイブリダイズされて、二本鎖の核酸７を形成する。

一本鎖の核酸を被検物質とする場合、プローブ物質である核酸と相補性部分を有していればよく、被検物質を構成する塩基対の長さは限定されないが、プローブ物質が核酸に対して１５ｂｐ以上の相補性部分を有するのが好ましい。本発明の方法によれば、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐの塩基対を有する比較的鎖長の長い核酸であっても、高感度にプローブ物質と被検物質の核酸同士の特異的結合形成を光電流として検出することができる。

被検物質としての一本鎖の核酸を含む試料液は、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞等の、核酸を含有する各種検体試料から、公知の方法により核酸を抽出して作製することができる。このとき、検体試料中の細胞の破壊は、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて担体を振動させることにより行なうことができる。また、核酸抽出溶液を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。核酸溶出溶液の例としては、ＳＤＳ、Triton-X、Tween-20のような界面活性剤、サポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液が挙げられる。これらの溶液を用いて核酸を溶出する場合、３７℃以上の温度でインキュベ−トすることにより反応を促進することができる。

本発明のより好ましい態様によれば、被検物質とする遺伝子の含有量が微量である場合には、公知の方法により遺伝子を増幅した後検出を行なうのが好ましい。遺伝子を増幅する方法としては、ポリメラ−ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）等の酵素を用いる方法が代表的であろう。ここで、遺伝子増幅法に用いられる酵素の例としては、ＤＮＡポリメラ−ゼ、Ｔａｑポリメラ−ゼのようなＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡポリメラ−ゼＩのようなＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラ−ゼ、Ｑβレプリカ−ゼのようなＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラ−ゼが挙げられ、好ましくは温度を調節するだけで連続して増幅を繰り返すことができる点で、Ｔａｑポリメラ−ゼを用いるＰＣＲ法である。

本発明の好ましい態様によれば、上記増幅時に特異的に核酸を増感色素で標識することが出来る。一般的には、ＤＮＡにアミノアリル修飾ｄUTPを取り込ませることにより行うことができる。この分子は未修飾の dUTP と同じ効率で取り込まれる。次のカップリング段階において、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）により活性化された蛍光色素が修飾 dUTP と特異的に反応し、均一に増感色素で標識された被検物質が得られる。

本発明の好ましい態様によれば、上記のようにして得られた核酸の粗抽出液あるいは精製した核酸溶液をまず９０〜９８℃、好ましくは９５℃以上の温度で熱変性を施し、一本鎖核酸を調製することができる。

本発明の方法にあっては、被検物質とプローブ物質が間接的に特異的に結合するものであってもよい。すなわち、本発明の別の好ましい態様によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、この被検物質と特異的に結合する物質を媒介物質として共存させ、この媒介物質と特異的に結合可能な物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、プローブ物質に特異的に結合できない物質であっても、媒介物質を介して作用電極上に間接的に特異的に結合させて検出することができる。この態様における、被検物質、媒介物質、およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、リガンド、このリガンドを受容可能な受容体蛋白質分子、およびこの受容体蛋白質分子と特異的に結合可能な二本鎖の核酸の組合せが挙げられる。リガンドの好ましい例としては、外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）が挙げられる。外因性内分泌撹乱物質とは、受容体蛋白質分子を介してＤＮＡに結合し、その遺伝子発現に影響して毒性を生じる物質であるが、本発明の方法によれば、被検物質によりもたらされる受容体等のタンパク質のＤＮＡに対する結合性を簡便にモニタリングすることができる。この態様における被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図３に示す。図３に示されるように、被検物質としてのリガンド１０は、まず、媒介物質である受容体蛋白質分子１１に特異的に結合する。そして、リガンドが結合された受容体蛋白質分子１３が、プローブ物質としての二本鎖の核酸１４に特異的に結合する。

本発明の方法によれば、１つのプローブ物質に対し、異なる入手経路に由来する複数の同一被検物質を同時に反応させ、サンプルの由来による被検物質量の差異を判断することにより、目的とする入手経路に由来する被検物質を定量することも可能である。具体的な適用例としては、マイクロアレイ上での競合的ハイブリダイゼーションによる発現プロフィール解析が挙げられる。これは、細胞間での特定遺伝子の発現パターンの差異を解析するため、別々の蛍光色素で標識された被検物質を、同一プローブ物質に対して競合的にハイブリダイゼーションを行わせるものである。本発明においては、このような手法を用いることにより、細胞間での発現差異解析が電気化学的に行えるという、従来に無い利点が得られる。

増感色素
本発明の方法にあっては、被検物質の存在を光電流で検出するために、増感色素の共存下、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させて、該結合により増感色素を作用電極に固定させる。そのために、本発明の方法にあっては、図２（ａ）および図３に示されるように被検物質１あるいは媒介物質１１に予め増感色素２，１２で標識しておくことができる。また、図２（ｂ）に示されるように被検物質およびプローブ物質の結合体７（例えばハイブリダイゼーション後の二本鎖核酸）にインターカレーション可能な増感色素８を用いる場合には、試料液に増感色素を添加することにより、プローブ物質に増感色素を固定させることができる。

本発明の好ましい態様によれば、被検物質が一本鎖の核酸の場合、被検物質１分子につき増感色素を一つ標識するのが好ましい。一本鎖の核酸における標識位置は、容易に被検物質とプローブ物質の特異的な結合を形成させる観点から、一本鎖の核酸の５’’末端または３’末端のいずれかの位置とするのが好ましく、標識工程をさらに簡便にする観点から被検物質の５’末端とするのがさらに好ましい。

また、本発明の別の好ましい態様によれば、被検物質１分子あたりの増感色素担持量を高める為、被検物質１分子につき増感色素を２つ以上標識するのが好ましい。これにより、電子受容物質の形成された作用電極における単位比表面積あたりの色素担持量をより多くすることができ、より高感度に光電流応答を観測することができる。

本発明に用いる増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子を放出可能な物質であり、光源の照射による光励起状態への遷移が可能であり、かつ励起状態から作用電極に電子注入できる電子状態を採りうるものであればよい。したがって、用いる増感色素は、作用電極、特に電子受容層との間において上記電子状態をとることができるものであればよいことから、多種の増感色素が使用可能であり、高価な色素を使用する必要がない。

複数の被検物質の個別検出を行う態様にあっては、各々の被検物質に標識する増感色素は、それぞれ異なる波長の光で励起できるものであればよく、例えば、照射光の波長を選択することにより各被検物質を個別に励起できればよい。例えば、複数の被検物質に対応する複数の増感色素を用い、各増感色素毎に異なる励起波長の光を照射すると、複数のプローブが同一スポット上であっても個別に信号を検出することが可能となる。本発明の方法において、被検物質の数は限定されないが、光源から照射される光の波長と増感色素の吸収特性を考慮すると、１〜５種類が適当であろう。この態様において使用可能な増感色素は、照射光の波長領域内において光励起しさえすればよく、必ずしもその吸収極大が該波長領域にある必要はない。なお、特定波長における増感色素の光吸収反応の有無は、紫外可視スペクトロフォトメーター（例えば、島津製作所社製、ＵＶ−３１５０）を用いて測定することができる。

増感色素の具体例としては、金属錯体や有機色素が挙げられる。金属錯体の好ましい例としては、銅フタロシアニン、チタニルフタロシアニン等の金属フタロシアニン；クロロフィルまたはその誘導体；ヘミン、特開平１−２２０３８０号公報や特表平５−５０４０２３号公報に記載のルテニウム、オスミウム、鉄及び亜鉛の錯体（例えばシス−ジシアネート−ビス（２、２’−ビピリジル−４、４’−ジカルボキシレート）ルテニウム（II））があげられる。有機色素の好ましい例としては、メタルフリーフタロシアニン、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン系色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、インジゴ系色素等が挙げられる。また、増感色素の別の好ましい例としては、アマシャムバイオサイエンス社製のＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｃｙ９；モルキュラープローブ社製のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０；Ｄｙｏｍｉｃｓ社製のＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹＱ−６６０、ＤＹＱ−６６１が挙げられる。

二本鎖核酸にインターカレーション可能な増感色素の好ましい例としては、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイドが挙げられる。このような増感色素を用いる場合、核酸のハイブリダイゼーション後に試料液に添加するだけで増感色素で標識された二本鎖核酸が形成されるので、予め一本鎖の核酸を標識する必要が無い。

作用電極およびその製造
本発明に用いる作用電極は、上記プローブ物質を表面に備えた電極であり、プローブ物質を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電極である。したがって、作用電極の構成および材料は、使用される増感色素との間で上記電子移動が生じるものであれば限定されず、種々の構成および材料であってよい。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極が増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面にプローブ物質が備えられてなるのが好ましい。また、本発明のより好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、この導電性基材上に電子受容層が形成されてなるのが好ましい。この態様の電極は図２および図３に示される。図２および図３に示される作用電極３は、導電性基材５と、この導電性基材５上に形成され、電子受容物質を含んで成る電子受容層６とを備えてなる。そして、電子受容層６の表面にプローブ物質４が担持される。

本発明における電子受容層６は、プローブ物質４を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる。すなわち、電子受容物質は、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位を取り得る物質であることができる。ここで、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位（Ａ）とは、例えば、電子受容性材料として半導体を用いる場合には、伝導帯（コンダクションバンド：CB）を意味する。すなわち、本発明に用いる電子受容物質は、このＡの準位が、増感色素のLUMOのエネルギー準位よりも卑な準位、換言すれば、増感色素のＬＵＭＯのエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有するものであればよい。

電子受容物質としては、シリコン、ゲルマニウムなどの単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バリウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドミウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマスの硫化物半導体；カドミウム、鉛のセレン化物半導体；カドミウムのテルル化物半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化物半導体；ガリウムヒ素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物の化合物半導体が挙げられる。なお、上記の列挙した半導体は、真性半導体および不純物半導体のいずれであってもよい。

一方、本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質は酸化物半導体を用いる。より好ましくは、TiO₂、ZnO、SnO₂、Fe₂O₃、WO₃、Nb₂O₅、Ta₂O₃、In₂O₃、チタン酸ストロンチウムであり、最も好ましくはTiO₂、インジウム−スズ複合酸化物（ＩＴＯ）またはフッ素がドープされた酸化スズ（ＦＴＯ）をもちいることができる。ＩＴＯおよびＦＴＯは電子受容層のみならず導電性基材としても機能する性質を有するため、これらの材料を使用することにより導電性基材を用いることなく電子受容層のみで作用電極として機能させることができる。

電子受容物質として半導体を用いる場合、その半導体は単結晶および多結晶のいずれであってもよいが、多結晶体が好ましく、さらに緻密なものよりも多孔性を有するものが好ましい。これにより、比表面積が大きくなり、被検物質および増感色素を多く吸着させて、より高い感度で被検物質を検出することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が多孔性を有しており、各孔の径が３〜１０００ｎｍであるのが好ましく、より好ましくは、１０〜１００ｎｍである。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容層を導電性基材上に形成した状態での表面積は、投影面積に対して１０倍以上であることが好ましく、さらに１００倍以上であることが好ましい。この表面積の上限には特に限定されないが、通常１０００倍程度であろう。電子受容層を構成する電子受容物質の微粒子の粒径は、投影面積を円に換算したときの直径を用いた平均粒径で一次粒子として５〜２００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは８〜１００ｎｍであり、さらに好ましくは２０〜６０ｎｍである。また、分散物中の電子受容性物質の微粒子（二次粒子）の平均粒径としては０．０１〜１００μｍであることが好ましい。また、入射光を散乱させて光捕獲率を向上させる目的で、粒子サイズの大きな、例えば３００ｎｍ程度の電子受容物質の微粒子を併用して、電子受容層を形成してもよい。

凹凸構造によって、電子受容層６の表面積を大きくしてプローブ分子を多く固定化することで検出感度を上げることができる。生体分子の大きさが０．１〜２０ｎｍ程度であるため、凹凸構造により形成される細孔径は２０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下が好ましい。凹凸構造により生じる空間の入口がそれ以下であれば、比表面積は増大するが生体分子とプローブとの結合ができず、検出信号は低下する。凹凸が粗ければ表面積もあまり増えないため信号強度もそれ程上がらない。生体分子のセンシングに好適な、より好ましい範囲は５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下である。

本発明の好ましい態様によれば、凸構造として、ナノスケールの柱（ピラー）を表面に規則正しく並べたピラー構造を採用するのが好ましい。その製法としては種々、知られているが、ナノメートルスケールの孔を有する陽極酸化アルミナを鋳型として用いる方法が一般的である。鋳型にセラミックのゾルを充填、熱処理した後に、エッチングによりアルミナの鋳型を除去する方法や、充填したセラミックのゾルを鋳型より離型した後に熱処理する方法がある。ピラー状のナノ構造体を製造する方法としては、特開２００４−１３０１７１で示された透明基体、透明導電層上にナノ構造体を製造する方法が挙げられる。ここでは、陽極酸化アルミナの鋳型にチタニアゾルを充填し、３００〜４００℃の熱処理を行った後に鋳型をエッチングによって除去する方法が採られている。その結果、ナノ構造体としてチタニアのナノチューブやナノワイアが形成される。

本発明の好ましい態様によれば、凹構造として、セラミック成分を含む無機‐有機ハイブリッド前駆体を焼成し、有機物の酸化分解により気相となるために生じる気孔を採用するのが好ましい。無機‐有機ハイブリッド前駆体は、有機金属化合物（金属アルコキシド）の酸化とそれに続く重縮合反応によって生じる金属‐酸素のネットワーク構造と有機ポリマーなどが共存するものである。また、市販の酸化チタン粒子（たとえばテイカ株式会社製アナターゼ型結晶、商品名ＡＭＴ−６００（平均粒径３０ｎｍ）など）や酸化チタン分散液に有機ポリマーなどを添加する方法もある。これらの組成については種々の提案がなされており、たとえば特開平１０‐２１２１２０ではグライム系溶剤（ＨＯ‐（‐ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ‐）_ｎ‐Ｒ、ｎは１〜１０、Ｒはアルキル基あるいはアリール基）に酸化チタン粒子を分散させ、さらに分散助剤として有機ポリマーを加える組成が提案されている。この組成の分散液を適当な方法（ディップコーティング法、スプレーコーティング法、スピナーコーティング法、ブレードコーティング法、ローラーコーティング法、ワイパーバーコーティング法、リバースロールコーティング法）によって支持体上に塗布し、２００〜８００℃で焼成した場合、１ｃｍ^２（厚さ１μｍ）あたり４０〜５０ｃｍ^２の比表面積が達成されている。また、特開２００１‐２３３６１５ではテトラアルコキシチタンとエチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、エチレンオキサイドブロックコポリマーと安定化剤と溶剤とからなるゾル溶液を基板上に滴下し、基板を高速回転させることで溶剤を蒸発させ、ゲル化させることで得られる三次元構造を有する有機無機複合チタニア薄膜を、高温焼結させてブロックコポリマーを除去することで微細な三次元凹構造を達成している。さらに、有機ポリマーとしてオリゴ糖（トレハロース）を用いる方法も開示されており（特開２００４‐８３３７６）、気孔率が３８〜５６％のセラミック多孔質膜が得られている。

このように、セラミックの微細な凹凸構造制御方法は種々提案されており、本技術に適したセラミック電極材料に応用することで、比表面積の大きい電極材料の創製が可能である。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、電子受容層が導電性基材上に形成されてなるのが好ましい。本発明に使用可能な導電性基材としては、チタン等の金属のように支持体そのものに導電性があるもののみならず、ガラスもしくはプラスチックの支持体の表面に導電材層を有するものであってよい。この導電材層を有する導電性基材を使用する場合、電子受容層はその導電材層上に形成される。導電材層を構成する導電材の例としては、白金、金、銀、銅、アルミニウム、ロジウム、インジウム等の金属；炭素、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス；およびインジウム−スズ複合酸化物、酸化スズにフッ素をドープしたもの、酸化スズにアンチモンをドープしたもの、酸化亜鉛にガリウムをドープしたもの、または酸化亜鉛にアルミニウムをドープしたもの等の導電性の金属酸化物が挙げられ、より好ましくは、インジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）、酸化スズにフッ素をドープした金属酸化物（ＦＴＯ）である。ただし、前述した通り、電子受容層自体が導電性基材としても機能する場合にあっては導電性基材は省略可能である。また、本発明において、導電性基材は、導電性を確保できる材料であれば限定されず、それ自体では支持体としての強度を有しない薄膜状またはスポット状の導電材層も包含するものとする。

本発明の好ましい態様によれば、導電性基材が実質的に透明、具体的には、光の透過率が１０％以上であるのが好ましく、より好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上である。これにより、作用電極の裏側（すなわち導電性基材）から光を照射させて、作用電極（すなわち導電性基材および電子受容層）を透過した光が増感色素を励起するようにセルを構成することができる。また、本発明の好ましい態様によれば、導電材層の厚みは、０．０２〜１０μｍ程度であるのが好ましい。さらに、本発明の好ましい態様によれば、導電性基材の表面抵抗が１００Ω／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは４０Ω／ｃｍ^２以下であるのが好ましい。導電性基材の表面抵抗の下限は特に限定されないが、通常０．１Ω／ｃｍ^２程度であろう。

導電性基材上への電子受容層の好ましい形成方法の例としては、電子受容物質の分散液またはコロイド溶液を導電性支持体上に塗布する方法、半導体微粒子の前駆体を導電性支持体上に塗布し空気中の水分によって加水分解して微粒子膜を得る方法（ゾル−ゲル法）、スパッタリング法、CVD法、PVD法、蒸着法などが挙げられる。電子受容物質としての半導体微粒子の分散液を作成する方法としては、前述のゾル−ゲル法の他、乳鉢ですり潰す方法、ミルを使って粉砕しながら分散する方法、あるいは半導体を合成する際に溶媒中で微粒子として析出させそのまま使用する方法等が挙げられる。このときの分散媒としては水または各種の有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル等）が挙げられる。分散の際、必要に応じてポリマー、界面活性剤、酸、もしくはキレート剤などを分散助剤として使用してもよい。

電子受容物質の分散液またはコロイド溶液の塗布方法の好ましい例としては、アプリケーション系としてローラ法、ディップ法、メータリング系としてエアーナイフ法、ブレード法等、またアプリケーションとメータリングを同一部分でできるものとして、特公昭５８−４５８９号公報に開示されているワイヤーバー法、米国特許２６８１２９４号、同２７６１４１９号、同２７６１７９１号等に記載のスライドホッパ法、エクストルージョン法、カーテン法、スピン法、スプレー法が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が半導体微粒子からなる場合、電子受容層の膜厚が０．１〜２００μｍであるのが好ましく、より好ましくは０．１〜１００μｍであり、さらに好ましくは１〜３０μｍ、最も好ましくは２〜２５μｍである。これにより、単位投影面積当たりのプローブ物質および固定される増感色素量を増加して光電流量を多くするとともに、電荷再結合による生成した電子の損失をも低減することができる。また、導電性基材１m2当たりの半導体微粒子の塗布量は０．５〜４００gであるのが好ましく、より好ましくは５〜１００gである。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質がインジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）または酸化スズにフッ素をドープした金属酸化物（ＦＴＯ）を含んでなる場合、電子受容層の膜厚が１ｎｍ以上であるのが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ〜１μｍである。

本発明の好ましい態様によれば、半導体微粒子を導電性基材上に塗布した後に加熱処理を施すのが好ましい。これにより、粒子同士を電気的に接触させ、また、塗膜強度の向上や支持体との密着性を向上させることができる。好ましい加熱処理温度は、４０〜７００℃であり、より好ましくは１００〜６００℃である。また、好ましい加熱処理時間は１０分〜１０時間程度である。

また、本発明の別の好ましい態様によれば、ポリマーフィルムなど融点や軟化点の低い導電性基材を用いる場合にあっては、熱による劣化を防止するため、高温処理を用いない方法により膜形成を行うのが好ましく、そのような膜形成方法の例として、プレス、低温加熱、電子線照射、マイクロ波照射、電気泳動、スパッタリング、ＣＶＤ、ＰＶＤ、蒸着等の方法が挙げられる。

こうして得られた作用電極の電子受容層の表面にはプローブ物質が担持される。作用電極へのプローブ物質の担持は公知の方法に従い行うことができる。本発明の好ましい態様によれば、プローブ物質として一本鎖の核酸を用いる場合には、作用電極表面に酸化層を形成させておき、この酸化層を介して核酸プロ−ブと作用電極とを結合させることにより行うことができる。このとき、核酸プローブの作用電極への固定化は、核酸の末端に官能基を導入することにより行うことができる。これにより、官能基が導入された核酸プロ−ブはそのまま固定化反応により担体上に固定化されることができる。核酸末端への官能基の導入は、酵素反応もしくはＤＮＡ合成機を用いて行なうことができる。酵素反応において用いられる酵素としては、例えば、タ−ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ−ゼ、ポリＡポリメラ−ゼ、ポリヌクレオチドカイネ−ス、ＤＮＡポリメラ−ゼ、ポリヌクレオチドアデニルトランスフェラ−ゼ、ＲＮＡリガ−ゼを挙げることができる。また、ポリメラ−ゼチェインリアクション（ＰＣＲ法）、ニックトランスレ−ション、ランダムプライマ−法により官能基を導入することもできる。官能基は、核酸のどの部分に導入されてもよく、３'末端、５'末端もしくはランダムな位置に導入することができる。

本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブの作用電極への固定化のため官能基として、アミン、カルボン酸、スルホン酸、チオール、水酸基、リン酸等が好適に使用できる。また、本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブを作用電極に強固に固定化するためには、作用電極と核酸プローブの間を架橋する材料を使用することも可能である。そのような架橋材料の好ましい例としては、シランカップリング剤、チタネートカップリング剤や、ポリチオフェン、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン等の導電性ポリマーが挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、核酸プロ−ブの固定化を物理吸着という、より簡単な操作で効率よく行うことも可能である。電極表面への核酸プロ−ブの物理吸着は、例えば、以下のように行なうことができる。
まず、電極表面を、超音波洗浄器を用いて蒸留水およびアルコ−ルで洗浄する。その後、電極を核酸プロ−ブを含有する緩衝液に挿入して核酸プロ−ブを担体表面に吸着させる。

また、核酸プローブの吸着後、ブロッキング剤を添加することにより、非特異的な吸着を抑制することができる。使用可能なブロッキング剤としては、核酸プローブが吸着していない電子受容層表面のサイトを埋めることができ、かつ電子受容物質に対して化学吸着あるいは物理吸着等により吸着可能な物質であれば限定されないが、好ましくは化学結合を介して吸着可能な官能基を有する物質である。例えば、酸化チタンを電子受容層として用いる場合における好ましいブロッキング剤の例としては、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基、水酸基、アミノ基、ピリジル基、アミド等の酸化チタンに吸着可能な官能基を有する物質が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が互いに分離された複数の領域毎に区分されて担持されてなり、光源による光照射が各領域に対して個別に行われるのが好ましい。これにより、複数の試料を一枚の作用電極上で測定することができるので、ＤＮＡチップの集積化等が可能となる。本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が担持された、互いに分離された複数の領域がパターニングされており、光源から照射される光でスキャニングしながら、各領域の試料について被検物質の検出または定量を一度の操作で連続的に行うことが好ましい。

本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域に複数種類のプローブ物質を担持させることができる。これにより、領域の個数に、各領域毎のプローブ物質の種類数を乗じた数の、多数のサンプルの測定を同時に行うことができる。

本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域毎に異なるプローブ物質を担持させることができる。これにより、区分された領域の数に相当する種類数のプローブ物質を担持させることができるので、多種類の被検物質の測定を同時に行うことができる。この態様は、各領域毎に異なる被検物質の分析が可能なため、一塩基多型の解析（ＳＮＰｓ）の多項目解析に好ましく利用することができる。

対電極
本発明に用いる対電極は、電解質媒体に接触させた場合に作用電極との間に電流が流れることができるものであれば特に限定されず、ガラス、プラスチック、セラミックス等の絶縁性の支持体に、金属もしくは導電性の酸化物を蒸着したものが使用可能である。また、対電極としての金属薄膜を５μｍ以下、好ましくは３ｎｍ〜３μｍの範囲の膜厚になるように、蒸着やスパッタリングなどの方法により形成して作成することもできる。対電極に使用可能な材料の好ましい例としては、白金、金、パラジウム、ニッケル、カーボン、ポリチオフェン等の導電性ポリマー、酸化物、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス等が挙げられ、より好ましくは、白金、カーボンであり、最も好ましくは白金である。これらの材料は電子受容層の形成方法と同様の方法により薄膜形成が可能である。

測定方法および装置
本発明の方法にあっては、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を前記作用電極に固定させる。このとき、試料液の溶媒として後述する本発明の緩衝溶液を用いることにより、作用電極による被検物質の検出感度を向上させることができる。

本発明の好ましい態様によれば、増感色素で予め標識された一本鎖の核酸を被検物質とする場合、プローブ物質である一本鎖核酸との間でハイブリダイゼーション反応を行なうことができる。ハイブリダイゼーション反応の好ましい温度は３７〜７２℃の範囲であるが、その最適温度は使用するプロ−ブの塩基配列や長さ等により異なる。

本発明の別の好ましい態様によれば、被検物質およびプローブ物質の結合体（例えばハイブリダイゼーション後の二本鎖核酸）にインターカレーション可能な増感色素を用いる場合には、試料液に増感色素を添加することにより結合体を特異的に増感色素で標識することができる。

本発明の好ましい態様によれば、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させた作用電極を洗浄液で洗浄することにより、作用電極に結合しなかった被検物質を除去するのが好ましい。このときの洗浄液は、界面活性剤をさらに含むものであってよい。

本発明の方法にあっては、被検物質が増感色素と共に固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、作用電極に光を照射して増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出する。作用電極および対電極の相対的な位置関係は、互いに電気的に短絡することなく、なおかつ電解質媒体に接触しさえしていれば限定されるものではなく、互いに対向させて配置してもよいし、あるいは同一平面上に互いに離間させて配置してもよい。なお、作用電極および対電極が同一平面上に互いに離間させて配置される場合には、作用電極と対電極との間の電気的な短絡を防止するために絶縁基板上に両電極が設けられるのが望ましい。

このような測定用セルの一例を図４及び図５に示す。図４及び図５に示される測定用セル２１は、作用電極２２と対電極２３とにより挟まれて形成された空隙２４内に電解液が充填されてなる。作用電極２２は、導電性基材２６と電子受容層２７とを備えてなり、電子受容層２７側を電解液に接触させるように配置される。作用電極２２と対電極２３との間には絶縁スペーサ２５が挿入されることにより、電解液を収容する空間２４が確保されている。電極間の距離は酸化還元のサイクルを効率良く行わせるためには短い方が好ましく、工作的な精度との兼ね合いから数十μｍであることが望ましい。また、いわゆるＭＥＭＳのような製造方法を利用するのであれば、より近接した電極間距離とすることも可能である。

作用電極２２の上方には光源２８が光源カバー２９を介して配置される。すなわち、作用電極２２の裏側（すなわち導電性基材）から光を照射させて、作用電極（すなわち導電性基材および電子受容層）を透過した光が増感色素を励起するようにセルが構成されている。もっとも、対電極を透光性の材料で構成することにより光を対電極の裏側から照射してもよく、あるいは、作用電極および対電極に平行に光を照射してもよいのは言うまでもない。本発明に用いる光源としては、標識色素を光励起できる波長の光を照射できるものであれば限定されず、好ましい例としては、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色、青、緑、赤）、レーザー（ＣＯ_２レーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光を用いることができ、より好ましくは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色、青、緑、赤）、太陽光等を挙げることができる。また、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを照射してもよい。

図６は他の測定用セルの一例の断面図、図７は同測定用セルの分解斜視図であり、基板３０上に対電極２３が設けられ、この基板３０には電解液または洗浄液の供給孔３１および排出孔３２が形成され、対電極２３上には電解液を収容する空間２４を有する絶縁スペーサ２５が配置され、この絶縁スペーサ２５上に作用電極２２が設けられ、この作用電極２２の空間２４に臨む面に複数の電子受容層２７が離間して形成されている。

そして、対電極２３と干渉しないように前記基板３０を貫通して作用電極用接点３３が設けられている。この作用電極用接点３３は電子受容層２７に結合したプローブを電気的接点とすることで電極の取り出しを行っている。

また、前記作用電極２２の上には押え部材３４が設けられ、この押え部材３４には前記複数の電子受容層２７のそれぞれに対応した位置に貫通孔３５が形成されている。この貫通孔３５を介して、光源２８からの光が作用電極２２に照射される。そして、作用電極２２および対電極２３間には電流計３６が接続され、光照射により系内を流れる光電流が電流計により測定される。

本発明の好ましい態様によれば、互いに異なる光波長で励起可能な二種以上の増感色素を用いて複数種類の被検物質を個別に検出する場合、光源から波長選択手段を介して特定波長の光を照射することにより、複数の色素を個別に励起することが可能である。波長選択手段の例としては、分光器、色ガラスフィルタ、干渉フィルタ、バンドパスフィルタ等が挙げられる。また、増感色素の種類に応じて異なる波長の光を照射可能な複数の光源を用いてもよく、この場合の好ましい光源の例としては、特定波長の光が照射されるレーザ光やLEDを用いてもよい。また、作用極に光を効率よく照射するため、石英、ガラス、液体ライトガイドを用いて導光してもよい。

本発明の好ましい態様によれば、光源から放射される光がもともと紫外線を実質的に含まないか、または光源からの光の照射が紫外線を除去する手段を介して行われるのが好ましい。これにより、照射光に４００ｎｍ以下の波長の紫外線が含まれる場合に発生しうる電子受容物質自体の光励起によるバックグランド電流、すなわちノイズを効果的に抑制して、より精度の高い測定が可能となる。なお、増感色素は一般的に可視光の吸収により励起されることができるため、紫外線を除去したとしても可視光の照射により高い感度で光電流を検出することが可能である。

紫外線を除去する手段の好ましい例としては、光学フィルタ、および分光器が挙げられる。光学フィルタまたは分光器を用いることにより、照射光の波長を制御することができ、作用電極自体の光励起を防止しつつ、増感色素のみを励起することが可能となる。好ましい光学フィルタの例としては、紫外線カットフィルタ等の色ガラスフィルタが挙げられる。好ましい分光器の例としては、厳密な波長制御が可能な点で、回折格子が内蔵された分光器が挙げられる。

紫外線を実質的に含まない光を放出する光源の好ましい例としては、レーザ、無機エレクトロルミネッセンス（ＥＬ）素子、有機エレクトロルミネッセンス（ＥＬ）素子、発光ダイオード（ＬＥＤ）が挙げられるが、最も好ましくは発光ダイオード（ＬＥＤ）またはレーザダイオードである。これらによれば、波長分布の狭い制御された光を照射することができ、小型、軽量、低消費電力、および長寿命といった利点も得られる。

本発明のより好ましい態様によれば、使用する電子受容物質についての既知のバンドギャップを下記式に代入して算出される、表１に示されるカットオフ波長よりも短い波長の光を除去することが好ましい。これにより、電子受容物質の特性に応じて、バックグランド電流の発生を効果的に抑制できる。
バンドギャップ（ｅＶ）＝ｈν ＝ｈｃ／λ ＝１２３９．８／λ（ｍｍ）（ｈ：プランク定数、ｃ：光速）

なお、電子受容物質には不純物準位を含む場合があるため、万全を期して、カットオフ波長を表１に示される波長よりも長波長側に設定しても構わない。また、作用電極が複数の電子受容物質で構成されている場合には、構成成分のうち最もバンドギャップが狭い成分のカットオフ波長よりも短い波長を除去するのが好ましい。

前記したように、作用電極２２および対電極２３間には電流計３６が接続され、光照射により系内を流れる光電流が電流計により測定される。これにより、被検物質を検出することができる。その際の電流値は作用電極上にトラップされた増感色素の量を反映する。例えば、被検物質が核酸の場合、相補性のある核酸間で形成された二本鎖の量が、電流値となり反映される。したがって、得られた電流値から被検物質を定量することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、電流計が、得られた電流量または電気量から試料液中の被検物質濃度を算出する手段をさらに備えてなるのが好ましい。

本発明の好ましい態様によれば、光電流を検出する工程が、電流値を測定し、得られた電流値または電気量から試料液中の被検物質濃度を算出することができる。この被検物質濃度の算出は、予め作成された被検物質濃度と電流値または電気量との検量線と、得られた電流値または電気量とを対比することにより行うことができる。本発明の方法にあっては、電流値は作用電極上にトラップされた増感色素の量が反映されるので、被検物質濃度に対応した正確な電流値が得られるため、定量測定に適する。

本発明の別の好ましい態様によれば、予め増感色素で標識された被検物質を競合物質として用いて、増感色素で標識されていない、プローブ物質に特異的に結合可能な第二の被検物質を定量することができる。第二の被検物質はプローブ物質に標識済被検物質よりも特異的に結合しやすい性質を有するのが好ましい。これら二種類の被検物質を競合させてプローブ物質に特異的に結合させると、検出される電流値と第二の被検物質の濃度との間に相関関係が得られる。つまり、色素標識されていない第二の被検物質の数が増加するにつれ、プローブ物質に特異的に結合する競合物質の数が減少するため、第二の被検物質濃度の増加につれて、検出電流値が減少する検量線を得ることができる。したがって、増感色素で標識されていない第二の被検物質の検出および定量が可能となる。

本発明のより好ましい態様によれば、被検物質および第二の被検物質が抗原であり、プローブ物質が抗体であるのが好ましい。この態様における被検物質および第二の被検物質のプローブ物質への固定化工程を図８に示す。図８に示されるように、増感色素で標識された抗原４１と、色素標識されていない抗原４２とが競合して抗体４３に特異的に結合する。したがって、色素標識されていない抗原４２が増加するにつれ、抗体に特異的に結合する色素標識された抗原４３が減少するため、第二の被検物質濃度の増加につれて、検出電流値が減少する検量線を得ることができる。

フロー型測定用セルおよびパターニング電極を用いた測定方法および装置
本発明の方法および装置の好ましい実施態様の一例として、フロー型測定用セルおよびパターニング電極を用いた測定方法および装置について説明する。図９に、装置の全体構造を示す。図９に示される装置５０は、フロー型測定用セル５１と、光源５２と、電解液タンク５３と、洗浄液タンク５４と、供給ポンプ５５と、電流計５６と、排出ポンプ５７とを備えてなる。フロー型測定用セル５１は、パターニングされた作用電極５８と、作用電極に対向する対電極５９とを備えてなり、作用電極５８および対電極５９の間に、電解液または洗浄液を収容しかつ流すことができる流路が形成される。すなわち、供給ポンプ５５により測定用セル５１内に供給された電解液または洗浄液は、作用電極５８および対電極５９に接触しながら流路を通過した後、排出ポンプ５７により測定用セル５１外に排出されるように構成されている。これら一連の動作の制御および光電流値の解析は図示しない制御解析装置により行われることができる。

作用電極５８は、電子受容層上にプローブ物質が担持された、互いに分離された複数の領域がパターニングされており、光源から照射される光でスキャニングしながら、各領域の試料について被検物質の検出または定量を一度の操作で連続的に行えるように構成されている。このようにパターニングされた作用電極の例を図１０（ａ）〜（ｄ）および図１１（ａ）〜（ｃ）に示す。

図１０（ａ）および（ｂ）に示される作用電極５８は、導電性基材５８ａの全面に形成された電子受容層５８ｂ上に、プローブ物質５８ｃが担持された複数のスポット６０が縦横方向にパターニングされたものである。そして、この作用電極５８の導電性基材にリード線６１が施され、このリード線６１を介して作用電極５８全体が電流計５６に接続されている。この作用電極５８によれば、各スポットに順次光照射を行うことにより、対電極５９との間で発生する光電流を各スポット毎に測定することができる。また、電極の構成が比較的簡単なため電極の作製が容易であり、従来のＤＮＡチップの製造技術を利用できるとの利点もある。また、変形例として、図１０（ｃ）に示されるように電子受容層５８ｂ自体をスポット状に形成してその上にプローブ物質５８ｃを担持させる、あるいは、図１０（ｄ）に示されるように導電性基材を省略して電子受容層５８ｂのみでスポット状の作用電極５８を構成してその上にプローブ物質５８ｃを担持させ、かつ電子受容層５８ｂにリード線６１を施してもよく、特に後者にあっては、製造工程が簡略化されるとともに製造コストも低減できるとの利点がある。この作用電極に使用される光源５２としては、図１２に示されるように作用電極５８上を縦横方向に移動する光源であるか、または図１３に示されるように作用電極５８の各スポットに対応して複数の光源が配列させておき、各光源を順に点灯および消灯させるものであってよい。

図１１（ａ）および（ｂ）に示される作用電極５８’は、絶縁基板５８ｄ’に導電性基材５８ａ’および電子受容層５８ｂ’からなる複数のスポット６０’が縦横方向にパターニングされており、電子受容層５８ｂ’上にプローブ物質５８ｃ’が担持される。そして、各スポット６０’の導電性基材には個別にリード線６１’が施され、このリード線６１’を介して各スポット６０’が電流計５６に接続されている。この作用電極５８’によれば、作用電極の全面に光を同時に照射するだけで、各スポットに発生する光電流を同時にかつ個別に測定することができる。また、各スポットにおける光電流を個別に測定することができるので、他のスポットで発生した光電流をノイズとして拾うことが無いとの利点もある。また、変形例として、図１１（ｃ）に示されるように導電性基材を省略して電子受容層５８ｂ’のみでスポット状の作用電極５８’を構成してその上にプローブ物質５８ｃ’を担持させ、かつ電子受容層５８ｂ’にリード線６１’を施してもよく、製造工程が簡略化されるとともに製造コストも低減できるとの利点がある。この作用電極５８’に使用される光源５２は、図９の作用電極の場合と同様、作用電極５８上を縦横方向に移動する光源であるか、または作用電極５８の各スポットに対応して複数の光源が配列させておき、各光源を順に点灯および消灯させるものであってよい。

この装置を使用した測定方法の一例について以下に説明する。
まず、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を作用電極５８に固定させる。このとき、作用電極の電子受容層に図１０に示されるスポットパターンのマスキングを施して、プローブ物質が担持された複数のスポット６０が縦横方向にパターニングされた作用電極５８を得る。こうして得られた作用電極５８をフロー型測定用セル５１に装着する。

次いで、供給ポンプ５５を作動させて電解液タンク５３から電解液を測定用セル５１内に送り込み、測定用セル内の流路を電解液で満たした後、送液を停止する。光源５２から作用電極５８に光を照射し、電流計５６により作用電極５８および対電極５９間に発生する光電流を測定する。この光電流値の測定にあっては、光電流値が安定する、照射開始後数十秒後の値を採用するのが好ましい。そして、図示しない制御解析装置において、得られた電流値と、予め作成された被検物質濃度と電流値との検量線とを対比することにより被検物質濃度が算出される。光電流の測定終了後、供給ポンプ５５を作動させて洗浄液タンク５３から洗浄液を測定用セル５１内に送り込むと同時に、測定用セル５１内の電解液を排出ポンプ５７を作動させて排出し、測定用セル内の流路内の電解液で洗浄液で置換した後、送液および排液を停止する。これにより、洗浄液で洗浄化された測定用セル５１を用いて、次の測定を上記同様の手順で行うことができる。

光照射機構を備えた測定装置
本発明の好ましい態様によれば、光源があらかじめ複数個設けられてなり、かつ前記測定装置が、該複数個の光源を切り替えて照射する、複数固定型の光照射機構を備えてなるのが好ましい。

本発明の別の好ましい態様によれば、前記測定用セル中の作用電極に対し、前記光源がＸＹ方向へ移動することによって、作用電極上の任意の領域に光照射する、光源移動型の光照射機構を備えてなるのが好ましい。この態様の装置としては、例えば、ＸＹ方向に移動可能なアームに光源を取り付け、測定用セルとしてのセンサユニットを固定した装置が挙げられる。このような態様の測定装置の一例の全体斜視図が図１４（ａ）に、その上面図が図１４（ｂ）に示される。図１４に示されるように、センサユニット５９は固定されており、センサユニット５９開口部へ光源６０が移動して光照射を行う。図１４では、ＸＹ方向への移動機構として、モーター６１の回転をベルト６２によって直線運動に変換するベルトドライブ機構が例示されているが、その他の機構、たとえばラックピニオン機構をモーターで駆動する機構なども使用できる。モーター回転の開始、停止および回転速度を制御することによって、センサユニット内に格納したセンサチップ上の生体分子固定化領域（スポット）に対し順次光照射を行うことができ、その際の照射速度や照射時の移動の有無を設定できる。この時使用するセンサユニットは本発明の電解質媒体を対電極と作用電極の間に装填できるような構造を有するものであればよい。光源は、ＸＹ移動時に、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を照射する際に停止してもよいし、あるいは前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を連続的に移動してもよい。

本発明のさらに別の好ましい態様によれば、前記光源が固定され、該固定された光源に対し、前記測定用セルがＸＹ方向へ移動することによって、作用電極上の任意の領域に光照射する、セル移動型の光照射機構を備えてなるのが好ましい。この態様の装置としては、ＸＹ方向に移動可能なステージに測定用セルとしてのセンサユニットを取り付け、光源を固定した装置が挙げられる。このような態様の測定装置の一例の全体斜視図が図１５（ａ）に、その上面図が図１５（ｂ）に示される。図１５に示されるように、光源６０は固定されており、センサユニット５９を載せたステージ６３がＸＹ移動することで、センサユニット開口部への照射を行う。図１５では、ＸＹ方向への移動機構として、モーター６４の回転をベルト６５によって直線運動に変換するベルトドライブ機構が例示されているが、その他の機構、たとえばラックピニオン機構をモーターで駆動する機構なども使用できる。モーター回転の開始、停止および回転速度を制御することによって、センサユニット５９内に格納したセンサチップ上の生体分子固定化領域（スポット）に対し順次光照射を行うことができ、その際の照射速度や照射時の移動の有無を設定できる。この時使用するセンサユニット５９は本発明の電解質媒体を対電極と作用電極の間に装填できるような構造を有するものであればよい。測定用セルは、ＸＹ移動時に、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を照射する際に停止してもよいし、あるいは前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を連続的に移動してもよい。

図１４に示される装置における光源移動型の光照射機構の一例として、光源６０がＸＹ移動機構６６に取り付けられた装置構成図を図１６に示す。また、図１５に示される装置におけるセル移動型の光照射機構の一例として、センサユニット６３がＸＹ移動機構６６に取り付けられた装置構成図を図１７に示す。図１６および１７に示されるように、光源６０のオンオフ、ＸＹ移動機構６６の制御、電流計６７の制御や電流信号の受信はインターフェースボード６８を介してコンピュータ６９によって行う。この時、コンピュータ６９は外部取り付けのＰＣを用いてもよいし、あるいは、装置内に組み込まれたマイコンを用い、入力装置７０、表示装置７１、および記憶装置７２も測定装置内に組み込んでもよい。入力装置７０、表示装置７１、および記憶装置（図示せず）の機能を装置内組込みのマイコンと外部取り付けのＰＣに適宜振り分けて機能させることもできる。このような照射光移動機構を備えた測定装置の一例の外観斜視図を図１８に示す。図１８に示されるように、動作条件入力のためのキー、ボタンなどの入力装置７０、設定条件や測定結果の表示装置７１、および記憶装置が組み込まれた装置とすることができる。また、これらの機能をすべて外付けのＰＣで行うことも可能である。

ＭＥＭＳのような製造方法を利用した光電流検出装置
ＭＥＭＳのような製造方法を利用した光電流検出装置の一例の概略斜視図を図１９に、この装置の構成図を図２０に、この装置に使用される検出チップの分解斜視図を図２１に示す。光電流検出装置７３には光源７４、電流計７５、検出チップ７６を固定できる機能、検出チップ７６の吸引口７７を介して吸引するポンプ７８が設けられている。光源７４（複数個）、作用電極７９の切り替え（本例は図１１に示したパターニング電極を用いた例を示す）、吸引ポンプ７７、電流計７５の制御や電流信号の受信はインターフェースボード８０を介してコンピュータ８１によって行う。この時、コンピュータ８１は装置内に組み込まれたマイコンを用い、入力装置８２、表示装置８３、記憶装置８４も測定装置に組み込まれている。入力装置８１では動作条件、設定条件の入力のためのキー、ボタン設けられ、表示装置８２には測定結果が表示される。記憶装置８３では測定結果の記憶を行うことができる。検出チップ７６は下部部材８５、電極基板８６、ＰＤＭＳチップ８７、上部部材８８から構成されており、下部部材８５には光源７４の光を通すための開口部８９が備えられている。電極基板８６には作用電極７９、対電極９０、及び読取装置と電気的に接続するための端子９１が設けられている。ＰＤＭＳチップ８７には送液用流路９２、廃液溜め９３が設けられ、上部部材８８の電解液注入口９４、洗浄液注入口９５、試料溶液注入口９６に連結した溶液口９７、９８、９９も設けられている。上記ＭＥＭＳのような製造方法を利用した光電流読取装置及び検出チップを用いることにより、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検物質を微量な試料溶液でかつ簡単な操作で測定することができる。

作用電極との接触下で使用される緩衝溶液
本発明の好ましい態様によれば、作用電極との接触下で使用される緩衝溶液として、カルボキシル基、リン酸基、およびアミノ基を含まない緩衝剤と、溶媒とを含んでなる緩衝溶液を用いるのが好ましい。作用電極との接触下での使用の例としては、プローブ物質を作用電極に固定化させる処理、被検物質をプローブ物質を介して作用電極に固定化させる処理、被検物質の固定化後の作用電極を洗浄する処理等が挙げられる。そして、上記緩衝剤を含む緩衝溶液を用いることにより、測定対象物および作用電極の特性を阻害することなく、光電流による被検物質の検出感度を飛躍的に向上させることができる。この傾向は、作用電極の表面が酸化チタンやチタン酸ストロンチウムからなる場合において、特に顕著である。

上記緩衝溶液を使用すると検出感度が飛躍的に向上する理由は定かではないが、一般的な生化学分野で使用される、リン酸緩衝液、およびアミンもしくはカルボン酸を主成分とする緩衝溶液と異なり、作用電極との相互作用が起こりにくいためではないか、と考えられる。すなわち、緩衝剤がカルボキシル基、リン酸基、およびアミノ基を含むと、これらの基が作用電極に対して何らかの相互作用をして、作用電極上のプローブ物質の剥離や色素から作用電極への電子注入の阻害を引き起こし、その結果検出電流値の値を低下を招くのではないかと考えられるが、本発明はこれに限定されるものではない。

上記緩衝剤は、カルボキシル基、リン酸基、およびアミノ基を含まない化学構造を有し、かつ緩衝作用を有するものである限り限定されないが、好ましい緩衝剤としては、下記式（Ｉ）：

（式中、Ｒ１はヒドロキシル基で置換されていてもよい、炭素数が１〜４のアルキレン基であり、Ｘはスルホン酸基またはその塩であり、ＡはＯまたはＹＲ２−Ｎ（ここで、Ｒ２はＲ１と同義であり、Ｙはスルホン酸基もしくはその塩またはヒドロキシル基である））で表される化合物が挙げられる。これらの緩衝剤は、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検物質を安定に保持させて測定精度を向上させるといった利点を有する。

本発明の好ましい態様によれば、アルキレン基がエチレン基であるのが好ましい。このような緩衝剤の具体例としては、２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、セスキナトリウム塩（ＰＩＰＥＳｓｅｓｑｕｉｓｏｄｉｕｍ）、および２−モルフォリノエタンスルホン酸(ＭＥＳ)が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、アルキレン基がプロピレン基であるのが好ましい。このような緩衝剤の具体例としては、３−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−[４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジニル]プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、およびピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシル−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、緩衝剤の濃度を１〜２００ｍＭとするのが好ましく、より好ましくは１〜１００ｍＭ、さらに好ましくは１０〜５０ｍＭである。

上記緩衝溶液に用いる溶媒は、被検物質および作用電極の特性を阻害しないものであれば限定されない。

本発明の好ましい態様によれば、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検物質を安定に保持させて測定精度を向上させるためには、緩衝溶液のｐＨを５，０〜９．０とするのが好ましく、より好ましくは６．０〜８．０、さらに好ましくは６．５〜７．５とする。

上記緩衝溶液の用途は、本発明の方法に用いられる作用電極との接触下で使用される溶液であれば限定されないが、好ましい用途としては、上述の通り、被検物質を含有する試料液の溶媒、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を含む溶液の溶媒、および作用電極ないし測定用セルの洗浄液等が挙げられる。

以下の例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

例１（参考）
本例はシランカップリング剤を介した結合でも光電変換が可能なことを示すものである。具体的には、FTOガラスおよびITOガラスの導電面をシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。このアミノ基と活性エステル基を持つ色素を反応させて、共有結合により色素を固定化した。これに励起光を照射して光電流を測定した。その詳細は以下の通りである。

フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO₂：FTO）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗：15Ω/□）およびスズをドープした酸化インジウム（Sn-InO₂：ITO）コート硝子（東洋精密工業株式会社製、100Ω/□）をアセトン、0.1vol% Tween20を含む超純水、さらに超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後で水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を水を入れ替えて3回行った。ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させてから無水メタノールに浸漬させて脱水した。

カップリング処理用の溶液は95%メタノール5%超純水を溶媒として、3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）を2vol%となるように加え、室温下で5分間の攪拌を行って調製した。

このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。それからガラスを取り出し、メタノール中で10回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、メタノールを3回換えて行った。その後110℃で30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、これにスペーサ用穴あき（5mm角）テープを貼り、ピンセットの先を用いてテープ接着面に残存する空気を除去した。さらにその上に5mm角の大きさの開口部が形成されたシリコンシートを載置して密着させた。

続いて50mM HEPES pH7.0に溶かして100μMに調整した活性エステル基を持つローダミン（Tetramethylrhodamine Protein Labeling Kit，Molecular Probes社）、または活性エステル基を持つCy5（Cy5 Mono-Reactive Dye Pack，Amersham Biosciences社）を先に用意したガラス上の開口部に均一に行き渡るように25μlを充填した。そして色素溶液中に気泡が入らないようにプレパラートガラスで真上から蓋をして、湿らせた紙などで蒸気圧が調製されたプラスチック容器に収容し、37℃で一晩インキュベートさせた。

インキュベート終了後プレパラートガラスを取り外し、超純水中で振盪させて洗浄した（10分間×3セット）。その後で空気を吹き付けて残水を除去し、室温で乾燥させた。

こうして得られた作用電極をフロー型測定セル（装置の実施例１）に組み込んだ。セル部分の構成は作用電極を白金対電極と対向させ、両電極間の接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が500μmのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには5mm角よりも十分大きい穴が空いており、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上のプローブ固定化面が接触する構造になっている。作用電極は電気的に接しているスプリングプローブを介して、白金電極は端部に接続されたリード線を介してポテンシオスタット（ビー・エー・エス株式会社ALS Model832A）に接続した。電解液として、体積比が7：3のアセトニトリルと炭酸エチレンの混合溶媒にヨウ素0.01Mとテトラプロピルアンモニウムヨーダイド0.1Mを溶解した混合液を用意した。この電解液を先に述べたフロー型測定セルに組み込まれた作用電極と白金対電極の間に充填させた。続いてフロー型測定セルに固定したLED（CCS株式会社，ローダミンの場合はHLV-24GR-NR-3W 中心波長：530nm 出力：67mW、Cy5の場合はHLV-27-NR-R 中心波長：627nm 出力：67mW）を光源として作用電極表面に照射して、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。測定は180秒間行ったが、光源の照射は電流の測定開始60秒後から60秒間のみ実施した。観測した電流値は120秒後の値から180秒後の値を差し引くことで補正を行った。

その結果、FTO電極及びITO電極を用いた場合の光電流値は、それぞれ図２２（ａ）および（ｂ）に示される通りであった。これらの図から、色素に由来する光電流はシランカップリング剤を介した時の方が、介していない時よりも大きくなることが確認できた。このことからシランカップリング剤により色素の固定化量が増えたこと、およびシランカップリング処理をした後でも電極の導電性が確保されていることが分かった。以上のことからシランカップリング処理を施したFTOガラスおよびITOガラスは色素増感型バイオセンサの作用電極を構成する材料として利用可能であることを示すことが出来た。

例２（参考）
本例は相補的ＤＮＡと非相補的ＤＮＡの観測される電流値の差を示すものである。具体的には、FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。このアミノ基とプローブDNAを静電的に結合させ、さらに紫外光を照射してプローブを共有結合で電極上に固定化した。これとCy5で標識したターゲットDNAとをハイブリダイゼーションさせてから励起光を照射して光電流を測定した。その詳細は以下の通りである。

フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO2：FTO）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗：15Ω/□）をアセトン、0.1vol% Tween20を含む超純水、さらに超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後で水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を水を入れ替えて3回行った。ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させてから無水メタノールに浸漬させて脱水した。

続いて2×SSCに溶かして1μMに調製したプローブDNA（5’NH2-ACCTTCATCAAAAACATCATCATCC3’）を95℃で5分間保持した後直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、先に用意したガラス上の開口部に均一に行き渡るように25μlを充填した。

これを75℃で1時間保持して溶媒を蒸発させた後でシリコンシートを剥がし、UVクロスリンカー（UVP社CL-1000型）で120mJの紫外光を照射して、プローブを固定化した作用電極とした。

この作用電極を超純水中で10回ほど振盪させてSSC成分（NaClとクエン酸ナトリウム）を除く操作を、超純水を2回換えて行った。それから沸騰水に2分間浸漬させ、取り出してから空気を吹き付けて残水を飛散させた。続いて4℃の無水エタノールに1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。次に5mm角の大きさの開口部が形成されたシリコンシートを作用電極上に載置して密着させた。

続いて5×SSC＋0.5%SDSに溶かして10nMの濃度に調整した、プローブと相補的なDNA（5’GGATGATGATGTTTTTGATGAAGGT-Cy5-3’）と、非相補的なDNA（5’TTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG-Cy5-3’）を95℃で5分間保持した後直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、先に用意した作用電極上の開口部にそれぞれ均一に行き渡るように25μlを充填した。そしてDNA溶液中に気泡が入らないようにプレパラートガラスで真上から蓋をして、湿らせた紙などで蒸気圧が調製されたプラスチック容器に収容し、37℃で一晩インキュベートさせた。

インキュベート終了後プレパラートガラスを取り外し、37℃に加温した2×SSC＋0.1%SDSで作用電極を2秒間ほど洗浄した。電極をスライドガラスに立てて以下の手順で洗浄を行った。
(1)2×SSC＋0.2%SDS 室温振盪3分×液を換えて3回
(2)0.2×SSC＋0.2%SDS 常温振盪3分×液を換えて2回
(3)0.2×SSC＋0.2%SDS 37℃ 振盪10分×液を換えて2回
(4)0.2×SSC＋0.2%SDS 常温振盪3分×1回
(5)0.2×SSC 常温振盪10回×液を換えて3回
(6)超純水常温振盪10回×液を換えて2回
(7)空気を吹き付けて残水を除去

こうして得られた作用電極をフロー型測定セルに組み込んだ。セル部分の構成は作用電極を白金対電極と対向させ、両電極間の接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が500μmのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには5mm角よりも十分大きい穴が空いており、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上のプローブ固定化面が接触する構造になっている。作用電極は電気的に接しているスプリングプローブを介して、白金電極は端部に接続されたリード線を介してポテンシオスタット（ビー・エー・エス株式会社ALS Model832A）に接続した。電解液として、体積比が7：3のアセトニトリルと炭酸エチレンの混合溶媒にヨウ素10mMとテトラプロピルアンモニウムヨーダイド100mMを溶解した混合液を用意した。この電解液を先に述べたフロー型測定セルに組み込まれた作用電極と白金対電極の間に充填させた。続いてフロー型測定セルに固定したLED（CCS株式会社 HLV-27-NR-R 中心波長は627nm）を光源として作用電極表面に照射して、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。測定は180秒間行ったが、光源の照射は電流の測定開始60秒後から60秒間のみ実施した。観測した電流値は120秒後の値から180秒後の値を差し引くことで補正を行った。

その結果、図２３に示されるように、プローブと相補的なDNAを反応させた時、標識色素（Cy5）に由来する電流が観測された。一方非相補的なDNAを反応させた時はCy5に由来する電流は観測されなかった。このことから前述したプローブ固定化法で作製したDNAセンサは高感度で特異的であることを示すことが出来た。

例３
本例は金属ヨウ素を含む電解液と含まない電解液の電流値についての差を示すものであり、一塩基変換（ＳＮＰｓ）の検出には金属ヨウ素を含まない方が優れることを示す。具体的には、FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。このアミノ基とプローブDNAを静電的に結合させ、さらに紫外光を照射してプローブを共有結合で電極上に固定化した。これとローダミンで標識したターゲットDNAとをハイブリダイゼーションさせてから励起光を照射して光電流を測定し、ターゲットの一塩基変異を検出した。その詳細は以下の通りである。

続いて2×SSCに溶かして1μMに調製したプローブDNA（ターゲットと完全に相補的な塩基配列を持つもの：5'-NH2-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3'またはターゲットと相補的だが一塩基のみ異なる配列を持つもの：5'-NH2-AGGATGGGCCTCGGGTTCATGCCGC-3'）を95℃で5分間保持した後直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、先に用意したガラス上の開口部に均一に行き渡るように25μlを充填した。

この作用電極を超純水中で10回ほど振盪させてSSC成分（NaClとクエン酸ナトリウム）を除く操作を、超純水を2回換えて行った。それから沸騰水に2分間浸漬させ、取り出してから空気を吹き付けて残水を飛散させた。続いて4℃の無水エタノールに1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。

続いて5×SSC＋0.5%SDSに溶かして10nMの濃度に調整した、ターゲットDNA（Rho-DP53-t：5'-Rho-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3'）を95℃で5分間保持した後直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、先に用意した作用電極上の開口部にそれぞれ均一に行き渡るように10μlを充填した。そしてDNA溶液中に気泡が入らないようにプレパラートガラスで真上から蓋をして、湿らせた紙などで蒸気圧が調製されたプラスチック容器に収容し、37℃で一晩インキュベートさせた。

インキュベート終了後プレパラートガラスを取り外し、超純水で作用電極を2秒間ほど洗浄した。次に電極をスライドガラス洗浄用ラックに立てて以下の手順で洗浄を行った。
（１）0.2×SSC＋0.2% SDS 63℃ 3分間浸漬（５Lの水槽を使用）
（２）超純中水で振盪10回×液を換えて2回
（３）空気を吹き付けて残水を除去

こうして得られた作用電極をフロー型測定セルに組み込んだ。セル部分の構成は作用電極を白金対電極と対向させ、両電極間の接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が500μmのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには5mm角よりも十分大きい穴が空いており、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上のプローブ固定化面が接触する構造になっている。作用電極は電気的に接しているスプリングプローブを介して、白金電極は端部に接続されたリード線を介してポテンシオスタット（ビー・エー・エス株式会社ALS Model832A）に接続した。電解液として次の二種類を用意した。
（１）電解液Ａ
アセトニトリルを溶媒とし、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド100mMを溶解した。
（２）電解液Ｂ
アセトニトリルを溶媒とし、ヨウ素10mMとテトラプロピルアンモニウムヨーダイド100mMを溶解した。

上記電解液を先に述べたフロー型測定セルに組み込まれた作用電極と白金対電極の間にそれぞれ充填させた。続いてフロー型測定セルに固定したLED（CCS株式会社 HLV-24GR-NR-3W 中心波長：530nm，出力：67mW）を光源として作用電極表面に照射して、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。測定は180秒間行ったが、光源の照射は電流の測定開始60秒後から60秒間のみ実施した。観測した電流値は120秒後の値から180秒後の値を差し引くことで補正を行った。

その結果、ヨウ素を含まない電解液Ａおよびヨウ素を含む電解液Ｂにおける測定された電流値は、それぞれ図２４（ａ）および（ｂ）に示される通りであった。図２４に示されるように、完全相補鎖を固定化した電極（図中PM）と一塩基のみ異なる相補鎖を固定化した電極（図中SNP）を比較したところ、電解液Ａで測定した場合は平均電流値に有意差のあることが統計学的に示された（N数：5、危険率：1%）。このことから色素増感現象を利用した電流検出型チップで、核酸配列における一塩基変異を検出できることが立証された。
また電解液Ｂで測定したところ、電解液Ａに比べて電流値が低く、平均電流値に有意差はなかった（N数：5、危険率：1%）。微弱電流を検出する際はヨウ素を含まない電解液で測定を行う方がより望ましいことが確認できた。

例４
本例は、複数のスポットを用いて一塩基変換（ＳＮＰｓ）を検出した例である。具体的には、FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。プローブDNAを作用電極上に形成したスポットに担持し、この電極に、特定の位置の一塩基が異なる２つの5'末端Cy5標識ターゲットDNAをそれぞれハイブリダイゼーションさせ、特定の条件で洗浄した。作用電極の同一平面上にPtを形成して対極としたセルへ組み込み、作用電極に励起光を照射して光電流を測定し、プローブDNAごとの光電流を比較した。その詳細は以下の通りである。

電極へのプローブの担持
フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO2：FTO）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗：15Ω/□）をアセトン、0.1vol% Tween20を含む超純水、さらに超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後で水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を、水を入れ替えて3回行った。ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させてから無水メタノールに浸漬させて脱水した。

このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。それからガラスを取り出し、メタノール中で10回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、メタノールを3回換えて行った。その後110℃で30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、これにスペーサ用穴あきテープ（穴：φ=3mm×６スポット、厚さ：50μm）を貼った。このテープ上にφ=3mmの大きさの開口部がスポット数分形成されたシリコンシート（厚さ：1mm）を載置して密着させた。

続いて2×SSCに溶かして1μMに調製したプローブDNA（プロリゴ社製 5'-NH2-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3'）を95℃で5分間保持した後直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、各スポットの開口部に7μlずつ充填した。

これを75℃で1時間保持して溶媒を蒸発させた後でシリコンシートを剥がし、UVクロスリンカー（UVP社CL-1000型）で120mJの紫外光を照射して、プローブDNAを固定化した作用電極とした。

ハイブリダイゼーションおよび洗浄
続いて5'末端にCy5標識した2種類のターゲットDNA、すなわちプローブと完全に相補的なターゲットDNA-1)（プロリゴ社製 5'-Cy5-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3'）と、その5'末端から13番目のTがGに代わったターゲットDNA-2)（プロリゴ社製 5'-Cy5-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3'）を別々に5×SSC＋0.5%SDSに溶かしてそれぞれ1μMの濃度に調整した。これを95℃で5分間保持した後、それぞれ別々の3スポットの開口部に5μlずつ充填した。そしてDNA溶液中に気泡が入らないようにプレパラートガラスで真上から蓋をして、湿らせた紙などで蒸気圧が調製されたプラスチック容器に収容し、37℃で一晩インキュベートさせた。

インキュベート終了後プレパラートガラスを取り外し、電極をスライドガラスに立てて、63℃に加温した2×SSC＋0.1%SDS中で3分間振盪したのち、常温の超純水中で軽く振盪した後、空気を吹き付けて残水を除去した。

測定
こうして得られた作用電極をフロー型測定セル（装置の実施例２）に組み込み、フロー型測定セル上には光源移動用アリ式ステージ（駿河精機(株)製 B05-41M）を取り付けた。セル部分の構成は作用電極と白金対電極とを同一平面に配置し、両電極間に接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が500μmのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには全スポットが入る十分大きい穴が空いており、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上に固定化されたDNAが接触する構造になっている。作用電極、対電極共に、電気的に接しているスプリングプローブを介してポテンシオスタット（ビー・エー・エス株式会社 ALS Modl832A）に接続した。

電解液として、アセトニトリルにテトラプロピルアンモニウムヨーダイド100mMを溶解した溶液を用意した。この電解液を先に述べたフロー型測定セルに充填させた。

続いて光源移動用アリ式ステージに固定した赤色LED（CCS株式会社 HLV-27-NR-R 中心波長は627nm）を光源として作用電極表面に照射して、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。光源はアリ式ステージを移動させ、各スポットに光を照射した。測定は各スポット180秒間行ったが、光の照射は電流の測定開始60秒後から60秒間のみ行った。観測した光電流は120秒後の光電流値から180秒後の光電流値を差し引くことで補正を行った。

その結果、ターゲットDNAごとの光電流値、その平均値、標準偏差（N数は３）は表２に示される通りであった。これら平均値の差の検定をおこなったところ、有意差があると判定された(危険率５％)。すなわち、ターゲットDNAの一塩基の違いを検出することができた。

例５
本例は、色素標識一本鎖DNA固定化作用電極を作製した例である。

フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO₂：FTO）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗：12Ω/□、形状：50mm×26mm）をアセトン、0.1vol% Tween20を含む超純水、さらに超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後で水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を水を入れ替えて3回行った。ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させてから無水メタノールに浸漬させて脱水した。

このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。それからガラスを取り出し、メタノール中で10回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、メタノールを3回換えて行った。その後110℃で30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、φ=1mmの大きさの開口部が1mm間隔で49スポット形成されたPDMSシート（厚さ：1.5mm）を載置して密着させた。

続いて2×SSCに溶かして1μMに調製したローダミン標識ssDNA（30mer）を95℃で5分間保持した後、直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、先に用意したガラス上のPDMSシートの49開口部に2μlずつ充填した。これを75℃で1時間保持して溶媒を蒸発させた後でPDMSシートを剥がし、UVクロスリンカー（UVP社CL-1000型）で120mJの紫外光を照射して、ローダミン標識ssDNAを固定化した作用電極とした。

この作用電極を0.2％SDS溶液中で15分間×3回浸透させ、その後超純水中で振盪させてSSC成分（NaClとクエン酸ナトリウム）を除く操作を行った。それから沸騰水に2分間浸漬させ、取り出してから空気を吹き付けて残水を飛散させた。続いて4℃の無水エタノールに1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。こうして得られた４９カ所にＤＮＡを固定化した作用電極の概略図を図２５に示す。

例６
本例は光源がＸＹ移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を停止させて光電流検出を行った一例である。

図１４に示す光照射機構を有する装置に、例５の方法で作製した作用電極を装着し、ローダミン標識ssDNA固定化領域で光源を停止させて光電流測定した。この時、光源は光束径が１ｍｍ、波長５３０ｎｍ、出力５０ｍＷの緑色レーザーダイオードを用いた。光照射時には対電極と作用電極の間にアセトニトリルに溶解した０．１Ｍテトラプロピルアンモニウムヨージドを充填した。

その結果は、図２６に示される通りであった。ここでは例５で作製した４９スポットの固定化DNA領域の１列のみの結果を示している。図２６から明らかなように、固定化DNA領域由来の光電流値がそれぞれ分離された波形として検知されている。光電流値の読み取りは、光照射期間中の任意の１点を代表値することもでき、任意の複数の点の平均値を代表値とすることもできる。いずれの場合でも、光照射期間のデータ取得のタイミングを一定にしてデータを取得する方法が好ましい。

例７
本例は光源がＸＹ移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を連続的に移動させながら光電流検出を行った一例である。

図１４に示す光照射機構を有する装置に、例５の方法で作製した作用電極を装着し、ローダミン標識ssDNA固定化領域を、光源を連続的に移動させながら光電流測定した。この時、光源は光束径が１ｍｍ、波長５３０ｎｍ、出力５０ｍＷの緑色レーザーダイオードを用いた。光照射時には対電極と作用電極の間にアセトニトリルに溶解した０．１Ｍテトラプロピルアンモニウムヨージドを充填した。

その結果は、図２７に示される通りであった。ここでは例５で作製した４９スポットの固定化DNA領域の１列のみの結果を示している。図２７から明らかなように、固定化DNA領域由来の光電流値がそれぞれ分離された波形として検知されている。光電流値の読み取りは、光照射期間中の最高値を代表値とする方法が簡便である。

例８
本例はセルステージがＸＹ移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を停止させて電流検出を行った一例である。

図１５に示す光照射機構を有する装置に、例５の方法で作製した作用電極を装着し、ローダミン標識ssDNA固定化領域で光源を停止させて光電流測定した。この時、光源は光束径が１ｍｍ、波長５３０ｎｍ、出力５０ｍＷの緑色レーザーダイオードを用いた。光照射時には対電極と作用電極の間にアセトニトリルに溶解した０．１Ｍテトラプロピルアンモニウムヨージドを充填した。

その結果は図２８に示される通りであった。ここでは例５で作製した４９スポットの固定化DNA領域の１列のみの結果を示している。図２８から明らかなように、固定化DNA領域由来の光電流値がそれぞれ分離された波形として検知されている。光電流値の読み取りは、光照射期間中の任意の１点を代表値することもでき、任意の複数の点の平均値を代表値とすることもできる。いずれの場合でも、光照射期間のデータ取得のタイミングを一定にしてデータを取得する方法が好ましい。

例９
本例はセルステージがＸＹ移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を連続的に移動させながら光電流検出を行った一例である。

図１５に示す光照射機構を有する装置に、例５の方法で作製した作用電極を装着し、ローダミン標識ssDNA固定化領域に光源を連続的に移動させながら光電流測定した。この時、光源は光束径が１ｍｍ、波長５３０ｎｍ、出力５０ｍＷの緑色レーザーダイオードを用いた。光照射時には対電極と作用電極の間にアセトニトリルに溶解した０．１Ｍテトラプロピルアンモニウムヨージドを充填した。

その結果は図２９に示される通りであった。ここでは例５で作製した４９スポットの固定化DNA領域の１列のみの結果を示している。図２９から明らかなように、固定化DNA領域由来の光電流値がそれぞれ分離された波形として検知されている。光電流値の読み取りは、光照射期間中の最高値を代表値とする方法が簡便である。

例１０
本例は各種の電解質物質および非プロトン性溶媒を用いた電解液により一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出した例である。

本例では、ｐ５３遺伝子の一塩基多型の検出に電解質物質であるＮＰｒ４Ｉ（テトラプロピルアンモニウムヨージド）、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、のいずれかとアセトニトリルを含む混合液を電解液として使用した。電解質物質の濃度は0.2Mに調製した。作用電極側には完全一致プローブ、一塩基変異鎖プローブおよび完全不一致プローブを固定化した。それぞれの塩基配列は下記のとおりである。
完全一致（ＰＭ）プローブ： 5'-NH2-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3'
一塩基変異鎖（ＳＮＰ）プローブ： 5'-NH2-AGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGC-3'
完全不一致（ＭＭ）プローブ： 5'-NH2-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3'
これらのプローブとハイブリダイゼーションさせるターゲットＤＮＡの塩基配列は下記のとおりである。
ターゲットＤＮＡ： 5'-ローダミン-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3'

フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO₂：FTO）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗：12Ω/□、形状：50mm×26mm）をアセトン、超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を水を入れ替えて3回行い、ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させた。

このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。それからガラスを取り出し、メタノール中で10回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、メタノールを3回換えて行った。その後110℃で30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、φ=3mmの大きさの開口部が9スポット形成された粘着性シール（厚さ：0.5mm）を載置して密着させた。続いて1μMに調製した完全一致鎖、一塩基変異鎖、完全不一致鎖のプローブDNA（２５mer）を95℃で10分間保持した後、直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、先に用意したガラス上のシールの9開口部に5μlずつ充填し、95℃で10分保持して溶媒を蒸発させた後で、UVクロスリンカー（UVP社CL-1000型）で120mJの紫外光を照射して、プローブDNAを固定化した（各プローブにつき、３スポットずつ固定化）。

その後シールをはがし、0.2％SDS溶液中で15分間×3回振盪させ、超純水を３回入れ替えて濯いだ。それから沸騰水に2分間浸漬させ、取り出してから空気を吹き付けて残水を飛散させた。続いて4℃の無水エタノールに1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。

その後、100nMに調製したターゲットDNAを含む5×SSC、0.5％SDS溶液を、プローブを固定した電極にのせてカバーガラスで密閉した状態で37℃・10時間保温した。それから室温の２×SSC中でカバーガラスをはずし、電極をラックに立て、４０℃の2×SSC、0.2％SDS溶液中で３０分間振とうした後、水で2回すすぎ電極を乾燥させた。

こうして得られた作用電極を測定セルに組み込み、測定セル上には光源自動移動用XYステージを取り付けた。セル部分の構成は作用電極と白金対電極とを対向させ、両電極間に接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が500μmのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには全スポットが入る十分大きい穴が空いており、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上に固定化されたDNAが接触する構造になっている。作用電極、対電極共に、電気的に接しているスプリングプローブを介して高感度な電流計に接続した。

続いて自動移動用XYステージに固定した光源により作用電極裏面の上方から光を照射し、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。作用電極の上方にはFTO基板上のスポットと同形状の遮光部材を設けて、隣接するスポットへの光照射を防止すると同時に、光の無照射スポットを設けた。測定はスポットを順次走査し、同時にスポットでの電流出力をパソコンに接続された高感度電流計を介してパソコンに記憶した。

その結果は図３０に示される通りであった。図３０の結果から明らかなように、非プロトン系の電解液を用いても、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を光電流値の差として検出することができた。

例１１
本例は各種濃度のアセトニトリル含有電解液を用いて一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出した例である。

本例では、ｐ５３遺伝子の一塩基多型の検出に電解質物質として0.2MのＮＰｒ４Ｉ（テトラプロピルアンモニウムヨージド）と各濃度のアセトニトリルと水を含む混合液を電解液として使用したこと以外は、例１０と同様にして測定を行った。

その結果は図３１に示される通りであった。図３１の結果から明らかなように、アセトニトリルの濃度が１０〜１００％の電解液を用いても、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を光電流値の差として検出することができた。

例１２
本例は、色素標識一本鎖DNA固定化作用電極を作製した例である。

フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO₂：FTO）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗：12Ω/□、形状：50mm×26mm）をアセトン、超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を水を入れ替えて3回行った。ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させてから無水メタノールに浸漬させて脱水した。

カップリング処理用の溶液は95%メタノール5%超純水を溶媒として、3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）を2vol%となるように加え、室温下で5分間の攪拌を行って調製した。
このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。それからガラスを取り出し、メタノール中で10回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、メタノールを3回換えて行った。その後110℃で30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、φ=3mmの大きさの開口部が9スポット形成された粘着性シール（厚さ：0.5mm）を載置して密着させた。続いて濃度調整した（100 nM、10nM、0nM）ローダミン標識ssDNA（25mer）を95℃で10分間保持した後、直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、先に用意したガラス上のシールの9開口部に5μlずつ充填し、95℃で10分保持して溶媒を蒸発させた後で、UVクロスリンカー（UVP社CL-1000型）で120mJの紫外光を照射して、標識ssDNAを固定化した。

例１３
本例は水と各電解質物質を用いた電解液により色素標識一本鎖DNAを検出した例である。

本例では、ローダミン標識ssDNA（30mer）の検出に電解質物質であるNaI、KI、CaI₂、LiI、NH₄I、ＮＰｒ_４Ｉ（テトラプロピルアンモニウムヨージド）、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、のいずれかと水を含む混合液を電解液として使用した。電解質濃度は０．２Mである。検出手順は図２に示す光照射機構を有する装置に、例１２の方法で作製した作用電極を装着し、ローダミン標識ssDNA固定化領域で光源を停止させて光電流測定した。このとき、固定化するssDNAの濃度は０ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの三種類とした。

その結果を図３２に示される通りであった。図３２の結果から明らかなように、検討したいずれの電解質でも、ssDNA固定化量に依存して光電流の増加が認められ、使用可能であることが明らかになった。

例１４
本例はＮＰｒ_４Ｉ（テトラプロピルアンモニウムヨージド）と水を含む混合液を電解液として使用し、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出した例である。

本例では、ｐ５３遺伝子の一塩基多型の検出に電解質物質として0.2MのＮＰｒ_４Ｉ（テトラプロピルアンモニウムヨージド）と水の混合液を電解液として使用したこと以外は、例１０と同様にして測定を行った。

その結果は図３３に示される通りであった。図３３の結果から明らかなように、水溶液系の電解液を用いても、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を光電流値の差として検出することができた。

例１５
本例は色素増感型バイオセンサ技術により色素標識蛋白質を検出した例である。

FTOガラスのシランカップリング処理
フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO₂：FTO）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗：15Ω/□）をアセトン、Tween20を0.1vol%含む超純水、さらに超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。次に5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させ、その後で水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を、水を入れ替えて3回行った。超純水からFTOガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させてから無水メタノールに浸漬させて脱水させた。メタノールも空気を吹き付けることで飛散させてFTOガラスを乾燥させた。
カップリング処理用の溶液は95vol%メタノール−5vol%超純水の混合溶液に3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS：AVOCADO社製）を2vol%となるように加え、室温下で5分間の攪拌を行って調製した。
このカップリング処理用溶液に上記FTOガラスを浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。FTOガラスを取り出して、無水メタノール中で10回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、無水メタノールを入れ替えて3回行った。その後110℃で30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温放置による徐冷後、これにスペーサ用穴あきテープ（穴：φ=3mm×６スポット、シートの厚み：50μm）を貼った。

オリゴDNAの固定化
5’末端にビオチンを標識したオリゴDNAまたは未標識のオリゴDNA（プロリゴ社製：配列は5’-TggCTCCTgACCTggAgTCTTCCAgTgTgA-3'）を超純水に溶かして1μMとし、95℃で5分間保持してDNAを変性させ、テープ開口部（スポット電極）に7μlずつ滴下した。これを95℃で10分間保持させて乾燥させた後にUVクロスリンカー（UVP社CL-1000型）で120mJの紫外光を照射して、オリゴDNA固定化作用電極とした。
この作用電極を0.2%SDS水溶液中で15分間振盪させる洗浄を、液を3回換えて行った。続いて超純水中で10回ほど振盪させる洗浄を、超純水を3回換えて行うことでSDSの除去を行った。その後で沸騰水に2分間浸漬させ、取り出してから空気を吹き付けて残水を飛散させた。さらに4℃の無水エタノールに1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。

ローダミン標識蛋白質のインキュベートおよび洗浄
Molecular Probes社から市販されているキットを用いてローダミン標識を行ったストレプトアビジン（標識比：3.1）を緩衝液（10mM HEPES pH7.4 + 150mM NaCl + 0.05% Tween20）により10ug/mlになるよう希釈を行った。
この蛋白質溶液7μlをスポット電極に滴下してからプレパラートガラスを被せて37℃で1時間インキュベートさせた。
インキュベート終了後にプレパラートガラスを取り外し、作用電極をラックに立てて上記緩衝液を満たした染色バットに沈め、10回ほど振盪させる洗浄を、緩衝液を3回換えて行った。なお作用電極は測定直前まで上記緩衝液に浸漬させておいた。

測定
こうして得られた作用電極は測定直前に超純水中で軽く振盪させ、次に空気を吹き付けて残水を飛散させてからフロー型測定セルに組み込んだ。セルは作用電極と白金対電極とを対向に配置し、その間に膜厚500μmのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには全てのスポット電極が入るよう十分大きい穴が空いており、この部分に送液された電解液が充填されることでスポット電極が電解液と接触する構造になっている。電解液は1Mのチオ硫酸ナトリウムと0.1Mの食塩水の混合溶液を用いた。作用電極と白金対電極はそれぞれ電気的に接しているスプリングプローブを介して電流計（ADVANTEST社製：R8240）に接続した。
このフロー型測定セルに、各スポット毎に対応した開口部を持つ遮光部材を被せ、下記電解液を充填させてから、その上に設置された可動式のレーザー光源（中心波長：532nm）で各スポットを順次照射して、作用電極と白金対電極との間に流れる光電流を経時的に測定した。各スポットを5秒間照射して、5秒目の光電流値からベース電流値を差し引くことで補正を行った。

その結果は、図３４に示される通りであった。図３４の結果から明らかなように、色素増感型バイオセンサの技術を用いて、蛋白質の検出が可能であることを実証することができた。

例１７
本例は水と各種の電解質物質を用いた電解液により色素標識一本鎖DNAを検出した例である。

本例では、ローダミン標識ssDNA（30mer）の検出に電解質物質であるヒドロキノン、トリエタノールアミン、フェリシアン化カリウム、ＮＰｒ_４Ｉ（テトラプロピルアンモニウムヨージド）、のいずれかと水を含む混合液を電解液として使用した。電解質濃度は０．２Mである。検出手順は図１４に示す光照射機構を有する装置に、例１２の方法で作製した作用電極を装着し、ローダミン標識ssDNA固定化領域で光源を停止させて光電流測定した。

ヒドロキノン、トリエタノールアミン、ＮＰｒ_４Ｉ、のいずれかと水を含む混合液を電解液として使用した際に得られた光電流波形は、図３５に示される通りであった。図３５で得られた光電流をデータ処理した結果を図３６に、フェリシアン化カリウムと水を含む混合液を電解液として使用した際に得られた光電流波形を図３７に示す。図３５および３６の結果よりヒドロキノン、ＮＰｒ_４Ｉを用いた場合、ssDNA固定化量に依存して光電流の増加が認められたが、トリエタノールアミンを用いた場合、微弱な光電流しか検出できなかった。ただし、図３５から明らかなように、ヒドロキノンを用いた場合には電流が安定せず、しかもノイズ電流も高いため、ヒドロキノンは高精度な検出には適切ではない。また、図３７に示されるように、フェリシアン化カリウムを用いた場合は電流が安定せず、光電流もほとんど検出されなかった。これらの結果から、測定に使用したヒドロキノン、トリエタノールアミン、フェリシアン化カリウム、ＮＰｒ_４Ｉ（テトラプロピルアンモニウムヨージド）の各種電解質の内、ＮＰｒ_４Ｉ（テトラプロピルアンモニウムヨージド）のみが高精度な検出に適していることが判明した。

色素増感型太陽電池の原理を説明する図である。被検物質が一本鎖の核酸であり、プローブ物質が前記核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図であり、（ａ）は被検物質が予め増感色素で標識されてなる場合を、（ｂ）は二本鎖の核酸にインターカレーション可能な増感色素を添加した場合をそれぞれ示す。被検物質がリガンドであり、媒介物質が受容体蛋白質分子であり、プローブ物質が二本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図である。光源が配置された測定用セルを示す図であり、図中の点線で囲まれる部分２１が測定用セルである。図４に示される測定用セルの平面図である。他の測定用セルの一例の断面図である。図６に示した同測定用セルの分解斜視図である。互いに競合する特異的結合性を有する被検物質および第二の被検物質が抗原であり、プローブ物質が抗体である場合の、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図である。フロー型測定用セルおよびパターニングされた作用電極を用いた装置の一例を示す図である。パターニングされた作用電極の一例を示す図であり、（ａ）は作用電極の平面図を、（ｂ）は作用電極の断面図を、（ｃ）は別の態様の作用電極の断面図を、（ｄ）はさらに別の態様の作用電極の断面図をそれぞれ示す。パターニングされた作用電極の他の一例を示す図であり、（ａ）は作用電極の平面図を、（ｂ）は作用電極の断面図を、（ｃ）は別の態様の作用電極の断面図をそれぞれ示す。パターニングされた作用電極に用いられる光源の一例を示す図である。パターニングされた作用電極に用いられる光源の他の一例を示す図である。光源移動型の光照射機構を備えた測定装置の一例を示す図であり、（ａ）は全体斜視図を、（ｂ）はその上面図をそれぞれ示す。セル移動型の光照射機構を備えた測定装置の一例を示す図であり、（ａ）は全体斜視図を、（ｂ）はその上面図をそれぞれ示す。図１４に示される装置における光源移動型光照射機構の一例を示す図である。図１５に示される装置におけるセル移動型光照射機構の一例を示す図である。光照射機構を備えた測定装置の例を示す図であり、（ａ）は図１４および１６に示される光源移動型の機構を備えた装置例を、（ｂ）は図１５および１７に示されるセル移動機能型の機構を備えた装置例をそれぞれ示す。ＭＥＭＳのような製造方法を利用した光電流検出装置の一例の概略斜視図である。図１９に示される光電流検出装置の構成図である。図１９に示される検出チップの分解斜視図である。例１において測定された検出電流値を示すグラフであり、（ａ）はＦＴＯ電極を、（ｂ）はＩＴＯ電極を用いた場合をそれぞれ示す。例２において測定された、相補的ＤＮＡと非相補的ＤＮＡの検出電流値に対する差を示したグラフである。図中、ＰＭはプローブと相補的なＤＮＡを、ＭＭはプロープと非相補的なＤＮＡをそれぞれ使用した場合に対応している。例３において測定された検出電流値を示す図であり、（ａ）はヨウ素を含む電解液を、（ｂ）はヨウ素を含まない電解液を用いた場合をそれぞれ示す。例５において作製された、４９カ所にＤＮＡを固定化した作用電極の概略図を示す図である。例６において測定された光電流の経時変化を示す図である。例７において測定された光電流の経時変化を示す図である。例８において測定された光電流の経時変化を示す図である。例９において測定された光電流の経時変化を示す図である。例１０において各種電解質を用いて測定された光電流値を示す図である。図中、ＰＭは完全一致プローブを、ＳＮＰは一塩基変異鎖プローブを、ＭＭは完全不一致プロープをそれぞれ使用した場合に対応している。例１１において、各種濃度のアセトニトリルを用いて測定された光電流値を示す図である。図中、ＰＭは完全一致プローブを、ＳＮＰは一塩基変異鎖プローブを、ＭＭは完全不一致プロープをそれぞれ使用した場合に対応している。例１３において、各種電解質を用いて測定された光電流値を示す図である。例１４において、水溶液系の電解液を用いて測定された、一塩基多型（ＳＮＰｓ）の光電流値を示す図である。例１６において、ローダミン標識蛋白質および非標識の蛋白質についてそれぞれ測定された光電流値を示す図である。例１７において、ヒドロキノン、トリエタノールアミン、およびＮＰｒ_４Ｉのいずれかと水との混合液について測定された光電流値の経時変化を示す図である。図３５で得られた光電流をデータ処理した結果を示す図である。例１７において、フェリシアン化カリウムと水との混合液を電解液として測定された光電流波形を示す図である。

Claims

増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介して固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に光を照射して前記増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出することを含んでなる被検物質の特異的検出方法であって、
前記作用電極が、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プローブ物質が担持され、
前記電子受容物質が、前記増感色素の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸化物半導体であり、
前記電解質媒体が酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒を含んでなり、
前記光電流を検出する際に、光照射時に検出される値から光を照射していない時に検出される値を差し引いた値を検出値とする方法。
前記光電流を検出する際に、電流値または電気量を測定し、得られた電流値または電気量から前記試料液中の被検物質濃度を算出する、請求項１に記載の方法。
得られた電流値または電気量から前記試料液中の被検物質濃度を算出する工程が、予め作成された被検物質濃度と電流値または電気量との検量線と、得られた電流値または電気量とを対比することにより行われる、請求項２に記載の方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載される方法において作用電極として用いられる電極であって、
導電性基材と、
該導電性基材上に形成される、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層と、
を備えた、電極。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の被検物質の特異的検出方法に用いられる測定用セルであって、
請求項４に記載の作用電極と、
対電極と、
を備えた、測定用セル。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の被検物質の特異的検出方法に用いられる測定装置であって、
請求項５に記載される測定用セルと、
前記作用電極の表面に光を照射する光源と、
前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と
を備えた、測定装置。