CN105758922B - 基于光电化学dna生物传感器的铅离子测定方法 - Google Patents

基于光电化学dna生物传感器的铅离子测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法，将含有部分能够特异性识别Pb2+的DNA序列组装于ITO电极表面，并以Ru(bpy)2(dppz)2+作为光电化学信号探针，当Pb2+与电极表面DNA作用后，探针从DNA链中脱离，导致光电化学信号的降低，实现了检测Pb2+的光电化学检测。本发明提供的ITO电极DNA生物传感器制备简单、成本低、反应条件温和，响应速度快，检测方便，周期短，稳定性高，重现性好。此外，该光电化学传感器对Pb2+具有高选择性、高灵敏度等优点。

Description

基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法
技术领域
本发明属于分析化学和光电化学传感技术领域，具体地说，涉及一种基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法。
背景技术
重金属是环境体系中一类重要的污染物，具有难降解、毒性强、生物累积性等特点，对生态系统及人类健康具有严重的危害，因此对重金属离子的快速、简单、灵敏检测具有重要意义。传统的重金属离子分析方法主要是采用原子荧光、原子发射光谱法、ICP-AES/MS等，这些方法具有操作复杂、仪器设备昂贵、检测费用高、难于实现在线分析等缺点。随着生物传感技术的发展，应用生物传感法对有毒重金属离子的检测已成为研究热点之一。与酶、微生物、免疫生物传感法相比，DNA生物传感法具有识别层稳定，特异性识别目标小分子，受环境干扰和限制少，且易于合成或再生以供重复利用等优点，诸多优势使电化学DNA传感器作为一种新型的检测技术用于环境监测领域。
铅离子作为“优先管理有害物质名单”上的重要金属离子，易对人体及环境产生毒害影响而备受人们关注。如今发展迅速的电化学、光电化学和光学传感技术，如基于荧光探针、金纳米粒子、DNA酶、半导体量子点和碳纳米管等生物传感方法，因具有操作简单、响应快速、分析成本低等优点，逐渐被广泛应用于Pb2+的检测。Li等在研究中发现，Pb2+可以和富含G碱基的DNA链发生作用生成Pb2+-DNA四联体结构，从而造成双链DNA的解链，在此基础上以锌卟啉为荧光探针，设计了荧光传感器，基于Pb2+引起DNA构型发生改变引起的荧光信号的变化，实现了对Pb2+的选择性检测。然而上述荧光方法仍然存在一定不足之处，如存在较高的背景信号干扰和较低的灵敏度等，因而在实际环境检测中受到多方面因素的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的基于光电化学DNA生物传感器的铅离子检测方法，利用Pb2+诱导ITO电极表面DNA构型发生变化，降低了DNA与Ru(bpy)2(dppz)2+光电化学信号探针分子的作用，从而实现对Pb2+的检测。所述方法包括以下步骤：
1)ITO电极的制备：
将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇清洗，最后用超纯水清洗并于烘箱中烘干；将浓度1～20％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导电玻璃表面，待自然风干后，于50～450℃(优选150～450℃)马弗炉中煅烧0.5～5h，自然冷却后切割成0.5cm×3cm玻璃片(优选用玻璃刀切割)，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；
2)DNA溶液的配制：
将固体DNA样品用Tris-HClO4缓冲液溶解，置于60-95℃(优选85℃)水浴锅中5～10min，然后自然冷却至室温，备用；
3)DNA修饰ITO电极的制备：
将0.1～5mg/ml的PDDA(聚二烯丙基二甲基氯化铵)溶液涂于步骤1)制备的修饰有SnO2的ITO电极表面，在湿度恒定条件下孵育1～12h，然后用超纯水清洗(优选洗三次)，氮气吹干；将步骤2)配制的DNA溶液用Tris-HClO4缓冲液稀释至2μM，取适量涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2～8h，用超纯水清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极备用；
4)Pb2+的光电化学检测：
将1～50μM Ru(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，然后用超纯水清洗(优选洗三次)，氮气吹干；然后将上述处理的DNA修饰ITO电极置于5-50mM(优选20mM)草酸缓冲液的光电化学测定池中，以Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，形成三电极测定体系，连接电化学工作站，在473nm蓝色光照射下，进行循环伏安扫描，测定光电流强度；同理，将不同浓度的Pb2+溶液滴于步骤3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，连接电化学工作站进行循环伏安扫描，测定光电流强度，实现对Pb2+的测定。
本发明适体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述Tris-HClO4缓冲液的pH值7.4，浓度为20mM。
基于上述检测方法，本发明提供一种DNA修饰ITO电极，所述DNA修饰ITO电极的制备方法包括以下步骤：
(1)将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇等清洗(清洗5分钟)，最后用超纯水清洗干净并于烘箱中烘干；将浓度1～20％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导电玻璃表面，待自然风干后，于50～450℃马弗炉中煅烧0.5～5h，自然冷却后用玻璃刀切割成0.5cm×3cm玻璃片，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；
(2)将固体DNA样品用Tris-HClO4缓冲液溶解，置于60-95℃(优选85℃)水浴锅中5～10min，然后自然冷却至室温，备用；其中，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(3)将0.1～5mg/ml的PDDA溶液涂于步骤(1)制备的修饰有SnO2的ITO电极表面，在湿度恒定条件下孵育1～12h，然后用超纯水清洗三次，氮气吹干；将步骤(2)配制的DNA溶液用Tris-HClO4缓冲液稀释至2μM，取适量涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2～8h，用超纯水清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极备用；
(4)将1～50μM Ru(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤(3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，然后用超纯水清洗三次，氮气吹干；然后将上述处理的DNA修饰ITO电极置于5-50mM(优选20mM)草酸缓冲液的光电化学测定池中，并与铂丝对电极、Ag/AgCl参比电极形成三电极测定体系，进行光电化学测定。
本发明还提供所述的DNA修饰ITO电极在环境水样中铅离子检测中的应用。
检测时，将DNA修饰ITO电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，并连接电化学工作站，通过电化学循环伏安法检测光电流强度，再将电流强度据换算为浓度数据。
本发明进一步提供一种光电化学DNA生物传感器，所述传感器包括电化学工作站以及所述DNA修饰ITO电极(工作电极)，铂丝对电极，Ag/AgCl参比电极，电化学工作站与上述三个电极之间通过导线连接。
本发明通过将含有部分能够特异性识别Pb2+的DNA序列组装于ITO电极表面，并以Ru(bpy)2(dppz)2+作为光电化学信号探针，当Pb2+与电极表面DNA作用后，探针从DNA链中脱离，导致光电化学信号的降低，实现了检测Pb2+的光电化学检测。本发明提供的ITO电极DNA生物传感器制备简单、成本低、反应条件温和，响应速度快，检测方便，周期短，稳定性高，重现性好。此外，该光电化学传感器对Pb2+具有高选择性、高灵敏度等优点。
本发明提供的基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法，在环境综合防治，特别是在铅离子污染物应急监测及突发性事件方面可以发挥重要的作用，在环境监测技术领域应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明实施例2中与Pb2+作用前(a)、作用后(b)的ITO电极DNA修饰膜分别与Ru(bpy)2(dppz)2+探针作用后光电化学谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的Tris-HClO4缓冲液的pH值7.4，浓度20mM。
实施例1 DNA修饰ITO电极及其生物传感器的制备
本实施例制备的DNA修饰ITO电极，其制备方法包括以下步骤：
(1)将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇等清洗5分钟，最后用超纯水清洗干净并于烘箱中烘干。将浓度10％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导电玻璃表面，待自然风干后，于350℃马弗炉中煅烧3h，自然冷却后用玻璃刀切割成0.5cm×3cm玻璃片，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；
(2)将固体DNA样品用Tris-HClO4缓冲液溶解，置于85℃水浴锅中10min，然后自然冷却至室温，备用；其中，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(3)将0.5mg/ml的PDDA溶液涂于步骤(1)制备的修饰有SnO2的ITO电极表面，在湿度恒定条件下孵育2h，然后用超纯水清洗三次，氮气吹干；将步骤(2)配制的DNA溶液用Tris-HClO4缓冲液稀释至2μM，取10μl涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2h，用超纯水清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极备用；
(4)将10μM Ru(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤(3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育1h，然后用超纯水清洗三次，氮气吹干；然后将上述处理的DNA修饰ITO电极置于20mM草酸缓冲液的光电化学测定池中，并与铂丝对电极、Ag/AgCl参比电极形成三电极体系。
检测时，用电化学工作站连接工作电极、参比电极、对电极，通过电化学工作站电化学循环伏安法测定光电流强度，再将光电流数据换算为浓度数据。
本实施例提供的生物传感器包括电化学工作站以及所述DNA修饰ITO电极(工作电极)，铂丝对电极，Ag/AgCl参比电极，电化学工作站与上述三个电极之间通过导线连接。
实施例2 基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法
将不同浓度的Pb2+溶液滴于实施例1中制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育2h，取出电极后用超纯水清洗三次，氮气吹干。然后再将10μM Ru(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于上述DNA电极表面，孵育1h。用超纯水洗三次后，氮气吹干，连接电化学工作站，在473nm蓝色光照射下，进行循环伏安扫描，实现对Pb2+的测定。不同浓度Pb2+与ITO电极DNA修饰膜作用后产生的光电化学信号见表1。
表1不同浓度Pb2+产生的光电化学信号I
与Pb2+作用前(a)、作用后(b)的ITO电极DNA修饰膜分别与Ru(bpy)2(dppz)2+探针作用后光电化学谱图见图1。
实施例3 Pb2+选择性研究
用100nM金属离子Pb2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+代替实施例2中Pb2+，其它实验条件与实施例2相同。不同金属离子与ITO电极DNA修饰膜作用后产生的光电化学信号变化ΔI见表2。
表2不同重金属离子产生的光电化学信号ΔI变化
从表2可以看出，当Pb2+与DNA修饰ITO电极表面作用后，引起的光电化学信号变化最大，而其它几种金属离子产生的光电化学信号变化较小。结果表明，该光电化学DNA生物传感器可以实现对Pb2+的选择性检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
T.Li,S.J.Dong,E.K.Wang,A Lead(II)-Driven DNA Molecular Device forTurn-On Fluorescence Detection of Lead(II)Ion with High Selectivity andSensitivity.J.Am.Chem.Soc.,2010,132:13156-13157.

Claims (7)

1.基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)ITO电极的制备：
将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇清洗，最后用超纯水清洗并于烘箱中烘干；将浓度1～20％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导电玻璃表面，待自然风干后，于50～450℃马弗炉中煅烧0.5～5h，自然冷却后切割成0.5cm×3cm玻璃片，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；
2)DNA溶液的配制：
将固体DNA样品用Tris-HClO4缓冲液溶解，置于60-95℃水浴锅中5～10min，然后自然冷却至室温，备用；
3)DNA修饰ITO电极的制备：
将0.1～5mg/ml的PDDA溶液涂于步骤1)制备的修饰有SnO2的ITO电极表面，在湿度恒定条件下孵育1～12h，然后用超纯水清洗，氮气吹干；将步骤2)配制的DNA溶液用Tris-HClO4缓冲液稀释至2μM，取适量涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2～8h，用超纯水清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极，备用；
4)Pb2+的光电化学检测：
将1～50μM Ru(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，然后用超纯水清洗，氮气吹干；然后将上述处理的DNA修饰ITO电极作为工作电极，置于5-50mM草酸缓冲液的光电化学测定池中，以Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，形成三电极测定体系，连接电化学工作站，在473nm蓝色光照射下，进行循环伏安扫描，测定光电流强度；将不同浓度的Pb2+溶液滴于上述处理的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，进行循环伏安扫描，测定光电流强度，实现对Pb2+的测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)马弗炉中煅烧温度为150～450℃。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述Tris-HClO4缓冲液的pH值7.4，浓度为20mM。
5.DNA修饰ITO电极，其特征在于，所述DNA修饰ITO电极的制备方法包括以下步骤：
(1)将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇清洗，最后用超纯水清洗并于烘箱中烘干；将浓度1～20％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导电玻璃表面，待自然风干后，于50～450℃马弗炉中煅烧0.5～5h，自然冷却后用玻璃刀切割成0.5cm×3cm玻璃片，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；
(2)将固体DNA样品用Tris-HClO4缓冲液溶解，置于60-95℃水浴锅中5～10min，然后自然冷却至室温，备用；其中，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(3)将0.1～5mg/ml的PDDA溶液涂于步骤(1)制备的修饰有SnO2的ITO电极表面，在湿度恒定条件下孵育1～12h，然后用超纯水清洗三次，氮气吹干；将步骤(2)配制的DNA溶液用Tris-HClO4缓冲液稀释至2μM，取适量涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2～8h，用超纯水清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极备用；
(4)将1～50μM Ru(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤(3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，然后用超纯水清洗三次，氮气吹干；然后将上述处理的DNA修饰ITO电极作为工作电极置于5-50mM草酸缓冲液的光电化学测定池中，并与铂丝对电极和Ag/AgCl参比电极形成三电极测定体系，进行光电化学测定。
6.光电化学DNA生物传感器，其特征在于，所述传感器包括电化学工作站以及权利要求5所述的DNA修饰ITO电极、铂丝对电极和Ag/AgCl参比电极，电化学工作站与上述三个电极之间通过导线连接。
7.权利要求5所述DNA修饰ITO电极或权利要求6所述光电化学DNA生物传感器在环境水样中Pb2+检测中的应用。
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