CN101726527B - 对被检物质进行检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可以提高被检物质的检测灵敏度的被检物质的检测方法。被检物质的检测方法包括：对检查芯片应用包含上述被检物质的试样，通过探针捕捉上述被检物质的工序；对极，由导电性材料构成；以及还原电极，用于还原电解质；在使包含电解质的电解质介质向上述作用电极、上述对极以及上述还原电极接触的状态下，对修饰由上述探针捕捉的上述被检物质的修饰物质照射使该修饰物质激励的光的工序；以及通过上述还原电极使包含在上述电解质介质中的电解质还原，对由于电子从通过上述光被激励的修饰物质向上述作用电极移动而在上述作用电极与上述对极之间流过的电流进行测定的工序。

Description

对被检物质进行检测的方法
技术领域
本发明涉及用于从试样中检测核酸、蛋白质等被检物质的检测方法、检测装置以及检查芯片。 
背景技术
在疾病的临床检查、诊断中，通过遗传基因检测法、免疫学检测法，对包含在生物体试样中的疾病渊源的遗传基因、蛋白质等进行检测。具体而言，可以举出免疫胶体金层析(Immunochromato)法、胶乳凝集法、酶免疫法、化学发光免疫法、遗传基因放大PCR法等。但是，这些检测方法在简易性、迅速性以及成本中的任意观点中都有改善的余地。 
因此，在国际公开第2007／037341号小册子中，提出了将通过敏化色素的光激励而产生的电流用于被检物质的检测中的方法。在该方法中，首先，在电极上形成半导体层(电极接受层)。在该半导体层上，固定可以与被检物质结合的探针物质。接下来，用探针物质来捕捉用敏化色素修饰的被检物质。在捕捉后，向修饰被检物质的敏化色素照射使敏化色素激励的光。其结果，从修饰被检物质的敏化色素中释放电子。对起因于所释放的电子被接受到半导体层而产生的电流进行检测。但是，在以往的方法中由于电流的检测效率低，所以期望提高被检物质的检测灵敏度。 
发明内容
本发明提供(1)一种对由通过光激励产生电子的修饰物质修饰的被检物质进行检测的方法，其特征在于，包括： 
对检查芯片应用包含上述被检物质的试样，通过探针捕捉上述被 检物质的工序，其中，上述检查芯片具备：作用电极，具有半导体层；探针，能够捕捉上述被检物质并且固定在上述半导体层上；对极，由导电性材料构成；以及还原电极，用于还原电解质； 
在使包含电解质的电解质介质向上述作用电极、上述对极以及上述还原电极接触的状态下，对修饰由上述探针捕捉的上述被检物质的修饰物质照射使该修饰物质激励的光的工序；以及 
通过上述还原电极使包含在上述电解质介质中的电解质还原，对由于电子从通过上述光被激励的修饰物质向上述作用电极移动而在上述作用电极与上述对极之间流过的电流进行测定的工序。 
(2)在上述对被检物质进行检测的方法中，其特征在于，通过上述还原电极进行的还原是在向上述还原电极施加了电位的状态下进行的。 
(3)在上述对被检物质进行检测的方法中，其特征在于，通过上述还原电极进行的还原是在将上述对极作为基准而向上述还原电极施加了-0.5V以上且小于0V的电位的状态下进行的。 
(4)在上述对被检物质进行检测的方法中，其特征在于，将上述还原电极保持为能够还原上述电解质的自然电位。 
(5)在上述对被检物质进行检测的方法中，其特征在于，上述探针是核酸、蛋白质或肽。 
(6)在上述对被检物质进行检测的方法中，其特征在于，上述电解质是碘或碘化物。 
(7)一种检测装置，对由通过光激励产生电子的修饰物质修饰的被检物质进行检测，其特征在于，包括： 
检查芯片收容部，该检查芯片收容部构成为能够收容检查芯片，上述检查芯片具备：作用电极，具有半导体层；探针，能够捕捉上述被检物质并且固定在上述半导体层上；对极，由导电性材料构成；以及还原电极，用于还原与上述作用电极以及上述对极接触的电解质介质中包含的电解质； 
光源，对修饰上述检查芯片收容部中收容的上述检查芯片内的被 检物质的修饰物质照射使该修饰物质激励的光； 
电位施加部，用于向上述还原电极施加电位；以及 
电流测定部，对由于电子从通过从上述光源照射的光被激励的修饰物质向上述作用电极移动而在上述作用电极与上述对极之间流过的电流进行测定。 
(8)在上述对被检物质进行检测的检测装置中，其特征在于，上述光源发生使对被检物质进行修饰的修饰物质激励的波长的光。 
(9)一种检查芯片，用于对由通过光激励产生电子的修饰物质修饰的被检物质进行检测，其特征在于，包括： 
作用电极，具有半导体层； 
探针，能够捕捉上述被检物质并且固定在上述半导体层上； 
对极，由导电性材料构成；以及 
还原电极，用于还原与上述作用电极以及上述对极接触的电解质介质中包含的电解质。 
(10)在上述检查芯片中，其特征在于，上述还原电极是由并列配置了多个线状部件的形状构成的电极。 
附图说明
图1是示出本发明的一个实施方式的检测装置的立体图。 
图2是示出图1所示的检测装置的结构的框图。 
图3是示出本发明的一个实施方式的检查芯片的立体图。 
图4是示出图3所示的检查芯片的剖面图。 
图5是示出从下面侧观察图3所示的检查芯片的上基板的平面图。 
图6是示出从上面侧观察图3所示的检查芯片的下基板的平面图。 
图7是示意性地示出图3所示的检查芯片的概略图。 
图8是示出由用户将检体试样注入到检查芯片中的步骤的流程图。 
图9是示出检测装置的检测动作步骤的流程图。 
图10是示出在实验1中在作用电极与对极之间流过的光电流的测定结果的图表。 
图11是示意性地示出实验2中使用的作用电极的概略图。 
图12是示出在实验2中由作用电极检测出的光电流值的经时变化的图表。 
图13是示出在实验2中在作用电极中检测的光电流与在还原电极中检测的电流的图表。 
图14是示出在实验3中检测的电解液的循环伏安法(voltammogram)的测定结果的图表。 
图15是示出在实验4中与施加给还原电极的电位的变化对应的光电流的测定结果的图表。 
图16是示出在实验5中使作用电极与对极等之间的间隔变化的情况下的光电流的测定结果的图表。 
具体实施方式
以下，参照附图，对本发明的关于检测方法及装置、以及检查芯片的实施方式进行说明。 
(检测装置的结构) 
图1是示出本发明的一个实施方式的检测装置的立体图。该检测装置1用于从生物体细胞中提取的、或者人工合成的核酸、蛋白质、肽(peptide)等具有特异结合性的被检物质进行检测。作为该检测装置1的一个例子，例如可以举出用于从检体试样中检测作为子宫颈癌的原因病毒的人乳头状瘤病毒(human papillomavirus)(以下称为HPV)的mRNA的HPV检测装置。 
本实施方式的检测装置1具备被插入检查芯片4的芯片收容部3、显示检测结果的显示器2。检查芯片4具备试样注入口11，具备通过从该试样注入口11注入检体试样，而捕捉用检体试样中的色素修饰的被检物质的功能。另外，检查芯片4是一次性的。 
图2是示出检测装置的结构的框图。检测装置1具备光源5、电流计(电流测定部)6、电源(电位施加部)9、A/D变换部7、控制部8和显示器2。 
光源5向修饰由检查芯片4捕捉的被检物质的色素照射光，而使色素激励。电流计6对起因于从被激励的色素释放的电子而在检查芯片4内流过的电流进行测定。电源9对设置在检查芯片4中的电极施加规定的电位。A/D变换部7对由电流计6测定的电流值进行数字变换。控制部8由CPU、ROM以及RAM等构成，对光源5、电流计6、电源9以及显示器2的动作进行控制。另外，控制部8针对由A/D变换部7数字变换后的电流值，根据预先制作的表示电流值与被检物质的量的关系的检量线，估算检体试样中的被检物质的量。显示器2显示由控制部8估算的检体试样中的被检物质的量。 
接下来，对本发明的一个实施方式的被检物质检测用的检查芯片4的结构、和使用了该检查芯片4的被检物质的特异检测方法进行说明。 
(检查芯片的结构) 
图3是本实施方式的检查芯片4的立体图。图4是检查芯片4的剖面图。检查芯片4具备上基板13、设置在上基板13的下方的下基板14、和夹在上基板13与下基板14之间的间隔保持部件12。 
图5是从下面侧观察上基板13的平面图。上基板13形成为矩形形状，在上基板13的表面(下表面)，形成有作用电极21、和与作用电极21连接的电极引线22。作用电极21形成为大致四边形形状，配置在上基板14的一侧部(图5的左侧)。电极引线22从作用电极21朝向上基板14的另一侧部(图5的右侧)延伸。 
图6是从上面侧观察下基板14的平面图。下基板14形成为与上基板13大致同一尺寸的矩形形状。在下基板14的表面(上表面)，形成有对极24、与该对极连接的电极引线25、还原电极26、与该还原电极26连接的电极引线27、参考电极28、和与该参考电极28连接的电极引线29。 
还原电极26形成为并列配置有细长的线状部的“梳子形”。其整体的外形形成为大致四边形形状，配置在下基板14的一侧部(图6的右侧)。还原电极26的电极引线27从还原电极26朝向下基板的另一侧部(图6的左侧)延伸。 
对极24和参考电极28隔着还原电极26配置在其两侧。对极24的电极引线25和参考电极28的电极引线29分别从下基板14的一侧部朝向另一侧部延伸。还原电极26、对极24以及参考电极28的各电极引线27、25、29被配置成在下基板14的另一侧部中相互并列。 
如图3以及图4所示，上基板13和下基板14以使在各自中形成的电极部分在上下方向上对向的方式，在一侧部中重复配置。而且，在上基板13与下基板14重复(对向)的部分中，介有间隔保持部件12。形成在上基板13与下基板14中的电极引线22、25、27、29从上基板13与下基板14重复的部分露出而向外部露出。 
如图5以及图6所示，间隔保持部件12形成为矩形的环状体形状，由作为绝缘体的硅橡胶构成。该间隔保持部件12配置成包围作用电极21、还原电极26、对极24以及参考电极28相互对向的区域。在上基板13和下基板14之间形成有与硅橡胶12的厚度t相当的间隔，由此在各电极21、24、26、28之间形成用于收容检体试样、电解液的空间30(参照图4)。形成在上基板13中的试样注入口11是贯通上基板13而形成的，以可以向该空间30内注入检体试样、电解液。 
另外，在本实施方式中，在上基板13的表面形成有作用电极21，在下基板14的表面形成有对极24、还原电极26和参考电极28，对于作用电极21、对极24、还原电极26和参考电极28的配置关系，只要各电极与其他电极不接触而配置在间隔保持部件12的框内，则没有特别限制。例如，也可以在同一基板上，配置作用电极21、对极24、还原电极26和参考电极28。 
图7是示意性地示出检查芯片4的概略图。作用电极21由形成在上基板13的表面的导电层32、和形成在该导电层32的表面的电子接受层(半导体层；半导体电极)33构成。电子接受层33包含可以 接受对被检物质42进行修饰的色素41根据光激励而释放的电子的物质。另外，作用电极21的电极引线22与导电层32连接。 
本实施方式中的上基板13由二氧化硅(SiO2)形成。导电层32以及电极引线22成为由氧化铟锡(ITO)与锑掺杂氧化锡(ATO)构成的两层结构，通过溅射法等形成在上基板13上。另外，电子接受层33由作为氧化物半导体的氧化钛(TiO2)构成，通过溅射法等形成在导电层32上。 
上基板13、导电层32、电极引线22以及电子接受层33的材质是一个例子，而不限于上述材质。例如，导电层32可以由铂、金、银、铜等金属、导电性陶瓷、金属氧化物等形成。电子接受层33是能够接受通过色素41的激励释放的电子的、可以取得能级(energylevel)的物质即可。例如，可以由硅、锗等单体半导体、硫化镉(CdS)等化合物半导体以及有机半导体等形成。 
另外，在电子接受层33自身由ITO、ATO等导电性材料构成的情况下，还可以使电子接受层33兼作导电层32。 
另外，在本实施方式中，在电子接受层33的表面通过蒸镀等形成有金属膜(金属层)(省略图示)。本实施方式的金属膜被设为金(Au)，但只要是可以与后述的探针34结合的金属，则没有特别限定。例如，也可以是铂、银、钯、镍、汞或铜等。另外，作为在电子接受层33的表面形成金属膜的方法，也可以使用溅射法、压印、丝网印刷、电镀处理或溶胶-凝胶(Sol-Gel)法等。 
在电子接受层33上(金属膜上)，固定有用于捕捉由色素41修饰的被检物质42的探针34。探针34是可以与被检物质42特异地结合的物质。例如，探针34是核酸、蛋白质或肽。另外，探针34通过共价键与设置在电子接受层33上的金属膜牢固地固定。 
作为修饰被检物质42的色素41，使用钌络合物，该色素41与被检物质42产生肽键合。但是，色素41只要是通过光源5(参照图2)被激励，而释放电子的物质，则没有特别限定。例如，色素41可以使用金属络合物、有机色素以及量子点等。作为通过光激励释放电 子的物质的具体例，可以举出金属酞菁、锇络合物、铁络合物、锌络合物、9-苯基呫吨类色素、花青类色素、金属花青类色素、呫吨类色素、三苯甲烷类色素、吖啶类色素、噁嗪类色素、香豆素类色素、部花青类色素、若丹菁(ロダシアニン)氧杂蒽色素、聚甲炔类色素、卟啉类色素、酞菁类色素、若丹明类色素、呫吨类色素、叶绿素类色素、曙红类色素、红汞类色素、靛蓝类色素、以及硒化镉类色素等。 
下基板14由二氧化硅(SiO2)形成。另外，对极24、还原电极26以及参考电极28由铂(Pt)形成，并通过溅射法设置在下基板14上。但是，这些电极24、26、28还可以由金、银、铜、碳、铝、铑、以及铟等金属、氧化物半导体、以及导电性陶瓷等构成，只要相对后述的电解液稳定，则对材质没有特别限定。另外，也可以是在氧化物半导体上通过溅射法附着了铂的电极、或者在TiO2(导电性陶瓷)上通过蒸镀附着了金的多层电极。 
(使用了检测装置的检测方法) 
对使用以上说明的检查芯片4，并通过检测装置1检测被检物质的方法进行说明。图8是示出由用户将检体试样注入到检查芯片4的步骤的流程图，图9是示出检测装置1的检测动作步骤的流程图。 
在图8中，在步骤S1中用户从检查芯片4的试样注入口11注入检体试样。对于包含在该检体试样中的被检物质42，预先用色素41来进行了修饰，如图7所示，通过固定在作用电极21的电子接受层33中的探针34来进行捕捉(在核酸的情况下，还有时称为杂化(Hybridization))。 
在步骤S2中，用户将检查芯片4内的溶液从试样注入口11排出，用杂化洗净液洗净检查芯片4内。探针34由于通过与设置在电子接受层33的表面的金属膜的共价键被牢固地固定，所以可以防止在杂化反应时以及检体试样的洗净时，探针34从电子接受层33被剥离。 
在步骤S3中，用户从试样注入口11注入电解液。该电解液可以使用例如作为电解质包含碘、作为支持电解质盐包含四丙基铵氯化物(tetrapropylammonium chloride)(NPr4Cl)、以及作为溶剂包含 将乙腈(AN)与碳酸乙烯酯(EC)以6∶4的体积比混合的有机溶剂的电解质。在向检查芯片4内注入了电解液时，电解液中的碘使电子接受层33上的金属膜(Au)溶解，探针34配置在电子接受层33上。由此，从通过在后工序中说明的光照射而激励的色素41释放的电子被电子接受层33高效地接受。 
另外，在本实施方式中，在探针的固定中利用了金属膜，但只要是使探针可以牢固地固定在电子接受层上的物质即可。例如，也可以使用氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)等硅烷偶联剂。 
之后，用户向检测装置1的芯片收容部3(参照图1)插入检查芯片4，在显示器2上进行测定开始的指示。 
在供给给检测装置1的检查芯片4中，如图7所示，其电极引线22、25、27、29与电流计6、电源9连接。电源9由第一电源9A和第二电源9B构成。第一电源9A将参考电极28作为基准而向作用电极21施加0V的电位，第二电源9B将参考电极28作为基准而向还原电极26施加-0.3V的电位(图9的步骤S4)。 
另外，在本实施方式中，可以省略参考电极28。在该情况下，第一、第二电源9A、9B分别将对极24作为基准而向作用电极21施加0V，向还原电极26施加-0.3V的电位。另外，可以适当变更施加给作用电极21以及还原电极26的电位的值。在充分地进行了后述的电解质的氧化还原的情况下，也可以不向各电极21、26施加电位。 
在图9的步骤S5中，光源5向修饰被检物质42的色素41照射光，而使色素41激励。在本实施方式中，光源5是发出激光的光源，从上基板13的外面(与电子接受层33相反的一侧的面)照射激光。通过激光激励的色素41释放电子，所释放的电子被电子接受层33接受。其结果，在作用电极21和对极24之间经由电解液流过电流(光电流)。 
在步骤S6中，可以用电流计6测定起因于电子从色素41移动到电子接受层33而在作用电极21和对极24之间流过的电流。由于用电流计6测定的电流值与色素的个数具有高的相关性，所以可以根据 测定到的电流值，来进行被检物质42的定量测定。 
此处，参照图7，对作用电极21和对极24之间的电流流动(电子的转移)的原理进行说明。在色素41通过光激励释放了电子时，电解液43中的碘(I-)对色素41转移电子，如下式那样被氧化，而成为(I3-)。 
式： 
另一方面，通过氧化产生的电解液43中的(I3-)通过自然扩散向对极24移动，并通过从对极24接收电子，而可逆地被还原为(I-)。这样反复进行电解质的氧化还原，在作用电极21和对极24之间流过电流。 
在如上所述反复进行了氧化还原反应时，可以向色素41转移电子的(I-)的浓度降低，从对极24向作用电极21的电子流动变少，从而被检物质的检测灵敏度降低。因此，在本实施方式中，与对极24独立地在检查芯片4内设置还原电极26，通过从还原电极26对电解液43中的(I3-)转移电子，被可逆地还原为(I-)。由此，(I3-)的还原反应被促进，使(I-)的浓度上升而使作用电极21和对极24之间流过的电流增大，从而可以提高被检物质42的检测精度。 
在图9的步骤S7中，通过A/D变换部7数字变换后的电流值被输入给控制部8。接下来，由控制部8根据预先制作的表示光电流值与被检物质42的量的关系的检量线，根据数字变换后的光电流值估算检体试样中的被检物质42的量。然后，制作用于在显示器2上显示所估算的被检物质42的量的检测结果画面。 
然后，在步骤S8中，由控制部8制作的检测结果画面被发送到显示器2上，在显示器2中进行显示，处理结束。 
在上述实施方式中，光源5只要是使色素41激励的光源，则没有特别限定。例如，可以使用发光二极管(LED)、无机场致发光元件、有机场致发光元件等。另外，也可以是卤素灯、氙灯等白色光源、将白色光源与光学滤波器组合的激励光源。 
由于各电极21、24、26、28经由电解液互相接触即可，所以既 可以形成在不同的基板13、14上，也可以形成在同一基板上。另外，还原电极26也可以是“梳子形”、平板状。但是，通过形成为“梳子形”，可以将边缘部分等结构作为因子，而提高电解质的还原效率。 
(实验1：通过还原电极的效果的验证) 
为了对通过上述那样的还原电极的效果进行验证，进行了如下那样的实验。在该实验中，在为了还原电解质而使用了还原电极的情况(实施例)、和没有使用还原电极的情况(比较例)下，对作用电极和对极之间的光电流值进行测定，并进行两者的比较，从而验证还原电极的有效性。 
(电极的制作) 
首先，对本实验中使用的电极的制作进行说明。在实施例以及比较例中使用的作用电极是如下制作的：在由二氧化硅(SiO2)形成的基板的表面通过溅射法形成由兼作导电层和电子接受层的氧化铟锡(ITO，厚度200nm)以及锑掺杂氧化锡(ATO，厚度100nm)构成的两层的薄膜，进而在电子接受层的表面通过真空蒸镀法形成由金(厚度10nm)构成的金属膜。 
另外，实施例的对极、还原电极以及参考电极是在由二氧化硅(SiO2)构成的基板上通过溅射法形成由铂(Pt)构成的薄膜而制作的。另一方面，在比较例中，仅制作了对极以及参考电极。 
(探针物质的固定) 
在作用电极的电子接受层(金属膜)上，固定由具有硫醇基的DNA(24碱基)构成的探针。如下进行该作业，将作用电极向分散了DNA(24碱基)的水溶液浸渍一定时间(约14个小时)，并水洗、干燥。由此，通过DNA的硫醇基与电子接受层上的金属膜即Au的共价键，探针被固定在金属膜上。 
(被检物质的调制) 
将使包含与探针相辅的碱性排列的DNA、和色素结合而得到的物质作为被检物质。色素使用钌络合物(商品名：Pulsar650、BiosearchTechnologies日本公司制)，对DNA肽键合钌络合物。 
(被检物质与探针的杂化) 
通过杂化反应，用作用电极上的探针来捕捉用色素修饰的被检物质。该作业如下进行：通过在作用电极上注入用色素修饰的DNA，并以规定温度(约45℃)加热，并且静置一定时间(约1个小时)。 
(电解液的调制) 
电解液是向将乙腈(AN)与碳酸乙烯酯(EC)以6∶4的体积比混合的溶剂，作为支持电解质盐溶解0.6M的氢氧化四丙基铵氯化物(Npr4Cl)，并作为电解质溶解0.06M的碘而调制的。 
(光电流的测定) 
用作为间隔保持部件的硅橡胶(厚度0.2mm)包围作用电极的电子接受层(金属膜)的周围，并向由该硅橡胶形成的空间注入了8μL的电解液。然后，用在上方形成了对极、参考电极以及还原电极的基板密封被注入了电解液的作用电极。由此，使作用电极、对极、参考电极以及还原电极与电解液接触。 
对实施例的还原电极以及作用电极，通过电源分别将参考电极作为基准而施加了-0.3V、0V的电压。另一方面，在比较例中，向作用电极将参考电极作为基准而施加了0V的电压。 
然后，从与固定了作用电极的探针的面相反的一侧，通过光源照射光。作为光源，使用发出可以使色素激励的规定波长(波长约473nm、强度约13mW)的激光的光源，使其以规定的周期(1Hz)点灭(导通/断开(on/off))。另外，作为作用电极21和对极24之间流过的光电流的测定值，用电流计观测根据激光的点灭(on/off)增减的光电流，并且求出该光电流的增加量。 
(测定结果) 
图10是示出在实验1中对在作用电极与对极之间流过的光电流的值进行测定而得到的结果的图表。在该图中，在附加了阴影的图表是使用了还原电极的情况(实施例)，白色的图表是没有使用还原电极的情况(比较例)。另外，对于实施例与比较例这双方，还示出了进行了使探针与被检物质杂化的工序的情况(图中左侧的图表)、和 没有进行的情况(图中右侧的图表)的光电流值的测定结果。在没有进行使探针与被检物质杂化的工序的情况下，电极自身通过光源的光照射而被激励，在作用电极与对极之间流过电极渊源(origin)的电流，而成为噪声。 
在实施例中，相对于进行了使探针与被检物质杂化的工序的情况的光电流值是37.0nA，在比较例中进行了使探针与被检物质杂化的工序的情况的光电流值是24.0nA。因此，在如实施例那样具备还原电极时，作用电极与对极之间的光电流值增大，被检物质的检测灵敏度提高。 
另外，在实施例中，没有进行使探针与被检物质杂化的工序的情况的光电流值是23.8nA，在比较例中，没有进行杂化工序的情况的光电流值是16.4nA。因此，在对实施例与比较例的S/N进行比较时，在实施例中成为S/N＝37.0/23.8＝1.55，在比较例中成为S/N＝24.0/16.4＝1.46。即，在实施例中，S/N的值变高，被检物质的检测精度提高。 
(实验2：光电流值的时间变化的验证) 
在该实验中，对由作用电极检测的光电流值的时间变化进行了测定。 
(电极的制作) 
如图11所示，作用电极是如下制作的：在由二氧化硅(SiO2)形成的基板的表面通过溅射法形成由氧化铟锡(ITO，厚度200nm)以及锑掺杂氧化锡(ATO，厚度100nm)这两层构成的导电层，并在导电层的表面形成由二氧化钛(TiO2)构成的电子接受层。 
对极、参考电极以及还原电极是与实验1同样地制作的。 
(被检物质的调制) 
在本实验中，不在电子接受层33的表面固定探针，而直接固定了修饰了色素的被检物质(DNA)。在该固定中，利用了核酸具有的硫醇基与TiO2的键、以及磷酸基与TiO2的键。 
色素与实验1同样地使用钌络合物(商品名：Pulsar650、Biosearch Technologies日本公司制)，对作为被检物质的DNA肽键 合钌络合物。 
(电解液的调制) 
电解液是与实验1同样地调制的。 
(光电流的测定) 
与实验1同样地，对作用电极以及还原电极，分别将参考电极作为基准而施加了0V、-0.3V的电位。然后，通过与实验1同样的光源，使激光以1Hz周期点灭，向与作用电极的电子接受层相反的一侧的面进行照射。 
(测定结果) 
图12是示出在实验2中由作用电极检测的光电流值的经时变化的图表。由作用电极检测的光电流根据光学的点灭而增减。于是，从光源断开到接通为止的增加量L随着时间经过而增大。其原因为，由于存在还原电极，电解液中的电解质、即碘的还原量逐渐增加。 
另外，图13是示出在实验2中在作用电极中检测的光电流值、和在还原电极中检测的电流值的图表。各个值是取图12中的电流值的增加量L而得到的值。 
根据该实验，可以知道在测定刚刚开始之后(图表左端)作用电极中的光电流值、还原电极中的电流值小，但随着时间经过都逐渐增加。其原因为，在测定刚刚开始之后，即使向还原电极施加了规定的电位，立即被还原的电解质少，而不会立即反映在光电流值中，但在时间经过后，由还原电极进行的还原反应逐渐活跃。因此，为了提高被检物质的检测灵敏度，需要从测定开始之后经过某种程度的时间。 
另外，由于测定刚刚开始之后(图表左端)的光电流值几乎不会受到还原电极的影响，所以可以推测为是与没有还原电极的情况的光电流值大致相等的值。于是，这样推测的光电流值是约25nA，约20秒后的光电流值是约43nA，所以由于存在还原电极，可以取出约1.7倍的光电流值。 
(实验3：施加给还原电极的电位的研究(I)) 
在该实验中，为了研究通过电源施加给还原电极的电位，而进行 了表示电解液的电气化学特性的循环伏安法的测定。 
在该实验中，使用了与实验1以及2同样的电解液，并使用了由铂(Pt)形成的电极。另外，电极的形状使用了与图6所示的还原电极26同样的“梳子形”电极(以10μm间距设置了5μm宽度的线状部的电极)、和在电极表面具备多个孔(井)的“井形”电极(以10μm的间距形成了孔径3μm的孔的电极)这两种。 
图14是示出在实验3中进行的电解液的循环伏安法的测定结果的图表。向电极施加从负的大电位(图14的左侧)到正的大电位(图14的右侧)，并对其进行了6个循环测定。将电位的扫描速度设为10mV/s。 
根据其结果，在施加给电极的电位大概比0V小的情况下，检测出负电流、即还原电流，另外，当考虑成在“梳子形”、“井形”这双方中有效地流过还原电流时，电位是-0.5V以上小于0V的范围，如果将还原电极的电位设定在该范围内，则可以良好地促进电解质的还原反应。 
(实验4：施加给还原电极26的电位的研究(II)) 
在该实验中，按照实验3的测定结果，一边使施加给还原电极的电位在规定的范围内变化，一边进行了光电流值的测定。 
(电极的制作) 
在作用电极中，在由二氧化硅(SiO2)构成的基板上形成了由氧化铟锡(ITO，厚度200nm)构成的电子接受层，并在乙醇(EtOH)中进行了规定时间(约10分钟)的超声波洗净。接下来，向1％APTES溶液(溶剂：甲苯)中将作用电极浸渍1个小时，用甲苯冲洗多余的APTES。 
对极、作用电极以及还原电极是与实验1同样地制作的。 
(被检物质的调制) 
将4μL的用10μM的色素修饰的DNA滴到作用电极上，在用盖玻璃密封的状态下以规定时间(约18个小时)、规定的温度(约37℃)进行浸渍固定。接下来，利用超纯水洗净作用电极。 
(光电流的测定) 
首先，在作用电极上注入与实验3同样的电解液(约8μL)。 
进而，在作用电极上，分散设置直径约10μm的硅球。该硅球是成为在实验1中使用的硅橡胶的替代的物质。通过使用硅球，在作用电极、与对极、参考电极以及还原电极(以下还称为对极等)之间，形成用于注入电解液的空间。在实验1中，作用电极与对极等的间隔根据硅橡胶而被设定为约0.2mm，但在本实验中，作用电极与对极等的间隔被设定为作为硅球的直径的约10μm。 
接下来，用在上方形成了对极、参考电极以及还原电极的基板密封被注入电解液的作用电极。由此，使作用电极、对极、参考电极以及还原电极与电解液接触。 
接下来，向作用电极，通过电源将参考电极作为基准而施加0V的电位。然后，一边将参考电极作为基准而使0V-0.5V的范围的电位经时地变化一边将其施加给还原电极。另外，向与固定了作用电极的探针的面相反的一侧，通过光源照射光。对于光源，使用发出可以使色素激励的规定波长(波长约488nm、强度约13mW)的激光的光源。 
然后，利用电流计对通过光照射而在作用电极与对极之间流过的光电流进行测定。 
(测定结果) 
图15是示出在实验4中对与施加给还原电极的电位的变化对应的光电流值进行测定而得到的结果的图表。向还原电极，按照从图表的左侧朝向右侧的顺序，一边每隔规定的时间间隔(约1分钟)在0V～-0.5V的范围内使电位变化一边进行施加。其中，左端与从右数的第二个白色的图表表示未对还原电极施加电压的情况的光电流值，其他附加了阴影的图表表示对还原电极施加了电位的情况的光电流值。 
如图15所示，在测定刚刚开始之后，未对还原电极施加电压，此时的光电流值是3.41nA。之后，在将施加给还原电极的电位每隔1分钟向负的方向增大时，由于还原反应被促进，所以光电流值逐渐上 升。特别地，在电位从-0.2V向-0.3V变化时，出现1nA以上的大光电流值的上升。 
在向还原电极施加了-0.3V的电位之后，临时停止向还原电极施加电位，之后，在经过约12分钟之后向还原电极再次施加-0.5V的电位。通过施加-0.5V的电位，光电流进一步上升。因此，根据本实验可知，如果施加给还原电极的电位是-0.5V以上且小于0V的范围，则在任意的电位下都可以良好地提高光电流值，从而提高被检物质的检测灵敏度。 
另一方面，在将施加给还原电极的电位与-0.5V相比更向负的方向增大时，引起电解质、作为被检物质的DNA、或作为探针的DNA的电气分解反应，从而测定结果有可能变得不稳定。 
另外，在成为0V以上时，难以通过还原电极产生还原反应。 
另外，在图15中，在使电位从-0.3V变化至-0.5V的过程中停止了电位的施加，但在该期间光电流值也增大(从右数的第二个白色的图表)。其原因为，在直到停止施加电位为止的阶段，通过还原电极，还原反应被促进，从而电解液中的(I-)的浓度提高。 
(实验5：电极间的间隔的研究) 
在本实验中，在使作用电极与对极等的间隔与实验1不同的状态下测定光电流值，从而研究了作用电极和对极等的间隔与光电流值之间的关系。具体而言，在作用电极和对极等之间形成了约200nm的间隔的状态下测定光电流，并将该测定值与形成了约200μm的间隔的情况的光电流的测定值进行比较。 
(作用电极的制作以及被检物质的调制) 
作用电极的制作以及被检物质的调制是与上述实验4同样地进行的。 
(对极、还原电极以及参考电极的制作) 
还原电极是与实验3中使用的“井形”电极(以10μm间距形成了孔径为3μm的孔的电极)同样地制作的。另外，对于对极、还原电极以及参考电极，与实验1同样地，在由二氧化硅(SiO2)构成的基板 上通过溅射法形成由铂(Pt)构成的薄膜。 
(电解质的调制) 
电解液是向将乙腈(AN)与碳酸乙烯酯(EC)以6∶4的体积比混合的溶剂，作为支持电解质盐溶解0.6M的氢氧化四丙基铵碘化物(NPr4I)，作为电解质溶解0.06M的碘而调制的。 
(光电流的测定) 
首先，在作用电极上滴下电解液(约1μL)。然后，在作用电极上分散直径约200nm的硅球的状态下进行设计。通过该硅球，在作用电极与对极等之间形成用于注入电解液的间隔(空间)。在实验1中，由硅橡胶形成的间隔是约200μm(0.2mm)，但在本实验中，由硅球形成的间隔成为作为硅球的直径的约200nm。 
用在上方形成了对极、参考电极、以及还原电极的基板密封了被注入电解液的作用电极。由此，使作用电极、对极、参考电极以及还原电极与电解液接触。 
向作用电极，将参考电极作为基准而施加0V的电位，向还原电极，将参考电极作为基准而施加-0.1V的电位。另外，从光源对与固定了作用电极的探针的面相反的一侧照射光。对于光源，使发出可以使色素激励的规定波长(波长约488nm、强度约13mW)的激光。 
然后，利用电流计对通过光照射而在作用电极与对极之间流过的光电流进行测定。 
(测定结果) 
图16是示出在实验5中在作用电极与对极之间流过的光电流的测定结果的图表。在图16中，左端的白色图表表示使用厚度约200μm的硅橡胶，并且未向还原电极施加电位的情况的光电流的测定结果。另外，对使用了直径约200nm的硅球的情况的光电流进行了三次测定，并在图16的No.1～No.3中示出了各测定结果。在No.1～No.3的各测定中，在向还原电极施加了电位的情况与未施加电位的情况这两个模式下测定光电流，在附加了阴影的图表与白色的图表中分别表示其测定结果。 
在No.1～No.3所示的测定结果中，在对向还原电极施加了电位的情况、与未施加的情况进行比较时，前者的光电流值更高。因此，可以判断为通过向还原电极施加电位而电解质的还原反应被促进。另外，在对作用电极与对极等的间隔是200μm的情况与200nm的情况进行比较时，前者的测定值是21.8nA，相对于此后者的测定值是33.1nA(No.1)，即使未向还原电极施加电位，光电流值也增大至约1.5倍。因此，作用电极与对极等的间隔越小，越有效。另外，即使未向还原电极附加电位，但只要是在自然电位的状态下保持为可以还原电解质的电位的材质的电极(在本实验中为白金)，则可以用作还原电极。 
另外，还可以将上述各实验中使用的电极、电解液、光源等结构应用于实施方式中的检查芯片、检查装置以及方法。 

Claims (3)

1.一种对由通过光激励产生电子的修饰物质修饰的被检物质进行检测的方法，其特征在于，包括：
对检查芯片应用包含上述被检物质的试样，通过探针捕捉上述被检物质的工序，其中，上述检查芯片具备：作用电极，具有半导体层；探针，能够捕捉上述被检物质并且固定在上述半导体层上；对极，由导电性材料构成；以及还原电极，用于还原电解质，其中，所述还原电极与所述对极独立地设置；
在使包含电解质的电解质介质向上述作用电极、上述对极以及上述还原电极接触的状态下，对修饰由上述探针捕捉的上述被检物质的修饰物质照射使该修饰物质激励的光的工序；以及
通过上述还原电极使包含在上述电解质介质中的电解质还原，对由于电子从通过上述光被激励的修饰物质向上述作用电极移动而在上述作用电极与上述对极之间流过的电流进行测定的工序，
通过上述还原电极进行的还原是在将上述对极作为基准而向上述还原电极施加了-0.5V以上且小于0V的电位的状态下进行的。
2.根据权利要求1所述的对被检物质进行检测的方法，其特征在于，上述探针是核酸、蛋白质或肽。
3.根据权利要求1所述的对被检物质进行检测的方法，其特征在于，上述电解质是碘或碘化物。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101317087B (zh) * 2005-09-29 2013-01-02 Toto株式会社 使用光电流特异性检测被检测物质的方法、其中所使用的电极、测定池和测定装置
JP5856780B2 (ja) * 2010-08-27 2016-02-10 シスメックス株式会社 検出物質の光電気化学的検出方法及び被検物質の光電気化学的検出方法
JP5806892B2 (ja) 2010-09-30 2015-11-10 シスメックス株式会社 検出物質の電気化学的検出方法および被検物質の電気化学的検出方法
JP5809010B2 (ja) * 2010-10-29 2015-11-10 シスメックス株式会社 検出物質の検出装置、電極基板、作用電極、検査チップ、検出物質の検出方法および被検物質の検出方法
JP2012150097A (ja) 2010-12-28 2012-08-09 Sysmex Corp 光電流検出用電極及びその製造方法並びに作用電極基板
WO2014018167A2 (en) * 2012-07-27 2014-01-30 Genefluidics, Inc. Cartridge for liquid transport
CN113777143A (zh) * 2021-09-16 2021-12-10 哈尔滨工业大学（深圳） 一种多通道集成式阵列光电化学传感电极及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1875113A (zh) * 2003-10-29 2006-12-06 新加坡科技研究局 借助分析物/聚合物活化剂双层排列检测分析物的方法
CN101059477A (zh) * 2007-05-11 2007-10-24 浙江大学 一种基于氧化/还原探针的细胞生长以及形态变化检测装置及检测方法
EP1947452A1 (en) * 2005-09-29 2008-07-23 Toto Ltd. Method for specifically detecting test substance using photocurrent, and electrode, measuring cell and measuring device for use therefor

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766934A (en) * 1989-03-13 1998-06-16 Guiseppi-Elie; Anthony Chemical and biological sensors having electroactive polymer thin films attached to microfabricated devices and possessing immobilized indicator moieties
US5470484A (en) * 1994-01-13 1995-11-28 Buckman Laboratories International, Inc. Method and apparatus for controlling the feed of water treatment chemicals using a voltammetric sensor
US6221586B1 (en) * 1997-04-09 2001-04-24 California Institute Of Technology Electrochemical sensor using intercalative, redox-active moieties
US6686150B1 (en) * 1998-01-27 2004-02-03 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
GB9808264D0 (en) * 1998-04-17 1998-06-17 Imperial College Biochemical devices and their methods of manufacture
US7022218B2 (en) * 2001-05-29 2006-04-04 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biosensor with interdigitated electrodes
EP1560930A4 (en) * 2002-11-15 2007-05-16 Applera Corp NUKLEINSûURESEQUENZNACHWEIS
US7981362B2 (en) * 2003-11-04 2011-07-19 Meso Scale Technologies, Llc Modular assay plates, reader systems and methods for test measurements
JP4919101B2 (ja) * 2004-09-24 2012-04-18 Ｔｏｔｏ株式会社 増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサセルおよび測定装置
US7892816B2 (en) * 2006-09-28 2011-02-22 Colorado State University Research Foundation Electrochemical detection of substrates

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1875113A (zh) * 2003-10-29 2006-12-06 新加坡科技研究局 借助分析物/聚合物活化剂双层排列检测分析物的方法
EP1947452A1 (en) * 2005-09-29 2008-07-23 Toto Ltd. Method for specifically detecting test substance using photocurrent, and electrode, measuring cell and measuring device for use therefor
CN101059477A (zh) * 2007-05-11 2007-10-24 浙江大学 一种基于氧化/还原探针的细胞生长以及形态变化检测装置及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N. Papageorgiou等."An Iodine/Triiodide Reduction Electrocatalyst for Aqueous and Organic Media".《Journal of the Electrochemical Society》.1997,第144卷(第3期), *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010107345A (ja) 2010-05-13
CN101726527A (zh) 2010-06-09
US20100108539A1 (en) 2010-05-06
EP2182358B1 (en) 2012-07-04
EP2182358A1 (en) 2010-05-05
JP5172606B2 (ja) 2013-03-27

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