CN110951733A - 一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA及构建的表达载体和应用 - Google Patents

一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA及构建的表达载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属生物医药以及分子生物学技术领域，涉及一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA，靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体。构建的RNA干扰重组慢病毒载体用于抑制食管癌细胞EGFL6基因表达，以有效抑制食管癌细胞EGFL6基因表达。所述siRNA为双链，标记为si EGFL6，利用失活慢病毒载体携带UCP2 RNA干扰片段的DNA模板，其在体内转录成shRNA,完美的解决了RNA干扰的靶向性、安全性以及表达持续性的问题。将目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小，是一种比较理想的用于导入肿瘤细胞，用于EGFL6基因在肿瘤细胞中沉默的干扰载体。

Description

一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA及构建的表达载 体和应用
技术领域
本发明属于生物医药以及分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA及构建的表达载体和应用。
背景技术
当今社会肿瘤的发病率和死亡率越来越高，由于肿瘤的侵袭性强且易转移，患者就诊时大多数都已处于中晚期，手术及放化疗疗效均有限。肿瘤的生长，发展和转移依赖新血管的生成，目前研究最为明确血管生成因子为内皮细胞生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF），并针对VEGF开发了多种抗血管生成药物，其中使用最为广泛的抗血管生成药物是贝伐单抗（bevacizumab），是一种阻断VEGF-A活性的单克隆抗体，已应用到多种肿瘤的治疗中，并取得了一定的疗效。但随着这种药物的使用，高血压、出血性休克、创伤愈合受损等特殊的不良反应也随着成为一个重要的问题，而且鉴于抗VEGF药物对伤口愈合的影响，这类药物也不适合在围手术期使用。因此，寻找抗肿瘤血管生成的独特靶点已成为当前肿瘤治疗领域亟待解决的关键性问题。
EGFL6是EGF超家族的成员，近年来众多学者的研究表明EGFL6在肿瘤相关内皮细胞中高度表达，而正常组织和伤口相关的内皮细胞表达较低，成为肿瘤血管中具有独特作用的重要靶点，且参与多种肿瘤的发生、发展过程成为目前肿瘤治疗研究的一大热点。
前期的研究表明EGFL6在卵巢肿瘤相关内皮细胞中高度表达，而正常卵巢和伤口相关的内皮细胞表达较低，成为肿瘤血管中具有独特作用的重要靶点。食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位于全部恶性肿瘤的第八位和第六位。我国食管癌呈高发状态，山西、河南以及河北更是“食管癌高发带”。我们前期通过免疫组化证实与正常食管组织相比，食管癌组织中EGFL6表达较高，因此推测EGFL6通过调控食管肿瘤组织的血管生成而参与肿瘤的发生发展，针对EGFL6的靶向治疗可能成为食管肿瘤抗血管生成治疗的新靶点。基于上述结论，欲利用食管癌细胞证明 EGFL6基因与肿瘤发生发展之间的联系，及探索其引起肿瘤发生发展的机制。因此，需要构建一个EGFL6基因功能研究模型，并在后续机制研究中发挥重要作用。目前，关于食管癌中EGFL6基因相关的siRNA及表达载体还未见研究报道。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将mRNA完全降解。
siRNA是RNA干扰的主要效应物。至今哺乳动物细胞RNAi 技术路线可以通过两种方式进行： 1) 直接制备21~23nt 的siRNA片段，将siRNA转入哺乳动物细胞。2) 将短发夹结构RNA (shRNA) 的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA, 经过Dicer切割后得到siRNA 。前者不适合长时间的研究项目，而后者可持续较长时间，有利于后续的实验开展。
RNAi 抑制基因表达作用在很大程度上受到转染方式、转染效率的限制，解决问题的关键是选择合适的载体导入细胞。目前siRNA 的导入方式有三种， 1) 化学合成siRNAs转染干扰， 2) shRNA表达载体法， 3) 病毒载体法。
为了能更加准确的说明EGFL6基因与肿瘤发生发展之间的联系，单纯的细胞实验很难有说服力，因此就需要用体外法来进一步验证。因此首选病毒载体法，即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞，再将肿瘤细胞导入动物体内，然后检测RNA干扰效果。
慢病毒载体是以HIV-1 为基础发展起来的基因治疗载体，其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，目前被广泛应用于表达RNAi的研究中。与质粒载体及其他病毒载体相比，慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。
发明内容
本发明提供了一种靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的siRNA。
本发明还提供了靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体。
本发明还提供了所构建的RNA干扰重组慢病毒载体的应用，用于抑制食管癌细胞EGFL6基因表达，以有效抑制食管癌细胞EGFL6基因表达。
本发明由如下技术方案实现的：一种靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的siRNA，所述siRNA为双链，标记为si EGFL6 ，序列为：
正义链：5' GGAAGCUACUACUGCAAAUTT 3'；
反义链：5' AUUUGCAGUAGUAGCUUCCTT 3'。
一种靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体，根据所述的siRNA序列，合成编码shRNA 的双链DNA片段，然后将其连接到自身失活的第三代慢病毒载体pLKO.1 puro的多克隆位点中，构建重组慢病毒载体。
具体构建方法为：
（1）根据所述的siRNA序列，合成编码shRNA 的DNA模板单链的正义链和反义链，序列为：
sh EGFL6-1 正义链：5' -CCGG GGAAGCUACUACUGCAAAUTT TTCAAGAGAUAAACGUCAUCGAAGGAA TTTTTTT GGTACC— 3' ；
sh EGFL6-2 反义链：5'-AATT GGTACC AAAAAA TTCCUUCGAUGAUGACGUUUA TCTCTTGAAAAATTGCAGTAGTAGCTTCC-3' ；
（2）将编码shRNA 的DNA模板单链的正义链和反义链退火形成双链DNA 片段，连接到pLKO.1 puro慢病毒载体的多克隆位点中，构建重组慢病毒载体pLK sh EGFL6；
（3）再以所述重组慢病毒载体pLK sh EGFL6联合第二代慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2dvpr和膜蛋白表达质粒pCMV-VSV-G共转染293T细胞，获得包装的重组慢病毒载体。
步骤（2）中具体方法为：在双链DNA片段的末端引入与Age I 和EcoR I酶切载体位点相连接的黏末端，并以Age I 和EcoRI 酶切pLKO.1 puro慢病毒载体，回收大片段与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。
所述的靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体在制备治疗食管癌的药物中的应用，所述重组慢病毒载体为靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达。
根据所述的siRNA序列，合成的两条编码shRNA 的DNA模板单链的正义链和反义链，由5' 黏末端+21nt靶序列＋茎环结构＋靶序列互补序列＋转录终止位点+3' 黏末端结构构成。
本发明所构建的RNA干扰重组慢病毒载体可以应用于抑制食管癌细胞EGFL6基因表达上，以有效抑制食管癌细胞EGFL6基因表达。
本发明提供的siRNA序列，通过体外转染实验证实，该序列能够有效抑制食管癌细胞中的EGFL6基因表达。进一步构建了能够稳定表达上述siRNA序列的重组慢病毒载体，并在293T细胞中生产出具有高感染率的该重组慢病毒。通过体内感染实验，该高效稳定表达EGFL6基因shRNA序列的重组慢病毒能够明显抑制食管癌细胞的EGFL6基因表达。上述研究结果为进一步研究EGFL6基因在肿瘤发生过程中的作用提供了细胞模型。
本发明采用的pLKO.1 puro载体含有U6 启动子，能够在宿主细胞中持续表达有干扰作用的小RNA同时，该质粒能够表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白EGFP,方便病毒包装时转染效率的检测，以及感染宿主细胞时感染效率的检测。本发明采用的第二代慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2 dvpr和膜蛋白表达质粒pCMV-VSV-G共转染293T细胞提供了病毒包装所需要的酶和蛋白。将以上载体共转染293T细胞，能够高效组装自身失活的慢病毒载体。使用辅助质粒包装病毒无需感染性的腺病毒，而且只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。
与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，利用慢病毒构建的shRNA载体具有以下优点：一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，转入靶细胞后可以插入宿主细胞基因组中并稳定表达，不会导致插入失活；另一方面，该病毒载体可用于感染传统转染试剂难以转染的非分裂细胞系，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，而前期其他传统形式的转染实验都无法达到预期目标。本发明将目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小，是一种比较理想的用于导入肿瘤细胞，用于EGFL6基因在肿瘤细胞中沉默的干扰载体。
本发明利用失活慢病毒载体携带UCP2 RNA干扰片段的DNA模板，其在体内转录成shRNA, 完美的解决了RNA干扰的靶向性、安全性以及表达持续性的问题。
附图说明
图1 是pLKO.1 puro慢病毒载体的结构示意图。
图2是病毒感染食管癌细胞的荧光显微镜观测结果；图中：A为pLK sh control 白光；B为pLK sh control荧光；C为pLK sh EGFL6 白光；D为pLK sh EGFL6 荧光。
图3是病毒感染食管癌细胞48h后对EGFL6基因mRNA表达干扰的效果图；注:**P<0.01，与空病毒对照组(Blank)比较。
图4是病毒感染食管癌细胞72h后对EGFL6基因的蛋白Western-blot检测结果；图中：1为空病毒对照组(Blank)，2 为pLK sh control 病毒干扰阴性对照组，3 为pLK shEGFL6 病毒干扰组。
图5是病毒感染食管癌细胞72h 后对EGFL6基因的蛋白Western-blot检测结果灰度值扫描；图中：1为空病毒对照组， 2 为pLK sh control病毒干扰阴性对照组， 3 为pLKsh EGFL6 病毒干扰组。
图6为体外转染食管癌细胞系，Real-time PCR及Western-blot结果图；图中：A为Real-time PCR结果；B为Western-blot结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1：设计靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的siRNA序列。
根据食管癌细胞EGFL6基因的mRNA序列(NM_015507.4), 设计3组针对EGFL6基因表达的siRNA序列及对照siRNA序列，并从中筛选出一个干扰效果最佳的siRNA序列，命名为si EGFL6。具体的siRNA序列如下，其中siEGFL6为有效干扰片段组， siNC为阴性对照组。
si EGFL6:5' — GGAAGCUACUACUGCAAAUTT— 3'；
5' — AUUUGCAGUAGUAGCUUCCTT— 3'。
si NC: 5' — UUCUCCGAACGUGUCACGUTT — 3'；
5' — ACGUGACACGUUCGGAGAATT— 3'。
通过体外转染食管癌细胞系，Real-time PCR及Western-blot方法挑选出转染效率最高的上述序列。该序列能够有效抑制食管癌细胞中的EGFL6基因表达。实验结果如图6所示。
实施例2：寡核苷酸的设计及合成：以实施例1设计的siRNA序列设计合成shRNA 的正义链和反义链。所述shRNA 中的Loop结构选用了"c TCAAGAGA" 和"TCTCTTGAg" , 并分别在5' 端加上Age I 和EcoR I酶切位点黏末端，由Invitrogen公司合成序列，具体的shRNA序列如下：
pLK sh EGFL6—1 (正义链）：5' -CCGG GGAAGCUACUACUGCAAAUTT TTCAAGAGAUAAACGUCAUCGAAGGAA TTTTTTT GGTACC— 3'；
pLK sh EGFL6 — 2(反义链）：5'-AATT GGTACC AAAAAA TTCCUUCGAUGAUGACGUUUATCTCTTGAA AAATTGCAGTAGTAGCTTCC-3'；
pLK sh control—1 (正义链）：5' -CCGG UUCUCCGAACGUGUCACGUTT TTCAAGAGAAATTCTCCGAACGTGTCACGT TTTTTTT GGTACC— 3'；
pLK sh control— 2(反义链）：5'-AATT GGTACC AAAAAA ACGUGACACGUUCGGAGAATTTCTCTTGAA AAACGTGACACGTTCGGAGAA-3'。
pLK sh EGFL6构建的EGFL6慢病毒包装载体（在pLKO.1 puro载体里加了能够干扰EGFL6基因表达的片段），pLK sh control病毒干扰阴性对照组，在pLKO.1 puro这个载体里加了与EGFL6干扰片段长度相同的无意序列。
将上述合成好的shRNA序列用oligo annealing buffer溶解成20μM后，互补单链各取30μ1 混合， 95℃水浴加热5 分钟，自然冷至室温，形成双链oligo 片段。取lμl 所述退火产物用于后续的连接反应，其余-20℃保存。
实施例3：靶向抑制食管癌EGFL6基因表达的干扰慢病毒载体的构建：慢病毒载体pLKO.1 puro的结构示意图如图1所示。该载体含有U6 启动子，能够在宿主细胞中持续启动下游基因表达，及持续表达有干扰作用的小干扰RNA 。该载体还含有CMV 启动子，能够驱动荧光蛋白EGFP 的表达，方便转染效率及感染效率的检测。
以Age I 和EcoR I双酶切慢病毒载体pLKO.1 puro使其线性化，胶纯化回收后，用T4连接酶与实施例2所得到的退火产物16℃连接过夜，转化感受态菌，挑取重组阳性克隆，经转化筛选之后，送Invitrogen公司进行测序鉴定。
测序结果显示与设计的序列完全相同，获得的正确克隆即为构建成功的靶向抑制食管细胞EGFL6基因表达的干扰慢病毒载体，命名为pLK sh EGFL6。
实施例4：重组干扰慢病毒载体的包装及滴度测定：取实施例3 制备的高纯度重组慢病毒载体pLK0.1-shEGFL6, 联合第二代慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2 dvpr和膜蛋白表达质粒pCMV-VSV-G (均购自Addgene)共转染293T细胞，具体操作步骤按照Invitrogen公司Lipofectamine 3000使用说明进行。
预先准备2 个lOcm细胞培养皿培养293T细胞，培养基为DMEM+10%FBS+1%Glutamax+1%青霉素-链霉素。将细胞分到10 个10cm培养皿中，每瓶细胞密度约107个。第二天镜下检查细胞，细胞融合度大致为80~90%, 分布均匀。
在2ml的聚丙烯微量离心管中，为每次转染制作鸡尾酒：1μg pLKO.1-shEGFL6质粒、750 ng pCMV-dR8.2 dvpr包装质粒、250 ng pCMV-VSV-G包膜质粒，至20μl无血清Opti-MEM™ I培养基。采用lipofectamine 3000 试剂改善慢病毒生产。
取两支无菌的5ml 离心管，标记A、B,其中A管中：使用Opti-MEM™ I培养基稀释Lipofectamine 3000试剂，充分混匀。复合物中的Opti-MEM™ I培养基1.5mL，Lipofectamine 3000试剂41μL。制备B 管：前面制备的鸡尾酒加入Opti-MEM™ I和P3000Enhancer试剂并充分混匀，复合物中的Opti-MEM™ I培养基1.5mL ，P3000试剂 35 μL。将A管加入B管 (1:1比例)， 充分混匀；A管体积1.5mL， B管体积1.5mL。
孵育：室温孵育15分钟，去除培养皿中50%的培养基，去除的培养基体积 6mL，将DNA-脂质体复合物加至293T细胞中 ，复合物体积 (每孔) 3mL，在37℃、5% CO2下孵育6小时去除并更换包装培养基(500MLGibcoTM Opti-MEM™ I减血清培养基，加入1Mm GibcoTM丙酮酸钠和5%GibcoFBS的GlutaMAXTM添加剂)然后再孵育过夜，包装培养基体积12mL，首次收集病毒上清液于转染24小时后，收集全部的细胞上清液，置于4℃保存，再加入预热37℃的包装培养基，包装培养基体积12mL，在37℃、5% CO2下孵育，转染52小时后，第2次收集病毒上清液，将两次收集的上清液混合，收集总体积24mL，2,000 rpm离心病毒上清液，通过45μm孔径的过滤器过滤上清液；测量滴度、分装并置于- 80℃保存。并取其中一支进行病毒生物学滴度测定。
实施例5：靶细胞侵染试验及基因表达抑制效果分析：
1、以重组干扰慢病毒载体侵染食管癌细胞：
1)选取状态良好的食管癌细胞，吸管柔和吹打使细胞分散，离心收集，用细胞培养液重悬后细胞计数，调节细胞浓度为3×104-5×104个/ml, 按90μ1/孔加入到24孔板里，放置培养箱里培养24 小时。
2) 制备MOI值为40 的重组干扰慢病毒载体稀释病毒液，吸去96孔板中的培养液，每孔加入100微升稀释病毒液，同时设立无效干扰片段病毒载体稀释液和空病毒载体稀释液，分别作为阴性对照和空白对照。
3) 24小时后去除含有病毒的培养液，加入新的培养液继续培养， 72 小时后在倒置荧光显微镜下通过观察GFP表达判断转染效率。图2是病毒感染食管癌细胞荧光的显微镜下观测结果，由于pLKO.1 puro载体上含有绿色荧光蛋白基因，可以看到食管癌细胞90% 以上的细胞均被病毒载体感染，感染效率较高。收集细胞样品，所得细胞用于Real-time PCR(实时定量PCR) 及Western-blot (蛋白印迹）检测。
2、侵染后食管癌细胞的RT-QPCR检测：
病毒感染食管癌细胞72 小时后，收集被感染细胞，常规Trizol 法提取细胞RNA, 逆转录获取cDNA, 逆转录试剂盒购自Takara 公司，具体步骤根据Takara公司的PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)操作说明书进行。
1) 去除基因组 DNA 反应：按表1所示成分于冰上配制反应混合液；PCR条件为：42℃、2 min；4℃.
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2) 反转录反应：按表2所示成分于冰上配制反转录反应液。PCR条件为：37℃ 15 min；85℃ 5 sec ；4℃。得到的RT反应产物cDNA用于PCR 。
表2
Figure 690914DEST_PATH_IMAGE002
3) Real—time PCR检测：以GAPDH基因作为内参，采用实时荧光定量PCR检测：引物序列如下：GAPDH：F:5’- TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，R：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；EGFL6：F:5’-AGGCATCACGGGTTGTTAGC -3’，R：5’-CGTAGCAGCAGGCCAGTTTAG-3’。
按表3所示比例配置反应体系：
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
设定程序为三步法Real-time 扩增程序， 95℃预变性2min30S, 之后每一步95℃变性5S,72℃退火延伸30S,55℃退火后延伸30S，共45个循环。每次在后延伸阶段读取吸光值。
结果表明，所设计的特异性干扰片段能有效抑制EGFL6基因表达，被感染食管癌细胞基因表达量仅为对照的28%, 即干扰率为72%, 具体结果如图1 和图2 所示，其中pLK shcontrol为转染了空病毒对照的食管癌细胞组（阴性对照），pLK sh EGFL6为转染了EGFL6基因的食管癌细胞组。
图3是以重组干扰慢病毒载体感染食管癌细胞48h 后，对食管癌细胞EGFL6 基因mRNA表达干扰的效果图。图中，空病毒组为转染了空病毒的对照组（空白对照）， pLK shcontrol为转染了pLKO.1 puro 病毒对照的细胞组（阴性对照），pLK sh EGFL6为转染了EGFL6基因的食管癌细胞组（阳性组）。可见被感染的食管癌细胞EGFL6基因mRNA表达量仅为空白对照的28%, 即干扰率为72% 。
3 、Western—blot 检测：本次实验中的抗体信息如表4所示。
表4
Figure 996605DEST_PATH_IMAGE004
病毒转染后72 小时，提取各实验组细胞总蛋白， Western blot 检测， EGFL6 和β-actin 的灰度比值显示，抑制率为65%, 说明该质粒抑制EGFL6 的效率较高，如图4 、5 所示。
图4是病毒感染食管癌细胞72h 后对EGFL6基因蛋白Western -blot检测结果，图中1为空病毒对照组， 2 为pLK sh control病毒干扰阴性对照组，3 为pLK sh EGFL6 病毒干扰组，可见第3 组蛋白表达条带明显减少。
图5是病毒感染食管癌细胞72h 后对EGFL6基因蛋白Western -blot检测结果的灰度值扫描。图中1 为空病毒对照组， 2 为pLK sh control病毒干扰阴性对照组， 3 为pLKshEGFL6 病毒干扰组。灰度扫描显示，第3组表达干扰达70% 左右。
上述图3 、4 、5 均可以说明，pLK sh EGFL6病毒干扰组可以明显降低食管癌细胞中EGFL6 的表达， pLK sh EGFL6为有效干扰片段。
siRNA序列，通过体外转染实验证实，该序列能够有效抑制食管癌细胞中的EGFL6基因表达。进一步构建了能够稳定表达上述siRNA序列的重组慢病毒载体，并在293T细胞中生产出具有高感染率的该重组慢病毒。通过体内感染实验，该高效稳定表达EGFL6基因shRNA序列的重组慢病毒能够明显抑制食管癌细胞的EGFL6基因表达。上述研究结果为进一步研究EGFL6基因在肿瘤发生过程中的作用提供了细胞模型。
采用的pLKO.1 puro载体含有U6 启动子，能够在宿主细胞中持续表达有干扰作用的小RNA同时，该质粒能够表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白EGFP,方便病毒包装时转染效率的检测，以及感染宿主细胞时感染效率的检测。本发明采用的第二代慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2 dvpr和膜蛋白表达质粒pCMV-VSV-G共转染293T细胞提供了病毒包装所需要的酶和蛋白。将以上载体共转染293T细胞，能够高效组装自身失活的慢病毒载体。使用辅助质粒包装病毒无需感染性的腺病毒，而且只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。

Claims (5)

1.一种靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的siRNA，其特征在于：所述siRNA为双链，标记为si EGFL6 ，序列为：
正义链：5' GGAAGCUACUACUGCAAAUTT 3'；反义链：5' AUUUGCAGUAGUAGCUUCCTT 3'。
2.一种靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体，其特征在于：根据权利要求1所述的siRNA序列，合成编码shRNA 的双链DNA片段，然后将其连接到自身失活的第三代慢病毒载体pLKO.1 puro的多克隆位点中，构建重组慢病毒载体。
3.根据权利要求2所述的一种靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体，其特征在于：具体构建方法为：
（1）根据所述的siRNA序列，合成编码shRNA 的DNA模板单链的正义链和反义链，序列为：sh EGFL6-1 正义链：5' -CCGG GGAAGCUACUACUGCAAAUTT TTCAAGAGAUAAACGUCAUCGAAGGAA TTTTTTT GGTACC— 3' ；
sh EGFL6-2 反义链：5'-AATT GGTACC AAAAAA TTCCUUCGAUGAUGACGUUUA TCTCTTGAAAAATTGCAGTAGTAGCTTCC-3' ；
（2）将编码shRNA 的DNA模板单链的正义链和反义链退火形成双链DNA 片段，连接到pLKO.1 puro慢病毒载体的多克隆位点中，构建重组慢病毒载体pLK sh EGFL6；
（3）再以所述重组慢病毒载体pLK sh EGFL6联合第二代慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2dvpr和膜蛋白表达质粒pCMV-VSV-G共转染293T细胞，获得包装的重组慢病毒载体。
4.根据权利要求3所述的一种靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体，其特征在于：步骤（2）中具体方法为：在双链DNA片段的末端引入与Age I 和EcoR I酶切载体位点相连接的黏末端，并以Age I 和EcoRI 酶切pLKO.1 puro慢病毒载体，回收大片段与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。
5.权利要求2所述的靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体在制备治疗食管癌的药物中的应用，其特征在于：所述重组慢病毒载体为靶向抑制食管癌细胞EGFL6基因表达。
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