CN106868006B - 一种e2f1蛋白可结合dna片段及在e2f1活性检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种E2F1蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个E2F1蛋白结合框；还涉及该DNA片段的应用；还涉及一种用于检测细胞内E2F1转录调控活性的方法。通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内E2F1的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析E2F1作为转录因子在一些发育生物学和病理学发展中所起的作用。

Description

一种E2F1蛋白可结合DNA片段及在E2F1活性检测中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种E2F1蛋白可结合的DNA片段及其在检测细胞内E2F1转录调控活性中的应用。

背景技术

转录因子E2F1是由人类E2F1基因编码，是细胞周期相关转录因子E2F家族成员之一，其活化可将信号传至核内，推动细胞周期由G1期进入到S期。E2F家族在控制细胞周期及抑癌基因功能上起到重要作用，也是小DNA致癌病毒转化蛋白的靶点。E2F家族中多个成员蛋白包含许多进化保守的结构域，即DNA结合域、与蛋白相互作用的二聚化结构域、富含酸性氨基酸的转活化结构域及位于转活化结构域中的抑癌蛋白关联结构域。

近年来研究发现，E2F1以细胞周期依赖性模式，优先与视网膜母细胞瘤蛋白pRB结合，介导细胞增殖及p53依赖性或非依赖性细胞凋亡。E2F1还参与肿瘤细胞代谢重编程，在肿瘤的发生、发展中起到重要作用。

在以上发育学或病理学过程中，E2F1作为转录调节因子的作用十分关键，其不同的剪切变体以及结合位点的改变均有可能造成其活性的改变，进而造成细胞功能紊乱，导致疾病的发生，甚至诱发恶性肿瘤。然而，目前检测E2F1内源性活性仍然依靠WesternBlot或者RCR等技术，这类方法虽然灵敏度高，但检测到的只是E2F1蛋白含量的差异，并不能直接体现其结合到靶序列后活性的改变。

因此，需要设计一种新的用于检测细胞内E2F1转录调控活性的方法。

发明内容

发明人通过研究发现，E2F1蛋白结合的DNA序列存在高度的保守性，其结合的DNA核心序列为5’-TTTSSCGS-3’(S表示C或G)。

基于以上研究，本发明提供了一种E2F1蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个E2F1蛋白结合框，所述E2F1蛋白结合框的序列为5’-TTTSSCGS-3’(S表示C或G)。

优选地，当包含多个E2F1蛋白结合框时，每两个相邻的E2F1蛋白结合框之间具有间隔序列，并且每两个相邻的E2F1蛋白结合框之间的间隔序列为所述间隔序列为2-4个A和/或T。用多个结合框可提高E2F1蛋白的识别和结合效率，提高灵敏度。

优选地，所述DNA片段的序列如SEQIDNO:1所示。在研究过程中，我们试验了多种组合，结果发现该序列的DNA片段比其他组合方式对E2F1蛋白的结合效率更高。

本发明还提供了上述DNA片段在检测细胞内E2F1转录调控活性中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞内E2F1转录调控活性的方法，其包括以下步骤：

S1：将包括上述DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内E2F1转录调控活性。可将报告基因的表达强度作为指示E2F1转录调控活性的指标。

优选地，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所述荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。将E2F1转录调控活性表示为荧光素酶I激发产生的荧光强度与荧光素酶II激发产生的荧光强度的比值。

优选地，所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的KpnI与HindIII位点之间得到。

优选地，所述对照质粒为phRL-TK。

优选地，S1具体包括：

S11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

S12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

优选地，S2具体包括：

S21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

S22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性；

S23：将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到值作为衡量E2F1转录调控活性的指标。

通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内E2F1的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析E2F1作为转录因子在一些发育生物学和病理学发展中所起的作用。

附图说明

图1为KpnI与HindIII对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片；

图2为转染有pGL3.0-E2F1-Luc后再分别转染pcDNA3.1(+)(即空载体)和pcDNA3.1(+)-E2F1的人结肠癌细胞系SW480、人宫颈癌细胞系HeLa、人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中的相对E2F1活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.构建E2F1蛋白可结合的DNA片段

发明人对E2F1进行研究分析，发现E2F1蛋白结合的DNA序列为5’-TTTSSCGS-3’(S表示C或G)。合成该DNA核心序列时，将这段DNA核心序列重复四次，以2-4个A和/或T进行间隔，其序列如SEQIDNO:1所示，并连接至携带萤火虫荧光素酶的表达载体(pGL3.0-Basic)中。

为保证载体构建的成功，在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端，本例在5’端加入KpnI酶切位点的粘性末端(CATGG)，在3’端加入HindIII酶切位点的粘性末端(TTCGA)，序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。

通过从头合成的方法，分别合成该片段的两条寡核苷酸链，其序列分别如SEQIDNO:2和3所示，这两条寡核苷酸链皆由武汉擎科生物技术有限公司合成。两条寡核苷酸链互补配对后形成包含KpnI酶切位点粘性末端和HindIII酶切位点粘性末端的双链DNA片段。100μl退火体系如下：AnnealingBufferforDNAOligos(5X)20μl、寡核苷酸链(50μM)各20μl，余下为ddH₂O。

充分混匀后，设置PCR仪程序进行退火反应，具体程序为：95℃退火2分钟(目的是让DNAoligo充分变性)；每8秒下降0.1℃，或每90秒下降1℃，降至25℃后结束反应。DNA退火产物用快速胶回收试剂盒进行纯化(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)然后置冰上备用。

2.将E2F1蛋白可结合的DNA片段插入荧光素酶表达载体

用内切酶KpnI和HindIII(购自TAKARA公司，KpnI货号为1618，HindIII货号为1615)对上述pGL3.0-Basic空载体进行双酶切，20μl酶切体系如下：10xQuickCutGreenbuffer2μl，KpnI1μl，HindIII1μl，pGL3.0-Basic空载体1μg，余下为ddH₂O。

充分混匀后，37℃酶切反应90分钟，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况，然后切胶回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，回收结束后测样品浓度，置冰上备用。

将退火得到的双链DNA连接至pGL3.0-Basic荧光素酶表达载体上。10μl连接体系如下：DNA连接酶(购自TAKARA公司，货号为6022)5μl，双链DNA片段与经双酶切的pGL3-Basic载体共5μl。为促进酶连成功率，将DNA片段与载体的摩尔比控制在10:1左右。充分混匀后，将酶连体系置于PCR仪中，16℃反应1小时，连接反应结束后得到重组质粒，置于冰上备用。

将重组质粒(含有E2F1蛋白结合的DNA片段的pGL3.0-Basic表达载体)转化至大肠杆菌。按照经典的热激法进行转化，具体方法如下：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α置于冰上解冻2分钟，加入上述连接好的重组质粒，轻轻混匀，冰上孵育20分钟，42℃热激60秒，迅速放至冰上静置2分钟，然后加入450μl不含抗生素的LB液体培养基，放置于恒温摇床中复苏1小时(37℃，200rpm)。取复苏后的菌液100μl均匀涂布于直径为3.5厘米含氨苄青霉素抗性的LB固体选择培养基中，吸收10分钟后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中过夜。，次日挑取单菌落至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，经37℃200转/分钟，摇菌繁殖12小时后提取质粒，1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。

用内切酶KpnI和HindIII(购自TAKARA公司，KpnI货号为1618，HindIII货号为1615)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道1为marker，泳道2、3和5显示为阳性克隆)。阳性质粒送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认DNA片段已整合至pGL3.0-Basic载体上。至此，含有E2F1蛋白结合的DNA片段的pGL3.0-Basic表达载体(以下均表示为pGL3.0-E2F1-Luc)构建成功。

3.pGL3.0-E2F1-Luc转染细胞

本发明实施例采用人结肠癌细胞系SW480、人宫颈癌细胞系HeLa、人乳腺癌细胞系MCF-7进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞均匀种植在24孔板内，每孔约10万个细胞，用10％胎牛血清，高糖DMEM培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后，将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80％为宜)。使用的转染试剂为Neofect(购自零客创智生物科技有限公司，货号为TF20121201)。50μl转染体系如下：质粒0.5μg，Neofect转染试剂0.5μl，余下为无血清培养基。

本实验中使用的质粒分别为：pGL3.0-Basic空报告基因质粒、pGL3.0-E2F1-Luc(含有E2F1蛋白的核心DNA结合位点序列的pGL3.0-Basic报告基因质粒)、phRL-TK(带有海肾荧光素酶基因的质粒)、pc DNA3.1(+)-E2F1(E2F1过表达质粒)。

4.计算E2F1的活性

以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化，计算E2F1活性。具体实验方法如下：转染后的细胞继续培养24-36小时，再弃培养基上清，用1xPBS清洗细胞3次，每次5分钟，清洗细胞时注意操作轻柔，避免正面吹打细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司，货号为GN201-01)进行检测。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否具有活性并且是否可以特异性检测E2F1活性，将pGL3.0-E2F1-Luc重组质粒转染至细胞中，然后将pcDNA3.1(+)-E2F1(E2F1过表达质粒)和空载体导入细胞中，检测E2F1报告基因系统的活性，测定结果如图2所示，外源导入E2F1后，阳性处理组荧光活性明显高于对照组。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种E2F1蛋白可结合DNA片段及在E2F1活性检测中的应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttggcgcat atttcgcgct attttcccgc atatttgccg c 41

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctttggcgca tatttcgcgc tattttcccg catatttgcc gca 43

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcttgcggc aaatatgcgg gaaaatagcg cgaaatatgc gccaaaggta c 51

Claims (8)

1.一种E2F1蛋白可结合的DNA片段，其特征在于，包含多个E2F1蛋白结合框，每个所述E2F1蛋白结合框的序列为5’-TTTSSCGS-3’，其中S表示C或G，每两个相邻的E2F1蛋白结合框之间具有间隔序列，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的DNA片段在检测细胞内E2F1转录调控活性中的应用。

3.一种用于检测细胞内E2F1转录调控活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将包含权利要求1所述的DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内E2F1转录调控活性。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所述荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与Hind I I I位点之间得到。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对照质粒为phRL-TK。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，S1具体包括：

S11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

S12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S2具体包括：

S21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

S22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶I I的活性；

S23：将荧光素酶I I活性归一化荧光素酶I活性得到的值作为衡量E2F1转录调控活性的指标。