KR20130065631A

KR20130065631A - 신규한 ７β-히드록시스테로이드 데히드로게나제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20130065631A
Application number: KR1020127016981A
Authority: KR
Inventors: 뤄 류; 롤프 슈미트; 아르노 아이그너
Original assignee: 파마젤 게엠베하
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2013-06-19
Also published as: WO2011064404A1; CN105936897A; JP6305451B2; EP2507367A1; NZ600189A; AU2010323042A9; AU2010323042B2; CN102791876A; US20160194615A1; US10465171B2; JP2013511973A; KR101986195B1; AU2010323042A1; EP2507367B1; JP2016127860A; US20130040341A1; US20180273916A1; CN102791876B

Abstract

본 발명은 콜린셀라 (Collinsella) 속의 박테리아, 특히 균주 콜린셀라 아에로파시엔스 (Collinsella aerofaciens)로부터 수득가능한 신규한 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나제, 상기 효소를 코딩하는 서열, 상기 효소의 생산 방법, 및 콜산 화합물의 효소적 전환에서, 특히 우르소데옥시콜산 (UDCS)의 생산에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 UDCS의 신규한 합성 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 ７β-히드록시스테로이드 데히드로게나제 및 그의 용도{NOVEL 7β-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASES AND THEIR USE}

본 발명은 콜린셀라 (Collinsella) 속, 특히 균주 콜린셀라 아에로파시엔스 (Collinsella aerofaciens)의 박테리아로부터 얻을 수 있는 신규한 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나제, 상기 효소를 코딩하는 서열, 효소의 생산 방법 및 콜산 화합물의 효소적 전환에서, 특히 우르소데스옥시콜산 (UDCA)의 생산에서의 그의 용도에 관한 것이고; 또한 본 발명의 대상은 UDCA의 신규한 합성 방법이다.

활성 물질 우르소데스옥시콜산 (UDCA) 및 상응하는 부분입체이성질체 체노데스옥시콜산 (CDCA)은 수년 동안 담석 문제의 의학적 치료를 위해 사용되어 왔다. 상기 두 화합물은 C 원자 7 상의 히드록시기의 입체형태에서만 상이하다 (UDCA: β 입체형태, CDCA: α 입체형태). UDCA의 생산을 위해, 다양한 방법이 현재 기술 수준에서 설명되어 있고, 순수하게 화학적으로 수행되거나 화학적 및 효소적 공정 단계의 조합으로 이루어진다. 각각의 경우에, 출발점은 콜산 (CA) 또는 콜산으로부터 생산된 CDCA이다.

따라서, UDCA 생산을 위한 전통적인 화학적 방법은 다음과 같이 도식적으로 제시될 수 있다:

특히 심각한 단점은 다음과 같다: 화학적 산화는 선택적이지 않으므로, 카르복시기 및 3α 및 7α-히드록시기는 에스테르화에 의해 보호되어야 한다.

효소 12α-히드록시스테로이드 데히드로게나제 (12α-HSDH)의 사용을 기초로 한 별법적인 화학적/효소적 방법은 다음과 같이 제시될 수 있고, 예를 들어 본 출원인의 PCT/EP2009/002190에 기재되어 있다.

여기서, 12α-HSDH는 CA를 12-케토-CDCA로 선택적으로 산화한다. 따라서, 전통적인 화학적 방법에 따라 필요한 2가지의 보호 단계는 불필요하게 된다.

또한, 문헌 [Monti, D., et al., (One-Pot Multienzymatic Synthesis of 12-Ketoursodeoxycholic Acid: Subtle Cofactor Specificities Rule the Reaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009)]에는 다음과 같이 도식적으로 제시될 수 있는 다른 효소적-화학적 방법이 기재되어 있다:

CA는 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis) ATCC 25285로부터의 7α-HSDH (Zhu, D., et al., Enzymatic enantioselective reduction of -ketoesters by a thermostable 7-hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis. Tetrahedron, 2006. 62(18): p. 4535-4539) 및 12α-HSDH에 의해 7,12-디케토-LCA로 먼저 산화된다. 상기 2개의 효소는 각각 NADH-의존성이다. 클로스트리디움 압소눔 (Clostridium absonum) ATCC 27555 (DSM 599)으로부터의 7β-HSDH (NADPH-의존성) (MacDonald, I.A. and P.D. Roach, Bile induction of 7 alpha- and 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase in Clostridium absonum. Biochim Biophys Acta, 1981. 665(2): p. 262-9)에 의한 환원 후에, 12-케토-UDCA가 형성된다. 최종 생성물은 볼프-키쉬너 (Wolff-Kishner) 환원에 의해 얻는다. 상기 방법의 단점은 촉매된 반응의 평형 위치 때문에 완전한 전환이 불가능하고, 제1 전환 단계를 위해 2개의 상이한 효소가 사용되어야 하고, 이는 공정 비용을 증가시킨다는 점이다. 보조인자 재생, 락테이트 데히드로게나제 (LDH; NAD⁺의 재생을 위해) 및 글루코스 데히드로게나제 (GlcDH; NADPH의 재생을 위해)가 사용된다. 이때 사용되는 보조인자 재생의 단점은 형성되는 공동생성물이 반응 혼합물로부터 매우 어렵게 제거될 수 있기 때문에 반응 평형이 유리한 영향을 받을 수 없고, 따라서 추출물의 불완전한 전환을 야기한다는 점이다.

균주 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986 (DSM 3979; 이전의 유박테리움 아에로파시엔스 (Eubacterium aerofaciens))로부터의 7β-HSDH는 1982년에 문헌 [Hirano, S. and N. Masuda, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. Appl Environ Microbiol, 1982. 43(5): p. 1057-63)]에서 기재되었다. 상기 효소에 대한 서열 정보는 개시되지 않았다. 겔 여과에 의해 결정된 분자량은 45,000 Da이었다 (상기 문헌 [Hirano], 1059 페이지, 좌측 칼럼 참조). 또한, 효소에 대해, 7-옥소기의 7β-히드록시기로의 환원은 관찰될 수 없었다 (상기 문헌 [Hirano], 1061 페이지, 제1 문단 논의 참조). 이와 유사하게, 히라노 (Hirano) 등은 또한 NADP⁺에 대한 K_M 및 V_max 값 (각각 0.4 및 0.2)만을 개시하였고, NADPH에 대해서는 개시하지 않았다. 따라서, 당업자는 히라노 등에 의해 기재된 효소가 7 위치에서 DHCA의 3,12-디케토-7β-CA로의 환원의 촉매에 적합하지 않음을 인지할 수 있다.

콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986의 게놈의 서열이 이미 2007년에 결정되었지만, 분석된 서열 모티프의 어느 것도, HSDH 효소가 속하는 잠재적인 단쇄 데히드로게나제 효소 패밀리에 배정될 수 없었다.

문헌 [Biotechnology Letters 1992, 14,12, 1131-1135]에서, 캐리어 (Carrea) 등은 농축된 7β-HSDH 및 3α-HSDH를 사용하여 CA로부터 UDCA를 생산하는 방법을 기재하였다. 그러나, 상기 방법의 단점은 병원성 미생물인 클로스트리디움 압소눔으로부터의 7β-HSDH의 사용, 및 요구되지 않는 7α-HSDH 활성을 추가로 갖는 박테리아 추출물로부터 효소를 미리 정제할 필요성이 있다는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기한 단점이 없는 신규한 UDCA 생산 방법을 제공하는 것이다. 특히, 7-위치에서 DHCA의 3,12-디케토-7β-CA로의 입체특이적 환원을 촉매하는 신규한 효소가 제공되어야 한다.

추가의 목적은 예를 들어 UDCA의 제조에 이용가능하고 특히 7-위치에서 콜산 유도체의 입체선택적 및 거울상이성질체 선택적 산화/환원을 촉매하는 신규한 7β-HSDH 효소의 제공에 있다.

발명의 개요

놀랍게도, 이들 문제는 콜린셀라 속, 특히 균주 콜린셀라 아에로파시엔스의 호기성 박테리아로부터의 신규한 부위특이적 (regiospecific) 및 입체특이적 7β-HSDH의 단리 및 특성화, 및 콜산 화합물의 전환에서, 특히 UDCA의 생산에서의 그의 사용을 통해 해결될 수 있었다.

본 발명에 따르면, 다음과 같이 도식적으로 제시될 수 있는 신규한 UDCA 생산 방법이 특히 제공된다:

여기서, CA의 산화는 간단히 전통적인 화학적 방법으로 실시된다. DHCA는 개별적으로 하나씩 또는 단일 용기 내에서 7β-HSDH 및 3α-HSDH에 의해 12-케토-UDCA로 환원된다. 따라서, 볼프-키쉬너 환원과 함께, UDCA는 단지 3개의 단계로 CA로부터 합성될 수 있다.

여기서 이점은 특히 효소적 반응이 높은 전환율을 가능하게 하고, 높은 선택성을 나타내고, 부산물을 형성하지 않는다는 점이다. 놀랍게도, 재조합 방식으로 생산된 효소 7β-HSDH 및 3α-HSDH를 사용하여 유리하게 UDCA를 대규모로 생산할 수 있다.

도 1a는 콜린셀라 아에로파시엔스로부터의 7β-HSDH의 아미노산 서열을 보여주고, 도 1b는 도 1a의 아미노산 서열에 대한 코딩 핵산 서열을 보여주고; 도 1c는 코마노모나스 테스토스테로니 (Comanomonas testosteroni)로부터의 3α-HSDH의 아미노산 서열을 보여주고, 도 1d는 도 1c의 아미노산 서열에 대한 코딩 핵산 서열을 보여주고; 도 1e는 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus)로부터의 3α-HSDH의 아미노산 서열을 보여주고, 도 1f는 도 1e의 아미노산 서열에 대한 코딩 핵산 서열을 보여준다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 정제된 7β-HSDH의 SDS 겔을 보여준다 (즉, 트랙 1: 조 세포 추출물, 트랙 2: 정제된 단백질, 및 트랙 M: 페이지 로울러 (Page Rouler)™, 분자량 마커 (페르멘타스 (Fermentas), 독일).
도 3은 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 7β-HSDH 및 선택된 HSDH 단백질의 서열 정렬을 보여준다. 서열 내의 보존된 잔기는 색깔로 눈에 뜨게 표시하였다. 다음 서열 기탁 번호가 적용된다: 호모 사피엔스 (Homo sapiens)로부터의 11β-HSDH, 진뱅크(GenBank) NP_005516; 무스 무스쿨루스 (Mus musculus)로부터의 11β-HSDH, 진뱅크 NP_001038216; 카비아 포르셀루스 (Cavia porcellus)로부터의 11β-HSDH, 진뱅크 AAS47491; 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis)로부터의 7α-HSDH, 진뱅크 NP_698608; 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)로부터의 7α-HSDH, 진뱅크 NP_288055; 클로스트리디움 소르델리이 (Clostridium sordellii)로부터의 7α-HSDH, 진뱅크 P50200; 스트렙토미세스 엑스폴리아테스 (Streptomyces exfoliates)로부터의 3α/20β-HSDH, 스위스-포트(Swiss-Port) P19992; 코마모나스 테스토스테로니로부터의 3β/17β-HSDH, 진뱅크 AAA25742; 슈도모나스 (Pseudomonas) 종으로부터의 3α-HSDH, 진뱅크 BAA08861; 코마모나스 테스토스테로니로부터의 3α-HSDH, 진뱅크 YP_003277364; 호모 사피엔스로부터의 17β-HSDH, 진뱅크 NP_000404 및 수스 스크로파 (Sus scrofa)로부터의 20β-HSDH, 진뱅크 NP_999238. 호모 사피엔스로부터의 17β-HSDH의 마지막 17개의 아미노산 및 수스 스크로파로부터의 20β-HSDH의 마지막 아미노산은 정렬에 제시되지 않는데, 그 이유는 추가의 정렬 정보가 그로부터 유도될 수 없었기 때문이다.
도 4는 HSDH 단백질 서열의 정렬을 기초로 한 계통수를 보여주고, 선택된 HSDH 단백질 사이의 관련성을 예시한다.
도 5는 본 발명에 따른 7β-HSDH의 활성에 대한 pH의 영향을 도시한 것이다. 다음 시험 조건을 이용하였다: 23℃의 50 mM 인산칼륨 내의 pH 4 내지 7, 50 mM 트리스(Tris)-HCl 내의 pH 7 내지 9 및 50 mM 글리신-NaOH 내의 pH 9 내지 11. 50 mM 글리신-NaOH 내의 pH 9 내지 11에서 DHCA 및 7-케토-LCA에 대한 활성 값이 중복된다.

본 발명의 구체적인 실시양태

1. 혐기성 박테리아, 특히 콜린셀라 속, 예컨대 균주 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979 (ATCC 25986)로부터 얻을 수 있는 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나제 (7β-HSDH) 및 그로부터 유도된 기능적 등가물.

콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터 본 발명에 따라 수득가능한 7β-HSDH는 특히 다음 특성 중의 적어도 하나 또는 그 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 또는 그러한 특성 전부에 의해 특성화된다:

a) 분자량 (SDS 겔 전기영동): 약 28-32 kDa, 특히 약 29 내지 31 kDa 또는 약 30 kDa;

b) 분자량 (특히 SDS 비함유와 같은 비-변성 조건 하의 겔 여과): 약 53 내지 60 kDa, 특히 약 55 내지 57 kDa, 예컨대 56.1 kDa - 이에 의해 본 발명에 따른 효소는 히라노 등에 의해 설명된 씨. 아에로파시엔스 (C. aerofaciens) ATCC25986으로부터의 45 kDa의 7β-HSDH 효소와 현저하게 상이하다 (상기 문헌 참조). 이것은 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 7β-HSDH의 이량체 성질 (콰르텟 (quartet) 구조)을 확증해 준다;

c) 7-케토-LCA의 7-카르보닐기의 7β-히드록시기로의 입체선택적 환원;

d) UDCA의 산화를 위한 최적 pH: pH 8.5 내지 10.5, 특히 9 내지 10 범위;

e) DHCA 및 7-케토-LCA의 환원을 위한 최적 pH: pH 3.5 내지 6.5, 특히 pH 4 내지 6 범위 - 이에 의해 놀랍게도 pH의 선택에 의해 산화 (특징 d)의) 및 환원 공정에 영향을 줄 가능성이 존재한다;

f) 적어도 하나의 본원에서 언급되는 물질/보조인자에 대한 다음 표의 적어도 하나의 동역학적 파라미터; 다음 표에서 구체적으로 언급되는 각각의 값의 ±20%, 특히 ±10%, ±5%, ±3% ±2% 또는 ±1%의 범위.

g) 카비아 포르셀루스, 호모 사피엔스 및 무스 무스쿨루스를 포함하는 동물 11β-HSDH 하위군과 동류인 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 원핵 7β-HSDH의 계통발생학적 서열 관련성.

예를 들어, 본 발명에 따른 7β-HSDH는 다음 특성 또는 특성의 조합을 보인다; a); b); a) 및 b); a) 및/또는 b) 및 c); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e) 및 f).

2. 실시양태 1에 있어서, 히라노 등 (상기 문헌 참조)에 의해 설명된 씨. 아에로파시엔스 ATCC25986으로부터의 7β-HSDH 효소와 달리 다음을 촉매하는 7β-HSDH 또는 그로부터 유도된 기능적 등가물:

a) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-히드록시스테로이드로의 입체특이적 환원 (수소화), 및/또는

b) 7-위치에 케토기 및 스테로이드 골격 상에 적어도 하나의 추가의 케토기를 함유하는 케토스테로이드의 상응하는 7β-히드록시스테로이드로의, 예컨대 특히 7-위치의 데히드로콜산 (DHCA)의 상응하는 3,12-디케토-7β-콜란산으로의 부위특이적 수소화 (환원) (이는 예를 들어 NADPH-의존성이다).

3. 서열 2에 따른 아미노산 서열 (기탁 번호: ZP_01773061) 또는 상기 서열에 대한 동일성 정도가 적어도 60%, 예를 들어 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90, 예를 들어 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5%인 그로부터 유도된 서열을 갖고; 임의로 다음 특성 중의 하나 또는 특성의 조합에 의해 추가로 특성화되는 7β-HSDH: 상기 정의에 따른 a); b); a) 및 b); a) 및/또는 b) 및 c); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e) 및 f).

4. 이전의 실시양태 중의 하나에서 언급된 정의에 따른 7β-HSDH를 코딩하는, 예를 들어 서열 1 (기탁 번호: NZ_AAVN02000010, 영역: 52005..52796)에 따른 핵산 서열.

5. 적어도 하나의 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에 실시양태 4에서 언급된 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트.

6. 실시양태 5에서 언급된 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 벡터.

7. 실시양태 4에서 언급된 적어도 하나의 핵산 서열 또는 실시양태 5에서 언급된 적어도 하나의 발현 카세트를 보유하거거나 또는 실시양태 6에서 언급된 적어도 하나의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.

8. 실시양태 7에서 언급된 미생물을 배양하고 발현된 7β-HSDH를 배양액으로부터 단리하는, 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에서 언급된 7β-HSDH의 생산 방법.

9. 상응하는 7-케토스테로이드를 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에서의 정의에 따른 7β-HSDH의 존재 하에 전환시키고, 형성된 적어도 하나의 환원 생성물을 반응계로부터 임의로 단리시키는, 7β-히드록시스테로이드의 효소적 합성 방법.

10. 실시양태 9에 있어서, 환원되는 케토스테로이드가 데히드로콜산 (DHCA), 7-케토-리토콜산 (7-케토-LCA), 7,12-디케토-리토콜산 (7,12-디케토-LCA) 및 그의 유도체, 예컨대 특히 산의 염, 아미드 또는 알킬 에스테르로부터 선택되는 것인 방법.

11. 실시양태 10에 있어서, DHCA 또는 그의 유도체가 3,12-디케토-7β-콜란산 또는 상응하는 유도체로 전환되거나; 또는 7-케토-LCA 또는 그의 유도체가 우르소데옥시콜산 (UDCA) 또는 상응하는 유도체로 전환되거나; 또는 7,12-디케토-LCA 또는 그의 유도체가 12-케토-우르소데옥시콜산 (12-케토-UDCA)으로 전환되는 것인 방법.

12. 실시양태 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 환원이 NAD(P)H의 존재 하에 (및 이를 소비하면서) 일어나는 것인 방법.

13. 히드록시스테로이드를 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에서의 정의에 따른 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나제의 존재 하에 반응시키고, 형성된 산화 생성물을 임의로 반응계로부터 단리시키는, 7β-히드록시스테로이드의 효소적 산화 방법.

14. 실시양태 13에 있어서, 7β-히드록시스테로이드가 3,12-디케토-7β CA 또는 그의 유도체, 예컨대 특히 염, 아미드 또는 알킬 에스테르인 방법.

15. 실시양태 13 또는 14에 있어서, 산화가 NAD(P)⁺의 존재 하에 (및 이를 소비하면서) 일어나는 것인 방법.

16. 실시양태 12 또는 15에 있어서, 소비된 산화환원 등가물이 특히 계내에서 전기화학적으로 또는 효소적으로 재생되는 것인 방법.

17. 실시양태 16에 있어서, 소비된 NAD(P)H가 특히 계내에서 NAD(P)H 데히드로게나제 및 특히 알콜 데히드로게나제 (ADH)로부터 선택되는 NAD(P)H-재생 효소와 커플링됨으로써 재생되는 것인 방법.

18. 실시양태 17에 있어서, NAD(P)H-재생 효소가 천연 또는 재조합의, 단리된 또는 농축된 a) 알콜 데히드로게나제 (ADH; EC.1.1.1.2) 및 b) 그로부터 유도된 기능적 등가물 (특히 기능적 도메인)로부터 선택되는 것인 방법.

19. a) 임의로 하기 화학식 2의 콜산 (CA)을 하기 화학식 3의 데히드로콜산 (DHCA)으로 화학적으로 산화하고,

b) 실시양태 1 내지 3 중의 어느 하나에서의 정의에 따른 적어도 하나의 7β-HSDH의 존재 하에 DHCA를 하기 화학식 4의 3,12-디케토-7β-콜란산 (3,12-디케토-7β-CA)으로 NADPH-의존적으로 환원하고,

c) 3,12-디케토-7β-CA를 적어도 하나의 3α-히드록시스테로이드 데히드로게나제 (3α-HSDH)의 존재 하에 NADPH-의존적으로 또는 NADH-의존적으로 (사용된 3α-HSDH의 종류에 따라) 하기 화학식 5의 상응하는 12-케토-우르소데스옥시콜산 (12-케토-UDCA)으로 환원하고, 이어서

d) 화학식 5의 12-케토-UDCA를 UDCA로 화학적으로 환원하고;

e) 반응 생성물을 임의로 추가로 정제하는,

하기 화학식 1의 우르소데스옥시콜산 (UDCA)의 생산 방법.

<화학식 1>

식 중,

R은 알킬, NR¹R², H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R³)₄ ⁺이고, 잔기 R³은 동일하거나 상이하고 H 또는 알킬을 나타낸다.

<화학식 2>

식 중, R은 상기한 의미를 갖는다.

<화학식 3>

식 중, R은 상기한 의미 및 다음에 규정되는 의미를 갖는다.

<화학식 4>

<화학식 5>

식 중, R은 상기한 의미를 갖는다.

20. 실시양태 19에 있어서, 단계 b) 및/또는 c)가 환원 등가물 (NADPH 및/또는 NADH)의 존재 하에 수행되는 것인 방법.

21. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 단계 b) 및/또는 c)가 (특히 효소적) 보조인자 재생 단계와 커플링되는 것인 방법.

22. 실시양태 21에 있어서, 단계 b)가, 사용되는 알콜의 소비 (특히 이소프로판올 및 아세톤의 형성)를 동반하면서 알콜 데히드로게나제 (ADH)에 의해 NADPH를 재생시키고 임의로 반응 평형으로부터 아세톤의 제거를 촉진시키는 (예를 들어, 승온함으로써), 특히 계내에서의 보조인자 재생 단계와 커플링되는 것인 방법.

23. 실시양태 21 또는 22에 있어서, 단계 c)가, 사용되는 3α-HSDH의 종류에 따라 포르메이트의 소비 (및 기상 CO₂의 형성)를 동반하면서 포르메이트 데히드로게나제 (FDH)에 의해 NADH를 재생시키거나; 또는 사용되는 알콜의 소비 (특히 이소프로판올 및 아세톤의 형성)를 동반하면서 알콜 데히드로게나제 (ADH)에 의해 NADPH를 재생시키고 임의로 반응 평형으로부터 아세톤의 제거를 촉진시키는 (예를 들어, 승온함으로써), 특히 계내에서의 보조인자 재생 단계와 커플링되는 것인 방법.

24. 실시양태 8 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 반응이 고정된 형태로 수반되는 적어도 하나의 효소를 사용하여 수행되는 것인 방법.

25. 실시양태 1 내지 3 중의 어느 하나에서 언급된 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나제를 고정된 형태로 함유하는 생물반응기.

본 발명의 추가의 실시양태

1. 일반적인 정의 및 사용되는 약어

다음 표에서, 구조식, 그의 화학물질 명칭 및 사용되는 약어를 표 형태로 요약한다:

달리 언급되지 않으면, 용어 "7β-HSDH"는 특히 NADPH를 화학양론적으로 소비하면서 적어도 DHCA의 3,12-디케토-7β CA로의 입체특이적 및/또는 부위특이적 환원, 및 임의로 상응하는 역반응을 촉매하는 데히드로게나제 효소를 의미한다. 여기서, 효소는 천연 또는 재조합 방식으로 생산된 효소일 수 있다. 효소는 원칙적으로 세포성, 예를 들어 단백질 불순물과 혼합되어 존재할 수 있지만, 바람직하게는 순수한 형태로 존재할 수 있다. 적합한 검출 방법은 예를 들어 하기 실험부에 기재되어 있거나 또는 문헌으로부터 알 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Characterization of NADP-Dependent 7β-hydroxysteroid dehydrogenase from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982]; 그러나, 이 문헌에서는 7-케토기의 환원을 촉매하는 유박테리움 아에로파시엔스로부터의 7β-HSDH는 검출할 수 없었다). 상기 활성을 갖는 효소는 EC 번호 1.1.1.201 하에 분류된다.

달리 언급되지 않으면, 용어 "3α-HSDH"는 특히 NADH 및/또는 NADPH를 화학양론적으로 소비하면서 적어도 3,12-디케토-7β CA의 12-케토-UDCA로의 입체특이적 및/또는 부위특이적 환원을 촉매하고, 임의로 상응하는 역반응을 촉매하는 데히드로게나제 효소를 의미한다. 적합한 검출 방법은 예를 들어 하기 실험부에 기재되어 있거나 또는 문헌으로부터 알 수 있다. 적합한 효소는 예를 들어 코마노모나스 테스토스테로니 (예를 들어, ATCC11996)로부터 얻을 수 있다. NADPH-의존성 3α-HSDH는 예를 들어 설치류로부터 알려져 있고, 또한 이용가능하다 (Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3 alpha-hydroxysteroid/dihydrodiol dehydrogenase, J E Pawlowski, M Huizinga and T M Penning, May 15, 1991 The Journal of Biological Chemistry, 266, 8820-8825). 상기 활성을 갖는 효소는 EC 번호 1.1.1.50 하에 분류된다.

본 발명에 따르면, "순수한 형태" 또는 "순수한" 또는 "본질적으로 순수한" 효소는 정상 단백질 추정 방법, 예를 들어 뷰렛 (biuret) 방법 또는 로우리 (Lowry) 등의 단백질 추정 (문헌 [R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982)]의 기재 참조)에 의해 결정될 때 총 단백질 함량을 기초로 하여 80 중량% 초과, 바람직하게는 90 중량% 초과, 특히 95 중량% 초과, 및 특히 99 중량% 초과의 순도를 갖는 효소를 의미하는 것으로 이해된다.

"산화환원 등가물"은 전자 공여자 또는 전자 수용자로서 사용될 수 있는 소분자 유기 화합물, 예컨대 니코틴아미드 유도체, 예컨대 NAD⁺ 및 NADH⁺ 또는 그 각각의 환원된 형태 NADH 및 NADPH를 의미하는 것으로 이해된다. NAD(P)⁺는 본원에서 NAD⁺ 및/또는 NADP⁺이고, NAD(P)H는 NADH 및/또는 NADPH를 나타낸다.

본 발명에 따르면, "콜산 화합물"은 콜산의 기본적인 탄소 골격, 특히 스테로이드 구조를 갖고 고리 위치 7 및 임의로 고리 위치 3 및/또는 12에 케토 및/또는 히드록시 또는 아실옥시기가 존재하는 화합물을 의미하는 것으로 이해된다.

특정 종류의 화합물, 예를 들어 "콜산 화합물" 또는 "우르소데스옥시콜산 화합물"은 특히 또한 근본적인 출발 화합물 (예를 들어 콜산 또는 우르소데스옥시콜산)의 유도체를 의미하는 것으로 이해된다.

그러한 유도체는 화합물의 "염", 예를 들어 알칼리 금속 염, 예컨대 리튬, 나트륨 및 칼륨 염; 및 암모늄 염을 포함하고, 여기서 암모늄 염은 NH₄ ⁺ 염 및 적어도 하나의 수소 원자가 C₁-C₆ 알킬 잔기로 교체될 수 있는 암모늄 염을 포함하는 것으로 이해된다. 전형적인 알킬 잔기는 특히 C₁-C₄ 알킬 잔기, 예컨대 메틸, 에틸, n- 또는 i-프로필-, n-, sec- 또는 tert-부틸, 및 n-펜틸 및 n-헥실 및 그의 단일 또는 다중 분지 유사체이다.

본 발명에 따른 "알킬 에스테르" 화합물은 특히 저급 알킬 에스테르, 예를 들어 C₁-C₆ 알킬 에스테르이다. 비-제한적인 예로서, 메틸-, 에틸-, n- 또는 i-프로필-, n-, sec- 또는 tert-부틸 에스테르, 또는 보다 긴 사슬 에스테르, 예를 들어 n-펜틸- 및 n-헥실 에스테르 및 그의 단일 또는 다중 분지 유사체를 언급할 수 있다.

"아미드"는 특히 암모니아 또는 1급 또는 2급 모노아민을 사용한, 본 발명에 따른 산의 전환 생성물이다. 상기 아민은 예를 들어 모노- 또는 디-C₁-C₆ 알킬 모노아민이고, 여기서 알킬 잔기는 상호 독립적으로, 예를 들어 카르복시, 히드록시, 할로겐 (예컨대 F, Cl, Br 또는 I), 니트로 및 술포네이트기에 의해 임의로 추가로 치환될 수 있다.

본 발명에 따른 "아실기"는 특히 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 비-방향족 기, 예를 들어 아세틸, 프로피오닐 및 부티릴, 및 임의로 치환된 단핵 방향족 고리를 갖는 방향족 기이고, 여기서 적합한 치환기는 예를 들어 히드록시, 할로겐 (예컨대, F, Cl, Br 또는 I), 니트로- 및 C₁-C₆ 알킬기, 예를 들어 벤조일 또는 톨루오일로부터 선택된다.

본 발명에 따라 사용되거나 생산된 히드록시스테로이드 화합물, 예를 들어 콜산, 우르소데스옥시콜산, 12-케토-체노데스옥시콜산, 체노데스옥시콜산 및 7-케토-리토콜산은 본 발명에 따른 방법에서 입체이성질체상 순수한 형태로 사용될 수 있거나 또는 다른 입체이성질체와 혼합되거나 또는 그로부터 얻을 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 사용되거나 제조되는 화합물은 본질적으로 입체이성질체상 순수한 형태로 사용되거나 단리된다.

본 발명에 따르면, "고정화"는 고체, 즉 주위 액체 매질에 본질적으로 불용성인, 지지체 물질에 대한 본 발명에 따라 사용되는 생체 촉매, 예를 들어 7β-HSDH의 공유 또는 비-공유 결합을 의미하는 것으로 이해된다.

2. 단백질

본 발명은 7β-HSDH 활성 또는 3α-HSDH 활성을 갖는 구체적으로 개시된 단백질 또는 효소로 제한되지 않고, 이들의 기능적 등가물로 또한 확장된다.

본 발명의 맥락에서, 구체적으로 개시된 효소의 "기능적 등가물" 또는 유사체는 요구되는 생물학적 활성, 예를 들어 7β-HSDH 활성을 또한 갖는 그와 상이한 폴리펩티드이다.

따라서, 예를 들어 "기능적 등가물"은 사용된 7β-HSDH 활성에 대한 시험에서 본원에서 정의된 아미노산 서열을 포함하는 효소의 활성보다 적어도 1%, 예를 들어 적어도 10% 또는 20%, 예를 들어 적어도 50% 또는 75% 또는 90% 더 높거나 더 낮은 활성을 나타내는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 이와 별도로, 기능적 등가물은 바람직하게는 pH 4 내지 11에서 안정하고, 유리하게는 pH 4 내지 6 또는 pH 6 내지 10, 예를 들어 8.5 내지 9.5의 최적 pH, 및 15℃ 내지 80℃ 또는 15℃ 내지 40℃, 20℃ 내지 30℃ 또는 20℃ 내지 70℃, 예를 들어 약 45 내지 60℃ 또는 약 50 내지 55℃의 최적 온도를 갖는다.

7β-HSDH 활성은 다양한 공지의 시험에 의해 검출될 수 있다. 그로 제한되지 않으면서, 실험부에서 정의되는 표준 조건 하에서 참고 물질, 예를 들어 CA 또는 DHCA를 사용한 시험을 언급할 수 있다.

본 발명에 따르면, "기능적 등가물"은 또한 상기한 아미노산 서열의 적어도 하나의 서열 위치가 구체적으로 언급된 것 이외의 다른 아미노산을 갖지만 그럼에도 불구하고 상기한 생물학적 활성 중의 하나를 갖는 "돌연변이체"를 특히 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, "기능적 등가물"은 하나 또는 그 초과, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 역위에 의해 얻을 수 있는 돌연변이체를 포함하고, 여기서 상기 변화는 본 발명에 따른 특성 프로파일을 갖는 돌연변이체를 생성하는 한 임의의 서열 위치에서 발생할 수 있다. 특히, 돌연변이체와 비변화된 폴리펩티드 사이의 반응성 패턴이 정성적으로 일치할 때, 즉 예를 들어 동일한 기질이 상이한 속도로 전환될 때 기능적 동등성이 또한 존재한다. 적합한 아미노산 치환의 예를 다음 표에 요약한다:

기재된 폴리펩티드의 "전구체" 및 폴리펩티드의 "기능적 유도체" 및 "염"도 또한 상기 의미에서 "기능적 등가물"이다.

여기서, "전구체"는 요구되는 생물학적 활성을 갖거나 갖지 않는 폴리펩티드의 천연 또는 합성 전구체이다.

표현 "염"은 본 발명에 따른 단백질 분자의 카르복실기의 염 및 또한 아미노기의 산 부가 염을 모두 의미하는 것으로 이해된다. 카르복실기의 염은 그 자체가 공지되어 있는 방식으로 생산될 수 있고, 무기 염, 예를 들어 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 및 아연 염 및 유기 염기, 예를 들어 아민, 예컨대 트리에탄올아민, 아르기닌, 리신, 피페리딘 등과의 염을 포함한다. 산 부가 염, 예를 들어 무기 산, 예컨대 염산 또는 황산과의 염 및 유기 산, 예컨대 아세트산 및 옥살산과의 염도 또한 본 발명의 대상이다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 "기능적 유도체"가 공지의 기법에 의해 기능적 아미노산 측기 또는 그의 N- 또는 C-말단 단부 상에 생성될 수 있다. 상기 유도체는 예를 들어 카르복실산기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 1급 또는 2급 아민과의 반응에 의해 얻을 수 있는 카르복실산기의 아미드; 아실기와의 반응에 의해 생산되는 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실기와의 반응에 의해 생산되는 유리 히드록시기의 O-아실 유도체를 포함한다.

또한, "기능적 등가물"은 천연적으로 다른 유기체로부터 입수할 수 있는 폴리펩티드, 및 천연 발생 변이체를 포함한다. 예를 들어, 서열 비교를 통해 상동성 서열 영역의 대역을 확인하고, 본 발명의 구체적인 조건을 기초로 하여 동등한 효소를 결정할 수 있다.

또한, "기능적 등가물"은 예를 들어 요구되는 생물학적 기능을 나타내는, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편, 바람직하게는 개개의 도메인 또는 서열 모티프를 포함한다.

또한, "기능적 등가물"은 상기한 폴리펩티드 서열 중의 하나 또는 그로부터 유도된 기능적 등가물 및 이와 기능적으로 N- 또는 C-말단 연결된 (즉, 융합 단백질 부분의 상호 기능적 손상이 없는) 적어도 하나의 추가의, 그와 기능적으로 상이한 이종성 서열을 갖는 융합 단백질이다. 상기 이종성 서열의 비-제한적인 예는 예를 들어 신호 펩티드, 히스티딘 앵커 (anchor) 또는 효소이다.

본 발명에 따르면, 구체적으로 개시된 단백질에 대한 상동체도 또한 "기능적 등가물"에 포함된다. 이들은 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448]의 알고리즘에 따라 계산시에 구체적으로 개시된 아미노산 서열 중의 하나에 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 특히 적어도 85%, 예를 들어 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 상동성 (또는 동일성)을 갖는다. 본 발명에 따른 상동성 폴리펩티드의 상동성 또는 동일성 백분율은 특히 본원에서 구체적으로 기재되는 아미노산 서열 중의 하나의 전체 길이를 기초로 한 아미노산 잔기의 동일성 백분율을 의미한다.

또한, 동일성 백분율 값은 BLAST 정렬, 알고리즘 blastp (단백질-단백질 BLAST)를 기초로 하여, 또는 아래에서 설명되는 클러스탈 (clustal) 조정을 적용하여 결정될 수 있다.

가능한 단백질 글리코실화의 경우에, 본 발명에 따르면 "기능적 등가물"은 탈글리코실화된 또는 글리코실화된 형태의 상기 나타낸 종류의 단백질 및 글리코실화 패턴의 변경에 의해 얻은 변형된 형태를 포함한다.

본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩티드의 상동체는 돌연변이 유발, 예를 들어 단백질의 점 돌연변이, 신장 또는 말단절단 (truncation)에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 단백질의 상동체는 돌연변이체, 예를 들어 말단절단 돌연변이체의 조합 은행의 스크리닝에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 단백질 변이체의 다양한 종류로 이루어진 은행은 핵산 수준에서 조합 돌연변이 유발에 의해, 예를 들어 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물의 효소적 결찰에 의해 생성될 수 있다. 축퇴성 (degenerated) 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 상동체의 은행을 생성하기 위해 사용될 수 있는 매우 많은 방법이 존재한다. 축퇴성 유전자 서열의 화학적 합성은 DNA 합성기에서 수행할 수 있고, 이어서 합성 유전자는 적합한 발현 벡터 내로 결찰될 수 있다. 축퇴성 유전자 세트를 사용함으로써, 요구되는 세트의 잠재적인 단백질을 코딩하는 혼합물 내의 모든 서열을 제공할 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3]; [Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323]; [Itakura et al., (1984) Science 198:1056]; [Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477]).

현재 기술적 수준에서, 점 돌연변이 또는 말단절단에 의해 생산된 조합 은행의 유전자 산물의 스크리닝을 위한 기법 및 선택된 특성을 갖는 유전자 산물에 대해 cDNA 은행을 스크리닝하기 위한 기법이 몇몇 알려져 있다. 이러한 기법은 본 발명에 따른 상동체의 조합 돌연변이 유발에 의해 생성된 유전자 은행의 신속한 스크리닝을 위해 적합화될 수 있다. 고효율 (high throughput) 분석에 적용되는 큰 유전자 은행의 스크리닝을 위해 가장 흔하게 사용되는 기법은 유전자 은행의 복제가능한 발현 벡터 내로의 클로닝, 생성되는 벡터 은행을 사용한 적합한 세포의 형질전환, 및 요구되는 활성의 검출이, 그의 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 단리를 용이하게 하는 조건 하에서의 조합 유전자의 발현을 포함한다. 상기 은행에서 기능적 돌연변이체의 발생률을 증가시키는 기술인 반복적인 동시 (recursive ensemble) 돌연변이 유발 (REM)이 상동체를 확인하기 위해 스크리닝 시험과 조합되어 사용될 수 있다 ([Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815]; [Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331]).

3. 핵산 및 구축물

3.1 핵산

또한, 본 발명의 대상은 7β-HSDH 또는 3α-HSDH 활성을 갖는 효소를 코딩하는 핵산 서열이다.

또한, 본 발명은 본원에서 기재되는 특이적인 서열에 대해 정의된 정도의 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.

2개의 핵산 사이의 "동일성"은 문제되는 전체 핵산 길이에 걸친 뉴클레오티드의 동일성, 특히 다음 파라미터를 조정하면서 클러스탈 방법을 사용하여 인포맥스 (Informax) (USA)의 벡터 NTI 스위트 (Vector NTI Suite) 7.1 소프트웨어에 의한 비교를 통해 계산된 동일성을 의미하는 것으로 이해된다 (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1):

다중 정렬 파라미터:

갭 개방 페널티 10

갭 연장 페널티 10

갭 분리 페널티 범위 8

갭 분리 페널티 off

정렬 지연에 대한 동일성 % 40

잔기 특이적 갭 off

친수성 잔기 갭 off

전이 가중 (Transition weighing) 0

쌍별 (pairwise) 정렬 파라미터:

FAST 알고리즘 on

K-튜플 (tuple) 크기 1

갭 페널티 3

창 크기 5

최적 대각선의 수 5

이에 대한 대안으로, 동일성은 또한 url: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#에 따라 다음 파라미터를 사용하여 문헌 [Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500]에 따라 결정될 수 있다:

DNA 갭 개방 페널티 15.0

DNA 갭 연장 페널티 6.66

DNA 매트릭스 동일성

단백질 갭 개방 페널티 10.0

단백질 갭 연장 페널티 0.2

단백질 매트릭스 Gonnet

단백질/DNA ENDGAP -1

단백질/DNA GAPDIST 4

본원에서 언급되는 모든 핵산 서열 (단일 및 이중 가닥 DNA 및 RNA 서열, 예를 들어 cDNA 및 mRNA)은 뉴클레오티드 빌딩 블록 (building block)으로부터 화학적 합성에 의해, 예를 들어 이중 나선의 개별적인 중복되는 상보성 핵산 빌딩 블록의 단편 축합에 의해 그 자체로 공지된 방식으로 생산될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 예를 들어 포스포아미다이트 방법에 의해 공지의 방법으로 실시될 수 있다 (Voet, Voet, 2^nd Edition, Wiley Press New York, pages 896-897). DNA 폴리머라제의 클레나우 (Klenow) 단편에 의한 합성 올리고뉴클레오티드의 부착 및 갭 충전 및 결찰 반응 및 일반적인 클로닝 방법은 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 대상은 상기 폴리펩티드 중의 하나를 코딩하는 핵산 서열 (단일 및 이중 가닥 DNA- 및 RNA 서열, 예를 들어 cDNA 및 mRNA) 및 예를 들어 인공 뉴클레오티드 유사체의 사용에 의해 얻을 수 있는 이들의 기능적 등가물이다.

본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 그의 생물학적 활성 절편, 및 또한 예를 들어 본 발명에 따른 코딩 핵산의 확인 또는 증폭을 위해 혼성화 프로브 또는 프라이머로서 유용하게 사용될 수 있는 핵산 단편에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 코딩 유전자 영역의 3' 및/또는 5' 말단부로부터의 비번역 서열을 함유할 수 있다.

본 발명은 구체적으로 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 절편에 상보성인 핵산 분자를 추가로 포함한다.

본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 사용함으로써, 다른 세포 종류 및 유기체에서 상동성 서열의 확인 및/또는 클로닝을 위해 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머를 생성할 수 있다. 그러한 프로브 또는 프라이머는 대체로 "엄격한" 조건 (아래 참조) 하에 본 발명에 따른 핵산 서열의 센스 가닥 또는 상응하는 안티센스 가닥의 적어도 약 12개, 바람직하게는 적어도 약 25개, 예를 들어 약 40, 50 또는 75개의 연속적인 뉴클레오티드에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다.

"단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되고, 또한 재조합 기법에 의해 생산될 경우 핵산 분자에 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 본질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성될 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없을 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기법 및 본 발명에 따라 제공된 서열 정보에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, cDNA는 혼성화 프로브로서 구체적으로 개시된 완전한 서열 중의 하나 또는 그의 절편 및 표준 혼성화 기법 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 것)을 사용하여 적합한 cDNA 은행으로부터 단리될 수 있다. 또한, 개시된 서열 중의 하나 또는 그의 절편을 포함하는 핵산 분자는 상기 서열을 기초로 하여 생성된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산은 적합한 벡터 내로 클로닝되고 DNA 서열 분석에 의해 특성화될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 표준 합성 방법에 의해, 예를 들어 자동 DNA 합성기를 사용하여 생산될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 서열 또는 그의 유도체, 상기 서열의 상동체 또는 일부는 예를 들어 다른 박테리아로부터, 예를 들어 게놈 또는 cDNA 은행을 통해, 예를 들어 통상적인 혼성화 방법 또는 PCR 기법을 사용하여 단리될 수 있다. 상기 DNA 서열은 본 발명에 따른 서열과 표준 조건 하에서 혼성화한다.

"혼성화"는 표준 조건 하에서 거의 상보성인 서열에 결합하는 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드의 능력을 의미하는 것으로 이해되고, 상기 조건 하에서 비-상보성 파트너 사이의 비특이적 결합은 발생하지 않는다. 이를 위해, 서열은 90-100% 상보성일 수 있다. 서로 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 서열의 특성은 예를 들어 노던 또는 서던 블롯 기법에서 또는 PCR 또는 RT-PCR에서 프라이머 결합에 이용된다.

혼성화를 위해, 보존된 영역의 짧은 올리고뉴클레오티드가 유리하게 사용된다. 그러나, 본 발명에 따른 핵산의 보다 긴 단편 또는 완전한 서열도 혼성화에 사용될 수 있다. 이들 표준 조건은 사용된 핵산 (올리고뉴클레오티드, 보다 긴 단편 또는 완전한 서열)에 따라 또는 혼성화에 사용되는 핵산 DNA 또는 RNA의 종류에 따라 상이하다. 따라서, 예를 들어 DNA:DNA 하이브리드의 융점은 동일한 길이의 DNA:RNA 하이브리드의 융점보다 약 10℃ 더 낮다.

핵산에 따라, 표준 조건은 예를 들어 0.1 내지 5 x SSC (1 X SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.2)의 농도의 수성 완충제 용액 내의 42 내지 58℃, 또는 추가로 50% 포름아미드의 존재 하에, 예를 들어 5 x SSC, 50% 포름아미드 내의 42℃의 온도를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 유리하게는, DNA:DNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 0.1 x SSC 및 약 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 45℃의 온도이다. DNA:RNA 하이브리드의 경우, 혼성화 조건은 유리하게는 0.1 x SSC 및 약 30℃ 내지 55℃, 바람직하게는 약 45℃ 내지 55℃의 온도이다. 혼성화를 위한 상기한 온도는 예를 들어 포름아미드의 부재 하에 길이가 약 100개의 뉴클레오티드이고 G + C 함량이 50%인 핵산에 대해 계산된 융점 값이다. DNA 혼성화에 대한 실험 조건은 관련 유전학 교재, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]에 기재되어 있고, 예를 들어 핵산의 길이, 하이브리드의 성질 또는 G + C 함량에 따라 당업자에게 공지된 공식에 따라 계산될 수 있다. 혼성화에 대한 추가의 정보를 당업자는 다음 교재로부터 얻을 수 있다: 문헌 [Ausubel et al. (Eds.), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York]; [Hames and Higgins (Eds.), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford]; [Brown (Ed.), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford].

"혼성화"는 특히 엄격한 조건 하에 시행될 수 있다. 그러한 혼성화 조건은 예를 들어 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기재되어 있다.

"엄격한" 혼성화 조건은 특히 다음을 의미하는 것으로 이해된다: 50% 포름아미드, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 g/ml 변성, 전단된 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 내에서 42℃에서의 밤새 인큐베이션, 이어서 65℃에서 0.1x SSC를 사용한 필터 세척 단계.

또한, 본 발명의 대상은 구체적으로 개시된 또는 유도가능한 핵산 서열의 유도체이다.

따라서, 본 발명에 따른 추가의 핵산 서열은 예를 들어 서열 1로부터 유도될 수 있고, 개개의 또는 몇몇의 뉴클레오티드의 부가, 치환, 삽입 또는 결실을 통해 그와 상이하지만, 요구되는 특성 프로파일을 갖는 폴리펩티드를 계속 코딩할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 소위 침묵 (silent) 돌연변이를 함유하거나 또는 구체적으로 언급된 서열에 비해 특정 기원 또는 숙주 유기체의 코돈 사용 빈도에 따라 변경된 핵산 서열, 및 또한 예컨대 그의 천연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 (splice) 변이체 또는 대립유전자 변이체가 포함된다.

또한, 보존적 뉴클레오티드 치환 (즉, 관련 아미노산이 동일한 전하, 크기, 극성 및/또는 용해도의 아미노산으로 교체됨)에 의해 얻을 수 있는 서열도 본 발명의 대상이다.

또한, 본 발명의 대상은 서열 다형성에 의해 구체적으로 개시된 핵산으로부터 유도된 분자이다. 상기 유전자 다형성은 천연 변이 때문에 집단 내의 개체 사이에 존재할 수 있다. 상기 천연 변이는 대체로 유전자의 뉴클레오티드 서열에 1 내지 5%의 변화를 야기한다.

서열 1을 갖는 본 발명에 따른 핵산 서열의 유도체는 예를 들어 전체 서열 영역에 걸쳐 유도된 아미노산 수준에서, 적어도 60%의 상동성, 바람직하게는 적어도 80%의 상동성, 특히 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 나타내는 대립유전자 변이체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다 (아미노산 수준에서의 상동성에 대해서는 상기한 설명을 참조할 수 있다). 서열의 일부 영역에 걸쳐, 상동성은 유리하게는 더 높을 수 있다.

나아가, 유도체는 또한 본 발명에 따른 핵산 서열, 특히 서열 1의 상동체, 예를 들어 진균 또는 박테리아 상동체, 말단절단된 서열 또는 코딩 및 비-코딩 DNA 서열의 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어 DNA 수준에서 서열 1에 대한 상동체는 서열 1에서 언급된 전체 DNA 영역에 걸쳐 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 60%, 특히 바람직하게는 적어도 70%, 보다 특히 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 갖는다.

또한, 유도체는 예를 들어 프로모터와의 융합체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 언급된 뉴클레오티드 서열의 앞에 삽입되는 프로모터는 적어도 하나의 뉴클레오티드 교환, 적어도 하나의 삽입, 역위 및/또는 결실에 의해 변형될 수 있지만, 그러나 이 때 프로모터의 기능성 또는 유효성이 손상되지 않아야 한다. 또한, 프로모터의 유효성은 그 서열의 변형에 의해 증가될 수 있거나, 또는 심지어 다른 종의 유기체로부터의 보다 효과적인 프로모터에 의해 완전히 교체될 수 있다.

나아가, 기능적 돌연변이체의 생성 방법도 당업자에게 공지되어 있다.

사용되는 기법에 따라, 당업자는 무작위 또는 또한 표적화된 돌연변이를 유전자 또는 또한 비-코딩 핵산 영역 (예를 들어 발현의 조절에 중요한 영역) 내로 도입하여 유전자 은행을 생성할 수 있다. 이를 위해 필요한 분자 생물학적 방법은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3^rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001]에 기재되어 있다.

유전자의 변형 및 그에 따라 이에 의해 코딩되는 단백질의 변형을 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이하가 있다:

- 유전자의 단일 또는 몇몇의 뉴클레오티드가 특이적으로 교체되는 부위-특이적 돌연변이 유발 (Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey),

- 임의의 아미노산에 대한 코돈이 유전자 내의 임의의 부위에서 교체되거나 삽입될 수 있는 포화 돌연변이 유발 ([Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593]; [Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541]; [Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1]),

- 뉴클레오티드 서열이 부정확하게 작동하는 DNA 폴리머라제에 의해 돌연변이되는 오류 유발 (error-prone) 폴리머라제 연쇄 반응 (오류 유발 PCR) (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);

- 예를 들어 결함 DNA 수복 메카니즘 때문에 뉴클레오티드 서열의 증가된 돌연변이 비율이 발생하는 변이유발 (mutator) 균주에서 유전자의 통과 (passaging) (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), 또는

- 밀접하게 관련된 유전자의 풀 (pool)이 형성되고 소화되고, 단편이 폴리머라제 연쇄 반응의 주형으로서 사용되고, 여기서 반복된 가닥 분리 및 재조립에 의해 전장 모자이크 (mosaic) 유전자가 최종적으로 생성되는 DNA 셔플링 ([Stemmer WPC (1994) Nature 370:389]; [Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747]).

소위 방향성 진화 (directed evolution) (특히, 문헌 [Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31]; [Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999)], [Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology]에 기재된 것)를 사용하여, 당업자는 지시된 방식으로 또한 대규모로 기능적 돌연변이체를 또한 생성할 수 있다. 여기서, 제1 단계에서, 관심있는 단백질의 유전자 은행을 먼저 생성하고, 이를 위해 예를 들어 상기한 방법을 이용할 수 있다. 유전자 은행은 적합한 방식으로, 예를 들어 박테리아 또는 파지 디스플레이 시스템에 의해 발현된다.

주로 요구되는 특성에 상응하는 특성을 갖는 기능적 돌연변이체를 발현하는 숙주 유기체의 관련 유전자는 추가 라운드의 돌연변이에 적용될 수 있다. 돌연변이 및 선택 또는 스크리닝의 단계는 당해 기능적 돌연변이체가 적절한 정도로 요구되는 특성을 나타낼 때까지 되풀이하여 반복될 수 있다. 이러한 반복적인 작동 방식을 통해, 제한된 수의 돌연변이, 예를 들어 1 내지 5개의 돌연변이가 단계적으로 수행되고, 관련 효소 특성에 대한 그의 영향에 대해 평가되고 선택될 수 있다. 이어서, 선택된 돌연변이체는 동일한 방식으로 추가의 돌연변이 단계에 적용될 수 있다. 시험되는 개개의 돌연변이체의 수는 이에 의해 유의하게 감소될 수 있다.

본 발명에 따른 결과는 요구되는 변형된 특성을 갖는 추가의 효소를 특이적으로 생성하기 위해 필요한, 관련 효소의 구조 및 서열에 대한 중요한 정보를 생성한다. 특히, 소위 "핫 스팟 (hot spot)", 즉 표적화된 돌연변이의 도입을 통해 효소 특성을 변경하기에 잠재적으로 적합한 서열 절편이 규정될 수 있다.

3.2 구축물

또한, 본 발명의 대상은 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 발현 구축물, 및 적어도 하나의 상기 발현 구축물을 포함하는 벡터이다.

본 발명에 따르면, "발현 단위"는 본원에서 정의된 프로모터를 함유하고 발현되는 핵산 또는 유전자와의 기능적 연결 후에 상기 핵산 또는 상기 유전자의 발현, 즉 전사 및 번역을 조절하는 발현 활성을 갖는 핵산을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 이러한 맥락에서 "조절 핵산 서열"도 또한 언급된다. 프로모터 이외에, 다른 조절 요소, 예를 들어 인핸서도 또한 함유될 수 있다.

본 발명에 따르면, "발현 카세트" 또는 "발현 구축물"은 발현되는 핵산 또는 발현되는 유전자와 기능적으로 연결된 발현 단위를 의미하는 것으로 이해된다. 발현 단위와 달리, 발현 카세트는 따라서 전사 및 번역을 조절하는 핵산 서열뿐만 아니라, 전사 및 번역의 결과로서 단백질로서 발현되는 핵산 서열도 포함한다.

본 발명의 측면에서, 용어 "발현" 또는 "과다발현"은 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 미생물 내의 하나 이상의 효소의 세포내 활성의 생성 또는 증가를 설명한다. 이를 위해, 예를 들어 유전자는 유기체 내로 도입되고, 존재하는 유전자는 다른 유전자로 교체되고, 유전자 또는 유전자들의 카피 수가 증가되고, 강력한 프로모터가 사용되거나 또는 높은 활성을 갖는 상응하는 효소를 코딩하는 유전자가 사용될 수 있고, 상기 수단들은 임의로 조합될 수 있다.

바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 구축물은 각각의 코딩 서열로부터 5' 상류의 프로모터 및 3' 하류의 종결인자 서열, 및 임의로 역시 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 다른 정상 조절 요소를 함유한다.

본 발명에 따르면, "프로모터", "프로모터 활성을 갖는 핵산" 또는 "프로모터 서열"은 전사되는 핵산과 기능적으로 연결될 때 상기 핵산의 전사를 조절하는 핵산을 의미하는 것으로 이해된다.

이러한 맥락에서, "기능적" 또는 "작동가능한" 연결은 각각의 조절 요소가 핵산 서열의 전사에서 그의 기능을 수행할 수 있도록, 예를 들어 프로모터 활성을 갖는 핵산 중의 하나 및 전사되는 핵산 서열 및 임의로 추가의 조절 요소, 예를 들어 핵산의 전사를 보장하는 핵산 서열, 및 예를 들어 종결인자의 순차적인 배열을 의미하는 것으로 이해된다. 이를 위해, 화학적 의미에서의 직접적인 연결이 절대적으로 필요하지는 않다. 또한, 유전자 제어 서열, 예를 들어 인핸서 서열이 보다 먼 위치 또는 심지어 다른 DNA 분자로부터의 표적 서열에 대해 그의 기능을 수행할 수 있다. 두 서열이 서로 공유 연결되도록 전사되는 핵산 서열이 프로모터 서열의 뒤에 (즉, 3' 말단부에) 위치하는 배열이 바람직하다. 여기서, 프로모터 서열과 유전자 도입에 의해 (transgenically) 발현되는 핵산 서열 사이의 거리는 200 염기쌍 미만, 또는 100 염기쌍 미만 또는 50 염기쌍 미만일 수 있다.

프로모터 및 종결인자 이외에, 표적화 서열, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 선택가능한 마커, 증폭 신호, 복제 기점 등도 추가의 조절 요소의 예로서 언급될 수 있다. 적합한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 핵산 구축물은 유전자 발현을 제어, 예를 들어 증가시키기 위해 하나 이상의 조절 신호와 작동가능하게 또는 기능적으로 유리하게 연결된, 특히 서열 1의 서열 또는 그의 유도체 및 상동체, 및 그로부터 유도가능한 핵산 서열을 포함한다.

이들 조절 서열에 추가로, 상기 서열의 천연 조절이 실제 구조 유전자 앞에 계속 존재할 수 있고, 천연 조절이 꺼지고 유전자 발현이 증가되도록 임의로 변형되었다. 그러나, 핵산 구축물은 또한 보다 간단한 구조를 가질 수 있는데, 즉, 추가의 조절 신호가 코딩 서열 앞에 삽입되지 않고, 그의 조절을 위한 천연 프로모터가 제거되지 않았다. 그 대신에, 추가의 조절이 발생하지 않고 유전자 발현이 증가되도록 천연 조절 서열이 돌연변이된다.

또한, 바람직한 핵산 구축물은 핵산 서열의 증가된 발현을 가능하게 하는, 프로모터에 기능적으로 연결된 하나 이상의 상기한 "인핸서" 서열을 함유한다. 또한, 추가의 유리한 서열, 예컨대 추가의 조절 요소 또는 종결인자가 DNA 서열의 3' 말단부에 삽입될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 카피로 구축물에 함유될 수 있다. 구축물 내에, 추가의 마커, 예컨대 항생제 내성 또는 영양요구성 보완 유전자가 임의로 구축물의 선택을 위해 함유될 수 있다.

적합한 조절 서열의 예는 cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaP_BAD)SP6-, 람다-P_R- 또는 람다-P_L 프로모터와 같은 프로모터에 함유되고, 이들은 그람-음성 박테리아에서 유리하게 사용된다. 추가의 유리한 조절 서열은 예를 들어 그람-양성 프로모터 amy 및 SPO2, 및 효모 또는 진균 프로모터 ADC1, MF알파, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28 및 ADH에 함유된다. 또한, 인공 프로모터도 조절에 사용될 수 있다.

숙주 유기체 내에서의 발현을 위해, 핵산 구축물은 숙주에서 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 파지 내로 유리하게 삽입된다. 플라스미드 및 파지 이외에, 벡터는 당업자에게 알려진 모든 다른 벡터, 예를 들어 바이러스, 예컨대 SV40, CMV, 바큘로바이러스 및 아데노바이러스, 트랜스포존, IS 요소, 파스미드, 코스미드, 및 선형 또는 환상 DNA를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이들 벡터는 숙주 유기체에서 자율 복제되거나 또는 염색체에 의해 복제될 수 있다. 이들 벡터는 본 발명의 추가의 실시양태이다.

적합한 플라스미드의 예는 다음과 같다: 이. 콜라이 (E. coli)에서 pET28a(+), pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 또는 pBdCI, 스트렙토미세스에서 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실루스 (Bacillus)에서 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리움 (Corynebacterium)에서 pSA77 또는 pAJ667, 진균에서 pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모에서 2알파M, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 또는 식물에서 pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51. 상기 플라스미드는 가능한 플라스미드의 일부만을 나타낸다. 추가의 플라스미드는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)]에서 볼 수 있다.

벡터의 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산 구축물 또는 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 벡터는 또한 선형 DNA의 형태로 미생물 내로 유리하게 도입되고, 이종성 또는 상동성 재조합을 통해 숙주 유기체의 게놈 내로 통합될 수 있다. 상기 선형 DNA는 선형화된 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 본 발명에 따른 핵산 구축물 또는 핵산으로 이루어질 수 있다.

유기체에서 이종성 유전자의 최적 발현을 위해, 유기체에서 사용되는 특정 "코돈 사용 빈도"에 따라 핵산 서열을 변경하는 것이 유리하다. "코돈 사용 빈도"는 관련된 유기체의 다른 공지의 유전자에 대한 컴퓨터 평가를 기초로 하여 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 발현 카세트의 생산은 적합한 프로모터와 적합한 코딩 뉴클레오티드 서열 및 종결인자 또는 폴리-아데닐화 신호와의 융합에 의해 시행된다. 이를 위해, 예를 들어 문헌 [T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 및 [T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기재된 표준 재조합 및 클로닝 기법이 사용된다.

적합한 숙주 유기체에서의 발현을 위해, 재조합 핵산 구축물 또는 유전자 구축물은 숙주에서 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 숙주-특이적 벡터 내로 유리하게 삽입된다. 벡터는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 ["Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]에서 볼 수 있다.

4. 미생물

문맥에 따라, 용어 "미생물"은 출발 미생물 (야생형) 또는 유전적으로 변형된 재조합 미생물 또는 둘 모두를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터에 의해, 예를 들어 본 발명에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물은 재현성 있고, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 유리하게는, 상기한 본 발명에 따른 재조합 구축물은 적합한 숙주 시스템 내로 도입되고 발현된다. 여기서, 당업자에게 알려진 통상적인 클로닝 및 형질감염 방법, 예를 들어 동시침전, 원형질체 융합, 전기천공, 레트로바이러스 형질감염 등이 상기 핵산을 관심있는 발현 시스템에서 발현시키기 위해 바람직하게 사용된다. 적합한 시스템은 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., Wiley Interscience, New York 1997], 또는 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 핵산 또는 핵산 구축물에 대한 재조합 숙주 유기체로서, 원칙적으로 모든 원핵 또는 진핵 유기체가 가능하다. 유리하게는, 미생물, 예컨대 박테리아, 진균 또는 효모가 숙주 유기체로서 사용된다. 유리하게는, 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아, 바람직하게는 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 슈도모나다세아에 (Pseudomonadaceae), 리조비아세아에 (Rhizobiaceae), 스트렙토미세타세아에 (Streptomycetaceae) 또는 노카르디아세아에 (Nocardiaceae) 과의 박테리아, 특히 바람직하게는 에스케리키아, 슈도모나스, 스트렙토미세스, 노카르디아 (Nocardia), 부르크홀데리아 (Burkholderia), 살모넬라 (Salmonella), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 클로스트리디움 또는 로도코쿠스 (Rhodococcus) 속의 박테리아가 사용된다. 특히 바람직하게는, 속 및 종은 에스케리키아 콜라이이다. 추가의 유리한 박테리아는 알파 프로토박테리아, 베타 프로토박테리아 또는 감마 프로토박테리아의 군에서 또한 발견된다.

여기서, 본 발명에 따른 숙주 유기체 또는 숙주 유기체들은 상기 정의에 따른 7β-HSDH 활성을 갖는 효소를 코딩하는, 본원에서 기재되는 핵산 서열, 핵산 구축물 또는 벡터 중 적어도 하나를 바람직하게 함유한다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 유기체는 숙주 유기체에 따라 당업자에 공지된 방식으로 성장 또는 배양된다. 미생물은 일반적으로 대부분 당 형태의 탄소원, 대부분 유기 질소원, 예컨대 효모 추출물 또는 염, 예컨대 암모늄 술페이트 형태의 질소 공급원, 미량 원소, 예컨대 철, 망가니즈 및 마그네슘 염 및 임의로 비타민을 함유하는 액체 배지에서 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃의 온도에서 산소 폭기 하에 배양된다. 그 동안, 영양소 액체의 pH는 고정된 값으로 유지될 수 있는데, 즉, 이는 배양 동안 조절되거나 조절되지 않을 수 있다. 배양은 "배치식", "반배치식" 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 영양소는 발효 개시시에 제공되거나 그 후에 반연속적으로 또는 연속적으로 공급될 수 있다.

5. UDCA의 생산

제1 단계: CA의 DHCA로의 화학적 전환

CA의 히드록시기는 전통적인 화학적 경로에 의해 그 자체로 공지된 방식으로 산성 용액 (예를 들어, H₂SO₄) 내에서 크롬산 또는 크로메이트에 의해 카르보닐기로 산화된다. 그 결과, DHCA가 형성된다.

제2 단계: DHCA의 12-케토-UDCA로의 효소적 전환

수용액에서, DHCA는 각각 NADPH 또는 NADH의 존재 하에 3α-HSDH 및 7β-HSDH에 의해 12-케토-UDCA로 특이적으로 환원된다. 보조인자 NADPH 또는 NADH는 각각 이소프로판올 또는 포름산나트륨으로부터 ADH 또는 FDH에 의해 재생될 수 있다. 반응은 온화한 조건 하에 진행된다. 예를 들어, 반응은 pH = 4 내지 9, 6 내지 9 또는 7 내지 9, 특히 약 pH = 8 및 약 10 내지 30, 25 내지 25 또는 약 23℃에서 수행될 수 있다.

제3 단계: 12-케토-UDCA의 UDCA로의 화학적 전환

12-케토-UDCA의 12-카르보닐기를 그 자체로 공지된 방식으로 볼프-키쉬너 환원에 의해 제거하고, 이에 의해 UDCA가 12-케토-UDCA로부터 형성된다. 반응에서, 카르보닐기는 먼저 히드라진을 사용하여 히드라존으로 전환된다. 이어서, 히드라존을 염기 (예를 들어, KOH)의 존재 하에 200℃로 가열하고, 이에 의해 질소가 절단되고, UDCA가 형성된다.

6. HSDH의 재조합 생성

또한, 본 발명의 대상은 폴리펩티드-생산 미생물을 배양하고, 필요한 경우 폴리펩티드의 발현을 유도하고 폴리펩티드를 배양액으로부터 단리하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 기능적, 생물학적 활성 단편의 재조합 생산 방법이다. 따라서, 폴리펩티드는 또한 요구되는 경우 대규모의 산업적 규모로 생산될 수도 있다.

본 발명에 따라 생산되는 미생물은 배치 공정 (배치 배양) 또는 유가식 공정 또는 반복된 유가식 공정에서 연속적으로 또는 불연속적으로 배양될 수 있다. 공지의 배양 방법의 요약은 문헌 [Chmiel, Bioprocess Technology 1. Introduction to bioprocess technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 문헌 [Storhas, Bioreactors and peripheral devices (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에서 찾아볼 수 있다.

사용되는 배양 배지는 관심있는 균주의 필요성을 적절하게 충촉시켜야 한다. 다양한 미생물의 배양 배지에 대한 설명은 안내서 ["Manual of Methods for General Bacteriology" from the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)]에 제시되어 있다.

본 발명에 따라 사용가능한 상기 배지는 대체로 하나 이상의 탄소원, 질소원, 무기 염, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함한다.

바람직한 탄소원은 당, 예컨대 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 매우 우수한 탄소원은 예를 들어 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 사카로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스이다. 또한, 당은 복합 화합물, 예컨대 당밀 또는 당 정제의 다른 부산물을 통해 배지에 첨가될 수 있다. 또한, 상이한 탄소원의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소원은 오일 및 지방, 예를 들어 대두 오일, 해바라기 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀산, 알콜, 예를 들어 글리세린, 메탄올 또는 에탄올 및 유기 산, 예를 들어 아세트산 또는 락트산이다.

질소원은 대체로 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 물질이다. 질소원의 예는 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 복합 질소원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두박, 대두 단백질, 효모 추출물, 고기 추출물 등을 포함한다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지에 함유될 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망가니즈, 아연, 구리 및 철의 클로라이드, 인 또는 술페이트 염을 포함한다.

황 공급원으로서, 무기 황-함유 화합물, 예를 들어 술페이트, 술파이트, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트 및 술파이드뿐 아니라, 유기 황 화합물, 예컨대 메르캅탄 및 티올도 또한 사용될 수 있다.

인 공급원으로서, 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 사용될 수 있다.

용액에 금소 이온을 유지하기 위해 킬레이트화제가 배지에 첨가될 수 있다. 특히 적합한 킬레이트화제는 디히드록시페놀, 예컨대 카테콜 또는 프로토-카테츄에이트, 또는 유기 산, 예컨대 시트르산을 포함한다.

또한, 본 발명에 따라 사용되는 발효 배지는 대체로 다른 성장 인자, 예컨대 비타민 또는 성장 촉진제, 예를 들어 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 함유한다. 성장 인자 및 염은 종종 복합 배지 성분, 예컨대 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등으로부터 유래한다. 이외에, 적합한 전구체가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 배지 화합물의 정확한 조성은 특정 실험에 따라 크게 좌우되고, 각각의 특이적인 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 얻을 수 있다. 성장 배지는 또한 상업적 공급처로부터, 예컨대 스탠다드 (Standard) 1 (머크 (Merck)) 또는 BHI (뇌 심장 침출 배지 (brain heart infusion), 디프코 (DIFCO)) 등으로 입수할 수 있다.

모든 배지 성분은 열 (1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균된다. 성분은 함께 멸균되거나 또는 필요한 경우 별개로 멸균될 수 있다. 모든 배지 성분은 배양 개시시에 존재하거나 또는 임의로 연속적으로 또는 일괄적으로 첨가될 수 있다.

배양 온도는 통상 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이고, 실험 동안 일정하게 유지되거나 또는 변경된다. 배지의 pH는 5 내지 8.5 범위, 바람직하게는 약 7.0이어야 한다. 배양을 위한 pH는 염기성 화합물, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아 또는 산성 화합물, 예컨대 인산 또는 황산의 첨가에 의해 배양 동안 제어될 수 있다. 거품 발생을 제어하기 위해, 소포제, 예를 들어 지방산 에스테르가 사용될 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 적합한 선택적으로 작용하는 물질, 예를 들어 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해서, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어 주위 공기를 배양액 내로 도입한다. 배양 온도는 통상 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 최대의 요구되는 생성물이 형성될 때까지 계속된다. 상기 목표는 통상 10시간 내지 160시간 내에 도달한다.

이어서, 발효 브로쓰를 추가로 처리한다. 필요에 따라, 바이오매스는 분리 방법, 예를 들어 원심분리, 여과, 경사분리 (decantation) 또는 상기 방법의 조합에 의해 발효 브로쓰로부터 전체적으로 또는 부분적으로 제거되거나, 또는 그 내부에 완전히 유지될 수 있다.

세포는 또한 폴리펩티드가 배양 배지 내로 분비되지 않는다면 분해되고, 생성물은 공지의 단백질 단리 방법에 의해 용해물으로부터 회수될 수 있다. 세포는 임의로 고주파수 초음파에 의해, 예를 들어 프렌치 프레스에서 고압에 의해, 삼투에 의해, 세제, 용해성 효소 또는 유기 용매의 작용에 의해, 균질화기에 의해 또는 언급된 방법의 몇몇의 조합에 의해 분해될 수 있다.

폴리펩티드의 정제는 공지의 크로마토그래피 방법, 예컨대 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 예컨대 Q-세파로스 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피에 의해, 및 다른 통상적인 방법, 예컨대 한외여과, 결정화, 염석, 투석 및 천연 겔 전기영동에 의해 달성될 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어 문헌 [Cooper, F. G., Biochemical Working Methods, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York] 또는 [Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기재되어 있다.

재조합 단백질의 단리를 위해, 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 cDNA의 길이를 연장하고, 그에 따라 예를 들어 보다 간단한 정제를 위해 기능하는 변형된 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 코딩하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 상기 적합한 변형은 예를 들어 앵커로서 기능하는 소위 "태그 (tag)", 예를 들어 헥사-히스티딘 앵커 또는 항체에 의해 항원으로 인식될 수 있는 에피토프로서 알려진 변형이다 (예를 들어, 문헌 [Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press]에 기재되어 있음). 상기 앵커는 고체 지지체, 예를 들어 크로마토그래피 칼럼 상에 충전될 수 있거나, 또는 마이크로타이터 플레이트 상에 또는 또 다른 지지체 상에서 사용될 수 있는 중합체 매트릭스 상으로의 단백질의 부착을 위해 기능할 수 있다.

이와 동시에, 상기 앵커는 또한 단백질의 인식을 위해 사용될 수 있다. 또한, 앵커는 단백질 정상 마커, 예컨대 형광 염료, 기질과의 반응 후에 검출가능한 반응 생성물을 형성하는 효소 마커, 또는 방사성 마커를 단독으로 또는 단백질의 유도체화를 위한 앵커와 조합되어 인식하기 위해 사용될 수 있다.

7. 효소 고정화

본 발명에 따른 효소는 유리 상태로 또는 고정화되어 본원에서 기재되는 방법에 사용될 수 있다. 고정화된 효소는 불활성 지지체 상에 고정된 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 적합한 지지체 물질 및 그 위에 고정된 효소는 EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 및 DE-OS 100193773 및 이들에서 인용된 참조문헌으로부터 알 수 있다. 이와 관련하여, 상기 간행물의 전체 개시내용을 참조한다. 적합한 지지체 물질의 예는 예를 들어 점토, 점토 광물, 예컨대 카올리나이트, 규조토, 진주암, 이산화규소, 산화알루미늄, 탄화나트륨, 탄화칼슘, 셀룰로스 분말, 음이온 교환 물질, 및 합성 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 아크릴계 수지, 페놀 포름알데히드 수지, 폴리우레탄 및 폴리올레핀, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌이다. 지지체 물질은 지지된 효소의 생산을 위해 통상 미분된 미립자 형태로 사용되고, 다공성 형태가 바람직하다. 지지체 물질의 입자 크기는 대체로 5 mm 이하, 특히 2 mm 이하이다 (크기 분포 곡선). 유사하게, 데히드로게나제를 전체 세포 촉매로서 사용할 때, 유리되거나 또는 고정화된 형태가 선택될 수 있다. 지지체 물질의 예는 Ca 알기네이트, 및 카라기난이다. 세포처럼 효소도 글루타르알데히드와 직접 가교결합될 수 있다 (CLEA에 대한 가교결합). 유사한 및 다른 고정화 방법은 예를 들어 문헌 [J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes"] 및 [K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim]에 기재되어 있다.

실험부:

달리 언급되지 않으면, 본 발명의 맥락에서 수행되는 클로닝 단계, 예를 들어 제한 절단, 아가로스 겔 전기영동, DNA 단편의 정제, 핵산의 니트로셀룰로스 및 나일론 막으로의 전달, DNA 단편의 연결, 미생물의 형질전환, 미생물의 배양, 파지의 증식 및 재조합 DNA의 서열 분석은 문헌 [Sambrook et al. (1989), 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

1. 일반적인 정보

재료:

콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979 (ATCC 25986, 이전 명칭 유박테리움 아에로파시엔스)로부터의 게놈 DNA를 저먼 컬렉션 포 마이크로오거니즘스 앤드 셀 컬쳐스 (German Collection for Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ))로부터 얻었다. UDCA 및 7-케토-LCA가 그 자체 공지된 출발 화합물이고, 이들은 문헌에 기재되어 있다. 다른 모든 화학물질은 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) 및 플루카 (Fluka) (독일)로부터 수득하였다. 모든 제한 엔도뉴클레아제, T4 DNA 리가제, Taq DNA 폴리머라제 및 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)는 페르멘타스 (독일)로부터 수득하였다.

배지:

배지 1리터당 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g 및 NaCl 5 g을 함유하는 LB 배지.

발현 벡터

pET22b(+) 및 pET28a(+) (노바겐 (Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨).

미생물

에스케리키아 콜라이 균주 DH5α (노바겐, 미국 위스콘신주 매디슨)를 적합한 항생제를 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 증식시켰다.

에스케리키아 콜라이 균주 BL21(DE3) (노바겐, 미국 위스콘신주 매디슨)을 적합한 항생제를 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 증식시키고, 0.5 mM IPTG로 OD₆₀₀ = 0.8에서 유도한 후, 25℃ 및 140 Rpm에서 유지하였다.

분석 방법

1. 7β-HSDH 활성 결정을 위한 표준 조건

반응 혼합물은 총 부피 1 ml로 다음을 함유하였다:

880 ㎕ 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 8.0

10 ㎕ 10 mM UDCA (물에 용해시킨, pH 8)

10 ㎕ 효소 용액 (상기 완충제 내, 1 내지 10 U/ml 범위)

100 ㎕ 1 mM NADP⁺ (상기 완충제 내)

340 nm에서의 흡광의 증가를 측정하고, 6.22 mM^-1xcm^-1의 몰 흡광 계수를 사용하여 효소 단위 (U, 즉 μmol/min)로서 활성을 계산한다.

2. BCA 검정에 의한 단백질 결정

샘플을 BCA 시약 (인터킴 (Interchim) 제품)과 혼합하고, 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 함량은 사용된 검정의 농도 범위에서 교정 곡선 (BSA)에 대해 562 nm에서 결정하였다.

3. 박층 크로마토그래피

5 내지 10 ㎍의 샘플을 TLC 필름 키젤겔 (Kieselgel) 60 (머크)에 적용하였다. 모사 (authentic) 물질을 참조물질로서 적용하였다. TLC 필름의 한쪽 끝을, 이동상이 상부에 도달할 때까지 용리액에 침지시켰다. TLC 필름을 건조시키고, 인몰리브덴산으로 현상하였다.

2. 실시예

생산 실시예 1: 7β- HSDH 활성의 확인

콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986의 게놈 DNA 서열은 "인간 장내 미생물군집 프로젝트 (human gut microbiome project)"를 위해 "워싱턴 유니버시티 게놈 시퀸싱 센터 (Washington University Genome Sequencing Center)"에 의해 2007년도에 진뱅크에서 공개되었다. HSDH는 "단쇄 데히드로게나제"에 속하는 것이다. 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986으로부터의 "단쇄 데히드로게나제"의 생화학적 기능은 진뱅크에서 설명되지 않았기 때문에, 9개의 후보를 벡터 pET22b+ 내로 클로닝한 후, 이. 콜라이 BL21(DE3)에서 발현시켰다.

이를 위해, 7β-HSDH 코딩 서열을 PCR-증폭하였다. PCR 생성물은 주형으로서 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986 (DSM 3979)의 게놈 DNA 및 프라이머 5'-gggaattcCATATGAACCTGAGGGAGAAGTA-3' (서열 3) 및 5'-cccAAGCTTCTAGTCGCGGTAGAACGA-3' (서열 4)를 사용하여 얻었다. 프라이머 서열 내의 NdeI 및 HindIII 절단 부위는 밑줄로 표시하였다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트 (퀴아젠 (Qiagen))로 정제하고, 효소 NdeI 및 HindIII로 절단하였다. 또한, 관련 벡터를 NdeI 및 HindIII로 절단하였다. 생성물을 아가로스 겔에 적용하고, 분리하고, 이로부터 절제하고, 정제하였다. 절단된 PCR 생성물 및 절단된 벡터를 T4 리가제로 결찰하였다. 결찰 생성물로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시켰다. 생성되는 벡터 (7β-HSDH의 유전자 함유)를 서열결정에 의해 확인하고, 이를 사용하여 이. 콜라이 BL21(DE3)을 형질전환시키고, IPTG로 유도하고, 발현시켰다.

발현은 50 ml의 LB 배지에서 수행하였다. 전배양액의 제조를 위해, LB 아가 플레이트 상의 하나의 콜로니를 선발하여, 5 ml의 LB 배지 (관련 항생제 함유) 내에서 37℃ 및 160 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ml의 LB 배지 (관련 항생제 함유)에 500 ㎕의 전배양액을 접종하였다. 배양액을 37℃ 및 160 rpm에 인큐베이션하였다. 약 0.8의 OD₆₀₀까지, 발현을 0.5 mM IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 6 hrs 또는 하룻밤 후에, 세포를 원심분리하였다. 펠릿을 6 ml의 인산칼륨 완충제 (50 mM, pH 8, 0.1 mM PMSF 함유) 내에 재현탁하고, 초음파로 분해하였다. 세포 단편을 원심분리에 의해 제거하였다.

7β-HSDH 활성의 확인을 위해, 활성을 광도측정 방법에 의해 시험하였다. 이를 위해, 효소 및 인산칼륨 완충제 (50 mM, pH 8) 내의 0.1 mM의 시험 물질 (UDCA)을 1 ml 큐벳에서 혼합하였다. NADPH (NADH) 또는 NADP⁺ (NAD⁺)의 첨가 후에, NAD(P)H의 분해 또는 형성을 측정하였다. 9개의 후보로부터 하나의 효소가 NADP⁺의 존재 하에 UDCA에 대한 활성 (60 U/ml)을 보이지만, CA에 대한 활성은 보이지 않았다. 상기 효소의 NADPH-의존성 7β-HSDH 활성이 확인되었다.

광도측정 시험에서, 7β-HSDH는 NADP⁺ 또는 NADPH의 존재 하에 UDCA에 대해 활성 60 U/ml을, 7-케토-LCA에 대해 활성 35 U/ml을, DHCA에 대해 활성 119 U/ml을 나타내었다. CA에 대한 활성은 검출가능하지 않았다.

7β-HSDH를 코딩하는 유전자를, 신속한 정제가 가능하도록 His-Tag와 함께 pET28a+에 재클로닝하였다. His-Tag와 함께 상기 7β-HSDH는 상기 설명한 바와 같이 이. 콜라이 BL21(DE3)에서 능동적으로 발현되었다. 정제는 탈론 (Talon) 칼럼을 사용하여 수행하였다. 칼럼을 먼저 인산칼륨 완충제 (50 mM, pH 8, 300 mM NaCl 함유)로 평형화하였다. 세포 용해물을 로딩한 후, 칼럼을 인산칼륨 완충제 (50 mM, pH 8, 300 mM NaCl 함유)로 세척하였다. 7β-HSDH를 인산칼륨 완충제 (50 mM, pH 8, 300 mM NaCl 및 200 mM 이미다졸 함유)로 용리시켰다. 용리물 내의 이미다졸을 투석에 의해 제거하였다. 정제 수율은 76%이고, 순도는 약 90%이었다.

전환 실시예 1: 7β- HSDH 에 의한 7- 케토 - LCA 의 효소적 전환

7β-HSDH의 생화학적 기능을 조사하기 위해서, 7β-HSDH에 의한 7-케토-LCA의 전환을 수행하였다. 20 ml 전환 혼합물은 50 mM 7-케토-LCA (약 0.4 g), 5 U/ml 7β-HSDH 및 0.05 mM NADP⁺를 함유하였다. NADPH의 재생을 위해, 4 U/ml ADH 및 1% 이소프로판올을 사용하였다 (도식 1 참조). 반응은 교반하면서 pH 8 및 24℃에서 퓸 컵보드 (fume cupboard)에서 수행하였다. 아세톤이 이소프로판올보다 빨리 증발되기 때문에, 반응은 UDCA의 형성을 향해 전환된다. 1% 이소프로판올을 24 hrs, 48 hrs 및 72 hrs 후에 다시 첨가하였다. 생성물을 TLC (키젤겔 60, 머크, 이동상 석유 에테르 및 에틸 아세테이트 1:10, vol:vol)로 분석하였다. TLC에서, 생성물을 모사 참조물질인 7-케토-LCA, UDCA 및 CDCA와 비교하였다. TLC 분석은 UDCA가 7β-HSDH에 의해 7-케토-LCA로부터 형성되었음을 보여주었다. 거울상이성질체 CDCA는 TLC에서 검출가능하지 않았다.

도식 1: 7β-HSDH에 의한 7-케토-LCA의 환원의 모식도. ADH는 보조인자 NADPH를 재생한다.

전환 실시예 2: 7β- HSDH 에 의해 DHCA 로부터 12- 케토 - UDCA 의 효소적 생산

DHCA로부터 12-케토-UDCA의 생산을 위한 7β-HSDH의 이용가능성을 시험하기 위해서, 7β-HSDH에 의한 DHCA의 전환을 수행하였다. 50 ml 전환 혼합물은 50 mM DHCA (1 g), 5 U/ml 7β-HSDH 및 0.05 mM NADP⁺를 함유하였다. NADPH의 재생을 위해, 4 U/ml ADH 및 1% 이소프로판올을 사용하였다 (도식 2 참조). 반응은 교반하면서 pH 8 및 24℃에서 퓸 컵보드에서 수행하였다. 아세톤이 이소프로판올보다 빨리 증발되기 때문에, 반응은 3,12-디케토-7β-CA의 형성을 향해 전환된다. 완전한 전환을 달성하기 위해, 1% 이소프로판올을 24 hrs, 48 hrs 및 72 hrs 후에 다시 첨가하였다. 중간체 3,12-디케토-7β-CA를 TLC로 분석하였다. 반응물 DHCA는 TLC (키젤겔 60, 머크; 이동상 클로로포름:메탄올:아세트산 10:1:0.08 vol:vol:vol)에서 더 이상 검출가능하지 않았다.

도식 2: 7β-HSDH에 의한 DHCA의 환원의 모식도. ADH는 보조인자 NADPH를 재생한다.

전환 실시예 3: 3,12- 디케토 -7β- CA 의 12- 케토 - UDCA 로의 효소적 전환

중간체 3,12-디케토-7β-CA (전환 실시예 2에 따라 제조됨)를 코마모나스 테스토스테로니로부터의 3α-HSDH (서열 5 및 6)에 의해 12-케토-UDCA로 추가로 전환하였다 (Mobus, E. and E. Maser, Molecular cloning, overexpression, and characterization of steroid-inducible 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni. A novel member of the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily. J Biol Chem, 1998. 273(47): p. 30888-96). 상기 3α-HSDH는 보조인자 NADH를 필요로 하고, 이는 FDH에 의해 재생되었다 (도 3 참조). 4 U/ml 3α-HSDH, 1 U/ml FDH (NADH-의존성, 코덱시스 (Codexis)), 200 mM 포름산나트륨 및 0.05 mM NAD⁺를 반응물에 첨가하였다. 40 hrs 후에, 생성물을 2M HCl을 사용하여 pH 2로 산성화하고, 10 ml 에틸 아세테이트로 6회 추출하였다. 증발 후에, 1.07 g의 생성물을 얻었다. 생성물인 12-케토-UDCA를 분석하고, TLC 및 NMR에 의해 확인하였다. 3α-HSDH는 7β-HSDH의 생산과 유사하게 생산되었지만, 플라스미드 pET22b+를 사용하였고, 추가의 정제 없이 사용되었다.

도식 3: 3α-HSDH에 의한 3,12-디케토-7β-CA의 환원의 모식도. FDH는 보조인자 NADH를 재생한다.

전환 실시예 4: CA 의 DHCA 로의 화학적 전환

1320 리터의 빙초산을 2000 리터의 교반 용기에 넣고, 110 kg (260 mol)의 콜산 (CA)을 용해시켰다. 422 리터의 차아염소산나트륨 용액 (2.3 M)을 상기 용액에 20 내지 40℃에서 계량 투입하고, 이어서 반응 용액을 반응의 완료를 위해 적어도 1시간 동안 추가로 교반하였다. 데히드로콜산 (DHCA)을 원심분리에 의해 100 kg (90%)의 수유로 단리하였다.

전환 실시예 5: 12- 케토 - UDCA 의 UDCA 로의 화학적 전환

105 g (0.258 mol)의 12-케토-UDCA를 384 ml의 트리에틸렌 글리콜, 52.2 g (1.304 mol)의 수산화나트륨 및 75.95 ml (1.563 mol)의 히드라진 수화물에 용해시키고, 180℃로 서서히 가열하였다. 그 동안, 히드라존이 형성되고, 160℃를 넘어서면서 질소를 방출하면서 UDCA로 재배열되었다. 전환 완료를 위해, 반응 혼합물을 180℃에서 8시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 100℃ 미만으로 냉각하고, 1500 ml의 물로 처리하였다. 이어서, UDCA를 염산을 사용한 산성화에 의해 침전시켰다. 생성물은 96.2 g 내지 99.2 g (95% - 98%까지)의 수율로 수득되었다.

생산 실시예 2: 예비 규모의 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986으로부터의 7β- HSDH 의 클로닝 , 발현 및 정제 및 효소의 추가의 특성화

a) 발현 구축물의 클로닝 및 생산

7β-HSDH를 코딩하는 유전자를 상기 생산 실시예 1에서 설명된 바와 같이 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 게놈 DNA로부터 다시 한번 증폭하였다:

PCR 생성물을 상기한 바와 같이 다시 한번 정제하고, 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 HindIII으로 소화시켰다. 소화된 PCR 생성물을 다시 한번 정제하고, 발현 벡터를 생성하기 위해 T4 리가제를 사용하여 pET-28a(+) 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서, 생성된 발현 구축물을 사용하여 이. 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 예상되는 단백질은 신호 펩티드 및 N-말단 6xHis-태그 및 트롬빈 절단 부위를 포함하는 20개의 아미노산 잔기를 가져야 한다. 삽입된 DNA의 서열을 서열결정에 의해 조사하였다.

b) 7β- HSDH 의 과다발현 및 정제

이. 콜라이 BL21(DE3)을 발현 구축물로 형질전환시켰다. 이를 위해, 발현 구축물을 함유하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주를 30 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 배지 (2 리터 진탕병 내의 2 x 400 ml)에서 증식시켰다. 세포를 원심분리 (10,000xg, 15분, 4℃)에 의해 수거하였다. 펠릿을 20 ml의 포스페이트 완충제 (50 mM, pH 8, 0.1 mM PMSF 함유) 내에 재현탁하였다. 세포를 일정하게 냉각하면서 소니파이어 (Sonifier) 250 초음파 장치 (브란존 (Branson), 독일)를 사용하여 1분 초음파 처리 (40 W 전력, 40% 간격 및 1분 정지)에 의해 분해하였다. 분해를 3회 반복하였다. 세포 추출물을 원심분리하였다 (22,000xg, 20분, 4℃). 상청액을 로딩 완충제 (50 mM 인산칼륨, 300 mM NaCl, pH 8)로 평형화시킨 탈론 칼럼 (클론테크 (Clontech), 미국) 상에 로딩하였다. 과정은 24℃에서 수행하였다. 칼럼을 로딩 완충제 (3배 칼럼 부피)로 세척함으로써 비결합 물질을 세척 제거하였다. 세척 완충제 (로딩 완충제 내의 20 mM 이미다졸; 3배 칼럼 부피)로 세척함으로써 약하게 결합된 단백질을 제거하였다. His-태그-7β-HSDH 단백질을 용리 완충제 (로딩 완충제 내의 200 mM 이미다졸)로 용리하였다. 용리물을 2 리터의 인산칼륨 완충제 (50 mM, pH 8)에서 분자 배제 한계가 5 kDa인 투석관 (시그마 (Sigma), 미국)에서 4℃에서 밤새 투석하였다. 최종적으로, 샘플을 새로운 관에 옮기고, 추가의 분석을 위해 -20℃에서 저장하였다. 단백질 농도는 제조자의 지시에 따라 BCA 시험 키트 (써모 (Thermo), 미국)를 사용하여 결정하였다. 또한, 샘플을 12.5% SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루로의 염색에 의해 분석하였다. 단백질의 순도는 싸이언 이미지 베타 (Scion Image Beta) 4.0.2 (싸이언 (Scion), 미국)에 의해 밀도측정에 의해 결정하였다.

c) 겔 여과

7β-HSDH의 분자량을 결정하기 위해서 겔 여과를 파마시아 (Pharmacia) AEKTA 단백질 정제 시스템으로 수행하였다. 정제된 효소를 200 mM 염화나트륨을 함유하는 50 mM 트리스-HCl (pH 8)로 사전에 평형화시킨 세파덱스 G-200 칼럼에 적용하였다. 단백질을 1 ml/min의 유량으로 동일한 완충제로 용리시켰다. 7β-HSDH의 분자량은 그의 용리 부피를 단백질 표준물 (혈청 알부민 (66 kDa), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae)로부터의 α-아밀라제 (52 kDa), 돼지 췌장으로부터의 트립신 (24 kDa) 및 달걀로부터의 리소자임 (14.4 kDa))과 비교함으로써 결정하였다.

d) 효소 시험 및 동역학적 분석

효소 시험을 위한 반응 혼합물은 1 ml의 총 부피에 50 μmol 인산칼륨 (pH 8), 0.1 μmol NAD(P)H 또는 NAD(P)⁺, 기질 및 단백질을 함유하였다. 반응 혼합물을 광 행로 길이가 1 cm인 큐벳에 넣었다. 7β-HSDH 활성은 분광광도계 (울트라스펙(Ultraspec) 3000, 파마시아 바이오텍 (Pharmacia Biotech), 영국)에 의해 340 nm에서의 흡광을 통해 NAD(P)H 농도의 변화를 기록함으로써 결정하였다. 효소 활성은 25℃에서 6.22 mM^-1 x cm^-1의 몰 흡광 계수를 사용하여 효소 단위 (U, 즉 μmol/min)로서 결정하였다. 변수로서 기질, 조효소, 농도, pH, 완충제 및 인큐베이션 온도를 사용하여 몇몇의 상이한 측정을 수행하였다. 동역학적 상수를 표준 방법을 이용하여 결정하였다.

e) 7- 케토 - 리토콜산의 7β- HSDH 에 의한 생체내변환

7β-HSDH에 의한 7-케토-LCA의 전환은 7β-HSDH의 생화학적 기능을 확인하기 위해 수행하였다. 0.4 g의 7-케토-LCA를 10 ml의 인산칼륨 완충제 (50 mM, pH 8)에 현탁시키고, pH를 2M 수산화나트륨의 첨가에 의해 pH 8로 조정하였다. 0.2 ml의 이소프로판올, 100 U의 7β-HSDH 및 써모아나에로박터 에타놀리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus)로부터의 80 U의 알콜 데히드로게나제 (ADH-TE) (독일 슈트트가르트의 ITB 유니버시티의 모모이 박사 (Dr. K. Momoi)의 기증물) 및 1 μmol NADP⁺를 첨가하였다. 동일한 완충제를 첨가하여 20 ml의 총 반응 부피를 얻었다. 반응 혼합물을 24℃에서 인큐베이션하고, 24시간 동안 교반하였다. 그 동안, NADPH가 2-프로판올의 산화를 통해 ADH에 의해 재생되었다. 생성물을 1 ml의 2M 염산으로 산성화시키고, 5 ml의 에틸 아세테이트로 5회 추출하였다. 이어서, 유기 용액을 증류하였다.

f) 크로마토그래피 생성물 결정

1 ml/min의 유량으로 LC20AD HPLC 시스템 (시마주 (Shimadzu), 일본)에서 리크로카르트(LiChroCART)® 스타(STAR) RP18 타입의 예비칼럼 (말단캐핑됨 (endcapped), 머크, 독일)이 장착된 푸로스퍼 (Purospher)® 스타 RP-18 타입 (히트바(Hitbar)® RT 125-4 예비충전 (Pre-Packed) 칼럼, 푸로스퍼® 스타 RP-18 말단캐핑됨, 머크, 독일)의 칼럼 상에서 HPLC 분석을 수행하였다. 이동상은 2개의 용리액으로 이루어졌다. 용리액 A는 아세토니트릴을 함유하였고, 용리액 B는 증류수 (pH 2.6, 오르토인산, 85%로 조정됨)를 함유하였다. 다음 구배를 사용하였다: A 35% (8분) - 35%-43% (1% min^-1) - 43%-70% (1% min^-1) - 70% (5 min) - 70%-35% (17.5% min^-1) - 35% (5 min); 용리액 A 65% (8 min) - 65%-57% (1% min^-1) - 57%-30% (1% min^-1) - 30% (5 min) - 30%-65% (17.5% min^-1) - 65% (5 min). 20 ㎕의 샘플 (1 mg/ml)을 분석하였다. 모사 UDCA, 7-케토-LCA 및 CDCA를 표준물로서 동일한 농도에서 사용하였다. 기록은 200 nm에서 UV 검출에 의해 수행하였다.

g) 서열 정렬 및 계통발생학적 분석

클러스탈 X 소프트웨어 (Thompson et al., 1997, Nucleic Acid Research 25: 4876-82)를 사용하여 다수의 서열 정렬을 생성하고, 잘뷰(Jalview)-소프트웨어 (Clamp et al., 2004, Bioinformatics 20:426-7)를 사용하여 변형하였다. 프로그램 트리뷰(TreeView) 1.6.6 (Roderic 2001, http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html)을 사용하여 계통수를 생성하였다.

h) 시험 결과:

1. 예비 생체내변환에서 7β- HSDH 활성의 확인

효소 기능을 확인하기 위해, 10 ml 규모에서 7-케토-LCA의 생체내변환을 수행하였고, 여기서 단리된 효소는 앞에서 설명한 바와 같이 2-프로판올을 사용한 NADPH의 재생을 위해 ADH와 조합하여 사용되었다. HPLC 분석은 UDCA가 효소에 의해 생성된 유일한 반응 생성물 (90% 전환)임을 보여주었다. CDCA (체류 시간 19.4분)는 반응 혼합물에서 검출되지 않았다. 결과는 효소가 NADPH-의존성 7β-HSDH이고 7-케토-LCA의 7-카르보닐기를 7β-히드록시기로 선택적으로 환원할 수 있음을 보여준다.

체류 시간 UDCA: 15.5분

체류 시간 7-케토-LCA: 18.3분

2. 정제 및 겔 여과

발현 벡터 pET28a(+) 내로 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 7β-HSDH 유전자의 클로닝 및 후속적인 과다발현 후에, N-말단에 His-태그가 제공된 융합 단백질을 배양액 1 리터당 332.5 mg (5828 U)의 7β-HSDH 수율로 얻었다. His-태그가 제공된 7β-HSDH를 하나의 고정화된 금속 이온 친화도 크로마토그래피에 의해 1 단계로 정제하였다 (순도 >90%, 수율 76%, 도 2 참조). 트랙 1 및 2의 주 밴드는 30 kDa에서 예상된 발현 생성물을 제시하는데, 이는 유전자의 아미노산 서열로부터 유도된 예측된 분자량에 상응한다. 그러나, 겔 여과에 의해 56.1 kDa의 분자량이 7β-HSDH에 대해 결정되었다. 이것은 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 7β-HSDH의 이량체 성질을 확증해 준다.

3. 서열 정렬

본 발명에 따른 7β-HSDH의 아미노산 서열을 공지의 HSDH 서열과 비교하였다 (도 3 참조). 관찰된 서열 유사성은 본 발명에 따른 효소가 단쇄 데히드로게나제 (SDR)의 패밀리에 속함을 나타낸다. SDR이 매우 낮은 상동성 및 서열 동일성을 보이는 것이 알려져 있다 ([Jornvall, H., B. Persson, M. Krook, S. Atrian, R. Gonzalez-Duarte, J. Jeffery, and D. Ghosh. 1995. Short-chain dehydrogenase/reductases (SDR). Biochemistry 34:6003-13] 및 [Persson, B., M. Krook, and H. Jornvall. 1991. Characteristics of short alcohol dehydrogenase and related enzymes. Eur J Biochem 200:537-43]). 그러나, 서열 정렬은 SDR 1차 구조 내의 보존된 도메인을 분명히 보여준다. N-말단 모티프 Gly-X-X-X-Gly-X-Gly (Gly-41, Gly-45 및 Gly-47에 상응, 정렬에 상응하는 넘버링)는 SDR 수퍼패밀리의 특징적인 디뉴클레오티드 결합 모티프에 상응한다. 또한, 3개의 강하게 보존된 잔기 Ser-177, Tri-190 및 Lys-194 (정렬에 따른 넘버링)가 식별될 수 있고, 이들은 SDR 효소의 촉매 세작용기 (catalytic triad)에 상응한다.

4. 계통발생학적 분석

도 3의 정렬을 기초로 한 계통수를 도 4에 제시한다. 클로스트리디움 소르델리이, 브루셀라 멜리텐시스 및 에스케리키아 콜라이로부터의 7α-HSDH는 동일한 하위군에 속한다. 두 3α-HSDH는 다른 HSDH보다 더 뚜렷한 관계를 보인다. 흥미롭게도, 원핵 7β-HSDH는 카비아 포르셀루스, 호모 사피엔스 및 무스 무스쿨루스를 포함하는 동물 11β-HSDH 하위군과 동류이다.

5. 동역학적 상수

라인위버-버크 (Lineweaver-Burk) 플롯에 의해 UDCA, 7-케토-LCA, DHCA, NADP⁺ 및 NADPH에 대한 V_max 및 K_M의 절대적인 값을 결정하기 위해 동역학적 평형 분석을 수행하였다. 다음 표에서, 기질 포화 곡선 및 역수 플롯 (reciprocal plot)으로부터 얻은 시험된 기질 및 조효소에 대한 모든 동역학적 데이터가 요약되어 있다. 모든 기질 및 조효소에 대한 V_max, K_M 및 k_cat 값은 동일한 범위 내에 있는 반면에, DHCA에 대한 K_M 값은 다른 기질보다 유의하게 더 높은데, 이것은 아마도 낮은 수 용해도 때문일 것이다. 효소는 NADPH-의존성이고, NAD⁺ 및 NADH에 대한 동역학적 상수는 매우 낮은 활성 때문에 결정될 수 없었다.

6. 최적 pH

또한, pH의 함수로서 다양한 기질에 대한 7β-HSDH 활성을 정제된 효소를 사용하여 결정하였다 (도 5 참조). 7β-HSDH를 사용한 UDCA의 산화의 경우, 최적 활성은 pH 9 내지 10 범위에서 관찰되었고, 산성으로 갈수록 점진적으로 감소하였다. 이와 반대로, 7β-HSDH에 의한 DHCA 및 7-케토-LCA의 환원의 경우, 최적 활성은 pH 4 내지 6 범위에서 관찰되었고, 산성으로 갈수록 급격하게 감소하고, 알칼리성으로 갈수록 점진적으로 감소하였다. 상이한 완충제는 동일한 pH에서 7β-HSDH의 활성에 대해 경미한 영향만을 갖는다.

7. 열 안정성

본 발명에 따른 NADP-의존성 7β-HSDH는 다음 안정성 거동을 보인다: 400분 후에, 30℃에서의 활성은 23℃에서보다 약 30% 더 낮았다. 효소는 1500분 후에 30℃에서 완전히 불활성화되었지만, 1500분 후에 23℃에서 잔류 활성은 20%이었다. 다수회의 동결 및 해동 후에 수개월의 기간에 걸쳐서 인산칼륨 완충제 (50 mM, pH 8) 내에서 -20℃에서 저장하는 동안 유의한 활성 상실은 관찰되지 않았다.

서열 정렬

본원에서 언급된 간행물을 분명하게 참조한다.

SEQUENCE LISTING <110> PharmaZell GmbH <120> Neuartige 7beta-Hydroxysteroiddehydrogenasen und deren Verwendung <130> M/50180-PCT <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 792 <212> DNA <213> Collinsella aerofaciens <220> <221> CDS <222> (1)..(792) <400> 1 atg aac ctg agg gag aag tac ggt gag tgg ggc ctg atc ctg ggc gcg 48 Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Leu Ile Leu Gly Ala 1 5 10 15 acc gag ggc gtc ggc aag gcg ttc tgc gag aag atc gcc gcc ggc ggc 96 Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Lys Ile Ala Ala Gly Gly 20 25 30 atg aac gtc gtc atg gtc ggc cgt cgc gag gag aag ctg aac gtg ctc 144 Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Asn Val Leu 35 40 45 gca ggc gag atc cgc gag acc tac ggc gtg gag acc aag gtc gtg cgc 192 Ala Gly Glu Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Val Glu Thr Lys Val Val Arg 50 55 60 gcc gac ttt agc cag ccc ggc gct gcc gag acc gtc ttc gcc gcg acc 240 Ala Asp Phe Ser Gln Pro Gly Ala Ala Glu Thr Val Phe Ala Ala Thr 65 70 75 80 gag ggc ctg gac atg ggc ttc 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Ser Gln Pro Gly Ala Ala Glu Thr Val Phe Ala Ala Thr 65 70 75 80 Glu Gly Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Leu His Ser 85 90 95 Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met Ile 100 105 110 Asn Val Asn Val Val Thr Phe Leu Lys Cys Phe His His Tyr Met Arg 115 120 125 Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Met 130 135 140 Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Lys 145 150 155 160 Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Cys Glu Gly 165 170 175 Thr Gly Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Leu Thr Pro 180 185 190 Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val Met 195 200 205 Lys Ile Ala Leu Thr Pro Glu Glu Cys Val Asp Glu Ala Phe Glu Lys 210 215 220 Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ala Gly Gln Arg Asn Lys Asp Ser 225 230 235 240 Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Glu Tyr Ile Arg Tyr 245 250 255 Met Gly Ser Phe Tyr Arg Asp 260 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR Primer <400> 3 gggaattcca tatgaacctg agggagaagt a 31 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 4 cccaagcttc tagtcgcggt agaacga 27 <210> 5 <211> 774 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni <220> <221> CDS <222> (1)..(774) <400> 5 atg tcc atc atc gtg ata agc ggc tgc gcc acc ggc att ggt gcg gct 48 Met Ser Ile Ile Val Ile Ser Gly Cys Ala Thr Gly Ile Gly Ala Ala 1 5 10 15 acg cgc aag gtc ctg gag gcg gcc ggt cac cag atc gta ggc atc gat 96 Thr Arg Lys Val Leu Glu Ala Ala Gly His Gln Ile Val Gly Ile Asp 20 25 30 ata cgc gat gcg gaa gtg att gcc gat ctc tcg acg gcc gaa ggt cga 144 Ile Arg Asp Ala Glu Val Ile Ala Asp Leu Ser Thr Ala Glu Gly Arg 35 40 45 aag cag gcg att gcc gat gta ctg gcg aag tgc agc aag ggc atg gac 192 Lys Gln Ala Ile Ala Asp Val Leu Ala Lys Cys Ser Lys Gly Met Asp 50 55 60 ggc ctg gtg ctg tgc gcc ggc ctg gga ccg cag acc aag gtg ctt ggc 240 Gly Leu Val Leu Cys Ala Gly Leu Gly Pro Gln Thr Lys Val Leu Gly 65 70 75 80 aat gtg gtt tcg gtc aat tat ttt 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384 Leu Tyr Ile Ile His Phe Pro Met Ala Leu Gln Pro Gly Asp Ile Phe 115 120 125 ttc cca cga gat gag cat gga aaa cta ttg ttt gaa aca gtg gat atc 432 Phe Pro Arg Asp Glu His Gly Lys Leu Leu Phe Glu Thr Val Asp Ile 130 135 140 tgt gac aca tgg gag gcc atg gaa aag tgt aag gat gca gga ttg gcc 480 Cys Asp Thr Trp Glu Ala Met Glu Lys Cys Lys Asp Ala Gly Leu Ala 145 150 155 160 aag tct att ggg gtg tcc aac ttt aac tgc agg cag ctg gag agg att 528 Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Asn Cys Arg Gln Leu Glu Arg Ile 165 170 175 ctg aat aag cca ggg ctc aaa tac aag cct gtg tgc aac cag gtg gaa 576 Leu Asn Lys Pro Gly Leu Lys Tyr Lys Pro Val Cys Asn Gln Val Glu 180 185 190 tgt cac ctt tat ctc aac cag agc aaa atg ctg gac tat tgt aag tca 624 Cys His Leu Tyr Leu Asn Gln Ser Lys Met Leu Asp Tyr Cys Lys Ser 195 200 205 aaa gac atc att ctg gtt tcc tac tgc acg ctg gga agt tca cga gac 672 Lys Asp Ile Ile Leu Val Ser Tyr Cys Thr Leu Gly Ser Ser Arg Asp 210 215 220 aaa aca tgg gtg gat cag aaa agt cca gtt ctc cta gat 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Gly Thr Thr Val Pro Glu Lys Val Ala Lys Asp 20 25 30 Glu Val Ile Lys Ala Thr Lys Ile Ala Ile Asp Asn Gly Phe Arg His 35 40 45 Phe Asp Ser Ala Tyr Leu Tyr Glu Val Glu Glu Glu Val Gly Gln Ala 50 55 60 Ile Arg Ser Lys Ile Glu Asp Gly Thr Val Lys Arg Glu Asp Ile Phe 65 70 75 80 Tyr Thr Ser Lys Leu Trp Ser Thr Phe His Arg Pro Glu Leu Val Arg 85 90 95 Thr Cys Leu Glu Lys Thr Leu Lys Ser Thr Gln Leu Asp Tyr Val Asp 100 105 110 Leu Tyr Ile Ile His Phe Pro Met Ala Leu Gln Pro Gly Asp Ile Phe 115 120 125 Phe Pro Arg Asp Glu His Gly Lys Leu Leu Phe Glu Thr Val Asp Ile 130 135 140 Cys Asp Thr Trp Glu Ala Met Glu Lys Cys Lys Asp Ala Gly Leu Ala 145 150 155 160 Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Asn Cys Arg Gln Leu Glu Arg Ile 165 170 175 Leu Asn Lys Pro Gly Leu Lys Tyr Lys Pro Val Cys Asn Gln Val Glu 180 185 190 Cys His Leu Tyr Leu Asn Gln Ser Lys Met Leu Asp Tyr Cys Lys Ser 195 200 205 Lys Asp Ile Ile Leu Val Ser Tyr Cys Thr Leu Gly Ser Ser Arg Asp 210 215 220 Lys Thr Trp Val Asp Gln Lys Ser Pro Val Leu Leu Asp Asp Pro Val 225 230 235 240 Leu Cys Ala Ile Ala Lys Lys Tyr Lys Gln Thr Pro Ala Leu Val Ala 245 250 255 Leu Arg Tyr Gln Leu Gln Arg Gly Val Val Pro Leu Ile Arg Ser Phe 260 265 270 Asn Ala Lys Arg Ile Lys Glu Leu Thr Gln Val Phe Glu Phe Gln Leu 275 280 285 Ala Ser Glu Asp Met Lys Ala Leu Asp Gly Leu Asn Arg Asn Phe Arg 290 295 300 Tyr Asn Asn Ala Lys Tyr Phe Asp Asp His Pro Asn His Pro Phe Thr 305 310 315 320 Asp Glu

Claims

박테리아, 특히 콜린셀라 (Collinsella) 속, 예컨대 균주 콜린셀라 아에로파시엔스 (Collinsella aerofaciens) DSM 3979 (ATCC 25986)로부터 얻을 수 있으며, 겔 여과에 의해 결정된 분자량이 약 53 내지 60 kDa인 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나제 (7β-HSDH) 및 7β-HSDH로부터 유도된 기능적 등가물.
제1항에 있어서,
a) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-히드록시스테로이드로의 입체특이적 환원, 및/또는
b) 7-위치의 케토스테로이드의 상응하는 7β-히드록시스테로이드로의 부위특이적 수소화
를 촉매하는 7β-HSDH 또는 그로부터 유도된 기능적 등가물.
서열 2에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열에 대한 동일성 정도가 적어도 80%인 그로부터 유도된 서열을 포함하고, 겔 여과에 의해 결정된 분자량이 약 53 내지 60 kDa이고, 특히 적어도 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-히드록시스테로이드로의 입체특이적 환원을 촉매하는 7β-HSDH.
상응하는 7-케토스테로이드가 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서의 정의에 따른 7β-HSDH의 존재 하에 전환되고, 형성된 적어도 하나의 환원 생성물이 반응계로부터 임의로 단리되는 것인, 7β-히드록시스테로이드의 효소적 합성 방법.
제4항에 있어서, 환원되는 케토스테로이드가 데히드로콜산 (DHCA), 7-케토-리토콜산 (7-케토-LCA), 7,12-디케토-리토콜산 (7,12-디케토-LCA) 및 그의 유도체, 예컨대 특히 산의 염, 아미드 또는 알킬 에스테르로부터 선택되는 것인 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 환원이 NAD(P)H의 존재 하에 (및 이를 소비하면서) 일어나는 것인 방법.
히드록시스테로이드가 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서의 정의에 따른 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나제의 존재 하에 전환되고, 형성된 산화 생성물이 임의로 반응계로부터 단리되는 것인, 7β-히드록시스테로이드의 효소적 산화 방법.
제7항에 있어서, 7β-히드록시스테로이드가 3,12-디케토-7β-CA 또는 그의 유도체, 예컨대 특히 염, 아미드 또는 알킬 에스테르인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 산화가 NAD(P)⁺의 존재 하에 (및 이를 소비하면서) 일어나는 것인 방법.
제6항 또는 제9항에 있어서, 소비된 산화환원 등가물이 전기화학적으로 또는 효소적으로 재생되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 소비된 NAD(P)H가 NAD(P)H 데히드로게나제 및 특히 알콜 데히드로게나제 (ADH)로부터 선택된 NAD(P)H-재생 효소와 커플링됨으로써 재생되는 것인 방법.
제11항에 있어서, NAD(P)H-재생 효소가 천연 또는 재조합의, 단리된 또는 농축된 a) 알콜 데히드로게나제 (EC 1.1.1.2) 및 b) 그로부터 유도된 기능적 등가물로부터 선택되는 것인 방법.
a) 하기 화학식 2의 콜산 (CA)을 임의로 하기 화학식 3의 데히드로콜산 (DHCA)으로 화학적으로 산화하고,
b) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서의 정의에 따른 적어도 하나의 7β-HSDH의 존재 하에 DHCA를 하기 화학식 4의 3,12-디케토-7β-콜란산 (3,12-디케토-7β-CA)으로 환원하고,
c) 3,12-디케토-7β-CA를 적어도 하나의 3α-히드록시스테로이드 데히드로게나제 (3α-HSDH)의 존재 하에 하기 화학식 5의 상응하는 12-케토-우르소데스옥시콜산 (12-케토-UDCA)으로 환원하고, 이어서
d) 화학식 5의 12-케토-UDCA를 UDCA로 화학적으로 환원하고;
e) 반응 생성물을 임의로 추가로 정제하는,
하기 화학식 1의 우르소데스옥시콜산 (UDCA)의 생산 방법.
<화학식 1>

식 중,
R은 알킬, NR¹R², H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R³)₄ ⁺이고, 잔기 R³은 동일하거나 상이하고 H 또는 알킬을 나타낸다.
<화학식 2>

식 중, R은 상기한 의미를 갖는다.
<화학식 3>

식 중, R은 상기한 의미를 갖는다.
<화학식 4>

<화학식 5>

식 중, R은 상기한 의미를 갖는다.
제13항에 있어서, 단계 b) 및/또는 c)가 (특히 효소적) 보조인자 재생 단계와 커플링되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 단계 b)가, 사용되는 알콜을 소비하면서 알콜 데히드로게나제 (ADH)에 의해 NADPH를 재생하는 보조인자 재생 단계와 커플링되는 것인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 단계 c)가, 포르메이트를 소비하면서 포르메이트 데히드로게나제 (FDH)에 의해 NADH를 재생하거나 또는 사용되는 알콜을 소비하면서 알콜 데히드로게나제 (ADH)에 의해 NADPH를 재생하는 보조인자 재생 단계와 커플링되는 것인 방법.