CN111378703A - 一种(2s,3s)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种(2S,3S)‑2‑羟基‑4‑苯基丁烷衍生物的制备方法，将(3S)‑3‑(叔丁氧羰基)氨基‑1‑氯‑4‑苯基‑2‑丁酮、羰基还原酶和过量的异丙醇进行生物酶催化反应获得转化液，再经连续浓缩结晶获得目标产物结晶；该羰基还原酶通过定向突变具有高浓度异丙醇耐受的特点，从而实现过量异丙醇对底物增溶，进而增加底物投量，提高了转化率，产品收率不低于95%，手性纯度不低于99.95%。本发明对转化液通过连续浓缩结晶，获得的产物结晶度95%以上，晶体均一，杂质纯度不低于99.95%，含量不低于99%。

Description

一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法

技术领域

本发明涉及生物酶催化工艺领域，具体地说涉及一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法。

背景技术

非肽类HIV蛋白酶抑制剂（PI），是治疗HIV首选药物，如沙奎那韦、奈非那韦、福沙那韦、地瑞那韦等，例如地瑞那韦可通过阻断从受感染的宿主细胞表面释放新的、成熟的病毒粒子的形成过程，抑制病毒的蛋白酶而起作用，2006年6月，FDA批准地瑞那韦与其他抗逆转录病毒药物联合用于治疗HIV感染的成年患者，2007年3月地瑞那韦在欧盟的27个成员国上市。

上述化合物的核心结构都为(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物结构。例如地瑞那韦主要通过式III化合物（化学名称：(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷）为中间体制备得到，该分子结构复杂，化学合成污染严重且难度较高。该结构存在两个手性中心，其中一个手性中心来源于天然的苯丙氨酸，另一个手性中心可将前手性的酮还原成手性醇，从而引入BOC-环氧化物上的第二个手性中心。若引入的第二个手性中心为R构型，则产物为(2R,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷，该构型为RS型，是合成阿扎那韦重要中间体；若引入的第二个手性中心为S构型，则产物为式III化合物，该构型为SS型。

目前(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷主要通过化学反应制备得到。欧洲专利EP1081133B1（优先权日1999年8月31日）公开了以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为原料，采用三叔丁氧基氢化铝锂或二异丁基氢铝等铝盐还原，收率为92%。上述化学合成方法均存在污染严重、溶剂回收困难、反应条件苛刻等问题。

生物催化法合成具有反应操作简单、成本低、条件温和、能耗小、环境友好和产品光学纯度高等优势，因此受到越来越多的关注，羰基还原酶类(EC1.1.1.184)的某些酶可用于立体选择性转化前立体异构的醛或酮底物为对应的手性醇产物，还可以催化逆反应，即醇底物被氧化为相应的酮/醛产物。因此合理利用生物催化方法，可将式IV化合物还原为式III化合物，进而用于后续的药物合成。

生物酶催化反应对酮和醛的还原以及醇的氧化需要辅因子，其中最常见的为NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）以及用于氧化反应的NAD⁺（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和NADP⁺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。NADH和NADPH充当电子供体，而NAD⁺和NADP⁺充当电子受体。由于辅因子成本较高，通常可选用葡萄糖或异丙醇作为电子供体驱使辅因子循环，而葡萄糖或异丙醇被氧化为相应的葡萄糖酸或丙酮，而酮底物一般被还原为相应的目的醇产物。

中国专利CN102482648B公开了选用来源于Novosphingobium aromaticivorans羰基还原酶基因构建工程菌催化(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，底物浓度100g/L，收率大于95%，产物非对映体过量de大于99.9%，但该专利只提供了制备RS构型的技术，而非SS构型。对于SS构型的生物制备，中国专利CN104745649A公开了采用(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，底物投加浓度为50g/L，通过助溶剂和表面活性剂助溶，促进转换体系流动性，增加底物与酶接触面积，若不加助溶剂，转化体系流动性变差，进而影响转化率。但该专利为了助溶，体系内容额外添加的甲苯、吐温60等物质不利于产品最后分离提纯，因此产品纯度只有99%。中国专利CN104745649A同样公开了SS构型的生物酶制备方法，但该方法的转化体系选用葡萄糖作为供氢体系，底物浓度100g/L，反应体系几乎全为水相，由于底物及SS构型产物均难溶于水，随着投加底物浓度的提高，且不加助溶剂，体系流动性会逐渐变差，转化率逐渐下降，进而限制底物浓度投加量，且反应结束体系中含有副产物葡萄酸盐，给产物分离纯化带来困难，难以用于工业化生产。

综上，目前本领域以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物通过生物酶催化技术制备(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物，底物浓度投加量因溶解性问题一般无法超过100g/L，或需要额外增加助溶剂使体系带入其他杂质，进而影响SS构型产物分离纯化及纯度，复杂的生产工艺也提高了生产成本。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种利用特定羰基还原酶生物催化制备(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物并进一步浓缩结晶的方法。

技术方案：一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，将底物、羰基还原酶和过量的有机溶剂在含有再生供氢辅因子的缓冲液中进行生物酶催化反应获得转化液，再经连续浓缩结晶获得目标产物结晶；

所述底物为式（I）所示化合物，所述目标产物为式（II）所示化合物，其中，式（I）和式（II）中的R为相同的氨基保护基团；

其中，所述羰基还原酶与SEQ ID No.1所示氨基酸序列的同源性不低于95%；所述有机溶剂在反应体系的浓度为15-60% (m/V)。

本发明的羰基还原酶是通过对CX-LAC II菌株的基因进行定点突变获得的。经定点突变，该酶不仅具有优秀的羰基还原特性，还具有高浓度有机溶剂耐受的效果。利用相应的酶液进行生物催化反应，可将底物和原料浓度提升至超过现有技术的上限，进而显著提高了转化率。CX-LAC II菌株于2020年2月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CGMCC)，保藏编号NO.19432，经鉴定为谷糠乳杆菌（Lactobacillus farraginis），兼性厌氧，在MRS固体培养基，菌落凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形，直径为3.0 mm±1.0 mm。 显微镜下，革兰氏染色阳性，一般呈短杆状，排成链，通常不运动。CX-LAC II含有基因序列如SEQID No.3所示。所述的定点突变包括对CX-LAC II氨基酸序列第8位、第173位、第190位、第226位的氨基酸进行定向突变。具体地说，是将第8位的K突变为N，第173位的D突变为E，第190位的Y突变为P，第226位的I突变为N。

所述羰基还原酶氨基酸序列与目前已知的乳杆菌属羰基还原酶（Lactobacillussp.）的同源性在80%左右。定点突变时保留辅酶结合域保守序列GATLGIG（CXP II氨基酸序列第14-20位）及催化保守序列YNASK（CXP II氨基酸序列第156-160位）。同时，需保留190-220位氨基酸残基，该区域在蛋白结构中形成环状结构，可用于与底物结合环。除此之外，对其他非关键位点进行突变获得的羰基还原酶，在与SEQ ID No.1所示氨基酸序列同源性不低于99%的情况下，都具备显著的酶催化效率和高浓度有机溶剂耐受的特性。

本发明的目标产物化合物（II）是式（I）底物被上述羰基还原酶转化获得的。式（V）进一步展示了底物在羰基还原酶和NADH/NADPH作为供氢体的作用下，将底物中羰基还原为羟基并产生再生供氢辅因子NAD⁺/NADP⁺，摩尔浓度为0.1~1.0 mmol/L。本发明所述的有机溶剂为异丙醇、乙醇、正丁醇的任意一种或多种的组合；优选为异丙醇。异丙醇作为供氢体在酶催化作用下被氧化丙酮，并伴随NADH/NADPH生成，从而实现辅因子再生循环。

基于上述方案进行的生物酶催化反应，将有机溶剂在反应体系的浓度控制为20-50% (m/V) ，所述底物的投料浓度得以进一步提高至100~400g/L，生物催化反应24小时的转化率一般不低于95.0%，所述目标产物的de值一般不低于99.5%。

优选地，所述羰基还原酶与底物的质量比为0.03~0.1:1，所述羰基还原酶催化反应的温度为35-45℃，缓冲液的pH为7~9。更优选地，所述羰基还原酶催化反应的温度为25-50℃，优选反应温度为30-45℃，反应体系的缓冲液优选为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。

更优选地，所述有机溶剂选用异丙醇，底物的投料浓度为80~200g/L，生物催化反应24小时的转化率不低于99.0%，所述目标产物的de值不低于99.9%。

所述缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液，摩尔浓度为50~200 mmol/L，pH为8.0。

反应体系中还加入0.01~0.05mol/L的镁离子。用于提高酶催化活力。提供镁离子的试剂可选用包括但不限于硝酸镁、氯化镁、硫酸镁的任意一种或多种的组合，优选用硫酸镁。

本发明所述的氨基保护基团选自包括但不限于叔丁基羰基、苄氧羰基、芴甲氧羰基、烯丙氧羰基、三甲基硅乙氧羰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、邻(对)硝基苯磺酰基、苯甲酰基、三苯甲基、2,4-二甲氧基苄基的任意一种。

作为优选的实施方式，加入底物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮、过量的异丙醇，于35-45℃搅拌，然后加入缓冲液（pH 7.0~9.0），0.01~0.05mol/L的镁离子试剂，0.1-1.0 mmol/L NAD+/NADP+，再加入羰基还原酶开始反应。其中，底物的投料浓度为100~400g/L，羰基还原酶与底物的质量比为0.03~0.1:1，异丙醇浓度为15~60% (m/V)。反应24小时后获得转化液，经检测转化率不低于99%，目标产物de值不低于99.5%。

在更优选的实施方式中，加入底物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮、过量的异丙醇于40℃搅拌，然后加入磷酸钾或磷酸钠缓冲液（pH 8.0），0.02mol/L 镁离子试剂，0.1-1.0 mmol/L NAD+/NADP+，再加入羰基还原酶开始反应。底物的投料浓度为200g/L，羰基还原酶与底物的质量比为0.05:1，异丙醇浓度为50% (m/V)，反应24小时后获得转化液，经检测转化率可达99.5%，目标产物de值可达为99.9%。

为了获得结晶度更高、纯度更高的目标产物(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1–氯-2-羟基-4-苯基丁烷结晶，本发明通过以下步骤进行连续浓缩结晶：

（1）向转化液中加入水，将有机相析出的产物离心，得到粗品；

（2）将粗品用甲醇复溶，40-50℃恒温下过滤，取清液经降膜蒸发器连续浓缩结晶；连续浓缩结晶的初始料液温度为40-48℃，当有晶体析出时将料液温度降为34-38℃；

（3）降膜蒸发后离心过滤获得目标产物结晶，母液回收到降膜蒸发器内继续浓缩结晶。

本发明反应体系的底物浓度和丙酮酸浓度均显著高于现有技术，因此通过加入总体系20-30%的水，使得溶解于异丙醇中的产物完全析出。经过两次不同温度下的浓缩结晶，获得的目标产物结晶的结晶度不小于95%，纯度不低于99.95%，含量不低于99%。

另外，待大量晶体析出时，可以经离心机过滤得到晶体，同时母液经过精密过滤器继续回到降膜浓缩设备内浓缩结晶。待体积较少时可以结束浓缩。同时浓缩得到的甲醇，可以给下批溶解使用。

本发明通过对CX-LAC II菌株进行定点突变，利用该菌株发酵获得的生物酶对高浓度异丙醇耐受的特点，提高了底物在体系中的投量，特别适用于基于高浓度异丙醇生物酶催化制备地瑞那韦中间体的工艺。高浓度的异丙醇一方面可作为辅因子供氢体用于辅因子循环再生，另一方面可充当助溶剂，进一步提高底物投加浓度。

本发明的制备方法提高了有机醇溶剂的浓度，因此无需引入其他助溶剂等杂质，使整个生产过程操作方便、产物分离更简单。酶催化结束后的转化液利用连续浓缩结晶的方式获得高手性纯度以及高杂质纯度的优质产品，手性纯度不低于99.95%，产品收率不低于95%。

本发明相对于化学合成方法提高了工作效率，减少了污水排放，结合浓缩结晶工艺获得结晶度95%以上，晶体均一，杂质纯度不低于99.95%，含量不低于99%的产品。

附图说明

图1为实施例1羰基还原酶CXP I氨基酸序列与其他代表性羰基还原酶的对比图；

图2为实施例1构建的pET-28a(+)-CX I质粒图谱；

图3为实施例1的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-CX I诱导表达后还原酶CXP I粗酶液的SDS-PAGE电泳图；

图4为实施例7反应6 h液相图谱；

图5为实施例7反应24 h液相图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明，需要说明的是，具体实施方式所述的异丙醇浓度采用质量体积百分比 (m/V)，单位为kg/L。

实施例1

羰基还原酶CXP I，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，含253个氨基酸组成的多肽链，通过对CX-LAC II菌株的基因进行定点突变获得的。

CX-LAC II菌株于2020年2月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号NO.19432，经鉴定为谷糠乳杆菌（Lactobacillusfarraginis），兼性厌氧，在MRS固体培养基，菌落凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形，直径为3.0 mm±1.0 mm。 显微镜下，革兰氏染色阳性，一般呈短杆状，排成链，通常不运动。CX-LAC II含有基因序列CX II如SEQ ID No.3所示。

对CX II的基因序列进行定点突变设计，将其第24位的碱基A突变为T，第519位的碱基T突变为A，第568-570位的碱基TAT突变为CCG，第678位的碱基T突变为A，获得如SEQ IDNo.2所示的编码羰基还原酶CXP I的基因序列CX I。然后委托杭州擎科生物进行基因合成，并进行密码子优化，获得CX I和CX II。

通过NCBI数据库的对比，本发明羰基还原酶的氨基酸序列与目前已知的乳杆菌属羰基还原酶（Lactobacillus sp.）的同源性在80%左右，请参考图1所示，图1展示了CXP I氨基酸序列与NCBI数据库中其他代表性羰基还原酶的区别，其中，“Lactobacillus”来自NCBIReference Sequence: WP_035179998.1；PDB:1NFR_A、PDB:1ZJY_A、PDB:2HSD_A来自PDB数据库。进一步分析可知CXP I与其他羰基还原酶均具有典型的短链脱氢酶家族的2个功能域：辅酶结合域保守序列GXXXGXG及催化保守序列YXXXK（“X”代表任意一种氨基酸），可预期其具备羰基还原的效果。

分别将上述CX I和CX II基因分别连接在pET-28a(+)载体上，获得对应的重组质粒。图2展示了pET-28a-CX I重组质粒的图谱。将2μL重组质粒溶液加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行转化，冰浴30分钟后，45℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟后将菌液均匀地涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养及平板上，37℃培养18小时后挑取单克隆菌落至4mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，220 rpm培养12小时，获得对应的羰基还原酶表达菌株。

分别将两个表达菌株接入各自的4mL含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，37℃，180 rpm培养12小时后，将菌液全部接种至600mL TB液体培养基中，37℃，180 rpm培养至OD600至2左右，加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导，25℃诱导16h。然后5000 rpm离心20分钟收集含羰基还原酶的菌体，将30g菌体用70g磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）重悬，超声破碎后即得到羰基还原酶粗酶液CXP I、CXP II。

将上述粗酶液稀释适当倍数，与5×样品缓冲液以4:1（体积比）的比例混合后，100℃水浴中加热3-5min，使蛋白质充分变性，加样电泳。电泳完毕后，凝胶经染色脱色步骤获得酶蛋白电泳凝胶图。图3为大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-CX I诱导表达后还原酶CXPI粗酶液的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准品，1号是诱导前的破碎上清液，2号是诱导后的破碎上清液，蛋白大小约29 kDa，与理论值相符；

实施例2

以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，利用实施例1获得的羰基还原酶粗酶液进行酶活实验，配制反应体系如下：50 mL体系：加入1g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，加入不同浓度异丙醇，40℃搅拌，加入2.4 g硫酸镁，130 mgNAD⁺，用磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0）定容至50 mL，加入1g粗酶液。反应24 h，高效液相色谱HPLC检测转化率及de值。结果如表1所示，可见CXP I 在60% (m/V)异丙醇浓度下可正常转化至底物几乎耗尽，且产物de值较高。而一般的羰基还原酶虽也表现出优秀的de值，但在异丙醇浓度超过40% (m/V)时活性显著降低，导致转化率大幅下降甚至被酶活被完全抑制。

注：表中每格数据表示“转化率%/de值%”；“-”表示未检测；“-de值%”表示产物主要构型为RS型。

实施例3

本发明通过提供具备高浓度醇溶液耐受的羰基还原酶，从而提高了体系中异丙醇的投入量，其作为优秀的底物溶剂和辅因子再生循环的供氢体，可进一步提高底物浓度，促使转化率突破现有技术的极限，得以进一步提高。

在1L催化体系中，加入80g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，2.4g硫酸镁，60g葡萄糖，130 mg NAD⁺，再用碳酸钠溶液将pH调至7.0，40℃搅拌，加入20 g葡萄糖脱氢酶，4 g上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，开始反应。反应用碳酸钠溶液维持pH 7.5左右，反应40h后，经检测反应体系中的仍残酸70%底物，转化率只有30%。

转化过程中发现随着反应进行，由于底物和产物均难溶于水，后期体系中转化液流动性极差，难以搅拌，底物与酶接触面积变小，可能导致转化率偏低，因此考虑加入助溶剂。

如在前述反应体系的基础上，进一步15%(m/V)不同类型的助溶剂（乙酸乙酯、吐温80、甲苯、DMSO、异丙醇其中一种）。反应用碳酸钠溶液维持pH 7.5左右，反应24h后，经检测加入乙酸乙酯和异丙醇反应体系效果最好，加入异丙醇体系转化率为51%，乙酸乙酯体系转化率55%，但上述两组反应24 h仍残留较多底物。

转化过程中发现随着反应进行，由于底物和产物均难溶于水，且随着反应进行中需适时补加碳酸钠溶液以维持pH，使水相体积进一步扩大，同时稀释助溶剂浓度，因此仍有较多底物残留。采用高浓度异丙醇显然要比葡萄糖更适合作为辅因子供氢。

实施例4

在1L催化体系中，加入80g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，200 g异丙醇，40℃搅拌，加入750 g磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0），2.4 g硫酸镁，130 mgNAD⁺或NADP⁺，加入4 g上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，以及0.5%(v/v)乙酸乙酯，开始反应。反应24h后，经检测转化体系转化率为99.5%，产物de值大于99.9%。

实施例5

在1L催化体系中，加入200 g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，200 g异丙醇，40℃搅拌，加入750 g磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0），2.4 g硫酸镁，130mg NAD⁺或NADP⁺，加入10 g上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，开始反应。反应30h后，经检测转化体系转化率为54.9%，产物de值大于99.9%。通过对比实施例5与实施例6可知，将底物浓度提高到200 g/L，20%异丙醇助溶效果明显变差，导致底物转化率偏低。

实施例6

在1L催化体系中，加入200 g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，500 g异丙醇，40℃搅拌，加入450 g磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0），2.4 g硫酸镁，130mg NAD⁺或NADP⁺，加入10 g上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，开始反应。反应24h后，经检测底物转化率为99.5 %，产物de值大于99.9%。由此可知将异丙醇浓度提高至50%(m/V)，底物几乎耗尽。

实施例7

在1000L催化体系中，加入200 kg (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，500 kg异丙醇，40℃搅拌，加入450 kg磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0），2.4 kg硫酸镁，130 g NAD⁺或NADP⁺，加入10 kg上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，开始反应。图4为反应6 h液相图谱，图5为反应24 h液相图谱。反应24 h后，经检测转化体系转化率为99.5%，产物de值大于99.9%。

实施例8

取实施例6的酶催化液，经过离心机离心得到粗品，将粗品用甲醇进行溶解，再经过过滤，得到的清液采取连续浓缩结晶的方式，在浓缩至大量晶体析出时，浓液直接经过离心机过滤得到精品，同时母液经过精密过滤器再回至浓缩罐里继续浓缩结晶。最后产品烘干得到193 kg，收率为96%。经检测，手性纯度为99.96%，杂质纯度为99.95%，含量为99.3%

反应结束后，加入总体系20-30%的水，使得溶解于异丙醇中的产物完全析出。开始离心，得到粗品。该粗品再用甲醇溶解，温度在40-50度下，过滤去除少量残留的酶渣以及其他异物，清液经降膜连续浓缩结晶。该步骤具体为：选用的设备为降膜浓缩设备，初始料液温度控制在40-48度，当有晶体析出时，料液温度降为34-38度，待大量晶体析出时，可以经离心机过滤得到晶体，同时母液经过精密过滤器继续回到降膜浓缩设备内浓缩结晶。待体积较少时可以结束浓缩。同时浓缩得到的甲醇，可以给下批溶解使用。经过该方法，提高了工作效率，减少了污水排放，得到的产品结晶度达到95%以上，晶体均一。经检测中间体手性纯度不低于99.95%，杂质纯度不低于99.95%，含量不低于99%，产品收率不低于95%。

序列表

<110> 长兴制药股份有限公司

<120> 一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法

<141> 2020-03-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 252

<212> PRT

<213> Lactobacillus farraginis

<400> 1

Met Ser Asn Arg Leu Lys Gly Asn Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Val Ala His Arg Phe Val Asp Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Asn Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Glu Pro

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Pro Asp Val Ile Arg Phe Ile Gln Gln Cys Ala

50 55 60

Ser Glu Gly Ala Gly Trp Val Lys Thr Trp Asp Glu Thr Glu Gln Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Arg Thr Val Val Asn His Ala Gly Ile Phe Val Asn

85 90 95

Lys Ser Val Glu Asn Thr Thr Glu Glu Glu Trp Arg Lys Asn Leu Ser

100 105 110

Val Asn Asn Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys His Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Asn Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Asn Met Ser Lys Ser Ser Ala Val Glu Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Gly Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Pro Gly Ala Glu Glu Ala Asn Ser Ala

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Asn Ile His Ile Gly Glu Pro Asp Met Ile Ala

210 215 220

Trp Asn His Cys Val Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ser Glu Phe Thr Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 2

<211> 759

<212> DNA

<213> Lactobacillus farraginis

<400> 2

atgagtaatc gtctgaaagg caatgtagca attgtaactg gcgcaaccct gggtattggc 60

ctggcagtcg ctcatcggtt tgttgatgaa ggcgcaaagg ttaatattac cggccgtcac 120

gctgatgtag gtgaaaaaga accgaaatca atcggcggcc ctgacgttat ccgttttatc 180

caacagtgtg cgtctgaagg agccggctgg gttaagacgt gggatgagac tgaacaagca 240

tttggcccag ttcgcacggt tgtcaaccat gccggtattt tcgtcaataa gagtgttgaa 300

aataccacag aggaagaatg gcgcaagaat ctgtcagtta acaatgatgg tgtcttcttc 360

ggtacccgtc tgggtatcca acgtatgaag aataaacatc tgggtgcatc aatcatcaat 420

atgtcatcta tcgaaggttt tgttggtgat ccaaatctcg gtgcatacaa tgcttcaaaa 480

ggtgctgtcc gtaatatgtc taaatcatct gccgtggaat gcgctctgaa ggactacggt 540

gttcgcgtta acactgttca tccaggtccg atcaagacac cgctggtgga cgatctgccg 600

ggcgcagaag aagcgaattc agcgcgcacc aagacaccaa atattcatat cggtgaacct 660

gatatgatcg cttggaatca ttgtgtcctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720

agcgaattca ccgtcgatgg tggttacact gctcaataa 759

<210> 3

<211> 759

<212> DNA

<213> Lactobacillus farraginis

<400> 3

atgagtaatc gtctgaaagg caaagtagca attgtaactg gcgcaaccct gggtattggc 60

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Claims (12)

1.一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：将底物、羰基还原酶和过量的有机溶剂在含有再生供氢辅因子的缓冲液中进行生物酶催化反应获得转化液，再经连续浓缩结晶获得目标产物结晶；

所述底物为式（I）所示化合物，所述目标产物为式（II）所示化合物，其中，式（I）和式（II）中的R为相同的氨基保护基团；

其中，所述羰基还原酶与SEQ ID No.1所示氨基酸序列的同源性不低于95%；所述有机溶剂在反应体系的浓度为15-60% (m/V)。

2.根据权利要求1所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述羰基还原酶来源于谷糠乳杆菌（Lactobacillusfarraginis），且与SEQ ID No.1所示氨基酸序列的同源性不低于99%。

3.根据权利要求1或2所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为异丙醇、乙醇、正丁醇的任意一种或多种的组合。

4.根据权利要求3所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂在反应体系的浓度为20-50% (m/V) ，所述底物的投料浓度为100~400g/L，生物催化反应24小时的转化率不低于95.0%，所述目标产物的de值不低于99.5%。

5.根据权利要求4所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述羰基还原酶与底物的质量比为0.03~0.1:1，所述羰基还原酶催化反应的温度为35-45℃，缓冲液的pH为7~9。

6.根据权利要求5所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为异丙醇，底物的投料浓度为80~200g/L，生物催化反应24小时的转化率不低于99.0%，所述目标产物的de值不低于99.9%。

7.根据权利要求4-6任意一项所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述再生供氢辅因子为NAD⁺/NADP⁺，摩尔浓度为0.1~1.0 mmol/L。

8.根据权利要求4-6任意一项所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液，摩尔浓度为50~200 mmol/L，pH为8.0。

9.根据权利要求4-6任意一项所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：反应体系中还加入0.01~0.05mol/L的镁离子。

10.根据权利要求4-6任意一项所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述氨基保护基团选自叔丁基羰基、苄氧羰基、芴甲氧羰基、烯丙氧羰基、三甲基硅乙氧羰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、邻(对)硝基苯磺酰基、苯甲酰基、三苯甲基、2,4-二甲氧基苄基。

11.根据权利要求1所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于，所述连续浓缩结晶的步骤是：

（1）向所述转化液中加入水，将有机相析出的产物离心，得到粗品；

（2）将粗品用甲醇复溶，40-50℃恒温下过滤，取清液经降膜蒸发器连续浓缩结晶；连续浓缩结晶的初始料液温度为40-48℃，当有晶体析出时将料液温度降为34-38℃；

（3）降膜蒸发后离心过滤获得目标产物结晶，母液回收到降膜蒸发器内继续浓缩结晶。

12.根据权利要求11所述的一种地瑞那韦中间体的生物制备方法，其特征在于：所述目标产物结晶的结晶度不小于95%，纯度不低于99.95%，含量不低于99%。

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