CN116083409A - 一种酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用 - Google Patents

一种酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酮糖3‑差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用，属于固定化酶制备技术领域，本发明分为以下步骤：第一步，对阴离子交换树脂进行预处理；第二步，离子交换树脂吸附蛋白酶；第三步，加入戊二醛进行交联。本发明制备的固定化酶制备简单，价格低廉，反应条件简单温和。固定化提高了酶的相对活性和稳定性，制备得到的固定化酶结合牢靠，可进行多次酶催化反应。这一发现对于工业化制备D‑阿洛酮糖具有重要的研究价值。

Description

一种酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用，属于固定化酶制备技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖(D-allulose)，在分类上属于己酮糖，是自然界存在但分布极为稀少的低能量功能性糖之一。D-阿洛酮糖表现出一定的甜度，没有苦味，口感与蔗糖相似，在以蔗糖为100的甜度值参比时，D-阿洛酮糖的甜度值约为70。根据美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)的指导文件(FDA-2019-D-0725)，D-阿洛酮糖提供的膳食能量值仅为0.4kcal/g。由于低能量、高甜度的特点，D-阿洛酮糖可以作为一种新型甜味剂种类，在制造糖果、甜点、面包等食品加工方面显示出巨大的潜力。此外，D-阿洛酮糖可用于美拉德过程反应中获得类似焦糖的产品，并在不同pH条件下均能保持较为稳定的状态。研究发现，当反应混合物的初始pH值为4.0和6.0时，最终的D-阿洛酮糖的浓度没有发生变化；当初始pH值设定为7.5时，D-阿洛酮糖的保留率为91.3％，这表明D-阿洛酮糖在正常的烹饪和生产条件下的稳定性。尽管D-阿洛酮糖在人体内不能被代谢生成能量，但表现出许多独特的生理功能。Hossain等人发现D-阿洛酮糖通过与同样需要葡萄糖转运蛋白作为运输载体的D-葡萄糖和D-果糖形成竞争性抑制，可以部分抑制D-葡萄糖和D-果糖的摄取。Braunstein等研究发现D-阿洛酮糖可以通过抑制肠道的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活力，并促进葡萄糖激酶在肝脏中将葡萄糖转化为糖原，从而显著改善进餐后体内葡萄糖水平。Pongkan等研究发现D-阿洛酮糖可以保护小鼠提升胰岛素调节能力，并通过减少心脏线粒体功能障碍来提供心脏保护作用。Moon等研究发现D-阿洛酮糖能够有效抑制脂肪细胞分化和肝脏生脂酶活性，减少脂肪积累，降低肥胖症的发生概率。Kimura等人研究报道表明，D-阿洛酮糖可以调节脂质代谢和脂肪生成相关的基因表达，通过增加脂肪酸氧化从而增强能量代谢。此外，D-阿洛酮糖还通过降低炎症细胞因子的水平显示出抗炎作用。Kanasaki等人发现D-阿洛酮糖可以通过减少仓鼠血清PCSK9蛋白来调节胆固醇代谢，并提高肝细胞对高密度脂蛋白胆固醇的吸收。D-阿洛酮糖在生理研究中表现出多种功能特性，为其进一步的应用研究奠定理论基础。
据Izumoring稀有糖转化策略，酮糖3-差向异构酶(KEase)在D-阿洛酮糖生物转化中起着不可替代的作用，可以催化D-果糖在C-3位置发生可逆的差向异构化反应生成D-阿洛酮糖。目前，对于酮糖3-差向异构酶的研究已经较为广泛，包括微生物筛选鉴定、酶的分离纯化、异源重组表达、酶固定化、食品级表达、分子改造和晶体结构解析。生产D-阿洛酮糖的下游研究中，生产成本的控制至关重要，酮糖3-差向异构酶的固定化、D-阿洛酮糖的分离纯化、低成本原料的探索是其中的技术重点。
游离酶存在着不能反复使用、稳定性差等缺陷，固定化酶和固定化细胞技术逐渐进入人们的视野。目前关于酮糖3-差向异构酶的固定化报道中，或者操作复杂、或者固定酶活不高、或者不易从反应体系分离等问题制约了固定化酶在实际工业生产中的应用。因此，制备一种操作简单、稳定性强、易于分离、重复利用率高的固定化酮糖3-差向异构酶来适应工业化生产是目前需要解决的问题。
发明内容
生产D-阿洛酮糖的下游研究中，生产成本的控制至关重要，酮糖3-差向异构酶的固定化、D-阿洛酮糖的分离纯化、低成本原料的探索是其中的技术重点。游离酶存在着不能反复使用、稳定性差等缺陷，固定化酶和固定化细胞技术逐渐进入人们的视野。目前关于KEase的固定化报道中，或者操作复杂、或者固定酶活不高、或者不易从反应体系分离等问题制约了固定化酶在实际工业生产中的应用。因此，制备一种操作简单、稳定性强、易于分离、重复利用率高的固定化酮糖3-差向异构酶来适应工业化生产是目前需要解决的问题。
本发明提供一种以阴离子交换树脂为载体的酮糖3-差向异构酶的固定化方法，这一发现对于工业化制备D-阿洛酮糖及酮糖3-差向异构酶的工业化应用有重要的现实意义。
为了解决上述存在的技术问题，本发明提供一种以阴离子交换树脂为载体的酮糖3-差向异构酶的固定化方法。
本发明的目的是提供一种以阴离子交换树脂为载体的酮糖3-差向异构酶的固定化方法，并进一步提供固定化酮糖3-差向异构酶在D-阿洛酮糖生产中的应用。
本发明提供了一种固定酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、将Labedella endophytica来源的酮糖3-差向异构酶添加至含有经预处理后的离子交换树脂的反应体系中进行吸附；
所述预处理后的离子交换树脂的处理方法为：(1)用乙醇浸泡树脂12～24h，弃杂液，并用体积分数为10～15％的氯化钠溶液浸泡10～15h，再用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；(2)以体积分数为2～5％的氢氧化钠溶液浸泡步骤(1)处理后的树脂10～15h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；(3)再以体积分数为2～5％的盐酸溶液浸泡步骤(2)处理后的树脂10～15h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性。
b、加入戊二醛交联剂对酶进行交联后得到固定化酮糖3-差向异构酶。
在本发明的一种实施方式中，所述离子交换树脂为：D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
在本发明的一种实施方式中，所述预处理后的离子交换树脂的处理方法为：
(1)用两倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，并用体积分数为10％氯化钠溶液浸泡12h，再用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；
(2)以体积分数为5％的氢氧化钠溶液浸泡步骤(1)处理后的树脂12h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；
(3)再以体积分数为2％的盐酸溶液浸泡树脂12h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；
经预处理的树脂用两倍树脂体积的去离子水浸泡，存放于4℃冰箱中备用；使用时将树脂抽滤擦干。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的总体积为2～4mL，将反应体系在15～37℃摇床吸附2～9h，置于2～8℃静置10～30min后，加入终浓度为0.005～0.1％的戊二醛进行交联，置于2～8℃交联1～8h；弃上清液，用去离子水洗涤，真空抽滤得到固定化酮糖3-差向异构酶，于4℃保存备用。
在本发明的一种实施方式中，酶的固定化步骤为：(1)取树脂0.5g，加入来源微生物Labedella endophytica的粗酶液0.5mL，加酶量为0.4mg蛋白/g树脂，终浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。
在本发明的一种实施方式中，固定化体系总体积为2mL。在18℃摇床吸附2h，置于4℃静置30min，加入终浓度为0.01％的戊二醛进行交联，置于4℃交联1h。
在本发明的一种实施方式中，固定化后弃上清，用去离子水将树脂洗净，置于4℃冰箱保存，备用。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中还含有终浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。
在本发明的一种实施方式中，所述酮糖3-差向异构酶在反应体系中的添加量为：0.2～6.0mg蛋白/g树脂。
在本发明的一种实施方式中，所述酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列在NCBI上的编号为WP_127049469.1。
在本发明的一种实施方式中，编码所述酮糖3-差向异构酶的核苷酸序列在NCBI上的编号为NZ_RZGZ01000002.1(1271830..1272699)。
本发明还提供采用上述固定酮糖3-差向异构酶的方法制备得到的固定化酮糖3-差向异构酶。
本发明还提供上述固定酮糖3-差向异构酶的方法，或得到的上述固定化酮糖3-差向异构酶在制备含D-阿洛酮糖或含D-阿洛酮糖的产品中的应用。
本发明还提供所述的固定化酮糖3-差向异构酶在医药生产、食品领域的应用。
有益效果
(1)本发明提供的固定化酮糖3-差向异构酶，加工工艺简单、成本低廉、活性损失小、效率很高、性质稳定、可重复使用；
(2)本发明提供的固定化方法，固定化酮糖3-差向异构酶的耐热性提高，pH稳定性增强；
(3)使用本发明的固定化酮糖3-差向异构酶可以重复利用，避免了载体的浪费；
(4)实验表明，本发明所得到的固定化酶可以以果糖为底物转化为D-阿洛酮糖。
附图说明
图1：固定化酮糖3-差向异构酶吸附pH优化图。
图2：固定化酮糖3-差向异构酶吸附温度优化图。
图3：固定化酮糖3-差向异构酶吸附时间优化图。
图4：固定化酮糖3-差向异构酶戊二醛浓度优化图。
图5：固定化酮糖3-差向异构酶交联时间优化图。
图6：固定化酮糖3-差向异构酶与粗酶液最适pH图。
图7：固定化酮糖3-差向异构酶与粗酶液热稳定性图。
图8：固定化酮糖3-差向异构酶重复利用次数图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB培养基：1％(w/v)的氯化钠，1％(w/v)的胰蛋白胨，0.5％(w/v)的酵母提取物，121℃灭菌20min，备用。使用前加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素(Amp)。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
粗酶液的酶活检测：
以50g/L的D-果糖为底物，加入0.5μmol/L的粗酶，1mmol/L CoCl2，在80℃，pH 6.0条件下酶反应5min，煮沸10min灭活。反应结束后，将产物离心过膜，稀释到一定浓度后使用HPLC进行检测。
固定化酶的酶活检测：
以50g/L的D-果糖为底物，加入0.25g的固定化酶，1mmol/L CoCl2，在80℃，pH 6.0条件下酶反应5min，取上清液煮沸10min灭活。反应结束后，将产物离心过膜，稀释到一定浓度后使用HPLC进行检测。
酶活定义(U)：标准反应条件下，单位时间(min)催化合成1μmol D-阿洛酮糖所需的酶量。酶活回收率＝固定化酶比酶活/粗酶液比酶活*固定化酶加酶量*100％。
实施例1:Labedella endophytica来源的KEase表达制备方法
(1)重组载体pET-22b(+)-Laen的制备
合成来源于L.endophytica来源的KEase的基因片段，由此获得重组质粒，以pET-22b(+)为KEase目的基因表达载体，Xho I和Nde I作为限制性酶切位点，将目的基因片段插入到载体中，得到pET-22b(+)-Laen重组质粒。
(2)重组菌的构建
将重组载体pET-22b(+)-Laen转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，制备得到E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-Laen。
(3)重组菌发酵产酶
挑取步骤(2)中的阳性转化子，在LB培养基中37℃、200rpm摇培12h，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按照0.01％的接种量接入LB培养基中，在37℃条件下培养3-4h，至OD值为0.6～0.8，降温至30℃，加入IPTG终浓度为1.0mM诱导6h，制备得到发酵液。
(4)粗酶液的制备
将步骤(3)得到的发酵液于4℃、8000rpm离心20min，取菌体。加入20mL缓冲液(50mM Tris，200mM NaCl，调节pH至7.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间l s，停止时间2s，共计15min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心10min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
检测得到的来源于Labedella endophytica的酮糖3-差向异构酶的粗酶液的酶活，结果为：25.4U/g树脂。
实施例2:以树脂为载体固定化酮糖3-差向异构酶。
具体步骤如下：
(1)树脂的预处理：
1)用两倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，用10％氯化钠溶液浸泡12h，再用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；
2)以体积分数为2％盐酸溶液浸泡上述步骤1)处理后的树脂12h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；
3)再以体积分数为5％氢氧化钠溶液浸泡上述步骤2)处理后的树脂12h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性。
经预处理的树脂用两倍树脂体积的去离子水浸泡，存放于4℃冰箱中备用。使用时将树脂抽滤擦干。
(2)酶的固定化：
取树脂0.5g，加入实施例1制备得到的来源微生物Labedella endophytica的粗酶液0.5mL，加酶量为0.4mg蛋白/g树脂，终浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。
固定化体系总体积为2mL；固定化条件：在18℃摇床吸附2h，置于4℃静置30min，加入终浓度为0.01％的戊二醛进行交联，置于4℃交联1h。
固定化后弃上清，用去离子水将树脂洗净，置于4℃冰箱保存，备用。
按照上述方法，分别采用离子交换树脂Dowex 1x8、D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、
Figure BDA0004094075520000061
FPA53阴离子交换树脂、D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂、D311大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂，
Figure BDA0004094075520000062
15离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂(NA)、
Figure BDA0004094075520000063
IRA-410(Cl)离子交换树脂、
Figure BDA0004094075520000064
IRA-900阴离子交换树脂、AmberliteTMXAD761离子交换大孔吸附树脂、Amberlite XAD7HP离子交换树脂、
Figure BDA0004094075520000065
IRC-748螯合型离子交换树脂，分别检测固定化酶的酶活，结果分别为0、18.2、1.5、0、2.3、0、0、0、3.5、0、0、0.9。
结果显示：采用D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂制备得到的固定化酶的效果最好。
实施例3:pH的优化。
具体实施方式同实施例1～2，区别在于，调整实施例2中的树脂为：D301树脂，同时，调整酶的固定化步骤为：
(1)酶液的配制：
以50mM、pH分别为6.0、6.5、7.0(醋酸盐缓冲液)、7.5、8.0、8.5、9.0(Tris-HCl缓冲液)配制的酶液，将粗酶液稀释到0.4mg/mL。
(2)称取树脂0.5g，分别加入2mL步骤(1)得到的酶液，加酶量0.4mg蛋白/g树脂，于18℃、200r/min的恒温摇床中吸附2h。放入4℃冰箱静置30min，加入10μL体积分数为1％的戊二醛，使其终浓度为0.01％，于4℃静置交联1h。弃上清，用缓冲液洗涤固定化酶三次。分别检测得到的固定化酶的比酶活和回收率。
结果如图1所示，结果显示：最佳吸附pH为8.0。
实施例4:温度的优化。
具体实施方式同实施例1～2，区别在于，调整实施例2中的树脂为：XX树脂，同时，调整酶的固定化步骤为：
(1)酶液的配制：
以50mM、pH8.0 Tris-HCl缓冲液配制的酶液，将粗酶液稀释到0.4mg/mL。
(2)称取树脂0.5g，加入2mL步骤(1)得到的酶液，加酶量0.4mg蛋白/g树脂，分别于15、18、25、28、30、37℃、200r/min的摇床中吸附2h。放入4℃冰箱静置30min，加入10μL体积分数为1％的戊二醛，使其终浓度为0.01％，于4℃静置交联1h。弃上清，用缓冲液洗涤固定化酶三次。分别检测得到的固定化酶的比酶活和回收率。
结果如图2所示，结果显示：最佳吸附温度为18℃。
实施例5:吸附时间的优化。
具体实施方式同实施例1～2，区别在于，调整实施例2中的树脂为：D301树脂，同时，调整酶的固定化步骤为：
(1)酶液的配制：
以50mM、pH8.0 Tris-HCl缓冲液配制的酶液，将粗酶液稀释到0.4mg/mL。
(2)称取树脂0.5g，加入2mL步骤(1)得到的酶液，加酶量0.4mg蛋白/g树脂，于18℃、200r/min的摇床中分别吸附0、2、4、6、8、9h。放入4℃冰箱静置30min，加入10μL体积分数为1％的戊二醛，使其终浓度为0.01％，于4℃静置交联1h。弃上清，用缓冲液洗涤固定化酶三次。分别检测得到的固定化酶的比酶活和回收率。
结果如图3所示，结果显示：最佳吸附时间为2h。
实施例6:交联剂浓度的优化。
具体实施方式同实施例1～2，区别在于，调整实施例2中的树脂为：D301树脂，同时，调整酶的固定化步骤为：
(1)酶液的配制：
以50mM、pH8.0 Tris-HCl缓冲液配制的酶液，将粗酶液稀释到0.4mg/mL。
(2)称取树脂0.5g，加入2mL步骤(1)得到的酶液，加酶量0.4mg蛋白/g树脂，分别于18℃、200r/min的摇床中吸附2h。放入4℃冰箱静置30min，加入10μL体积分数分别为0、0.5、1、2、4、8、10％的戊二醛，使其终浓度分别为0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.1％，于4℃静置交联1h。弃上清，用缓冲液洗涤固定化酶三次。分别检测得到的固定化酶的比酶活和回收率。
结果如图4所示，结果显示：最佳交联剂浓度为0.01％。
实施例7:交联时间的优化。
具体实施方式同实施例1～2，区别在于，调整实施例2中的树脂为D301树脂，同时，调整酶的固定化步骤为：
(1)酶液的配制：
以50mM、pH8.0 Tris-HCl缓冲液配制的酶液，将粗酶液稀释到0.4mg/mL。
(2)称取树脂0.5g，加入2mL步骤(1)得到的酶液，加酶量0.4mg蛋白/g树脂，于18℃、200r/min的摇床中吸附2h。放入4℃冰箱静置30min，加入10μL体积分数为1％的戊二醛，使其终浓度为0.01％，于4℃静置交联分别静置交联0、1、2、4、6、8h。弃上清，用缓冲液洗涤固定化酶三次。分别检测得到的固定化酶的比酶活和回收率。
结果如图5所示，结果显示：最佳交联时间为1h。
实施例8:固定化前后酶最适pH的检测。
分别以醋酸盐缓冲液(50mM，pH缓冲范围4.0-6.0)，PBS缓冲液(50mM，pH缓冲范围6.0-7.5)以及Tris-HCl缓冲液(50mM，pH缓冲范围7.5-9.0)作为缓冲体系进行酶反应。除改变反应体系中的缓冲液外，其他反应及检测条件同实施例3所述。
最适反应pH即为最高酶活力所对应的pH。为了比较不同反应pH对重组酶活力的影响，将最适反应pH下的酶活力设定为100％相对酶活力，以计算其他pH下的相对酶活力。
按照酶活的检测方法，分别检测按照实施例2最佳树脂D301的方法制备得到的固定化酶及实施例·制备得到的固定化前的粗酶液相对酶活。
结果见说明书附图6，固定化酶最适pH为5.5。值得注意的是，在pH 4.0条件下，游离酶完全失去酶活，但固定化酶仍旧保持80％的酶活，说明固定化酶有较强的pH耐受性，不会在酸性环境失活，这在工业上具有较好的应用前景。
实施例9:固定化前后酶热稳定性的测试。
分别将实施例2制备得到的Laen的粗酶液和实施例2最佳树脂D301的方法制备得到的固定化酶置于60和65℃下进行恒温孵育，每隔一定的时间，取出经不同条件孵育的粗酶和固定化酶，按照酶活的检测方法，测定酶的残余酶活力。
结果如图7所示，结果显示：
在60和65℃下保温6h，固定化酶的残余酶活均达到80％以上，粗酶液的残余酶活分别为60％(60℃)和不到20％(65℃)，固定化酶的残余酶活比游离酶高，说明固定化酶的热稳定性要更好，对高温更耐受。
实施例10:固定化酶重复利用性测试。
称取1g实施例2最佳树脂D301的方法制备得到的固定化酶，加入1mL反应体系中：100g/L果糖，50mM PBS 6.0溶液，1mM Ni2+，在条件为70℃进行连续反应，取5min反应液100μL测定其D-阿洛酮糖产量，反应时间2h，反应结束后用去离子水洗涤固定化酶3次，加入新鲜的反应体系溶液后继续下一个批次的反应。重复操作，HPLC计算每一批次的酶活，分析固定化酶的重复利用性。
结果如图8所示，结果显示：在重复使用20次后，残余酶活仍有60％，在重复使用20次后，残余酶活迅速下降，重复使用30次后，残余酶活仅有27％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种固定酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，所述方法包括，将Labedellaendophytica来源的酮糖3-差向异构酶添加至含有经预处理后的离子交换树脂的反应体系中进行吸附；加入戊二醛交联剂对酶进行交联后得到固定化酮糖3-差向异构酶；
所述预处理后的离子交换树脂的处理方法为：(1)用乙醇浸泡树脂12～24h，弃杂液，并用体积分数为10～15％的氯化钠溶液浸泡10～15h，再用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；(2)以体积分数为2～5％的氢氧化钠溶液浸泡步骤(1)处理后的树脂10～15h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；(3)再以体积分数为2～5％的盐酸溶液浸泡步骤(2)处理后的树脂10～15h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换树脂为：D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预处理后的离子交换树脂的处理方法为：(1)用两倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，并用体积分数为10％氯化钠溶液浸泡12h，再用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；(2)以体积分数为5％的氢氧化钠溶液浸泡步骤(1)处理后的树脂12h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；(3)再以体积分数为2％的盐酸溶液浸泡树脂12h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；经预处理的树脂用两倍树脂体积的去离子水浸泡，存放于4℃冰箱中备用；使用时将树脂抽滤擦干。
4.根据权利要求3任一所述的方法，其特征在于，所述反应体系的总体积为2～4mL，将反应体系在15～37℃摇床吸附2～9h，置于2～8℃静置10～30min后，加入戊二醛进行交联，置于2～8℃交联1～8h；弃上清液，用去离子水洗涤，真空抽滤得到固定化酮糖3-差向异构酶，于4℃保存备用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有终浓度为50mM的pH8.0的Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酮糖3-差向异构酶在反应体系中的添加量为：0.2～6.0mg蛋白/g树脂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述戊二醛添加的终浓度为0.005～0.1％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列在NCBI上的编号为WP_127049469.1。
9.权利要求1～8任一所述的方法制备得到的固定化酮糖3-差向异构酶。
10.权利要求1～8任一所述的方法，或权利要求9所述的固定化酮糖3-差向异构酶在制备含D-阿洛酮糖或含D-阿洛酮糖的产品中的应用。
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CN116987689A (zh) * 2023-09-27 2023-11-03 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一种结晶阿洛酮糖的制备方法
CN117965519A (zh) * 2024-04-02 2024-05-03 东晓生物科技股份有限公司 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116987689A (zh) * 2023-09-27 2023-11-03 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一种结晶阿洛酮糖的制备方法
CN116987689B (zh) * 2023-09-27 2023-12-15 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一种结晶阿洛酮糖的制备方法
CN117965519A (zh) * 2024-04-02 2024-05-03 东晓生物科技股份有限公司 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法

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