CN111778308A - 一种季也蒙毕赤酵母及分泌的胞外蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种季也蒙毕赤酵母及分泌的胞外蛋白的应用，涉及微生物技术领域，具体涉及一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法；所述的应用通过季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）的分泌的胞外蛋白实现催化功能；该胞外蛋白具有较强的催化活性，具有催化效率高，反应条件温和，特异性强等特点，有望为高效合成赛门苷I的理想催化剂，拓宽赛门苷I的来源。

Description

一种季也蒙毕赤酵母及分泌的胞外蛋白的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法。
背景技术
罗汉果(Siraitia grosvenorii)是广西道地药材，对生境的要求较严格，主要垂直分布于海拔250～1000m的亚热带有坡地区，分布区多有苔藓、兰科植物、油茶林和竹林等植物；罗汉果要求生长在昼夜温差较大、环境湿润的地区，最适温度为25～30℃，空气相对湿度为70％～85％；喜光但不耐强光，怕霜冻；适宜栽培在排水较好、有机质丰富、疏松湿润的红黄壤土中。桂林的临桂、永福、兴安、资源、龙胜、灵川栽培面积最大，也是我国最大的罗汉果生产基地。罗汉果有凉血解暑、滑肠通便、化痰止咳、舒胃、清肺和生津止渴等功效，临床用于治疗肠燥便秘、高血压和呼吸系统疾病，同时具有一定抗菌作用，对消化系统疾病也有较好的疗效。目前，以罗汉果为主要原料已经制成的中药有罗汉果咽喉片、镇咳祛痰合剂、罗汉果止咳露、止咳定喘片、罗汉果止咳剂等(黎霜等，2003)。罗汉果甜苷类物质甜度高、热值低、水溶性与热稳定性好。无毒，食用安全，没有异味，因此广泛应用于食品及保健品工业中。近年来，罗汉果被制成汁粉、果糕、柿饼汤、面包、果凉茶、单晶冰糖等食品和保健品；罗汉果在国外市场也非常受欢迎，日本、韩国、英国、新加坡等国先后批准罗汉果可以作为食品添加剂，特别是用罗汉果制成的高级润喉糖、罗汉果果汁等产品在日本深受人们的喜爱。
目前从罗汉果果实中提取和鉴定的葫芦烷型三萜类成分有：罗汉果苷Ⅳ、罗汉果苷Ⅴ、罗汉果皂苷ⅣA、罗汉果二醇Ⅰ苯甲酸酝、罗汉果新苷、罗汉果苷Ⅲ、罗汉果皂苷ⅡA1、赛门苷Ⅰ、11-氧化-罗汉果苷Ⅴ、罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A等(杨秀伟等，2008)。以上成分是罗汉果的主要甜味成分，在罗汉果干果中的总含量为3.755％～3.858％。罗汉果中含有多种皂苷成分，目前已从罗汉果中分离并鉴定30多种葫芦烷型三萜皂苷，其中罗汉果苷IV、V和赛门苷I是迄今为止报道的罗汉果甜苷中甜度最高的3种成分，分别为蔗糖甜度的392，425和563倍。赛门苷I是葫芦烷三萜苷中最甜的成分，赛门苷I(0.01％浓度)的为5％蔗糖甜度的563倍。
此外，体外试验表明赛门苷对麦芽糖酶有抑制作用，Suzuki等研究发现，罗汉果苷提取物(包含罗汉果苷V，IV，III，赛门苷I等)对单剂量口服麦芽糖大鼠餐后血糖具有强烈的抑制作用，IC50分别为14,12,10和1.6mM。日本学者Konoshima等在罗汉果甜苷的病毒抑制作用试验中,发现赛门苷I可抑制病毒的生长。赛门苷I还具有很强的降血糖血压的功用。Yasushi A.Suzuki等研究罗汉果粗提物对餐后血糖浓度增加的影响，实验发现，大鼠摄入麦芽糖之前3分钟口服罗汉果粗提物，血浆中葡萄糖浓度的增高得到显著的抑制，但摄入葡萄糖时没有抑制作用。试验结果表明罗汉果赛门苷I对麦芽糖酶有抑制能力。
然而，当前赛门苷I的生产与制备主要是通过植物提取获得，但是植物类含量极低，严重制约着赛门苷I的大规模应用，在过去的十年里文献报道了用植物组织培养法生产赛门苷I的方法，一般都是通过添加诱导物诱导植物细胞生产赛门苷I。目前，尚未有大量制备和生产赛门苷I的公开报道。
发明内容
本发明的目的是提供季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的新用途，该菌株能生产胞外蛋白，该胞外蛋白具有高效催化合成赛门苷I的作用，将为赛门苷I大规模生产提供新的思路。
本发明的目的是提供一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法。其能够高效地提高合成罗汉果赛门苷I，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，以满足罗汉果赛门苷I的大规模生产，具有较强的实用性和推广价值。
一种季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在制备赛门苷I中作为催化剂的应用。
所述的应用通过季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的分泌的胞外蛋白实现催化功能。
季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在生产赛门苷I的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤实现：
步骤1：将季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)划线接种于新鲜的斜面培养基上，于25℃培养48h，得到活化的斜面菌种；
步骤2：将步骤1得到的活化的斜面菌种，用接种环挑取1环接种于装有20mL种子培养基的100mL三角瓶中，于25℃、200rpm摇床培养48h，即得种子液；然后按照体积百分比2％-10％的接种量，将种子液接种于装有200mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中，25℃、200rpm摇床培养48h，得到发酵液；
步骤3：将步骤2得到的发酵液进行离心，收集菌体沉淀及上清液，对上清液纯化、浓缩即得到胞外蛋白。
步骤4：利用步骤3得到的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的胞外蛋白作为催化剂制备赛门苷I。反应式如下：
Figure BDA0002016887080000031
所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述斜面培养基
包括可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL，pH值自然。
所述的应用，其特征在于，所述的步骤(2)中，所述液体发酵培养基包括葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.5g和水1000mL，pH值自然。
所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述上清液纯化、浓缩方法为：在上清溶液中，于4℃冷藏5h，加入硫酸铵将饱和度调为65％，4000rpm离心15min；得沉淀，沉淀物为胞外蛋白。
一种利用季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白制备赛门苷I的方法，其特征在于，将获得胞外蛋白0.01-10g/L，罗汉果苷V0.1–100g/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液0.2M混合，25℃，200rpm搅拌下，反应5-72h。
所述的方法，其特征在于所述的胞外蛋白将罗汉果苷V转化为赛门苷I。
所述的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)，具有以下特性：
(1)个体形态：菌体呈椭圆形状。
(2)在固体培养基平板上的菌落性状：菌落呈圆形、中间皱起，呈乳白色。
(3)生长适温25-30℃，pH值6.0-7.0，好氧。
上述固体培养基由可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL组成，pH值自然。
上述固体培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
该菌株经过综合菌落形态、菌体形态特征观察、分子生物学测序结果，确定季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)。
有益效果
1、本发明首次发现罗汉果共生菌为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)，并且首次发现其培养物可以将罗汉果V转变为赛门苷I。进一步来说，所述的季也蒙毕赤酵母经培养后获得胞外蛋白，且该胞外蛋白具有较强的催化活性，其将可以把罗汉果苷V特异催化为赛门苷I，具有催化效率高，反应条件温和，专属性好等特点，有望为高效合成赛门苷I的理想催化剂，拓宽赛门苷I的来源。
2、发明人测试了人参皂苷Rb1、西红花苷I，木蝴蝶苷B，上述的化合物葡萄糖与罗汉果苷V都是1-6连接，并还有测试了罗汉果I、罗汉果IV，罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A，但实验结果发现：只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I，其他无效。
附图说明
图1为本发明的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的菌落图；
图2实施例4的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白催化生产赛
门苷I结果；
图3不同罗汉果提取物HPLC出峰时间图；
图4为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的鉴定报告；
图5为赛门苷I的碳谱图；
图6为赛门苷I的氢谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)先期从罗汉果共生菌分离得到，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，验证两者一致。
实施例1季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白制备赛门苷I
步骤1：季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)划线接种于新鲜的斜面培养基上，于25℃培养48h，得到活化的斜面菌种；
步骤2：将步骤1得到的活化的斜面菌种，接种于装有20mL种子培养基的100mL三角瓶中，于25℃、200rpm摇床培养48h，即得种子液；然后按照2％(v/v)-10％(v/v)的接种量，将种子液接种于装有200mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中，25℃、200rpm摇床培养48h，得到发酵液；
步骤3：将步骤2得到的发酵液进行离心，收集菌体沉淀及上清液，对上清液浓缩即得到胞外蛋白；
其中步骤1中，所述斜面培养基由可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL组成，pH值自然；
其中步骤1中，2中，所述种子培养基和液体发酵培养基均由葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.5g和水1000mL组成，pH值自然。
其中步骤3中季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白浓缩方法为：在上清溶液中，于4℃冷藏5h，加入硫酸铵将饱和度调为65％，4000rpm离心15min；得沉淀，沉淀物为粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白。
实施例2利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白制备赛门苷I
5g/L粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白，10g/L罗汉果苷V，0.2M磷酸盐缓冲液pH＝7.2混合，25℃，200rpm搅拌，反应24h，底物转化率达31％，赛门苷I纯度为98.5％，如图2所示。赛门苷I波谱数据见图5和图6。
实施例3利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白制备赛门苷I
1g/L粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白，5g/L罗汉果苷V，0.2M磷酸盐缓冲液pH＝7.2，25℃，200rpm，反应24h。底物转化率达31％，赛门苷I纯度为98.5％，如图4所示。
上述实施例2或3中罗汉果提取物含量的测定方法：
以高效液相色谱法(HPLC)测定赛门苷I和其他罗汉果提取物含量。
样品处理：反应液加入与反应液同体积的乙醇，沉淀蛋白，并溶解底物(罗汉果苷V)和产
物(赛门苷I)，10000r/min离心6min，0.45μm滤膜过滤，待测。
色谱柱：Ultimate○RXB-C18柱(150mm×4.6mm×3μm，
Figure BDA0002016887080000051
)；
流动相：A相(0.1％v/v磷酸-水溶液)和B相(甲醇)，
梯度变化(B相)：0-20min 10-30％，20-25min 30-90％,25-26min 90-10％，26-30min 10％。
流速：1mL/min，
波长：205nm处紫外检测，
进样量20μL。其中罗汉果苷V和赛门苷I的出峰时间分别为19.9min和20.9min左右(如图3所示)。
实施例4
参照实施例2利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白酶解脱糖，实验分别测试了人参皂苷Rb1、西红花苷I，木蝴蝶苷B，上述的化合物葡萄糖与罗汉果苷V都是1-6连接，并还有测试了罗汉果I、罗汉果IV，罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A，但实验结果发现：只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I，其他无效。
Figure BDA0002016887080000061
实验结果证明，本发明罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白催化作用具有结构特异性，只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）在制备赛门苷I中作为催化剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用通过季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）的分泌的胞外蛋白实现催化功能。
3.一种利用权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤实现：
季也蒙毕赤酵母经培养后得到发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体沉淀及上清液，
对上清液浓缩即得到胞外蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述上清液浓缩方法为：在上清溶液中，于4℃冷藏5 h，加入硫酸铵将饱和度调为 65 ％， 4000 rpm 离心15 min；得沉淀，沉淀物为胞外蛋白。
5.一种利用季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）所产胞外蛋白制备赛门苷I的方法，其特征在于，将权利要求2或3获得胞外蛋白0.01-10g/L，罗汉果苷V 0.1–100g/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液0.2 M混合，25 oC ，200 rpm搅拌下，反应5-72h，所述的胞外蛋白将罗汉果苷V转化为赛门苷I。
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