CN111778308A - 一种季也蒙毕赤酵母及分泌的胞外蛋白的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种季也蒙毕赤酵母及分泌的胞外蛋白的应用,涉及微生物技术领域,具体涉及一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法;所述的应用通过季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的分泌的胞外蛋白实现催化功能;该胞外蛋白具有较强的催化活性,具有催化效率高,反应条件温和,特异性强等特点,有望为高效合成赛门苷I的理想催化剂,拓宽赛门苷I的来源。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法。
背景技术
罗汉果(Siraitia grosvenorii)是广西道地药材,对生境的要求较严格,主要垂直分布于海拔250~1000m的亚热带有坡地区,分布区多有苔藓、兰科植物、油茶林和竹林等植物;罗汉果要求生长在昼夜温差较大、环境湿润的地区,最适温度为25~30℃,空气相对湿度为70%~85%;喜光但不耐强光,怕霜冻;适宜栽培在排水较好、有机质丰富、疏松湿润的红黄壤土中。桂林的临桂、永福、兴安、资源、龙胜、灵川栽培面积最大,也是我国最大的罗汉果生产基地。罗汉果有凉血解暑、滑肠通便、化痰止咳、舒胃、清肺和生津止渴等功效,临床用于治疗肠燥便秘、高血压和呼吸系统疾病,同时具有一定抗菌作用,对消化系统疾病也有较好的疗效。目前,以罗汉果为主要原料已经制成的中药有罗汉果咽喉片、镇咳祛痰合剂、罗汉果止咳露、止咳定喘片、罗汉果止咳剂等(黎霜等,2003)。罗汉果甜苷类物质甜度高、热值低、水溶性与热稳定性好。无毒,食用安全,没有异味,因此广泛应用于食品及保健品工业中。近年来,罗汉果被制成汁粉、果糕、柿饼汤、面包、果凉茶、单晶冰糖等食品和保健品;罗汉果在国外市场也非常受欢迎,日本、韩国、英国、新加坡等国先后批准罗汉果可以作为食品添加剂,特别是用罗汉果制成的高级润喉糖、罗汉果果汁等产品在日本深受人们的喜爱。
目前从罗汉果果实中提取和鉴定的葫芦烷型三萜类成分有:罗汉果苷Ⅳ、罗汉果苷Ⅴ、罗汉果皂苷ⅣA、罗汉果二醇Ⅰ苯甲酸酝、罗汉果新苷、罗汉果苷Ⅲ、罗汉果皂苷ⅡA1、赛门苷Ⅰ、11-氧化-罗汉果苷Ⅴ、罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A等(杨秀伟等,2008)。以上成分是罗汉果的主要甜味成分,在罗汉果干果中的总含量为3.755%~3.858%。罗汉果中含有多种皂苷成分,目前已从罗汉果中分离并鉴定30多种葫芦烷型三萜皂苷,其中罗汉果苷IV、V和赛门苷I是迄今为止报道的罗汉果甜苷中甜度最高的3种成分,分别为蔗糖甜度的392,425和563倍。赛门苷I是葫芦烷三萜苷中最甜的成分,赛门苷I(0.01%浓度)的为5%蔗糖甜度的563倍。
此外,体外试验表明赛门苷对麦芽糖酶有抑制作用,Suzuki等研究发现,罗汉果苷提取物(包含罗汉果苷V,IV,III,赛门苷I等)对单剂量口服麦芽糖大鼠餐后血糖具有强烈的抑制作用,IC50分别为14,12,10和1.6mM。日本学者Konoshima等在罗汉果甜苷的病毒抑制作用试验中,发现赛门苷I可抑制病毒的生长。赛门苷I还具有很强的降血糖血压的功用。Yasushi A.Suzuki等研究罗汉果粗提物对餐后血糖浓度增加的影响,实验发现,大鼠摄入麦芽糖之前3分钟口服罗汉果粗提物,血浆中葡萄糖浓度的增高得到显著的抑制,但摄入葡萄糖时没有抑制作用。试验结果表明罗汉果赛门苷I对麦芽糖酶有抑制能力。
然而,当前赛门苷I的生产与制备主要是通过植物提取获得,但是植物类含量极低,严重制约着赛门苷I的大规模应用,在过去的十年里文献报道了用植物组织培养法生产赛门苷I的方法,一般都是通过添加诱导物诱导植物细胞生产赛门苷I。目前,尚未有大量制备和生产赛门苷I的公开报道。
发明内容
本发明的目的是提供季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的新用途,该菌株能生产胞外蛋白,该胞外蛋白具有高效催化合成赛门苷I的作用,将为赛门苷I大规模生产提供新的思路。
本发明的目的是提供一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法。其能够高效地提高合成罗汉果赛门苷I,具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征,以满足罗汉果赛门苷I的大规模生产,具有较强的实用性和推广价值。
一种季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在制备赛门苷I中作为催化剂的应用。
所述的应用通过季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的分泌的胞外蛋白实现催化功能。
季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在生产赛门苷I的应用,其特征在于,所述的应用按如下步骤实现:
步骤1:将季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)划线接种于新鲜的斜面培养基上,于25℃培养48h,得到活化的斜面菌种;
步骤2:将步骤1得到的活化的斜面菌种,用接种环挑取1环接种于装有20mL种子培养基的100mL三角瓶中,于25℃、200rpm摇床培养48h,即得种子液;然后按照体积百分比2%-10%的接种量,将种子液接种于装有200mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中,25℃、200rpm摇床培养48h,得到发酵液;
步骤3:将步骤2得到的发酵液进行离心,收集菌体沉淀及上清液,对上清液纯化、浓缩即得到胞外蛋白。
步骤4:利用步骤3得到的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的胞外蛋白作为催化剂制备赛门苷I。反应式如下:
所述的应用,其特征在于,步骤(1)中,所述斜面培养基
包括可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL,pH值自然。
所述的应用,其特征在于,所述的步骤(2)中,所述液体发酵培养基包括葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.5g和水1000mL,pH值自然。
所述的应用,其特征在于,步骤(3)中,所述上清液纯化、浓缩方法为:在上清溶液中,于4℃冷藏5h,加入硫酸铵将饱和度调为65%,4000rpm离心15min;得沉淀,沉淀物为胞外蛋白。
一种利用季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白制备赛门苷I的方法,其特征在于,将获得胞外蛋白0.01-10g/L,罗汉果苷V0.1–100g/L,pH7.2的磷酸盐缓冲液0.2M混合,25℃,200rpm搅拌下,反应5-72h。
所述的方法,其特征在于所述的胞外蛋白将罗汉果苷V转化为赛门苷I。
所述的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii),具有以下特性:
(1)个体形态:菌体呈椭圆形状。
(2)在固体培养基平板上的菌落性状:菌落呈圆形、中间皱起,呈乳白色。
(3)生长适温25-30℃,pH值6.0-7.0,好氧。
上述固体培养基由可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL组成,pH值自然。
上述固体培养基在使用前,先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
该菌株经过综合菌落形态、菌体形态特征观察、分子生物学测序结果,确定季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)。
有益效果
1、本发明首次发现罗汉果共生菌为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii),并且首次发现其培养物可以将罗汉果V转变为赛门苷I。进一步来说,所述的季也蒙毕赤酵母经培养后获得胞外蛋白,且该胞外蛋白具有较强的催化活性,其将可以把罗汉果苷V特异催化为赛门苷I,具有催化效率高,反应条件温和,专属性好等特点,有望为高效合成赛门苷I的理想催化剂,拓宽赛门苷I的来源。
2、发明人测试了人参皂苷Rb1、西红花苷I,木蝴蝶苷B,上述的化合物葡萄糖与罗汉果苷V都是1-6连接,并还有测试了罗汉果I、罗汉果IV,罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A,但实验结果发现:只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I,其他无效。
附图说明
图1为本发明的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的菌落图;
图2实施例4的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白催化生产赛
门苷I结果;
图3不同罗汉果提取物HPLC出峰时间图;
图4为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的鉴定报告;
图5为赛门苷I的碳谱图;
图6为赛门苷I的氢谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是,下述实施方案中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)先期从罗汉果共生菌分离得到,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,验证两者一致。
实施例1季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白制备赛门苷I
步骤1:季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)划线接种于新鲜的斜面培养基上,于25℃培养48h,得到活化的斜面菌种;
步骤2:将步骤1得到的活化的斜面菌种,接种于装有20mL种子培养基的100mL三角瓶中,于25℃、200rpm摇床培养48h,即得种子液;然后按照2%(v/v)-10%(v/v)的接种量,将种子液接种于装有200mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中,25℃、200rpm摇床培养48h,得到发酵液;
步骤3:将步骤2得到的发酵液进行离心,收集菌体沉淀及上清液,对上清液浓缩即得到胞外蛋白;
其中步骤1中,所述斜面培养基由可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL组成,pH值自然;
其中步骤1中,2中,所述种子培养基和液体发酵培养基均由葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.5g和水1000mL组成,pH值自然。
其中步骤3中季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白浓缩方法为:在上清溶液中,于4℃冷藏5h,加入硫酸铵将饱和度调为65%,4000rpm离心15min;得沉淀,沉淀物为粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白。
实施例2利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白制备赛门苷I
5g/L粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白,10g/L罗汉果苷V,0.2M磷酸盐缓冲液pH=7.2混合,25℃,200rpm搅拌,反应24h,底物转化率达31%,赛门苷I纯度为98.5%,如图2所示。赛门苷I波谱数据见图5和图6。
实施例3利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白制备赛门苷I
1g/L粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白,5g/L罗汉果苷V,0.2M磷酸盐缓冲液pH=7.2,25℃,200rpm,反应24h。底物转化率达31%,赛门苷I纯度为98.5%,如图4所示。
上述实施例2或3中罗汉果提取物含量的测定方法:
以高效液相色谱法(HPLC)测定赛门苷I和其他罗汉果提取物含量。
样品处理:反应液加入与反应液同体积的乙醇,沉淀蛋白,并溶解底物(罗汉果苷V)和产
物(赛门苷I),10000r/min离心6min,0.45μm滤膜过滤,待测。
流动相:A相(0.1%v/v磷酸-水溶液)和B相(甲醇),
梯度变化(B相):0-20min 10-30%,20-25min 30-90%,25-26min 90-10%,26-30min 10%。
流速:1mL/min,
波长:205nm处紫外检测,
进样量20μL。其中罗汉果苷V和赛门苷I的出峰时间分别为19.9min和20.9min左右(如图3所示)。
实施例4
参照实施例2利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白酶解脱糖,实验分别测试了人参皂苷Rb1、西红花苷I,木蝴蝶苷B,上述的化合物葡萄糖与罗汉果苷V都是1-6连接,并还有测试了罗汉果I、罗汉果IV,罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A,但实验结果发现:只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I,其他无效。
实验结果证明,本发明罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白催化作用具有结构特异性,只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在制备赛门苷I中作为催化剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于所述的应用通过季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的分泌的胞外蛋白实现催化功能。
3.一种利用权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的应用按如下步骤实现:
季也蒙毕赤酵母经培养后得到发酵液;将发酵液进行离心,收集菌体沉淀及上清液,
对上清液浓缩即得到胞外蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述上清液浓缩方法为:在上清溶液中,于4℃冷藏5 h,加入硫酸铵将饱和度调为 65 %, 4000 rpm 离心15 min;得沉淀,沉淀物为胞外蛋白。
5.一种利用季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白制备赛门苷I的方法,其特征在于,将权利要求2或3获得胞外蛋白0.01-10g/L,罗汉果苷V 0.1–100g/L,pH7.2的磷酸盐缓冲液0.2 M混合,25 oC ,200 rpm搅拌下,反应5-72h,所述的胞外蛋白将罗汉果苷V转化为赛门苷I。
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