CN110143988B - 一种三叶苷的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三叶苷的提取方法，包括如下步骤：步骤一、取木姜叶柯叶子，粉碎，然后加入水加热提取，加热提取后趁热过滤得到滤液；步骤二、将滤液冰冻冷藏；步骤三、将冷冻的滤液取出，然后在温度40℃以下解冻，过滤得到沉淀；步骤四、将沉淀干燥；步骤五、干燥后的沉淀放入加热的乙醇溶液中溶解，乙醇溶液的温度为60‑80℃；然后将乙醇溶液冷却至‑20‑40℃，得到结晶体；步骤六、将结晶体干燥即得到黄色三叶苷纯品。本发明只需经过冷冻复溶后过滤，热饱和结晶即可得到高纯度三叶苷，耗时短，操作简便，易于工业化生产，且更环保，对操作者身体损伤小。

Description

一种三叶苷的提取方法
技术领域
本发明属于药物领域，特别涉及一种三叶苷的提取方法。
背景技术
木姜叶柯为壳斗科柯属常绿植物Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun多分布在长江以南的低山密丛中，是一种兼有药食作用，可作为茶、糖、药三种功能的植物i。传统民间经验表明，木姜叶柯具有清热利尿，滋肝养胃，化痰，祛风和降压等功效，可用于治疗湿热痢疾，皮肤瘙痒，肺热咳嗽和高血压。近代医学研究证明木姜叶柯具有抗氧化、免疫抑制、改善记忆力以及植物生长发育、降血糖等药理作用。其中三叶苷是木姜叶柯的主要活性成分之一，具有抗糖尿病、降血糖、抗HIV-1感染、抗炎等作用。三叶苷是木姜叶柯具有降糖活性的主要成分，是一种具有应用潜力的抗糖尿病活性药物。相关报道指出，木姜叶柯中三叶苷对α-葡萄糖苷酶有明显抑制作用，与阿卡波糖的抑制效果无明显差别。目前，国内对木姜叶柯中根皮苷的研究较多，对三叶苷的研究较少。三叶苷的药用保健机制尚未得到充分开发利用。
现有文献关于木姜叶柯中三叶苷提取、分离报道较少，仅有相关专利报道从木姜叶柯中分离三叶苷单体。专利中大多采用乙醇水溶液进行提取且一般采用色谱法进行进一步的分离，此方法耗时较长；或采用高速逆流色谱法，试验和提取成本较高。例如张亚洲等分离三叶苷单体的步骤繁琐，耗时较长。此外，传统的重结晶多采用甲醇溶剂，甲醇具有很大的毒性。甲醇在使用国产过程中，对人体的神经系统和血液系统影响最大，经消化道、呼吸道或皮肤摄入都会产生毒性反应，特别是甲醇蒸汽会对呼吸道粘膜和视力造成很大损伤。
发明内容
为了克服以上问题，本发明提供了一种三叶苷的提取方法。本发明只需经过冷藏过滤，热饱和结晶即可得到高纯度三叶苷，耗时短，操作简便，易于工业化生产，且本发明采用水提取，相比于乙醇水溶液提取更环保，通过实验对比乙醇提取和水提取(文本中并没有对比试验说明)，使用乙醇提取会有较多的杂质，并且不易形成沉淀；而且本发明采用乙醇，污染小，且对操作者身体损伤小。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种三叶苷的提取方法，包括如下步骤：
步骤一、取木姜叶柯叶子，粉碎，然后加入水加热提取0.5-12h，加热温度为60-100℃，木姜叶柯叶子与水的质量比为1-1：1-100；加热提取后，过滤得到滤液，过滤时溶液温度为50℃以上；
步骤二、将滤液冰冻0.5小时以上，冷冻温度低于0℃；
步骤三、将冷冻的滤液取出，然后在温度40℃以下解冻，过滤得到沉淀；
步骤四、将沉淀干燥；
步骤五、干燥后的沉淀放入加热的乙醇溶液中溶解，乙醇溶液的温度为60-80℃；然后将乙醇溶液冷却至-20-40℃，得到结晶体；
步骤六、将结晶体干燥即得到黄色三叶苷纯品。
进一步的改进，所述步骤一中，将木姜叶柯叶子分别在水浸泡提取三次，分别过滤然后合并滤液。
进一步的改进，所述步骤五中，将结晶体在乙醇溶液中重复溶解，结晶两次或两次以上后再进行干燥。
进一步的改进，所述木姜叶柯叶子的叶龄不超过60天。
附图说明
图1为280nm的HPLC检测结果；
图2为254nm的HPLC检测结果；
图3为320nm的HPLC检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图对本发明做进一步阐述和说明:
1.仪器与试药
Agilent 1260型高效液相色谱仪(包括G1311B四元泵和G4212BDAD型阵列二极管检测器，美国Agilent科技有限公司)；AUW120D型电子分析天平(日本岛津有限公司)；Mighty-10超纯水机(上海砾鼎水处理设备有限公司)；BZF-50真空干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；薄层色谱(青岛海洋化工厂)；三叶苷对照品(含量＞98.0％，批号为WKQ18052505)，购于四川省维克奇生物科技有限公司；木姜叶柯样品购自君健中药材合作社，经湖南医药学院蔡伟博士鉴定为Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun的干燥嫩叶。
2.方法与结果
2.1提取与分离
取木姜叶柯叶子0.1Kg，用粉碎机稍加粉碎，过2号筛，装入2000mL圆底烧瓶中，用10倍量水在80℃条件下提取3次，每次1h，得残渣和滤液，合并滤液。将滤液，放冰箱冷藏静止12h，有大量沉淀析出，过滤，得黄色沉淀物，减压干燥箱中干燥(55℃)24h，即得三叶苷粗品。
2.2结晶
进行热饱和结晶。在无水乙醇溶液中缓缓加入三叶苷粗品，边加热边溶解，待三叶苷饱和溶解后，冷却溶解液得到结晶，如此重复三次，干燥后即得白色三叶苷纯品。
2.3水分测定
按照《中华人民共和国药典》2015版药典通则0832项下的水分测定的第二法(烘干法)，对所得三叶苷纯品中的水分进行测定：分别称取三叶苷纯品约2g，放置在干燥至恒重的称量瓶中，精密称取重量后，将锥形瓶瓶塞打开，放置在105℃环境的干燥箱中干燥5h，移出并迅速盖上瓶盖，放置在干燥器中冷却30min，精密称重，将其放置在上述环境中干燥1h，迅速取出，冷却后称重，使得连续干燥两次后的重量差小于5mg为止，根据最后损失的重量，计算三叶苷纯品中水分的含量，三叶苷样品取样与操作均重复三次。平均测定值为3.55％，SD等于0.163。
2.4结构鉴定
白色针状结晶1H-NMR(500MHz,DMSO)δ7.03(2H，d,J＝8.0Hz，H-2，H-6),6.66(2H，d，J＝8.0Hz，H-3，H-5),6.04(2H,S),4.88(1H，d，J＝7.71Hz),5.36(1H，d，J＝5.82Hz),5.13(1H，d，J＝5.42Hz),2.78(2H，t，J＝7.66Hz，H-β).13C-NMR131.49(C-1),129.20(C-2，C-6),155.42(C-4),115.09(C-3，C-5),45.77(C-α),29.32(C-β),205.07(C＝O),105.23(C-1'),163.39(C-2'，C-6'),95.07(C-3'，C-5'),163.74(C-4'),99.52(C-1″),73.05(C-2″),76.41(C-3″),69.41(C-4″),77.14(C-5″),60.48(C-6″).以上数据与文献的三叶苷核磁数据[17]一致。
2.5色谱条件试验
2.5.1检测波长选择
张亚洲等将280nm作为三叶苷含量测定的检测波长。为了进一步检查三叶苷的纯度，使用DAD检测器检查峰纯度，峰纯度达到995.0(阈值1000.0)。最终选择280,254,320nm作为检测波长。见图1-3所示。
表1波长考察结果
Figure BDA0002052472510000031
2.5.2流速考察
取三叶苷供试液适量，将流速设置为0.8、1.0、1.2ml/min进行考察。见表2
表2流速研究结果
Figure BDA0002052472510000041
由表可见，当流速为0.8ml/min时，基线稳定，且理论塔板数高。
2.4.3色谱柱考察
取三叶苷供试液适量，检测波长:280nm；柱温:45℃，流动相：0.5％磷酸水溶液(A)-乙腈(C)，梯度洗脱(见表5)；流速：1.0ml/min；进样量：10μL，分别采用Agilent XDB-C18(250nm×4.6mm，5μm)、Thermo Scientific Hypersil BDS C18柱(250nm×4.6mm，5μm)、Dikma(250nm×4.6mm，5μm)见表3
表3色谱柱考察结果
Figure BDA0002052472510000042
由表3结果可知，当色谱柱为Thermo Scientific Hypersil BDS C18柱(250nm×4.6mm，5μm)时，对称因子最好且基线平稳。
2.4.4柱温考察结果
取三叶苷供试液适量，分别设置柱温30、35、40、45℃，进行考察。见表4
表4柱温考察结果
Figure BDA0002052472510000043
由表4结果可知，当柱温为30℃时，对称因子和理论塔板数最高。
2.5纯度测定
2,5,1薄层色谱(TLC)法
将制备的三叶苷和对照品分别点于硅胶板上，分别以石油醚-正丁醇(1:8)、乙酸乙酯：正丁醇(2:1)、乙酸乙酯：丙酮(3:2)为展开剂进行硅胶薄层层析。以5％硫酸-乙醇为显色剂，加热，在日光灯下下观察样品与对照品Rf比对。经以上3个展开系统方式检测时，结果样品与对照品Rf值相同，且均无杂质斑点。
2.5.2高效液相色谱(HPLC)法
色谱柱:Thermo Scientific Hypersil BDS C18柱(250nm×4.6mm，5μm)；0.5％磷酸水-乙腈溶液进行梯度洗脱(见表5),临用前用0.45μm微孔滤膜过滤并超声脱气处理；流速:0.8mL/min；检测波长:280、254、320nm；柱温:30℃。
表5流动相洗脱程序
Figure BDA0002052472510000044
Figure BDA0002052472510000051
取三叶苷0.0101g，加甲醇溶解制成浓度约为1mg/mL的溶液，作为供试品，取空白溶剂(甲醇)和供试品溶液各10μL，按上述色谱条件测定。在扣除溶剂干扰峰后，使用归一化法计算含量，三叶苷的含量在各波长均大于98.O％，如表1所示。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (1)

1.一种三叶苷的提取方法，其特征在于，步骤如下：
取木姜叶柯叶子0.1 Kg，用粉碎机稍加粉碎，过2号筛，装入2000 mL 圆底烧瓶中，用10倍量水在80℃条件下提取3 次，每次1 h，得残渣和滤液，合并滤液， 将滤液，放冰箱冷藏静止12h，有大量沉淀析出，过滤，得黄色沉淀物，减压干燥箱中 55 ℃干燥24 h，即得三叶苷粗品；然后在无水乙醇溶液中缓缓加入三叶苷粗品，边加热边溶解，待三叶苷饱和溶解后，冷却溶解液得到结晶，如此重复三次，干燥后即得白色三叶苷纯品。
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