CN111793102A - 从芷江野生甜茶中分离三叶苷和根皮苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从芷江野生甜茶中分离三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：(1)粉碎、提取；(2)絮凝、离心、超滤；(3)大孔树脂吸附；(4)除杂；(5)梯度洗脱：大孔吸附树脂柱先后用低浓度醇和高浓度乙洗脱，分别收集低浓度醇洗脱液和高浓度醇洗脱液，所述低浓度醇中含有少量羧酸；(6)三叶苷的分离和精制；(7)根皮苷的分离和精制。按照本发明方法可同时获得两种高含量的芷江野生甜茶天然活性成分，实现了资源综合利用，工艺连贯，可操作性强，设备要求低，生产成本低，适宜于工业化生产；所得三叶苷精品和根皮苷精品纯度和收率都得到了保证和改善。

Description

从芷江野生甜茶中分离三叶苷和根皮苷的方法

技术领域

本发明涉及芷江野生甜茶天然活性成分的方法，具体涉及从芷江野生甜茶中分离三叶苷和根皮苷的方法。

背景技术

芷江野生甜茶，学名“多穗石柯茶叶”(Lithocarpus polystachyus Rehd)，壳斗科隶属植物，常绿乔木，以野生状态生长在的密林中，集药、糖、茶三种功能于一体。

芷江野生甜茶的根、叶及果实可入药，有清热解毒、湿热痢疾、止血活血、利尿、调节内分泌、降血压、降血脂、降血糖、疏通软化心脑血管、抗肿瘤等作用。芷江野生甜茶无糖自甜，滋味鲜醇。因为芷江野生甜茶中含有三叶苷、根皮苷和3-羟基根皮苷，在食品、药物、化妆品、食品添加剂等方面得到广泛应用。其中三叶苷是甜味来源的主角，它的甜度是蔗糖的300倍，但是热量却只有蔗糖的三百分之一，且无毒无副作用，正是各国寻求的天然甜味剂的理想资源。芷江野生甜茶还具有绿茶的功效，茶汤中浸出物含量高、耐冲泡，含有丰富的茶多酚、钙、铁、锰、硒、18种氨基酸和人体所必需但无法生成的各种维生素。三叶苷和根皮苷都属于二氢查尔酮类物质，是芷江野生甜茶中的主要化学成分，具有一些生理活性，现有技术对其的提取多有研究。

CN201510187280.6公开了一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，是以多穗石柯为原料，经乙醇超声辅助提取、微滤膜过滤、超滤膜过滤、ADS-7树脂吸附、乙醇洗脱、减压浓缩、冷冻干燥等步骤得到根皮苷单体。该方法步骤繁杂、设备投入高、树脂昂贵，所得到的根皮苷产品收率偏低。

CN201610610596.6公开了一种提取多穗石柯根皮苷的方法，是以多穗石柯新鲜叶片为原料，经真空冷冻干燥、粉碎、乙醇和碳酸二甲酯混合溶剂超声提取、过滤、AB-8大孔树脂吸附、解吸、干燥等步骤，得到根皮苷。该方法以新鲜叶片为原料，对生产季节有很大的制约，无法常年生产；新鲜原料需要真空冷冻干燥处理，对生产量同样有制约；工艺中用到了大量易燃易爆的有机溶剂，不适合工业化生产。

CN201810780192.0公开了从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法，是以多穗石柯叶片为原料，经研磨、乙醇回流提取、冷冻干燥、温水溶解、聚酰胺柱吸附、除杂、解吸、大孔树脂柱吸附、解吸、冷冻干燥等步骤，得到根皮苷干粉。该方法工艺冗繁复杂，需反复柱层析，得到的根皮苷产品收率和含量都偏低。

CN201510358050.1公开了多穗柯甜茶中提取三叶苷的工艺，是以干燥的多穗柯甜茶叶为原料，经过醇提，过滤，浓缩，萃取，最后利用高速逆流色谱法得到三叶苷。虽然该专利得到了高纯度的三叶苷，但是使用了昂贵的高速逆流色谱，而且三叶苷的收率并不能令人满意，该专利方法并不适用于工业化的大规模生产三叶苷，而且该专利不涉及芷江野生甜茶中另一种活性成分，即根皮苷的提取。

此外，上述公开的方法中，都还有一个共同的技术缺陷——只能得到芷江野生甜茶(多穗石柯)中的一种天然活性成分，没有对原料中的其他天然活性成分分离纯化、加以利用，都造成了自然资源的浪费。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种可将芷江野生甜茶资源综合利用、同时获得两种芷江野生甜茶天然活性成分，产品收率高、含量高，工艺连贯，可操作性强，设备要求低，生产成本低，适宜于工业化生产的从芷江野生甜茶中分离三叶苷和根皮苷的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从芷江野生甜茶中分离三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

(1)粉碎、提取：将干燥的芷江野生甜茶叶片原料粉碎，热水提取，过滤，得提取液；

(2)絮凝、离心、超滤：将提取液冷却至室温，加入絮凝剂，离心，离心液用超滤膜过滤；

(3)大孔树脂吸附：将超滤膜滤液通过大孔吸附树脂柱；

(4)除杂：先用弱碱溶液冲洗树脂柱，水洗至上柱流出液pH值中性或基本无色；再用稀酸溶液冲洗树脂柱，水洗至上柱流出液pH值中性或基本无色；

(5)梯度洗脱：大孔吸附树脂柱先后用低浓度醇和高浓度醇洗脱，分别收集低浓度醇洗脱液和高浓度醇洗脱液，所述低浓度醇中含有少量羧酸；

(6)三叶苷的分离和精制：取低浓度醇洗脱液，浓缩至无醇，真空干燥，得三叶苷粗品，将三叶苷粗品用醇溶剂热溶解，趁热过滤除去不溶物，滤液在搅拌下滴加温水，自然降温至室温，降温冷却，搅拌析晶，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得三叶苷精品。

(7)根皮苷的分离和精制：取高浓度醇洗脱液，加入活性炭，加热搅拌，过滤，浓缩，将浓缩液降温冷却，搅拌析晶，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得根皮苷精品。

优选地，步骤(1)中，所述原料粉碎的粒径为2～5mm，所述热水提取得温度为85～100℃。热水提取优选为两次以上提取，热水总的体积用量为原料重量的18～25倍(L/kg)，总的提取时间为3～8小时。每次提取所用热水的用量和提取时间依次减少，减少的幅度为20％～50％。比如若为两次提取，所用热水的用量依次为原料重量的10～15倍、8～10倍(L/kg)，提取的时间依次为2～3小时、1～2小时。热水提取的目的是将芷江野生甜茶原料中易溶于水的三叶苷、根皮苷等水溶性成分浸出。多次提取能够更充分地将目标提取物浸出。

优选地，步骤(2)中，所述的絮凝剂为聚合氯化铝(PAC)和/或聚丙烯酰胺(PAM)，絮凝剂的用量均为原料重量的0.5％～2％。加入絮凝剂的目的，是将提取液中的多酚、鞣质、蛋白质等杂质絮凝并沉降。

优选地，步骤(2)中，所述的离心没有特别的限定，能够除去絮凝沉淀的离心方式皆可。优选为卧螺离心。卧螺离心的目的是除去絮状沉淀，从而除去多酚、鞣质、蛋白质等杂质。

优选地，步骤(2)中，所述超滤膜的截留分子量为1000～2000Da，超滤的压力为0.2～0.4Mpa。超滤的目的，是除去离心液中残留的絮凝剂以及无法絮凝的少量大分子杂质。

优选地，步骤(3)中，所述大孔吸附树脂的型号为LX-38、LX-32、LX-162、LX-157、LX-158、D101C、LX-T28、LX-T81、LSA-10、LX-12、LX-100B，大孔吸附树脂的用量为原料重量的0.5～2倍(L/kg)，大孔吸附树脂柱的高径比为2～6:1，超滤膜滤液通过大孔吸附树脂柱的流速为0.5～2.0BV/h。

优选地，步骤(4)中，所述弱碱溶液为碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中至少一种的水溶液，弱碱溶液的质量百分比浓度为0.5％～2％，弱碱溶液的用量为2～3BV，弱碱溶液通过树脂柱的流速为1～2BV/h。

优选地，步骤(4)中，所述稀酸溶液为盐酸、硫酸、水溶液，稀酸溶液的质量百分比浓度为0.1％～1％，稀酸溶液的用量为2～3BV，稀酸溶液通过树脂柱的流速为1～2BV/h。使用弱碱溶液和稀酸溶液冲洗树脂柱的目的，是除去吸附在树脂上的色素及其它杂质。

优选地，步骤(5)中，所述低浓度醇和高浓醇的醇为甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇中的至少一种，优选为乙醇。所述低浓度醇中还溶有少量的羧酸，其体积百分浓度为0.3～0.5％；所述羧酸选自醋酸，苹果酸，柠檬酸，苯甲酸；优选为醋酸。

所述低浓度醇的体积百分浓度为10～30％，用量2～4BV，洗脱流速0.5～1BV/h；优选地，所述低浓度醇的体积百分浓度为18～25％，用量为2～3BV，洗脱流速为0.7～1.0BV/h。低浓度醇洗脱的目的是将吸附于大孔树脂上的三叶苷解吸。若低浓度醇的体积百分比浓度过低、用量过少或洗脱的流速过快，都将导致三叶苷无法彻底洗脱，造成三叶苷的收率偏低；若低浓度醇的体积百分比浓度过高、用量过多或洗脱的流速过慢，都将导致部分根皮苷和三叶苷同时被洗脱，造成三叶苷的含量偏低、根皮苷的收率偏低。

所述高浓度醇的体积百分比浓度为60％～80％，用量为2～4BV，洗脱流速为0.5～1.0BV/h；优选地，所述高浓度醇的体积百分比浓度为65％～75％，用量为2～3BV，洗脱流速为0.7～1.0BV/h。高浓度醇洗脱的目的是将吸附于大孔树脂上的根皮苷解吸。若高浓度醇的体积百分比浓度过低、用量过少或洗脱的流速过快，都将导致根皮苷无法彻底洗脱，造成根皮苷的收率偏低；若高浓度醇的体积百分比浓度过高、用量过多或洗脱的流速过慢，都将造成物料和能源的浪费。

优选地，步骤(6)中，所述醇溶剂选自甲醇或乙醇，三叶苷在甲醇/乙醇中溶解度随温度变化较大。醇溶剂的用量为三叶苷粗品重量的5～8倍(L/kg)，所述温水的用量为三叶苷粗品的5～8倍(L/kg)，温水的温度为50～70℃。往三叶苷粗品的无水甲醇/乙醇溶液中滴加温水的目的，是降低溶液中甲醇/乙醇的体积百分比浓度，从而降低三叶苷的溶解度，使三叶苷逐渐析出，同时黄酮类杂质少析出或不析出，以确保三叶苷结晶的含量。若温水的用量过多或温水的温度过低，将导致黄酮类杂质和三叶苷一起过快的析出，造成三叶苷晶体的含量偏低；若温水的用量过少或温水的温度过高，将导致三叶苷的析出不彻底或析晶速度太慢，造成三叶苷的收率偏低。

优选地，步骤(6)中，所述降温冷却的温度为5～10℃，搅拌的速度为30～90r/min，析晶的时间为12～24小时。

优选地，步骤(7)中，所述活性炭的用量为原料重量的1‰～5‰。加入活性炭的目的，是除去高浓度乙醇解吸液中少量的黄酮类杂质，以提高根皮苷产品的含量。

优选地，步骤(7)中，所述浓缩液中固形物的浓度为20％～25％，所述降温冷却的温度为5～10℃，搅拌的速度为30～90r/min，析晶的时间为12～24小时。降温冷却、搅拌析晶的目的是使浓缩液中的杂质少析出或不析出、根皮苷多析出。若浓缩液中固形物的浓度过高、降温冷却的温度过低、搅拌的速度过慢或析晶的时间过长，都将导致杂质大量析出，造成根皮苷的含量偏低；若浓缩液中固形物的浓度过低、降温冷却的温度过高、搅拌的速度过快或析晶的时间过短，都将导致根皮苷析出不完全，造成根皮苷的收率偏低。

本发明中，1BV＝1个树脂柱填装体积。

本发明方法的原理：芷江野生甜茶中的三叶苷和根皮苷都易溶于热水，可以用热水提取的方式将两者从原料中浸出。同时被热水浸出的杂质，比如多酚、鞣质、蛋白质等可用絮凝剂凝聚、沉降，离心除去。三叶苷和根皮苷都可以被大孔树脂吸附，如果用常规的方法、一次性的用乙醇洗脱大孔树脂柱，那么，三叶苷和根皮苷将无差别的同时被洗脱，从而无法达到分离的目的。但是，由于三叶苷和根皮苷极性的差异，三叶苷的极性小，可以被低浓度醇从大孔树脂上洗脱；根皮苷的极性大，不会被低浓度醇从大孔树脂上洗脱。此外，在低浓度乙醇中加入少量有机羧酸，能够增加低度乙醇对三叶苷的选择性洗脱能力(低度乙醇含有适量的羧酸只会洗脱三叶苷，不会洗脱根皮苷)。因此，利用含少量羧酸的低浓度醇和高浓度醇进行梯度洗脱，可将三叶苷和根皮苷依次、分别洗脱，从而达到了分离的目的。

本发明方法的有益效果如下：

(1)按照本发明方法所得三叶苷精品的含量高达98％，收率高达93％；按照本发明方法所得根皮苷精品的含量高达98％，收率高达97％。即两种产品的纯度和收率都得到了保证和改善。

(2)本发明方法可同时获得两种高含量的芷江野生甜茶天然活性成分，实现了资源综合利用，工艺连贯，可操作性强，设备要求低，生产成本低，适宜于工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的芷江野生甜茶干叶购于湖南芷江，其中，三叶苷和根皮苷的质量含量分别为0.57％、6.19％；本发明实施例所使用的大孔吸附树脂购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用高效液相色谱(HPLC)外标法检测三叶苷和根皮苷的含量。

实施例1

(1)粉碎、提取：取干燥的芷江野生甜茶叶片原料200kg，粉碎至粒径为2～3mm，投入提取罐中，用温度为98℃的热水提取两次(第一次提取的热水用量为2800L，提取时间为3小时；第二次提取的热水用量为2000L，提取时间为2小时)，过滤，得提取液；

(2)絮凝、离心、超滤：将提取液冷却至室温，加入絮凝剂PAC和PAM(用量分别为2kg、2kg)，絮凝，卧螺离心，离心液用截留分子量为2000Da的超滤膜在压力为0.2Mpa条件下过滤，得超滤膜滤液；

(3)大孔树脂吸附：将超滤膜滤液以1.5BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂的型号为LX-38，树脂的用量为300L，大孔吸附树脂柱的高径比为4:1)；

(4)除杂：先用2BV质量百分比浓度为1.5％的碳酸氢钠水溶液冲洗树脂柱(流速为1BV/h)，水洗至上柱流出液pH值中性、基本无色；再用2.5BV质量百分比浓度为0.5％的盐酸水溶液冲洗树脂柱(流速为1.5BV/h)，水洗至上柱流出液pH值中性、基本无色；

(5)梯度洗脱：大孔吸附树脂柱先后用低浓度乙醇(乙醇的体积百分比浓度20％，用量为2.5BV，洗脱流速1.0BV/h，其中醋酸体积百分比浓度为0.4％)和高浓度乙醇(乙醇的体积百分比浓度65％，用量为3BV，洗脱流速1.0BV/h)洗脱，分别收集低浓度乙醇洗脱液和高浓度乙醇洗脱液；

(6)三叶苷的分离和精制：取低浓度乙醇洗脱液，浓缩至无醇，真空干燥，得三叶苷粗品1.60kg。将三叶苷粗品用12L无水乙醇加热溶解，趁热过滤除去不溶物，滤液在搅拌下滴加12L温度为65℃的温水，自然降温至室温，降温冷却至10℃，以30r/min的搅拌速度，析晶24小时，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得三叶苷精品1.09kg。

(7)根皮苷的分离和精制：取高浓度乙醇洗脱液，加入0.4kg活性炭，加热搅拌，过滤，浓缩至浓缩液中固形物的浓度为22％，将浓缩液降温冷却至5℃，以90r/min的搅拌速度，析晶16小时，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得根皮苷精品12.23kg。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为98.26％，三叶苷的收率为93.95％；本实施例所得根皮苷精品的含量为99.03％，根皮苷的收率为97.80％。

实施例2

(1)粉碎、提取：取干燥的芷江野生甜茶叶片原料200kg，粉碎至粒径为3～4mm，投入提取罐中，用温度为90℃的热水提取两次(第一次提取的热水用量为3000L，提取时间为3小时；第二次提取的热水用量为1600L，提取时间为1小时)，过滤，得提取液；

(2)絮凝、离心、超滤：将提取液冷却至室温，加入絮凝剂PAC和PAM(用量分别为2kg、1.5kg)，絮凝，卧螺离心，离心液用截留分子量为1500Da的超滤膜在压力为0.3Mpa条件下过滤，得超滤膜滤液；

(3)大孔树脂吸附：将超滤膜滤液以1BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂的型号为LX-32，树脂的用量为200L，大孔吸附树脂柱的高径比为5:1)；

(4)除杂：先用3BV质量百分比浓度为1％的碳酸钾水溶液冲洗树脂柱(流速为2BV/h)，水洗至上柱流出液pH值中性、基本无色；再用2BV质量百分比浓度为0.2％的硫酸水溶液冲洗树脂柱(流速为1BV/h)，水洗至上柱流出液pH值中性、基本无色；

(5)梯度洗脱：大孔吸附树脂柱先后用低浓度乙醇(乙醇的体积百分比浓度25％，用量为2BV，洗脱流速0.8BV/h，其中醋酸体积百分比浓度为0.5％)和高浓度乙醇(乙醇的体积百分比浓度70％，用量为2.5BV，洗脱流速1.0BV/h)洗脱，分别收集低浓度乙醇洗脱液和高浓度乙醇洗脱液；

(6)三叶苷的分离和精制：取低浓度乙醇洗脱液，浓缩至无醇，真空干燥，得三叶苷粗品1.55kg。将三叶苷粗品用12L无水乙醇加热溶解，趁热过滤除去不溶物，滤液在搅拌下滴加12L温度为60℃的温水，自然降温至室温，降温冷却至6℃，以60r/min的搅拌速度，析晶18小时，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得三叶苷精品1.10kg。

(7)根皮苷的分离和精制：取高浓度乙醇洗脱液，加入0.5kg活性炭，加热搅拌，过滤，浓缩至浓缩液中固形物的浓度为25％，将浓缩液降温冷却至8℃，以60r/min的搅拌速度，析晶20小时，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得根皮苷精品12.12kg。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为97.92％，三叶苷的收率为94.48％；本实施例所得根皮苷精品的含量为98.74％，根皮苷的收率为96.67％。

实施例3

(1)粉碎、提取：取干燥的芷江野生甜茶叶片原料200kg，粉碎至粒径为4～5mm，投入提取罐中，用温度为92℃热水提取两次(第一次提取的热水用量为2200L，提取时间为3小时；第二次提取的热水用量为1800L，提取时间为1.5小时)，过滤，得提取液；

(2)絮凝、离心、超滤：将提取液冷却至室温，加入絮凝剂PAC和PAM(用量分别为1.5kg、2kg)，絮凝，卧螺离心，离心液用截留分子量为1000Da的超滤膜在压力为0.35Mpa条件下过滤，得超滤膜滤液；

(3)大孔树脂吸附：将超滤膜滤液以0.5BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂的型号为LX-T28，树脂的用量为150L，大孔吸附树脂柱的高径比为6:1)；

(4)除杂：先用2BV质量百分比浓度为1％的碳酸钠水溶液冲洗树脂柱(流速为1BV/h)，水洗至上柱流出液pH值中性、基本无色；再用3BV质量百分比浓度为1％的柠檬酸水溶液冲洗树脂柱(流速为2BV/h)，水洗至上柱流出液pH值中性、基本无色；

(5)梯度洗脱：大孔吸附树脂柱先后用低浓度乙醇(乙醇的体积百分比浓度18％，用量为3BV，洗脱流速1.0BV/h，其中醋酸体积百分比浓度为0.3％)和高浓度乙醇(乙醇的体积百分比浓度75％，用量为2BV，洗脱流速0.7BV/h)洗脱，分别收集低浓度乙醇洗脱液和高浓度乙醇洗脱液；

(6)三叶苷的分离和精制：取低浓度乙醇洗脱液，浓缩至无醇，真空干燥，得三叶苷粗品1.52kg。将三叶苷粗品用10L无水乙醇加热溶解，趁热过滤除去不溶物，滤液在搅拌下滴加10L温度为68℃的温水，自然降温至室温，降温冷却至8℃，以90r/min的搅拌速度，析晶20小时，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得三叶苷精品1.10kg。

(7)根皮苷的分离和精制：取高浓度乙醇洗脱液，加入0.6kg活性炭，加热搅拌，过滤，浓缩至浓缩液中固形物的浓度为20％，将浓缩液降温冷却至10℃，以30r/min的搅拌速度，析晶24小时，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得根皮苷精品12.21kg。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为98.16％，三叶苷的收率为94.72％；本实施例所得根皮苷精品的含量为98.65％，根皮苷的收率为97.30％。

实施例4

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于，步骤(5)的梯度洗脱中，低浓度乙醇中醋酸的百分比浓度为0.1％。经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为97.17％，三叶苷的收率为87.34％；本实施例所得根皮苷精品的含量为98.20％，根皮苷的收率为96.45％。

实施例5

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于，步骤(5)的梯度洗脱中，低浓度乙醇中醋酸的百分比浓度为0.7％。经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为97.04％，三叶苷的收率为93.94％；本实施例所得根皮苷精品的含量为98.26％，根皮苷的收率为92.65％。

实施例6

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于，步骤(5)的梯度洗脱中，低浓度乙醇中醋酸替换为苹果酸，体积百分比浓度为0.4％。经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为97.25％，三叶苷的收率为93.48％；本实施例所得根皮苷精品的含量为98.31％，根皮苷的收率为96.07％。

实施例7

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于，步骤(5)的梯度洗脱中，低浓度乙醇用量为4BV，洗脱流速0.5BV/h。经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为95.31％，三叶苷的收率为94.35％；本实施例所得根皮苷精品的含量为98.64％，根皮苷的收率为93.62％。

实施例8

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于，步骤(5)的梯度洗脱中，高浓度乙醇用量为1.5BV，洗脱流速1.5BV/h。经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为98.21％，三叶苷的收率为93.92％；本实施例所得根皮苷精品的含量为97.92％，根皮苷的收率为93.89％。

对比例1

其他条件和操作和实施例1相同，区别在于，步骤(5)的梯度洗脱中，低浓度乙醇中不加入醋酸。经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得三叶苷精品的含量为97.25％，三叶苷的收率为80.53％；本实施例所得根皮苷精品的含量为93.61％，根皮苷的收率为97.32％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从芷江野生甜茶中分离三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

(1)粉碎、提取：将干燥的芷江野生甜茶叶片原料粉碎，热水提取，过滤，得提取液；

(2)絮凝、离心、超滤：将提取液冷却至室温，加入絮凝剂，离心，离心液用超滤膜过滤；

(3)大孔树脂吸附：将超滤膜滤液通过大孔吸附树脂柱；

(4)除杂：先用弱碱溶液冲洗树脂柱，水洗至上柱流出液pH值中性或基本无色；再用稀酸溶液冲洗树脂柱，水洗至上柱流出液pH值中性或基本无色；

(5)梯度洗脱：大孔吸附树脂柱先后用低浓度醇和高浓度醇洗脱，分别收集低浓度醇洗脱液和高浓度醇洗脱液，所述低浓度醇中含有少量羧酸；

(6)三叶苷的分离和精制：取低浓度醇洗脱液，浓缩至无醇，真空干燥，得三叶苷粗品，将三叶苷粗品用醇溶剂热溶解，趁热过滤除去不溶物，滤液在搅拌下滴加温水，自然降温至室温，降温冷却，搅拌析晶，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得三叶苷精品；

(7)根皮苷的分离和精制：取高浓度醇洗脱液，加入活性炭，加热搅拌，过滤，浓缩，将浓缩液降温冷却，搅拌析晶，抽滤，晶体再用冰水淋洗，真空干燥，得根皮苷精品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述原料粉碎的粒径为2～5mm，所述热水提取的温度为85～100℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的絮凝剂为聚合氯化铝(PAC)和/或聚丙烯酰胺(PAM)，絮凝剂的用量均为原料重量的0.5％～2％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超滤膜的截留分子量为1000～2000Da，超滤的压力为0.2～0.4Mpa。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述大孔吸附树脂的用量为原料重量的0.5～2倍(L/kg)，大孔吸附树脂柱的高径比为2～6:1，超滤膜滤液通过大孔吸附树脂柱的流速为0.5～2.0BV/h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述弱碱溶液为碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中至少一种的水溶液，弱碱溶液的质量百分比浓度为0.5％～2％，弱碱溶液的用量为2～3BV，弱碱溶液通过树脂柱的流速为1～2BV/h；和/或

所述稀酸溶液为盐酸、硫酸的水溶液，稀酸溶液的质量百分比浓度为0.1％～1％，稀酸溶液的用量为2～3BV，稀酸溶液通过树脂柱的流速为1～2BV/h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述低浓度醇和高浓醇的醇为甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇中的至少一种，优选为乙醇。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述低浓度醇中羧酸的体积百分浓度为0.3～0.5％；所述羧酸选自醋酸，苹果酸，柠檬酸，苯甲酸；优选为醋酸。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述低浓度醇的体积百分浓度为10～30％，用量2～4BV，洗脱流速0.5～1BV/h；优选地，所述低浓度醇的体积百分浓度为18～25％，用量为2～3BV，洗脱流速为0.7～1.0BV/h；和/或

所述高浓度醇的体积百分比浓度为60％～80％，用量为2～4BV，洗脱流速为0.5～1.0BV/h；优选地，所述高浓度醇的体积百分比浓度为65％～75％，用量为2～3BV，洗脱流速为0.7～1.0BV/h。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述醇溶剂选自甲醇或乙醇，醇溶剂的用量为三叶苷粗品重量的5～8倍(L/kg)，所述温水的用量为三叶苷粗品的5～8倍(L/kg)，温水的温度为50～70℃；和/或所述降温冷却的温度为5～10℃，搅拌的速度为30～90r/min，析晶的时间为12～24小时；和/或

步骤(7)中，所述活性炭的用量为原料重量的1‰～5‰；和/或

步骤(7)中，所述浓缩液中固形物的浓度为20％～25％，所述降温冷却的温度为5～10℃，搅拌的速度为30～90r/min，析晶的时间为12～24小时。