CN111635440B - 一种从枳实中分离多种活性成分的方法 - Google Patents

一种从枳实中分离多种活性成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从枳实中分离多种活性成分的方法，包括以下步骤：(1)枳实精油的提取与分离；(2)酶解：加入纤维素酶进行酶解；(3)果胶的提取和分离；(4)多糖的分离；(5)辛弗林的分离；(6)水溶性黄酮的分离；(7)橙皮苷的提取和分离：将步骤(3)所得离心渣加入碱液，循环提取渗漉，加入硅藻土，粗过滤，超滤膜过滤，超滤滤液依次用稀酸调节pH值8～9，再用酸调节pH值6～7，最终得枳实橙皮苷。本发明提供的方法可连续提取多种枳实活性成分且各种活性成分的含量高、收率高，特别是橙皮苷产品，含量高，且不含异柚皮苷。

Description

一种从枳实中分离多种活性成分的方法
技术领域
本发明涉及天然产物的分离提取，具体涉及一种从枳实中分离多种活性成分的方法。
背景技术
枳实，芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrussinensis Osbeck的干燥幼果。酸橙主产于江西、四川、湖北、湖南、浙江、江苏、福建、贵州等地；甜橙在江苏、浙江、江西、四川、贵州、福建、台湾、广东、广西、云南等地均有栽培。
在传统中医领域，枳实辛散苦降，气锐力猛，为破气除痞，消积导滞之要药，用治积滞内停，痞满胀痛，泻痢后重，大便不通等证，常作为主药。药理学研究发现，枳实具有以下多种药用用途：对胃肠道运动及子宫平滑肌有抑制和兴奋双重作用；有强心、增加心输血量和收缩血管作用；抗炎；抗菌、抗病毒；抗变态反应；抗氧化；镇痛；中枢抑制；解热；治疗毛细血管脆性增加的出血性紫癜等等。
枳实之所以具有以上多种不同的药用用途，是与枳实中含有丰富的天然活性成分是分不开的，如：枳实精油、枳实果胶、枳实多糖、枳实水溶性黄酮、辛弗林和橙皮苷等。其中枳实精油主要由柠檬烯、芳樟醇、异松香烯等组成；枳实水溶性黄酮包括柚皮苷、新橙皮苷、柚皮芸香苷和川陈皮素等。
现有技术中，对枳实活性成分的分离和纯化，往往只是针对其中的一种或两、三种成分，对其余多种同样具有生理活性的成分没有加以利用，而是当成废弃物丢弃。由于没有实现资源的综合利用，此举不但会对环境造成严重的污染，还会在经济上造成了巨大的浪费。尤其是对橙皮苷的提取过程中，还普遍存在碱和酸的浓度高、用量大，污水排放多的工艺缺陷。
CN200710034378.3公开了冷去杂一步法提取高纯度橙皮苷制备工艺，是以枳实、枳壳、青皮、柚皮、陈皮为原料，经破碎、氢氧化钠溶液去杂、氢氧化钙溶液提取、加热酸化、结晶等步骤，得到橙皮苷产品。该方法在去杂步骤使用的是强碱，部分橙皮苷可能会被浸出，易造成橙皮苷的收率偏低。
CN200910155907.4公开了一种从陈皮中提取橙皮苷的方法，是以陈皮为原料，经破碎、碱液混合研磨、加水、离心、调酸等步骤，得到橙皮苷产品。该方法得到的橙皮苷产品含量偏低，最高含量仅91％。
CN201110103032.0公开了一种从陈皮中提取陈皮油树脂和橙皮苷的方法，是以陈皮粉为原料，经乙醇连续微波提取、真空抽滤、浓缩等步骤得到陈皮油树脂；提取渣经氢氧化钙和还原剂连续微波提取、真空抽滤、调节pH等步骤，得到橙皮苷产品。该方法由于氢氧化钙碱性不足的原因，无法将原料中的橙皮苷充分、彻底浸出，导致橙皮苷的收率偏低。
CN201610725509.1公开了一种从芸香科植物枳实中提取橙皮苷的方法，是以枳实为原料，经粉碎、水煮除杂、碳酸钠溶液二次除杂、氢氧化钠和氢氧化钙混合溶液提取、酸化、碱醇钠溶解、调酸结晶等步骤，得到纯度为92％的橙皮苷产品。该方法仅针对橙皮苷含量大于25％的高含量枳实原料，且所得到的产品中橙皮苷的含量偏低。
CN201410301178.X公开了枳实中联合提取辛弗林、橙皮苷和PMFs的工艺，是以枳实为原料，经酸液渗漉、浓缩、树脂吸附、氨水解吸等步骤得到辛弗林；经碱液渗漉、浓缩、无水甲醇或无水乙醇溶解、过滤、浓缩、树脂吸附、调酸等步骤，分别得到橙皮苷和PMFs。该工艺使用的碱、酸浓度高且用量大，两次浓缩过程都是在强酸或强碱条件下进行，活性成分在该条件下易分解，导致收率很低，经济价值不高。此外，该方法使用的无水甲醇或无水乙醇用量大，实际生产中无法回收并循环使用。
CN201610567977.0公开了一种从枳实中分离高纯度橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷和辛弗林的方法，但是该方法是先酶解，再进行水提，按照该方法无法得到枳实精油，因为原料酶解膨胀以后，亲脂性有机溶剂无法渗入湿的原料中。由于枳实原料中的精油、果胶和多糖都未针对性的浸出或去除，所以该方法获得的几种活性成分都需要经过离子交换树脂吸附或重结晶等工艺方法处理，才能得到纯度高的产品，生产周期过长。此外，该方法用碱液提取橙皮苷的过程中，若提取温度过高，橙皮苷在强碱性溶液中黄酮结构开环后，有被破坏、降解的风险。
此外，以上公开文件对橙皮苷的分离纯化过程中，都没有对一种同样来源于枳实原料、溶解性和理化性质与橙皮苷极为相识、难以轻易去除、橙皮苷成品中普遍存在的杂质——异柚皮苷——做针对性的研究、去除和检测。这也是目前市场上橙皮苷成品的含量规格普遍在85％至95％之间的原因。橙皮苷的主要用途是用于半合成地奥司明(Diosmin)，这是一种市场需求量极大的增强静脉张力药物和血管保护剂。橙皮苷成品中如果存在的异柚皮苷，将极大的影响半合成产品中地奥司明的纯度和药物的疗效。因此，对于橙皮苷的纯度也提出了很高的要求。
研究发现，地奥司明药典标准中规定的“杂质C”的来源，与异柚皮苷有密切的关系。橙皮苷半合成地奥司明的反应式如下：
Figure BDA0002574222800000031
如果橙皮苷中混有少量异柚皮苷，在半合成反应过程中，异柚皮苷同样会参与碘化和脱氢的反应，反应的产物就是地奥司明药典标准中规定的“杂质C”，反应式如下：
Figure BDA0002574222800000032
由此可见，橙皮苷成品中如果存在的异柚皮苷，将极大的影响半合成产品中地奥司明的纯度和药物的疗效。因此，对于橙皮苷的纯度也提出了很高的要求。
因此，目前亟需一种可将枳实资源综合利用、适合工业化生产、可连续提取多种枳实活性成分的新方法，并且得到的橙皮苷产品纯度高，不含有异柚皮苷，适合作为制备药物地奥司明的原料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种全新的、可将枳实资源综合利用，工艺连贯、简单，可操作性强，酸和碱的用量少，污水排放少，生产成本低，不使用有毒有害化工溶剂，安全环保，各种活性成分的含量高、收率高，且橙皮苷产品中不含异柚皮苷，产品质量高；本发明方法适合工业化生产，可连续提取多种枳实活性成分的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从枳实中分离多种活性成分的方法，包括以下步骤：
(1)枳实精油的提取与分离：将枳实原料破碎，投入提取罐中，加入亲脂性有机溶剂，加热回流提取，过滤，分别得提取液和提取渣；将提取液通过硅胶层析柱，收集硅胶层析柱流出液，浓缩至无溶剂，得枳实精油；
(2)酶解：将步骤(1)中的提取渣中有机溶剂蒸除干净，加入水，调节pH值为弱酸性，加入纤维素酶进行酶解；
(3)果胶的提取和分离：将步骤(2)酶解后的物料加热，搅拌提取，冷却，离心过滤，得离心渣和离心滤液，离心滤液陶瓷膜过滤，超滤膜过滤，收集超滤膜截留液和透过液；超滤膜截留液经过脱色，减压浓缩，醇沉，过滤，得絮状沉淀和醇的滤液，将絮状沉淀物干燥，得枳实果胶；
(4)多糖的分离：取步骤(3)醇的滤液，减压浓缩至无醇，干燥，得枳实多糖；
(5)辛弗林的分离：将步骤(3)超滤膜透过液用纳滤膜过滤，纳滤膜透过液先用和水不混溶的中等极性溶剂萃取，再用氨水反萃取，浓缩，干燥，得辛弗林；
(6)水溶性黄酮的分离：取步骤(5)纳滤膜截留液，用金属氧化物脱色，过滤，减压浓缩，干燥，得枳实水溶性黄酮；
(7)橙皮苷的提取和分离：将步骤(3)所得离心渣，加入碱液，循环提取渗漉，直至离心渣中橙皮苷提取完全，收集渗漉液；加入硅藻土，粗过滤，超滤膜过滤，超滤滤液用稀酸调节pH值8～9，加热，保温，再用酸调节pH值6～7，静置析晶过夜，离心，水洗，干燥，得枳实橙皮苷。
优选的，步骤(1)中，所述亲脂性有机溶剂是指乙醚、石油醚、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、6#溶剂油、120#溶剂油中的至少一种。
优选地，步骤(1)中，所述加热回流提取，为两次以上提取，亲脂性有机溶剂总的体积用量枳实原料重量的12-20倍(L/kg)。每次提取的溶剂用量依次减少30-50％。提取总时间为3-8小时，每次提取的时间依次减少30-60％。
比如，如果为两次提取，所用亲脂性有机溶剂的用量依次为枳实原料重量的8～10倍、5～8倍(L/kg)，回流提取的时间依次为2～3小时、1～2小时。使用亲脂性有机溶剂多次提取的目的，是利用枳实精油易溶于亲脂性有机溶剂的原理，将枳实原料中的枳实精油充分浸出；第二是将枳实原料中的枳实精油等脂溶性成分充分浸出后，即有利于后续步骤中水渗透入原料细胞组织中，也有利于酶解。
优选的，步骤(1)中，所述柱层析硅胶的用量为枳实原料重量的0.05～0.1倍(L/kg)，所述硅胶层析柱的高径比为5～8:1，上柱的流速为0.5～1.0BV/小时。将有机溶剂提取液通过硅胶层析柱的目的，是除去有机溶剂提取液中的脂溶性色素等杂质，提高枳实精油的纯度。
优选的，步骤(2)中，所述纯水的用量为枳实原料重量的8～10倍(L/kg)，所述调节pH值为弱酸性是指调节pH值为4.5～6.0。
所述酶解，是加入纤维素酶，优选地，还可以加入原果胶酶，在室温下搅拌均匀，酶解时间为4-6小时。
维素酶和/或原果胶酶的用量为枳实原料重量的1‰～5‰，优选为1‰～3‰。加入纤维素酶的目的，是将枳实细胞组织中的细胞壁主要成分纤维素酶解，从而有利于后续各种活性成分的充分浸出。加入原果胶酶的目的，是将枳实原料中不溶于水的原果胶酶解为可溶于水的小分子果胶，有利于热水将果胶充分浸出，可提高果胶的收率，从而防止果胶溶于后续的碱水中，降低后续橙皮苷分离纯化的难度。
本发明中，步骤1)的提取和步骤2)的酶解，顺序不能颠倒，如果先酶解，再提取，原料酶解膨胀以后，亲脂性有机溶剂无法渗入湿的原料中，导致枳实精油的收率将极低。
优选的，步骤(3)中，所述加热的温度为80～95℃，搅拌提取的时间为2～3小时。加热、搅拌提取的目的，第一是灭酶，第二是将酶解后的枳实原料中易溶于水的果胶、多糖、辛弗林以及水溶性黄酮充分浸出，从而减少后续碱水提取步骤中非橙皮苷成分浸出，降低橙皮苷分离纯化的难度。
优选的，步骤(3)中，所述陶瓷膜的孔径为20～50nm。使用陶瓷膜过滤的目的，是除去离心滤液中细微的原料颗粒和因加热而变性析出的蛋白质。步骤(3)过滤只能使用陶瓷膜，本领域其他的膜分离技术，超滤，纳滤，反渗透膜的截留分子量太小，细微的原料颗粒和因加热而变性析出的蛋白质会被截留，但是需要的目标成分也会被截留。
优选的，步骤(3)中，所述超滤膜的截留分子量为800～2000Da，超滤的压力为0.1～0.3Mpa。使用超滤膜过滤的目的是，果胶和多糖因分子量大，无法透过超滤膜的孔隙，因此被超滤膜截留，存在于超滤膜截留液中；辛弗林、水溶性黄酮以及无机盐等分子量小，因此可以通过超滤膜的孔隙，存在于超滤膜透过液中，从而实现了陶瓷膜滤液中大、小分子量成分的分离。
优选的，步骤(3)中，所述脱色使用活性炭，活性炭的用量为枳实原料重量的2‰～10‰，室温搅拌的时间为2～3小时。加入活性炭、室温搅拌的目的是除去超滤膜截留液中的色素和杂质。
优选的，步骤(3)中，所述浓缩液的固形物含量为15％～25％，所述醇沉物料中醇的体积分数为40％～60％。所述醇为低碳醇，优选为乙醇。浓缩并醇沉的目的是将超滤膜截留液中的果胶沉淀、析出，使其与超滤膜截留液中另一种大分子成分——多糖——分离。若浓缩液的固形物含量过低、醇沉物料中乙醇的体积分数过小，将导致果胶的析出不充分，造成果胶的收率偏低、且后续得到的多糖含量偏低；若浓缩液的固形物含量过高、醇沉物料中乙醇的体积分数过大，将导致部分多糖跟果胶同时析出，造成果胶的含量偏低、且后续得到的多糖收率偏低。
优选的，步骤(5)中，所述纳滤膜的截留分子量为200～500Da，纳滤的压力为0.3～0.6Mpa。使用纳滤膜过滤的目的是，水溶性黄酮的分子量较大，无法透过纳滤膜的孔隙，因此被纳滤膜截留，存在于纳滤膜截留液中；辛弗林和无机盐分子量较小，因此可以通过纳滤膜的孔隙，存在于纳滤膜透过液中，从而实现了超滤膜透过液中分子量偏大、分子量较小成分的分离。使用纳滤膜还有一个目的，即将纳滤膜截留液浓缩，方便后续水溶性黄酮的制备。
优选的，步骤(5)中，所述和水不混溶的中等极性溶剂选自正丁醇，正戊醇，丁酮，乙酸丁酯，异丙醚中的至少一种，用量为枳实原料重量的5％～10％。使用和水不混溶的中等极性溶剂的目的，是将辛弗林从无机盐含量较高的纳滤膜透过液中萃取出，达到脱盐、提高纯度的目的。
优选的，步骤(5)中，所述氨水的质量百分比浓度为5％～10％，所述氨水的用量为枳实原料重量的5％～10％(L/kg)。使用氨水反萃取的目的，是将有机溶剂中的辛弗林转移至氨水层中，氨水的沸点低，易于浓缩，且浓缩、干燥后无灰分残留。
优选的，步骤(6)中，所述金属氧化物选自活性氧化镁，氧化铝中的至少一种，金属氧化物的用量为枳实原料重量的2‰～10‰，所述室温搅拌的时间为2～3小时。加入金属氧化物室温搅拌的目的是除杂和脱色，对杂质吸附量大，而对黄酮类成分吸附小；同时金属氧化物活经再生、活化处理后，可以重复使用。
优选的，步骤(7)中，所述的碱液为氢氧化钙，氢氧化钠，氢氧化钾中的至少一种的溶液。优选地，使用氢氧化钙和氢氧化钠(钾)的混合物的液碱溶液，更为优选地，液碱溶液中，氢氧化钙的质量百分比的浓度为0.1％～0.15％，氢氧化钠/氢氧化钾的质量百分比的浓度为0.5％～1％，所述碱液的用量为枳实原料重量的5～6倍(L/kg)。加入氢氧化钠/氢氧化钾的目的是将步骤(3)离心渣中的橙皮苷充分浸出。加入氢氧化钙的目的，是因为步骤(3)离心渣中如果残留少量的果胶，势必会和橙皮苷一起被碱液浸出，钙离子的存在将使果胶凝聚，该部分可能存在的果胶杂质将在后续的过滤步骤除去，从而达到提高并确保调酸前碱性物料中橙皮苷的纯度。
优选的，步骤(7)中，所述的渗漉没有特别的限定，可以为正向渗漉或反向渗漉。正向渗漉即传统的渗漉方式，液体物料从渗漉器顶部进入，再从渗漉器底部流出；反向渗漉则相反，液体物料从渗漉器底部进入，再从渗漉器顶部流出。所述渗漉的流速为5～20BV/小时，所述渗漉的时间为4～6小时。使用循环提取渗漉方式的目的是，将用量有限的碱液，在短时间内反复与原料接触、快速完成传质和渗透，从而达到提取完全的最终目的。
优选的，步骤(7)中，所述硅藻土的用量为枳实原料重量的1％～3％，所述室温搅拌的时间为2～3小时。加入硅藻土、室温搅拌的目的，第一是除去存在于原料中、且性质与橙皮苷极为接近、与橙皮苷一同被碱液浸出的异柚皮苷，第二是脱色，从而提高橙皮苷的纯度或含量。
优选的，步骤(7)中，所述超滤膜的截留分子量为1000～2000Da，超滤的压力为0.1～0.3Mpa。超滤的目的是使溶解于碱液的橙皮苷透过超滤膜，并除去细微的不溶物颗粒(原料粉末、絮凝物或细小的硅藻土等)，从而提高物料的澄清度和产品的纯度。
优选的，步骤(7)中，所述加热的温度为50～65℃，保温的时间为0.5～2小时。
优选地，步骤(7)中，所述稀酸为5-10wt％盐酸或硫酸。本发明先用酸调节pH值8～9、加热、保温、再用酸调节pH值6～7，而不是如传统工艺一般、直接将pH值调至酸性。本发明分为两步调节pH的目的在于：橙皮苷在碱性条件下，其黄酮结构开环生成易溶于水的橙皮苷查尔酮(因此橙皮苷易溶解于碱液中)，橙皮苷查尔酮遇酸则黄酮结构闭环，分子结构恢复为水溶性极差的橙皮苷(从而从酸水中析出)。发明人研究发现，溶有橙皮苷的碱液用酸调节pH值8～9时，虽然此时溶液中的分子形态仍然为开环的橙皮苷查尔酮，但是选择适宜的温度加热和保温，即可以确保橙皮苷查尔酮不发生高温水解，又可以使橙皮苷查尔酮利用水分子(H2O)电离出的氢原子(H+)生成部分橙皮苷，提高了橙皮苷的收率，并且减少了酸的用量，减少污水的排放，综合极大降低了橙皮苷的生产成本，以较高收率制得产品纯度高，质量好的橙皮苷。
本发明中，1BV＝1个硅胶柱或原料填装体积。
本发明方法的原理是：
枳实原料粉碎后，先用亲脂性有机溶剂可以将脂溶性的枳实精油充分浸出，亲脂性有机溶剂提取液通过硅胶层析柱脱色，可得到纯度较高的枳实精油；酶解后的原料渣中，果胶、多糖、水溶性黄酮和辛弗林等水溶性成分，都可以被热水浸出，可依次分别用超滤膜、醇沉、纳滤膜、萃取与反萃取等方式将四者分离；上述五种成分和绝大部分杂质(包括脂溶性杂质和水溶性杂质)被分离和提纯后，最终存在于热水提取渣中的橙皮苷被碱水浸出，杂质极少，最难分离的杂质——异柚皮苷——可以在碱液中用硅藻土吸附并除去，从而得到高含量、高纯度的橙皮苷。
本发明方法的有益效果如下：
(1)本发明方法提供了一种全新的、可连续提取多种枳实活性成分的方法，可将枳实资源综合利用，工艺连贯、简单，可操作性强，酸、碱的用量少，污水排放少，生产成本低，不使用有毒有害化工溶剂，安全环保，且各种活性成分的含量高、收率高，适合工业化生产。
(2)本发明生产的橙皮苷产品中，含量高，且不含异柚皮苷。使用本发明方法制备的橙皮苷用于合成地奥司明，由于没有异柚皮苷的干扰，以其为原料制备地奥司明的产品纯度高、药效好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的枳实原料购于益阳沅江，其中果胶的含量为15.25wt％，多糖的含量为5.79wt％，辛弗林的含量为0.24wt％，水溶性黄酮的含量为5.37wt％，橙皮苷的含量为18.67wt％，异柚皮苷的含量为1.74wt％；本发明实施例所使用的陶瓷膜、超滤膜和纳滤膜均购于南京福林德环保科技有限公司；本发明实施例所使用的辅料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用咔唑比色法检测枳实果胶的含量，采用苯酚-硫酸比色法测定枳实多糖的含量，采用紫外分光光度法测定枳实水溶性黄酮的含量，采用高效液相色谱(HPLC)外标法检测辛弗林、橙皮苷和异柚皮苷的含量。
实施例1
(1)枳实精油的提取与分离：取枳实原料100kg，破碎至粒径为1～1.5mm，投入提取罐中，加入石油醚，加热回流提取两次(第一次900L，提取时间2小时；第二次600L，提取时间2小时)，过滤，得石油醚提取液，提取渣待用。合并石油醚提取液，将石油醚提取液以0.5BV/小时的流速通过硅胶层析柱(柱层析硅胶的用量为6L，硅胶层析柱的高径比为8:1)，收集硅胶层析柱流出液，浓缩至无溶剂，得到油状物0.72kg，即枳实精油。
(2)酶解：将步骤(1)中的提取渣用水蒸汽将其中残留的有机溶剂蒸馏干净，加入900L纯水，调节pH值5.0，并加入0.2kg纤维素酶和0.2kg原果胶酶，混合均匀，室温搅拌酶解6小时。
(3)果胶的提取和分离：将步骤(2)酶解后的物料加热至85℃，搅拌提取3小时，冷却至室温，离心过滤，得离心滤液和离心渣，离心渣待用。将离心滤液先用孔径为50nm的陶瓷膜过滤，再用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤(超滤的压力为0.2Mpa)，分别收集超滤膜截留液和透过液，超滤膜透过液待用。往超滤膜截留液中加入0.4kg活性炭，室温搅拌脱色2小时，过滤除去活性炭，减压浓缩至浓缩液的固形物含量为23％，往浓缩液中加入乙醇，使物料中乙醇的体积分数为45％，醇沉，析出大量絮状沉淀物，过滤，得絮状沉淀和乙醇滤液，乙醇滤液待用。将絮状沉淀物干燥，得枳实果胶18.71kg。
(4)多糖的分离：取步骤(3)乙醇滤液，减压浓缩至无醇，干燥，得枳实多糖7.32kg。
(5)辛弗林的分离：将步骤(3)超滤膜透过液截留分子量为500Da的纳滤膜过滤(纳滤的压力为0.3Mpa)，分别收集纳滤膜透过液和纳滤膜截留液，纳滤膜截留液待用。纳滤膜透过液先用10L正丁醇萃取，分液，收集正丁醇层；将正丁醇层用8L氨水(质量百分比浓度为8％)反萃取，分液，收集氨水层，浓缩，干燥，得辛弗林0.23kg。
(6)水溶性黄酮的分离：取步骤(5)纳滤膜截留液，用0.4kg活性氧化镁室温搅拌脱色3小时，过滤除去活性氧化镁，减压浓缩，干燥，得枳实水溶性黄酮5.34kg。
(7)橙皮苷的提取和分离：将步骤(3)离心渣，投入渗漉器中，加入600L碱液(氢氧化钙的质量百分比的浓度为0.12％，氢氧化钠的质量百分比的浓度为0.5％)，开始正向渗漉，渗漉的流速为10BV/小时，将渗漉液当作提取用的碱液，再次输入渗漉器中，如此快速渗漉、循环提取，渗漉提取5小时，直至离心渣中橙皮苷提取完全，停止渗漉，用压缩空气从渗漉器顶部加压，将渗漉器中的液体充分挤压干净，收集最终的渗漉液。往渗漉液中加入3kg硅藻土，室温搅拌3小时，粗过滤除去硅藻土，再用截留分子量为1000Da的超滤膜过滤(超滤的压力为0.3Mpa)，收集超滤膜滤液，用10wt％HCl调节pH值8，加热至60℃，保温1小时，再用10wt％HCl调节pH值6，静置析晶过夜，离心，用纯水淋洗滤饼，干燥至恒重，得枳实橙皮苷18.51kg。
经咔唑比色法测定，本实施例所得枳实果胶中半乳糖醛酸的含量为69.53％，枳实果胶的收率为85.30％；经苯酚-硫酸比色法测定，本实施例所得枳实多糖的含量为73.29％，枳实多糖的收率为92.66％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得辛弗林的含量为91.96％，辛弗林的收率为88.13％；经紫外分光光度法测定，本实施例所得枳实水溶性黄酮的含量为95.80％，枳实水溶性黄酮的收率为95.26％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得橙皮苷的含量为99.06％，橙皮苷的收率为98.21％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
实施例2
(1)枳实精油的提取与分离：取枳实原料100kg，破碎至粒径为1～1.5mm，投入提取罐中，加入6#溶剂油，加热回流提取两次(第一次1000L，提取时间2小时；第二次600L，提取时间1.5小时)，过滤，得6#溶剂油提取液，提取渣待用。合并6#溶剂油提取液，将6#溶剂油提取液以0.8BV/小时的流速通过硅胶层析柱(柱层析硅胶的用量为8L，硅胶层析柱的高径比为6:1)，收集硅胶层析柱流出液，浓缩至无溶剂，得到油状物0.70kg，即枳实精油。
(2)酶解：将步骤(1)中的提取渣用水蒸汽将其中残留的有机溶剂蒸馏干净，加入800L纯水，调节pH值5.5，并加入0.1kg纤维素酶和0.2kg原果胶酶，混合均匀，室温搅拌酶解5小时。
(3)果胶的提取和分离：将步骤(2)酶解后的物料加热至90℃，搅拌提取3小时，冷却至室温，离心过滤，得离心滤液和离心渣，离心渣待用。将离心滤液先用孔径为50nm的陶瓷膜过滤，再用截留分子量为2000Da的超滤膜过滤(超滤的压力为0.1Mpa)，分别收集超滤膜截留液和透过液，超滤膜透过液待用。往超滤膜截留液中加入0.5kg活性炭，室温搅拌脱色3小时，过滤除去活性炭，减压浓缩至浓缩液的固形物含量为20％，往浓缩液中加入乙醇，使物料中乙醇的体积分数为55％，醇沉，析出大量絮状沉淀物，过滤，得絮状沉淀和乙醇滤液，乙醇滤液待用。将絮状沉淀物干燥，得枳实果胶19.73kg。
(4)多糖的分离：取步骤(3)乙醇滤液，减压浓缩至无醇，干燥，得枳实多糖6.93kg。
(5)辛弗林的分离：将步骤(3)超滤膜透过液截留分子量为400Da的纳滤膜过滤(纳滤的压力为0.5Mpa)，分别收集纳滤膜透过液和纳滤膜截留液，纳滤膜截留液待用。纳滤膜透过液先用8L正丁醇萃取，分液，收集正丁醇层；将正丁醇层用9L氨水(质量百分比浓度为6％)反萃取，分液，收集氨水层，浓缩，干燥，得辛弗林0.24kg。
(6)水溶性黄酮的分离：取步骤(5)纳滤膜截留液，用0.5kg活性氧化镁室温搅拌脱色2.5小时，过滤除去活性氧化镁，减压浓缩，干燥，得枳实水溶性黄酮5.4kg。
(7)橙皮苷的提取和分离：将步骤(3)离心渣，投入渗漉器中，加入500L碱液(氢氧化钙的质量百分比的浓度为0.15％，氢氧化钾的质量百分比的浓度为0.5％)，开始正向渗漉，渗漉的流速为8BV/小时，将渗漉液当作提取用的碱液，再次输入渗漉器中，如此快速渗漉、循环提取，渗漉提取4小时，直至离心渣中橙皮苷提取完全，停止渗漉，用压缩空气从渗漉器顶部加压，将渗漉器中的液体充分挤压干净，收集最终的渗漉液。往渗漉液中加入2kg硅藻土，室温搅拌2小时，粗过滤除去硅藻土，再用截留分子量为2000Da的超滤膜过滤(超滤的压力为0.3Mpa)，收集超滤膜滤液，用10wt％HCl调节pH值为8.5，加热至60℃，保温2小时，再用10wt％HCl调节pH值为7，静置析晶过夜，离心，用纯水淋洗滤饼，干燥至恒重，得枳实橙皮苷18.39kg。
经咔唑比色法测定，本实施例所得枳实果胶中半乳糖醛酸的含量为67.52％，枳实果胶的收率为87.35％；经苯酚-硫酸比色法测定，本实施例所得枳实多糖的含量为75.52％，枳实多糖的收率为90.39％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得辛弗林的含量为91.89％，辛弗林的收率为91.89％；经紫外分光光度法测定，本实施例所得枳实水溶性黄酮的含量为93.16％，枳实水溶性黄酮的收率为93.68％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得橙皮苷的含量为98.63％，橙皮苷的收率为97.15％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
实施例3
(1)枳实精油的提取与分离：取枳实原料100kg，破碎至粒径为1～1.5mm，投入提取罐中，加入环己烷，加热回流提取两次(第一次800L，提取时间3小时；第二次700L，提取时间2小时)，过滤，得环己烷提取液，提取渣待用。合并环己烷提取液，将环己烷提取液以0.6BV/小时的流速通过硅胶层析柱(柱层析硅胶的用量为10L，硅胶层析柱的高径比为5:1)，收集硅胶层析柱流出液，浓缩至无溶剂，得到油状物0.75kg，即枳实精油。
(2)酶解：将步骤(1)中的提取渣用水蒸汽将其中残留的有机溶剂蒸馏干净，加入1000L纯水，调节pH值6.0，并加入0.3kg纤维素酶和0.2kg原果胶酶，混合均匀，室温搅拌酶解4.5小时。
(3)果胶的提取和分离：将步骤(2)酶解后的物料加热至95℃，搅拌提取2小时，冷却至室温，离心过滤，得离心滤液和离心渣，离心渣待用。将离心滤液先用孔径为20nm的陶瓷膜过滤，再用截留分子量为1000Da的超滤膜过滤(超滤的压力为0.1Mpa)，分别收集超滤膜截留液和透过液，超滤膜透过液待用。往超滤膜截留液中加入0.8kg活性炭，室温搅拌脱色2小时，过滤除去活性炭，减压浓缩至浓缩液的固形物含量为16％，往浓缩液中加入乙醇，使物料中乙醇的体积分数为60％，醇沉，析出大量絮状沉淀物，过滤，得絮状沉淀和乙醇滤液，乙醇滤液待用。将絮状沉淀物干燥，得枳实果胶19.02kg。
(4)多糖的分离：取步骤(3)乙醇滤液，减压浓缩至无醇，干燥，得枳实多糖6.93kg。
(5)辛弗林的分离：将步骤(3)超滤膜透过液截留分子量为200Da的纳滤膜过滤(纳滤的压力为0.5Mpa)，分别收集纳滤膜透过液和纳滤膜截留液，纳滤膜截留液待用。纳滤膜透过液先用10L正丁醇萃取，分液，收集正丁醇层；将正丁醇层用10L氨水(质量百分比浓度为8％)反萃取，分液，收集氨水层，浓缩，干燥，得辛弗林0.22kg。
(6)水溶性黄酮的分离：取步骤(5)纳滤膜截留液，用0.8kg活性氧化镁室温搅拌脱色2小时，过滤除去活性氧化镁，减压浓缩，干燥，得枳实水溶性黄酮5.32kg。
(7)橙皮苷的提取和分离：将步骤(3)离心渣，投入渗漉器中，加入600L碱液(氢氧化钙的质量百分比的浓度为0.1％，氢氧化钾的质量百分比的浓度为0.8％)，开始反向渗漉，渗漉的流速为12BV/小时，将渗漉液当作提取用的碱液，再次输入渗漉器中，如此快速渗漉、循环提取，渗漉提取4小时，直至离心渣中橙皮苷提取完全，停止渗漉，用压缩空气从渗漉器顶部加压，将渗漉器中的液体充分挤压干净，收集最终的渗漉液。往渗漉液中加入2.5kg硅藻土，室温搅拌3小时，粗过滤除去硅藻土，再用截留分子量为2000Da的超滤膜过滤(超滤的压力为0.2Mpa)，收集超滤膜滤液，用10wt％HCl调节pH值为9，加热至50℃，保温1小时，再用10wt％HCl调节pH值为6，静置析晶过夜，离心，用纯水淋洗滤饼，干燥至恒重，得枳实橙皮苷18.52kg。
经咔唑比色法测定，本实施例所得枳实果胶中半乳糖醛酸的含量为71.59％，枳实果胶的收率为89.29％；经苯酚-硫酸比色法测定，本实施例所得枳实多糖的含量为76.34％，枳实多糖的收率为91.37％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得辛弗林的含量为97.92％，辛弗林的收率为89.76％；经紫外分光光度法测定，本实施例所得枳实水溶性黄酮的含量为94.71％，枳实水溶性黄酮的收率为93.83％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得橙皮苷的含量为98.21％，橙皮苷的收率为97.42％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
实施例4
其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于步骤7)中得到渗漉液中硅藻土的加入量为1kg，经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得橙皮苷的含量为96.42％，橙皮苷的收率为95.17％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为1.24％。
实施例5
其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于步骤2)中不加入原果胶酶，本实施例所得枳实果胶中半乳糖醛酸的含量为64.32％，枳实果胶的收率为76.83％。经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得橙皮苷的含量为94.12％，橙皮苷的收率为96.41％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
实施例6
其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于步骤7)中600L碱液中为1wt％的氢氧化钠溶液，不含氢氧化钙。经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得橙皮苷的含量为96.83％，橙皮苷的收率为97.58％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
实施例7
其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于步骤7)中600L碱液中为0.3wt％的氢氧化钙溶液，不含氢氧化钠。经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得橙皮苷的含量为98.67％，橙皮苷的收率为83.41％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
对比例1
其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于步骤7)中得到渗漉液中不加入硅藻土，经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，所得橙皮苷的含量为94.28％，橙皮苷的收率为91.53％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为3.85％。
对比例2
其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于步骤7)中直接用10wt％HCl调节pH值为6，经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，所得橙皮苷的含量为96.58％，橙皮苷的收率为95.42％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
对比例3
其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于步骤7)中粗过滤除去硅藻土后，不进行超滤。经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，所得橙皮苷的含量为94.31％，橙皮苷的收率为96.40％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
对比例4
其他步骤和条件和实施例1相同，区别在于步骤2)中不加入纤维素酶，酶解步骤只加入0.2kg原果胶酶。经过测试，本实施例所得枳实果胶中半乳糖醛酸的含量为72.06％，枳实果胶的收率为89.42％；经苯酚-硫酸比色法测定，本实施例所得枳实多糖的含量为76.13％，枳实多糖的收率为86.37％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得辛弗林的含量为97.32％，辛弗林的收率为83.51％；经紫外分光光度法测定，本实施例所得枳实水溶性黄酮的含量为94.82％，枳实水溶性黄酮的收率为88.63％；经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得橙皮苷的含量为98.15％，橙皮苷的收率为93.42％；该橙皮苷产品中，异柚皮苷的含量为0。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种从枳实中分离多种活性成分的方法，包括以下步骤：
（1）枳实精油的提取与分离：将枳实原料破碎，投入提取罐中，加入亲脂性有机溶剂，加热回流提取，过滤，分别得提取液和提取渣；将提取液通过硅胶层析柱，收集硅胶层析柱流出液，浓缩至无溶剂，得枳实精油；
（2）酶解：将步骤（1）中的提取渣中有机溶剂蒸除干净，加入水，调节pH值为弱酸性，加入纤维素酶和原果胶酶进行酶解，在室温下搅拌，酶解时间为4-6小时，所述维素酶的用量为枳实原料重量的1‰～3‰，所述原果胶酶的用量为枳实原料重量的1‰～3‰；
（3）果胶的提取和分离：将步骤（2）酶解后的物料加热，搅拌提取，冷却，离心过滤，得离心渣和离心滤液，离心滤液陶瓷膜过滤，超滤膜过滤，收集超滤膜截留液和透过液；超滤膜截留液经过脱色，减压浓缩，醇沉，过滤，得絮状沉淀和醇的滤液，将絮状沉淀物干燥，得枳实果胶；
（4）多糖的分离：取步骤（3）醇的滤液，减压浓缩至无醇，干燥，得枳实多糖；
（5）辛弗林的分离：将步骤（3）超滤膜透过液用纳滤膜过滤，纳滤膜透过液先用和水不混溶的中等极性溶剂萃取，再用氨水反萃取，浓缩，干燥，得辛弗林；
（6）水溶性黄酮的分离：取步骤（5）纳滤膜截留液，用金属氧化物脱色，过滤，减压浓缩，干燥，得枳实水溶性黄酮；
（7）橙皮苷的提取和分离：将步骤（3）所得离心渣，加入碱液，循环提取渗漉，直至离心渣中橙皮苷提取完全，收集渗漉液；加入硅藻土，室温搅拌，粗过滤，超滤膜过滤，所述超滤膜的截留分子量为1000～2000Da，超滤滤液用稀酸调节pH值8～9，加热，保温，再用酸调节pH值6～7，静置析晶过夜，离心，水洗，干燥，得枳实橙皮苷，所述碱液为氢氧化钙，与氢氧化钠或氢氧化钾的混合物的液碱溶液；液碱溶液中，氢氧化钙的质量百分比的浓度为0.1%～0.15%，氢氧化钠和/或氢氧化钾的质量百分比的浓度为0.5%～1%，所述碱液的用量为枳实原料重量的5～6倍，单位L/kg，硅藻土的用量为枳实原料重量的1%～3%，所述室温搅拌的时间为2～3小时。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述亲脂性有机溶剂是指乙醚、石油醚、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、6#溶剂油、120#溶剂油中的至少一种；和/或所述加热回流提取，为两次以上提取，亲脂性有机溶剂总的体积用量为枳实原料重量的12-20倍（L/kg）。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述纳滤膜的截留分子量为200～500Da；和/或
所述和水不混溶的中等极性溶剂选自正丁醇，正戊醇，丁酮，乙酸丁酯，异丙醚中的至少一种，用量为枳实原料重量的5%～10%；和/或
所述氨水的质量百分比浓度为5%～10%，所述氨水的用量为枳实原料重量的5%～10%，单位L/kg。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述金属氧化物选自活性氧化镁，氧化铝中的至少一种，金属氧化物的用量为枳实原料重量的2‰～10‰。
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