CN110183541B - 红车轴草多糖及总异黄酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种红车轴草多糖及总异黄酮的制备方法，包括以下步骤：（1）将干燥的红车轴草原料粉碎；（2）在粉碎后的红车轴草原料中加入水，搅拌提取，过滤，得到水提取液和提取渣；（3）将所得水提取液依次通过阴、阳离子交换树脂柱，减压浓缩，然后加入活性炭，加热搅拌，过滤，干燥，粉碎，制得红车轴草多糖；（4）在所得提取渣中加入碱液，搅拌提取，过滤，得到碱水提取液；（5）在所得碱水提取液中加入氧化铝，搅拌，纳滤，所得透过液用酸液调节PH值，静置析晶，离心，所得滤饼用水洗涤，真空干燥，粉碎，制得红车轴草总异黄酮。本发明生产成本低，安全、绿色、环保，所得的各种活性成分产品的含量及收率高，实现了红车轴草资源的高效综合利用。
Description
技术领域
本发明涉及红车轴草活性成分的制备方法，具体涉及一种红车轴草多糖及总异黄酮的制备方法。
背景技术
红车轴草（Trifolium pratense L.）为豆科（Leguminosae）、车轴草属（Trifolium L.）多年生草本植物，又名红三叶、红花苜蓿、三叶草、红菽草等，是我国长江流域以南地区优良的豆科牧草。红车轴草中的活性成分有黄酮类化合物、蛋白质、氨基酸、多糖、维生素等，其中，异黄酮由于具有植物雌激素样作用和抗癌作用而备受关注。现代研究发现，红车轴草异黄酮还具有抗氧化作用、诱导癌细胞凋亡、防止骨质疏松、治疗妇女更年期综合症、预防动脉粥样硬化、抗肿瘤和增强机体免疫力等作用。红车轴草中的异黄酮主要有鹰嘴豆芽素A、芒柄花素、染料木素、大豆苷元4钟。目前，只是从红车轴草提取异黄酮加以利用，并未对红车轴草中其他活性成分分离、提纯，来实现红车轴草的综合利用，而且在提取异黄酮时，安全性差，含量低以及原料来源受限。例如：
CN102302539A公开了一种红车轴草异黄酮的生产方法，是以红车轴草为原料，通过甲醇提取、过滤、活性炭柱脱色、石油醚及乙酸乙酯萃取、调碱、大孔树脂吸附、萃取、结晶等步骤得到异黄酮。该方法不仅反复、大量的使用有毒有害、易燃易爆的化工溶剂，而且步骤繁琐，不利于安全生产。
CN101559094A公开了一种从红车轴草中提取分离异黄酮的生产工艺，是以红车轴草为原料，通过粉碎、甲醇动态提取、减压浓缩、有机混合溶剂萃取、弱极性有机溶剂结晶等步骤，得到异黄酮。该方法同样使用了大量的有毒有害、易燃易爆的化工溶剂，而且所得到的异黄酮含量偏低。
CN101396422A公开了一种红车轴草提取物及其制备方法，是以红车轴草为原料，通过醇提、浓缩、水沉、离心、低级醇梯度溶解、浓缩、干燥，得到红车轴草提取物。该方法获得的总黄酮产品含量参差不齐，最低含量低至5%，最高含量仅30%。
CN1981799A公开了红车轴草提取物的制备方法，是以新鲜的红车轴草地上部分为原料，通过榨汁、醇提、浓缩、静置、干燥等步骤，得到红车轴草提取物。该方法使用的原料是处于特定生长期内的新鲜红车轴草原料，来源会受到季节的限制，不宜常年生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种红车轴草多糖及总异黄酮的制备方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种红车轴草多糖及总异黄酮的制备方法，包括以下步骤：
（1）将干燥的红车轴草原料粉碎；
（2）在粉碎后的红车轴草原料中加入水，搅拌提取，过滤，得到水提取液和提取渣；
（3）将所得水提取液依次通过阴、阳离子交换树脂柱，减压浓缩，然后加入活性炭，加热搅拌，过滤，干燥，粉碎，制得红车轴草多糖；
（4）在所得提取渣中加入碱液，搅拌提取，过滤，得到碱水提取液；
（5）在所得碱水提取液中加入氧化铝，搅拌，纳滤，所得透过液用酸液调节PH值，静置析晶，离心，所得滤饼用水洗涤，真空干燥，粉碎，制得红车轴草总异黄酮。
在本发明中，红车轴草原料可以选自红车轴草茎叶或全草。
进一步，步骤（1）中，所述红车轴草原料粉碎的目数为20～40目。
在本发明中，选用水提取的目的是将原料中易溶于水的多糖浸出，并可少浸出其他水溶性杂质。
在本发明中，若水的用量过少或搅拌提取的时间过短，可导致多糖的浸出不完全，造成多糖的收率偏低；若水的用量过多或搅拌提取的时间过长，不但可造成物料和能源的浪费，还可导致杂质的浸出过多，造成多糖的含量偏低。
进一步，步骤（2）中，所述水的总用量为红车轴草原料重量的30～40倍，所述水分两次加入搅拌提取，每次搅拌提取的时间为2～4小时。
在本发明中，水可选用纯水。
在本发明中，选用阴、阳离子交换树脂柱的目的不仅可以除盐，还可除杂。
在本发明中，若阴、阳离子交换树脂的用量过少、高径比过小或上柱流速过快，可导致除盐、除杂不彻底，造成多糖产品的含量偏低；若阴、阳离子交换树脂的用量过多、高径比过大或上柱流速过慢，可造成物料和能源的浪费。
在本发明中，阳离子交换树脂柱可以选择强酸阳离子交换树脂，例如，苯乙烯系凝胶型强酸阳离子交换树脂（如：产品型号001×7H、 001×8N），也可以为弱酸阳离子交换树脂，例如丙烯酸系大孔型弱酸阳离子交换树脂（如：产品型号D113）。
在本发明中，阴离子交换树脂柱可以选择弱碱阴离子交换树脂，例如，丙烯酸系大孔型弱碱阴离子交换树脂（如：产品型号938、 958），也可以为强碱阴离子交换树脂，例如丙烯酸系凝胶型强碱阴离子交换树脂（如：产品型号258）。
进一步，步骤（3）中，所述阴、阳离子交换树脂柱的高径比均为1～5:1，所述阴、阳离子交换树脂与红车轴草原料的体积重量比V/m为1～5∶10。
进一步，步骤（3）中，所述水提取液通过阴、阳离子交换树脂柱的流速为0.5～1.0BV/h。
在本发明中，加入活性炭、加热搅拌的目的是脱色。
在本发明中，若活性炭的用量过少、加热的温度过低或搅拌的时间过短，可导致脱色不彻底，造成多糖产品的含量偏低；若活性炭的用量过多、加热的温度过高或搅拌的时间过长，可造成物料和能源的浪费。
进一步，步骤（3）中，所述干燥的方式为微波干燥。
在本发明中，微波干燥的条件包括：微波功率15～25 KW，干燥时间10～30min。
在本发明中，选用碱液室温搅拌提取的目的是将原料中易溶于碱液的总异黄酮浸出，并可少浸出其他杂质。
在本发明中，若碱液的浓度过低、用量过少或搅拌提取的时间过短，可导致总异黄酮的浸出不完全，造成总异黄酮的收率偏低；若碱液的浓度过高、用量过多或搅拌提取的时间过长，不但可造成物料和能源的浪费，还可导致杂质的浸出过多，造成总异黄酮的含量偏低。
进一步，步骤（4）中，所述碱液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氢氧化钙水溶液，所述碱液的质量百分比浓度为0.1%～5.0%，所述碱液的总用量为红车轴草原料重量的10～15倍，所述碱液分两次加入搅拌提取，每次搅拌提取的时间为6～8小时。
进一步，步骤（5）中，所述氧化铝的用量为红车轴草原料重量的1%～5%。
在本发明中，纳滤的目的是除去溶解于碱液中的叶绿素、蛋白质等大分子杂质。
在本发明中，若纳滤膜的截留分子量过小或过滤的压力过小，部分总异黄酮会无法透过纳滤膜，造成总异黄酮收率偏低；若纳滤膜的截留分子量过大或过滤的压力过大，部分杂质会透过纳滤膜，造成总异黄酮的含量偏低。
进一步，步骤（5）中，步骤（5）中，所述纳滤的条件包括：纳滤膜的截留分子量为500～1000Da，过滤压力为1.0～2.0Mpa。
在本发明中，选用酸调节PH值的目的是将溶解于碱液中的总异黄酮加酸析出、并沉淀。
在本发明中，若酸的浓度过高或调节的PH过低，会因为酸性过强而破坏异黄酮的分子结构，导致收率偏低，且还会造成物料的浪费；若酸的浓度过低或调节的PH过高，会导致总异黄酮析出不完全，同样会造成总异黄酮收率偏低。
进一步，步骤（5）中，所述酸液为盐酸水溶液或硫酸水溶液，所述酸液的质量百分比浓度为5%～15%，所述PH值为1～3。
在本发明中，1 BV=1个柱体积。
本发明利用多糖易溶于水、异黄酮不溶于水的原理，采用水先将红车轴草多糖浸出，然后通过阴、阳离子交换树脂柱除盐除杂，活性炭脱色，浓缩、干燥后即可得到高含量的红车轴草多糖。与此同时，由于绝大部分水溶性成分已被浸出，故在后续碱液提取过程中，碱液浸出物中水溶性成分将极少，这时利用“碱溶酸沉”的原理，期间选用氧化铝吸附色素等小分子杂质，并利用纳滤除去叶绿素等大分子杂质，即可得到高含量的总黄酮。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的效果：
（1）工艺过程可操作性强，不使用任何有毒有害、易燃易爆的化工溶剂，安全、绿色、环保。
（2）生产成本低，可分离多种活性成分，且所得的各种活性成分产品的含量及收率高，与此同时实现了红车轴草资源的高效综合利用，适宜于工业化生产。
实验证明，本发明制得的红车轴草多糖的含量高达87.1%，收率高达91.8%；制得的红车轴草总异黄酮的含量高达95.5%，收率高达97.1%。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
红车轴草总异黄酮含量通过高效液相色谱（HPLC）外标法测得；
红车轴草多糖的含量通过苯酚-硫酸比色法测得；
红车轴草干燥全草购于湖北恩施，其中，红车轴草多糖和红车轴草总异黄酮的质量含量分别为5.25%和0.43%；
阴、阳离子交换树脂均购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；
在没有特别说明的情况下，其他材料均采用普通市售产品。
实施例1
（1）原料粉碎：取干燥的红车轴草全草100kg，粉碎至40目；
（2）多糖的提取：在粉碎后的原料中分两次加入纯水（纯水的总量为3000kg）搅拌提取，每次搅拌提取2小时，过滤，分别合并得水提取液和提取渣；
（3）多糖的纯化：将所得水提取液先通过体积为50L、高径比为4:1的958型阴离子交换树脂柱，再通过体积为50L、高径比为4:1的001×7H型阳离子交换树脂柱，其中，阴、阳离子交换树脂的用量均为50 L，冷水提取液上柱的流速均为1.0BV/h；接着将流出液在温度为65℃、真空度为-0.09MPa条件下减压浓缩，浓缩至固形物含量为30%；然后在浓缩液中加入2kg活性炭，加热至65℃，保温搅拌2小时，过滤，微波干燥（微波功率 15 KW，干燥时间30min），粉碎，得红车轴草多糖5.55kg；
（4）总异黄酮的提取：在所得提取渣中分两次加入氢氧化钠水溶液（总量为1000kg质量百分比浓度为2.0%的氢氧化钠水溶液）室温搅拌提取，每次室温搅拌提取的时间为6小时，过滤，合并得碱水提取液；
（5）总异黄酮的纯化：在所得碱水提取液中加入1kg氧化铝，室温搅拌2小时，用截留分子量为500Da的纳滤膜，在压力2.0Mpa下进行纳滤，所得纳滤膜透过液用质量百分比浓度为10%的盐酸调节PH值=2，静置析晶，离心，所得滤饼用温水洗涤，真空干燥，粉碎，得红车轴草总异黄酮0.45kg。
经苯酚-硫酸比色法测定，所得红车轴草多糖的含量为85.3%，红车轴草多糖的收率为90.2%；经高效液相色谱（HPLC）外标法检测，所得红车轴草总异黄酮的含量为91.6%，红车轴草总异黄酮的收率为95.8%。
实施例2
（1）原料粉碎：取干燥的红车轴草全草150kg，粉碎至20目；
（2）多糖的提取：在粉碎后的原料中分两次加入纯水（纯水的总量为6000kg）搅拌提取，每次搅拌提取4小时，过滤，分别合并得水提取液和提取渣；
（3）多糖的纯化：将所得水提取液先通过体积为60L、高径比为3:1的258型阴离子交换树脂柱，再通过体积为60L、高径比为3:1的001×8H型阳离子交换树脂柱，其中，阴、阳离子交换树脂的用量均为60 L，冷水提取液上柱的流速均为0.5BV/h；接着将流出液在温度为75℃、真空度为-0.08MPa条件下减压浓缩，浓缩至固形物含量为35%；然后在浓缩液中加入6kg活性炭，加热至75℃，保温搅拌2.5小时，过滤，微波干燥（微波功率 20 KW，干燥时间25 min），粉碎，得红车轴草多糖7.80kg；
（4）总异黄酮的提取：在所得提取渣中分两次加入氢氧化钠水溶液（总量为1800kg质量百分比浓度为2.5%的氢氧化钾水溶液）室温搅拌提取，每次室温搅拌提取的时间为8小时，过滤，合并得碱水提取液；
（5）总异黄酮的纯化：在所得碱水提取液中加入3kg氧化铝，室温搅拌4小时，用截留分子量为1000Da的纳滤膜，在压力2.0Mpa下进行纳滤，所得纳滤膜透过液用质量百分比浓度为6%的硫酸调节PH值=1.5，静置析晶，离心，所得滤饼用温水洗涤，真空干燥，粉碎，得红车轴草总异黄酮0.67kg。
经苯酚-硫酸比色法测定，所得红车轴草多糖的含量为87.1%，红车轴草多糖的收率为86.3%；经高效液相色谱（HPLC）外标法检测，所得红车轴草总异黄酮的含量为93.4%，红车轴草总异黄酮的收率为97.1%。
实施例3
（1）原料粉碎：取干燥的红车轴草全草200kg，粉碎至30目；
（2）多糖的提取：在粉碎后的原料中分两次加入纯水（纯水的总量为7000kg）搅拌提取，每次搅拌提取3小时，过滤，分别合并得水提取液和提取渣；
（3）多糖的纯化：将所得水提取液先通过体积为60L、高径比为5:1的938型阴离子交换树脂柱，再通过体积为60L、高径比为5:1的D113型阳离子交换树脂柱，其中，阴、阳离子交换树脂的用量均为60L，冷水提取液上柱的流速均为0.7BV/h；接着将流出液在温度为70℃、真空度为-0.08MPa条件下减压浓缩，浓缩至固形物含量为38%；然后在浓缩液中加入6kg活性炭，加热至70℃，保温搅拌3小时，过滤，微波干燥（微波功率25 KW，干燥时间20 min），粉碎，得红车轴草多糖11.53kg；
（4）总异黄酮的提取：在所得提取渣中分两次加入氢氧化钠水溶液（总量为2800kg质量百分比浓度为3.0%的氢氧化钠水溶液）室温搅拌提取，每次室温搅拌提取的时间为7小时，过滤，合并得碱水提取液；
（5）总异黄酮的纯化：在所得碱水提取液中加入5kg氧化铝，室温搅拌3小时，用截留分子量为800Da的纳滤膜，在压力1.5Mpa下进行纳滤，所得纳滤膜透过液用质量百分比浓度为12%的盐酸调节PH值=2.5，静置析晶，离心，所得滤饼用温水洗涤，真空干燥，粉碎，得红车轴草总异黄酮0.87kg。
经苯酚-硫酸比色法测定，所得红车轴草多糖的含量为83.6%，红车轴草多糖的收率为91.8%；经高效液相色谱（HPLC）外标法检测，所得红车轴草总异黄酮的含量为95.5%，红车轴草总异黄酮的收率为96.6%。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种红车轴草多糖及总异黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将干燥的红车轴草原料粉碎；
（2）在粉碎后的红车轴草原料中加入水，搅拌提取，过滤，得到水提取液和提取渣；
（3）将所得水提取液依次通过阴、阳离子交换树脂柱，减压浓缩，然后加入活性炭，加热搅拌，过滤，干燥，粉碎，制得红车轴草多糖；
（4）在所得提取渣中加入碱液，搅拌提取，过滤，得到碱水提取液；
（5）在所得碱水提取液中加入氧化铝，搅拌，纳滤，所得透过液用酸液调节pH值，静置析晶，离心，所得滤饼用水洗涤，真空干燥，粉碎，制得红车轴草总异黄酮；
步骤（2）中，所述水的总用量为红车轴草原料重量的30～40倍，所述水分两次加入搅拌提取，每次搅拌提取的时间为2～4小时。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述红车轴草原料粉碎的目数为20～40目。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述阴、阳离子交换树脂柱的高径比均为1～5∶1，所述阴、阳离子交换树脂与红车轴草原料的体积重量比为1～5∶10。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述水提取液通过阴、阳离子交换树脂柱的流速为0.5～1.0BV/h。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述干燥的方式为微波干燥。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述碱液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氢氧化钙水溶液，所述碱液的质量百分比浓度为0.1%～5.0%，所述碱液的总用量为红车轴草原料重量的10～15倍，所述碱液分两次加入搅拌提取，每次搅拌提取的时间为6～8小时。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述氧化铝的用量为红车轴草原料重量的1%～5%。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，步骤（5）中，所述纳滤的条件包括：纳滤膜的截留分子量为500～1000Da，过滤压力为1.0～2.0MPa。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述酸液为盐酸水溶液或硫酸水溶液，所述酸液的质量百分比浓度为5%～15%，所述pH值为1～3。
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