CN110272508B - 一种枳壳多糖提取物的制备方法及其用途 - Google Patents

一种枳壳多糖提取物的制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枳壳多糖提取物的制备方法及其用途，属于植物活性成分提取技术领域。本发明的制备方法包括：将枳壳原料药材脱脂后，再经过水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的枳壳多糖提取物。本发明制备得到的枳壳多糖提取物用于制备治疗心肌缺氧缺血导致的心肌损伤类疾病药物。

Description

一种枳壳多糖提取物的制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及植物活性成分提取技术领域，更具体的说是涉及一种枳壳多糖提取物的制备方法及其用途。
背景技术
枳壳为芸香科柑橘属植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrussinensis Osbeckr的干燥未成熟果实。枳壳性微寒，味苦、辛、酸，归脾、胃、大肠经，主产于四川、江西、湖南、福建等地，具有理气宽中，行滞消胀之功效，主治胸胁气滞、食积不化、胀满疼痛、痰饮内停、脏器脱垂等症，临床上应用广泛。现代药理学研究发现，枳壳在抗氧化、抗溃疡、抗血栓、抗心肌缺血、抗癌、抗炎、抗真菌、抗病毒、免疫抑制、镇痛及退烧等方面具有良好的功效。目前对枳壳化学成分的研究主要集中于低分子量物质上，如各种黄酮类、挥发油类和生物碱类化合物，但关于枳壳多糖还没有相关报道。
因此，提供一种枳壳多糖提取物的制备方法及其用途是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种枳壳多糖提取物的制备方法及其在制备抗心肌损伤药物中的用途。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种枳壳多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：枳壳原料药材脱脂后，再经过水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的枳壳多糖提取物。
所述的枳壳包括：芸香科柑橘属植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeckr的干燥未成熟果实。
进一步，一种枳壳多糖提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将枳壳用6～12倍重量的95％乙醇回流脱脂3次，每次回流3h，除去脂溶性杂质，剩余残渣；
(2)将步骤(1)剩余的残渣用6～12倍重量的蒸馏水回流提取3次，每次回流提取2h，将滤液浓缩至枳壳0.2～1.0体积，加入3倍重量的95％乙醇醇沉，离心得沉淀；
(3)将步骤(2)得到的沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；
(4)将步骤(3)洗涤后的沉淀用0.5～2倍重量的蒸馏水复溶，以分子量大小为3.0×103-1.2×104的透析袋透析24～72h，获得透析液；
(5)将步骤(4)获得的透析液减压浓缩至枳壳1体积，加入3倍重量的95％乙醇醇沉，静置过夜，2000rpm/min离心，得多糖沉淀；
(6)将步骤(5)获得的多糖沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；
(7)将步骤(6)洗涤后的多糖沉淀用0.5～2倍重量的蒸馏水复溶，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去多糖中的色素和蛋白质，即得枳壳多糖提取物。
进一步，枳壳多糖提取物在制备治疗心肌损伤引发的动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心律失常、缺血性心肌病、心绞痛和心肌梗死药物中的用途。
进一步，所述药物为注射剂和口服剂。
进一步，所述注射剂为粉针或水针，所述粉针为冻干粉针；所述口服剂为片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种枳壳多糖提取物的制备方法，操作简单，提取效率高。本发明制备得到的枳壳多糖提取物能有效抑制心肌细胞凋亡，用于制备治疗心肌缺氧缺血导致的心肌损伤类疾病药物，心肌损伤类疾病包括动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心律失常、缺血性心肌病、心绞痛和心肌梗死。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明5组大鼠心电图(ECG)测量结果；
图2附图为本发明5组大鼠心电图ST段抬高情况；
图3附图为本发明5组大鼠心脏组织病理观察(HE染色)；
图4附图为本发明将H9c2心肌细胞于不同梯度浓度的CALB(1，2.5，5，10，20，40和80μg/mL)中培养24h，用MTT法测细胞存活率；
图5附图为本发明将H9c2心肌细胞于CALB(80μg/mL)中培养，用MTT法测不同时间点(0，1，2，4，8，12，24和48h)的细胞存活率；
图6附图为本发明将H9c2心肌细胞于不同梯度浓度的CALB(5，10和20μg/mL)中培养12h，然后置于缺氧环境下培养6h后进行复氧16h(Hypoxia/Reoxygenation，H/R)诱导，模拟缺血再灌注，用MTT法测细胞存活率；
图7附图为本发明采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(购自南京建城生物工程所)检测LDH释放量；
其中，图4-图7中，数据用三个独立实验的平均值±标准差表示；与对照组比较，**P<0.01，与H/R组比较，##P<0.01；
图8附图为本发明采用Hoechst 33342/PI染色观察细胞凋亡和坏死情况；
图9附图为本发明用荧光法测定caspase-8的活性，并以对照组相比的倍数变化来表达；
图10附图为本发明用荧光法测定caspase-9的活性，并以对照组相比的倍数变化来表达；
图11附图为本发明用荧光法测定caspase-3的活性，并以对照组相比的倍数变化来表达；
图12附图为本发明CALB对H/R诱导的H9c2细胞线粒体膜去极化的影响；
图13附图为本发明Bcl-2、Bax和β-actin的免疫印迹分析；
图14附图为本发明Bcl-2/Bax的相对蛋白表达情况柱状图；
其中，数据用平均值±标准差表示；与对照组比较，**P<0.01，与H/R组比较，##P<0.01。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
取枳壳药材0.8kg，用6倍重量的95％乙醇回流提取3次，每次3h，过滤，将滤渣晾干，残渣加蒸馏水12倍量，回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂至枳壳药材1倍体积，用95％乙醇调至含醇量为80％，静置过夜，2000rpm/min离心，沉淀依次用4倍量无水乙醇、丙酮洗涤，得粗多糖。取粗多糖加水溶解，上清液用分子量为3500的透析袋透析48h，透析液减压浓缩至枳壳药材1倍体积，加入95％乙醇调含醇量为80％，静置过夜，2000rpm/min离心，沉淀用4倍量无水乙醇、丙酮依次洗涤，蒸馏水复溶，进行弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂(Amberlite FPA90Cl+Amberlite IRC84)脱去粗多糖中色素和蛋白质，冷冻干燥，得枳壳多糖提取物。用苯酚-硫酸法，在500nm处，紫外分光光度法测定枳壳多糖提取物含量，以葡萄糖C6H12O6计为75％。
实施例2
取枳壳药材约3kg，12倍重量的95％醇回流提取3次，每次3h，过滤，将滤渣晾干，残渣加蒸馏水10倍量，回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂至枳壳药材1倍体积，用95％乙醇调至醇含量为85％，静置过夜，2000rpm/min离心，沉淀依次用4倍量无水乙醇、丙酮洗涤，得粗多糖。取粗多糖加水溶解，上清液用分子量为7000的透析袋透析48h，透析液减压浓缩至药材1倍体积，加入95％乙醇调含醇量为85％，静置过夜，2000rpm/min离心，沉淀用4倍重量无水乙醇、丙酮依次洗涤，蒸馏水复溶，进行弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂(Amberlite FPA90Cl+Amberlite IRC84)脱去粗多糖中色素和蛋白质冷冻干燥，得枳壳多糖提取物。用苯酚-硫酸法，在500nm处，紫外分光光度法测定枳壳多糖提取物含量，以葡萄糖C6H12O6计为72％。
实施例3
按以下比例制备片剂：枳壳多糖提取物50g，交联聚维酮50g，硫酸钙400g，滑石粉2.5g，硬脂酸镁2.5g，混合均匀，以40％PEG6000为粘合剂制粒，过20目筛，60℃干燥，过40目筛整粒，压制成片(控制片剂的硬度为6～8kg·cm－2)，包衣或喷薄膜衣即得。
实验例1枳壳多糖(CALB)对异丙肾上腺素(ISO)所致大鼠心脏功能指标分析
取SD雄性大鼠，随机分为5组，即空白组(Cont)、ISO模型组、CALB低剂量组(50mg/kg)、CALB中剂量组(100mg/kg)、CALB高剂量组(200mg/kg)，每组20只。空白组和ISO模型组每日灌胃同体积蒸馏水，CALB组分别灌胃50、100和200mg/kg枳壳多糖，连续21天。第19天开始，各组灌胃枳壳多糖或蒸馏水2小时后，除空白对照组外，灌胃给予异丙肾上腺素(ISO)(2mg/kg)3天。在第21天对各组大鼠进行心脏功能相关指标(体重、心脏重量、心率和心电图)分析。
实验结果：在大鼠体重和心脏重量测量结果中，体重组间差异无统计学意义(表1)。与其他组相比，ISO模型组心脏重量增加有统计学意义(P<0.05)。CALB治疗对心脏重量的影响呈剂量依赖性(P<0.05)；在心率(HR)测量结果中，模型组与空白组相比，大鼠HR值明显降低；而CALB组与ISO模型组相比HR值有明显升高(P<0.05，表1)；在心电图(ECG)测量结果中(附图1-图2)，可看出，ISO能明显损伤大鼠心脏，模型组与空白组相比，心电图ST段抬高明显延长(控制倍数为3.22倍，P<0.01)。CALB组与ISO模型组相比，ST段抬高显著降低(分别为1.137±0.131，0.975±0.103，0.779±0.088vs 1.452±0.134，P<0.01)，其效果与剂量有关。
表1大鼠心脏功能相关指标汇总表
Figure BDA0002140830010000061
Figure BDA0002140830010000062
注:与空白组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比**P＜0.01；
Figure BDA0002140830010000063
为平均值±标准偏差。
实验例2枳壳多糖对ISO所致大鼠心肌缺血的保护作用
取SD雄性大鼠，随机分为5组，即空白组、ISO模型组、CALB低剂量组(50mg/kg)、CALB中剂量组(100mg/kg)、CALB高剂量组(200mg/kg)，每组20只。空白组和模型组每日灌胃同体积蒸馏水，多糖组分别灌胃50、100和200mg/kg枳壳多糖，连续21天。第19天开始，各组灌胃枳壳多糖或蒸馏水2小时后，除空白组外，其余各组灌胃给予异丙肾上腺素(ISO)(2mg/kg)3天。在最后一次给药24小时后，称重，处死大鼠，取各组的血清和心脏分别进行各生化指标测定和组织病理学分析。
(1)枳壳多糖能预防ISO诱导的心肌损伤
通过观察心肌细胞损伤的病理变化(如附图3所示)，空白组未见明显异常，而ISO模型组心肌损伤严重，表现为心肌纤维断裂、间质增宽、局部波形胞质溶解、膜破裂。三个剂量的枳壳多糖预处理可明显改善上述病理改变，说明枳壳多糖能预防ISO诱导的心肌损伤。
(2)枳壳多糖能抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡
Caspase酶可调控多种与凋亡相关的细胞和生化变化，其中caspase-3和caspase-8为典型的促凋亡蛋白。如表2所示，ISO显著提高了caspase-3活性(为空白组的5.4倍；P<0.01)；CALB预处理以剂量依赖的方式显著抑制这种活性(P<0.01)。同样，ISO处理后心脏组织中caspase-8活性也上调，CALB预处理后caspase-8活性显著下调(P<0.01)。
Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中调节线粒体外膜通透性的两种主要蛋白，ISO诱导的细胞凋亡伴随着抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低以及促凋亡蛋白Bax的表达增加。CALB预处理组通过降低Bax(分别为288.273±11.981、239.910±26.477、193.913±24.391vs 357.663±31.371；P<0.05或P<0.01)和升高Bcl-2(分别为75.413±2.647、84.887±4.167和90.727±3.421vs 68.223±4.896；P<0.05或P<0.01)逆转了ISO的影响，CALB对大鼠心肌组织蛋白Bcl-2和Bax表达水平调节呈剂量依赖性。上述结果提示枳壳多糖能够通过线粒体依赖的凋亡通路抑制ISO诱导的细胞凋亡。
表2枳壳多糖对大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的影响
Figure BDA0002140830010000071
Figure BDA0002140830010000072
注:与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验例3枳壳多糖对H/R(Hypoxia/Reoxygenation，缺氧复氧法)诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用
(1)枳壳多糖对H9c2心肌细胞存活率、LDH释放及H/R诱导的凋亡的影响
采用MTT法检测枳壳多糖对细胞存活率的保护作用。将H9c2心肌细胞(购自中国科学院细胞库(上海))于不同梯度浓度的CALB(1，2.5，5，10，20，40和80μg/mL)中培养24h，各组细胞存活率无明显差异，如图4所示。将H9c2心肌细胞于CALB(80μg/mL)中培养，不同时间点(0，1，2，4，8，12，24和48h)的细胞存活率无明显差异，如图5所示。CALB培养细胞12h后，抑制H/R诱导的H9c2细胞损伤在浓度为20μg/mL时表现出最大保护作用，结果如图6所示。
LDH是细胞膜破裂后从细胞中渗出的一种细胞损伤指标，采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(购自南京建城生物工程所)检测LDH释放量。结果如图7所示，将细胞培养12h后进行H/R诱导，LDH活性显著增加。当使用5、10和20μg/mL CALB处理细胞后LDH水平显著降低。LDH法测定的CALB对H/R诱导的细胞毒性的保护作用与MTT法相似。因此，筛选出20μg/mL的浓度和12h的时期进行下一步研究。
为了证实CALB的保护作用是否与凋亡有关，我们对H9c2心肌细胞进行了H33342/PI染色荧光检测。正常细胞在Hoechst 33342上有完整的蓝色染色细胞核。早期凋亡细胞核染色质凝聚破碎，Hoechst 33342染色为亮蓝色，晚期凋亡细胞核为红/粉红色(Hoechst33342染色为亮蓝色，PI染色为红色)。如图8所示，CALB预处理的20μg/mL的浓度在12h表现出很强的抗凋亡作用。
(2)枳壳多糖能降低H/R诱导的H9c2心肌细胞凋亡，调节凋亡相关蛋白表达
检测CALB对H/R诱导的caspase-8、caspase-9、caspase-3活化的影响，从图9-图11可以看出，经过H/R处理后，活化的caspase-3、caspase-8、caspase-9的比例明显增加；而经CALB预处理后显著抑制了caspase-3、caspase-8和caspase-9的活化，表明CALB通过抑制caspase的活化减弱了H/R诱导的凋亡。
线粒体是细胞能量供应和凋亡的主要细胞器。线粒体膜电位(ΔΨm)的丧失将导致膜去极化和触发凋亡级联。用JC-1染色评价枳壳多糖对线粒体膜电位的影响，H/R可损伤H9c2细胞的线粒体膜电位，细胞绿色荧光增强即为证明，如图12所示。CALB预处理对心肌细胞具有一定的保护作用，对抑制H/R诱导的线粒体膜电位缺乏症呈现剂量依赖性。
为了了解CALB具有抗凋亡功能的潜在信号通路，通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达，结果如图13所示，H/R处理导致抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降以及促凋亡蛋白Bax表达增加，这与线粒体稳态失衡密切相关。然而，与对照组相比，CALB预处理提高了Bcl-2/Bax蛋白的比例，说明CALB可以通过调节Bcl-2家族蛋白的表达来抑制H/R诱导的凋亡，如图14所示。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.枳壳多糖提取物在制备治疗心肌损伤引发的动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心律失常、缺血性心肌病、心绞痛和心肌梗死药物中的用途，其特征在于，所述枳壳多糖提取物的制备方法如下：
(1)将枳壳用6～12倍重量的95％乙醇回流脱脂3次，每次回流3h，除去脂溶性杂质，剩余残渣；
(2)将步骤(1)剩余的残渣用6～12倍重量的蒸馏水回流提取3次，每次回流提取2h，将滤液浓缩至枳壳0.2～1.0体积，加入3倍重量的95％乙醇醇沉，离心得沉淀；
(3)将步骤(2)得到的沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；
(4)将步骤(3)洗涤后的沉淀用0.5～2倍重量的蒸馏水复溶，以分子量大小为3.0×103-1.2×104的透析袋透析24～72h，获得透析液；
(5)将步骤(4)获得的透析液减压浓缩至枳壳1体积，加入3倍重量的95％乙醇醇沉，静置过夜，2000rpm/min离心，得多糖沉淀；
(6)将步骤(5)获得的多糖沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；
(7)将步骤(6)洗涤后的多糖沉淀用0.5～2倍重量的蒸馏水复溶，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去多糖中的色素和蛋白质，即得枳壳多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为注射剂和口服剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述注射剂为粉针或水针；所述口服剂为片剂、口服液、颗粒剂或胶囊剂。
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