CN110946887A - 一种具有活血抗炎作用的中药提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有活血抗炎作用的中药提取物，是由原料当归和川芎制成的，当归和川芎的重量比为1～10:1～10，是通过以下方法制备得到的：当归和川芎，经先水后醇提取得到，或经先醇后水提取得到，或经水‑醇组合溶媒提取得到。本发明将当归和川芎配伍，以水和醇组合溶媒提取，有利于多种成分的协同溶出，药理效果也具有协同增效作用。本发明的中药提取物具有活血行气、通络止痛、消肿祛瘀功效，具有抗炎、镇痛作用的同时，通过降低抗氧化损伤，对心血管系统具有很好的保护作用，可预防和治疗炎症、疼痛相关的病症，可以用于制备预防或/和治疗炎症、疼痛相关病症的药物。

Description

一种具有活血抗炎作用的中药提取物及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有活血抗炎作用的中药提取物及其应用，属于中药提取技术领域。
背景技术
当归是伞形科植物当归（Angelica sinensis）的干燥根，性温，味辛、甘，归肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效。川芎是伞形科植物川芎( Ligusticumchuanxiong Hort) 的干燥根茎，其性温、味辛，归肝、胆、心包经，具有活血行气、祛风止痛的等功效。当归和川芎药对临床常配伍用于养血活血，调经止痛，以不同配伍比例应用于中医方剂和中药复方中，例如佛手散、四物汤、八珍汤以及当归芍药散等，在治疗脑血管疾病的128个中成药复方中，当归和川芎出现频次最高，配伍出现25次。
庞晓军等【当归水溶性低分子质量部分抗炎作用研究[J]. 中国医院药学杂志,2016,36(06):447-450. 】对当归水溶性成份进行抗炎研究，明显降低大鼠血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的含量，明显抑制小鼠耳肿胀程度。钟立甲等【代谢组学方法评价当归不同炮制品挥发油抗大鼠急性炎症作用的研究[J]. 中国中药杂志, 2016,41(11):2061-2069.】研究报道当归的四种炮制品对角叉菜胶导致的大鼠足肿胀具有较好的治疗效果，对急性炎症具有良好的治疗效果。马宁宁等【川芎的抗炎物质筛选及其作用机制分析[J]. 中国实验方剂学杂志, 2018,24(18):140-146.】对川芎提取液进行抗炎研究，川芎提取物在人支气管上皮细胞（BEAS-2B）建立炎症细胞模型能显著降低核转录因子（NF-κB）的活性，具有良好的抗炎活性。夏青松等【不同配比当归-川芎药对的抗炎、镇痛作用实验研究[J]. 湖北中医药大学学报, 2015(06):1-4.】研究发现不同配比的当归和川芎能有效抑制二甲苯致小鼠耳肿胀程度以及蛋清致小鼠足肿胀程度，但仅以水煎提取获得提取液，未涉及到乙醇和水的组合溶剂提取，如先水后醇提取、先醇后水提取或50%乙醇提取等，也未进行心血管风险的关联研究。
国内也有论文涉及不同配比、不同制备方法的当归-川芎提取物的抗氧化活性。马宏跃等【基于抗氧化活性的不同制法当归-川芎药对配伍比例研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2010,15(06):631-635.】研究了基于抗氧化活性的不同制法当归-川芎药对配伍比例，黄美艳等【当归-川芎药对不同制法与配比抗氧化活性相互作用研究[J]. 中国中药杂志,2013,38(02):234-238】探讨了当归-川芎药对不同制法与配比抗氧化活性相互作用，也涉及到不同配比当归-川芎分别不同制备方法所得药液的抗氧化活性，但均未涉及到当归和川芎提取物通过抑制氧化应激及炎症因子COX-2、PGE2和TNF-α相关的抗炎作用。
临床上常用非甾体抗炎药物如双氯芬酸、吲哚美辛、塞来昔布等多以环氧合酶为主要靶点的抗炎机制，这类药物具有潜在的心血管风险。本发明的发明人【（环氧合酶(COX-2)抑制剂提高心血管安全性的抗炎机制探讨[J]. 中国中药杂志, 2014,39(20):4054-4059.】曾探讨环氧合酶(COX-2)抑制剂提高心血管安全性的抗炎机制，提及抗炎药物提高抗氧化作用有利于降低心血管风险，但均未涉及到当归和川芎药的使用。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种具有活血抗炎作用的中药提取物，当归和川芎是活血化瘀和祛风湿复方中的共有药对，两者配伍具有活血和抗炎作用。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种具有活血抗炎作用的中药提取物，是由原料当归和川芎制成的，当归和川芎的重量比为1～10:1～10，是通过以下方法制备得到的：当归和川芎，经先水后醇提取得到，或经先醇后水提取得到，或经水-醇组合溶媒提取得到。
优选地，所述当归和川芎的重量比为1～3: 1～3，更优选2:1，3:1，3:2，1:1，1:2，2:3，1:3。
进一步地，所述醇，选自甲醇、乙醇；所述水-醇组合溶媒中，醇选自甲醇、乙醇。
进一步地，所述水-醇组合溶媒中，水和醇的体积比为1～10:1～10。
优选的，所述水-醇组合溶媒中，醇选自乙醇，水和醇的体积比为1:1。
进一步地，提取时，当归和川芎混合后提取，或当归、川芎分别提取后将提取物混合。
优选的，所述中药提取物是通过以下方法制备得到的：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的组合溶媒，回流提取1～4次，合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物。
优选的，所述中药提取物是通过以下方法制备得到的：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的水，回流提取，滤渣加入原料药总重量2～50倍的乙醇或95%乙醇，回流提取；合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物。
优选的，所述中药提取物是通过以下方法制备得到的：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的乙醇或95%乙醇，回流提取，滤渣加入原料药总重量2～50倍的水，回流提取；合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物。
本发明的中药提取物，可以与药学上可接受的辅料混合制成各种剂型，比如颗粒剂、片剂、胶囊剂等。
所述中药提取物在制备预防或/和治疗炎症、疼痛药物中的应用。
所述中药提取物在制备预防或/和治疗炎症、疼痛相关病症的药物中的应用。所述炎症、疼痛相关病症选自心血管病。
本发明的中药提取物，可预防和治疗炎症、疼痛相关的病症，并通过降低抗氧化损伤，对心血管系统具有保护作用。
本发明对当归和川芎以不同溶媒进行提取，如纯水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、无水甲醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、酸水溶液（pH=3～7）、碱水溶液（pH=7～10），先水后醇、先醇后水等提取。对当归和川芎以不同重量比进行配伍，如当归和川芎重量比1:0、10:1、5:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:5、1:10、0:1等比例进行配伍研究。当归和川芎的提取，可以结合浸泡、加热、回流、超声、微波等辅助提高效率。
本发明对当归和川芎中的有效成分，如阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、多糖、总黄酮等的溶出进行研究，在实施例中以阿魏酸和川芎嗪进行举例，当归和川芎在重量比例2:1时，95%乙醇提取时阿魏酸的溶出为0.735 mg/g（市售95%乙醇为最常用，无水乙醇的溶出更差，大约0.650 mg/g），纯水提取时的溶出为1.157 mg/g，50%乙醇提取（HE-2-1）和先水后醇提取（WE-2-1）时的溶出为1.342 mg/g和1.252 mg/g。以当归和川芎在重量比例1:2时川芎嗪的溶出为例，95%乙醇提取液中含量最低为0.122 mg/g，水提取液中的含量为0.027 mg/g，50%乙醇提取液（HE-2-1）和先水后醇提取液（WE-2-1）中阿魏酸的含量最高分别为0.165 mg/g和0.211 mg/g。以水和醇的组合提取比单独溶剂的提取效果好，以水和醇的组合溶媒提取具有协同作用，对于不同有效成分也具有协同溶出的作用。在体外对自由基的清除实验中，先水后醇、先醇后水以及50%乙醇提取物对自由基均具有较好的清除能力，95%乙醇提取或者水提取的清除能力较弱，水和醇的组合溶媒提取物对自由基的清除能力具有协同增效作用。当归中的当归多糖、总黄酮以及川芎中的川芎嗪、总黄酮、川芎多糖等成分也具有良好的抗氧化作用，表明组合溶媒提取有利于多种成分的协同作用。
当归和川芎配伍后与单独的当归或川芎提取物比较，对自由基的清除能力都较强。当归和川芎配伍后对炎症的抑制效果较好，尤其是醇和水组合提取时WE-2-1组和EW-2-1组的肿胀抑制率分别为34.26%和31.38%，优于当归和川芎配伍时单独水提取时的W-2-1组或单独醇提取的E-2-1组，也优于单独的当归或者川芎提取物。当归和川芎配伍后先水后醇提取时WE-2-1组对疼痛抑制率为30.77 % ，优于水提取时W-2-1组对疼痛的抑制率，也优于单独的当归或者川芎提取物的疼痛抑制率。表明当归和川芎配伍组合，以水和醇组合溶剂提取时，与单独的当归或川芎比较，其药理效果具有协同增效作用。
在抗炎机制研究中，当归和川芎以重量比2:1配伍时，以先水后醇或先醇后水的组合溶媒提取得到提取物WE-2-1和EW-2-1，对血管内皮细胞的存活率最高，分别为88.42%和87.37%，具有较好的氧化损伤保护作用。当归和川芎提取物能显著降低MDA的水平，提高SOD活力，降低NO、PGE2、TNF-α和COX-2的水平，在体内具有抗氧化和抗炎作用。当归和川芎提取物可减轻氧化应激程度，降低炎症因子的水平，对心血管系统的氧化损伤具有保护作用。动脉粥样硬化、心肌梗死和心脏病等都是一种炎症性疾病，氧化应激状态和内皮功能障碍是共同的病理基础。临床上常用的非甾体药物在治疗炎症、疼痛方面有良好的效果，但长期使用导致胃肠道副作用，以及较高的心血管风险。抗炎药物提高抗氧化作用，降低氧化应激损伤，有利于降低其心血管风险。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：当归和川芎都具有良好的抗氧化和抗炎作用，对冠心病具有良好的治疗效果，其共有成分阿魏酸和咖啡酸具有抗氧化、抗炎作用，能够清除自由基、降低脂质过氧化、减轻氧化应激，对内皮细胞提供保护作用，而其它有效成分如当归中的当归多糖、总黄酮以及川芎中的川芎嗪、总黄酮、川芎多糖等，也具有良好的药理活性。本发明将当归和川芎配伍，以水和醇组合溶媒提取，有利于多种成分的协同溶出，药理效果也具有协同增效作用。本发明的中药组合物具有活血行气、通络止痛、消肿祛瘀功效，具有抗炎、镇痛作用的同时，对心血管系统具有很好的保护作用。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明中，术语组合溶媒中的“醇”和“水”，“醇”指常见的醇类溶剂，可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等常见溶剂，优选为甲醇、乙醇，再进一步优选为乙醇。“水”指蒸馏水、纯净水、自来水等，水可以弱酸性（pH大约3～7）或者弱碱性（pH大约7～10），优选是中性纯净水。
本发明中，术语“先水后醇”，是指先用水提取一次，再用醇类溶剂（比如无水乙醇，95%乙醇，70%乙醇）提取一次，然后合并两次提取液。
本发明中，术语“先醇后水”，是指先用醇类溶剂（比如无水乙醇，95%乙醇，70%乙醇）提取一次，再用水提取一次，然后合并两次提取液。
附图说明
图1：当归川芎提取液对DPPH·自由基清除能力比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例一：药物制备方法。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量20倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以20倍的工业乙醇（95%乙醇）回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材2000g，川芎药材1000g，粉碎成粗粉，以药材重量10倍的50%乙醇先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以10倍的50%乙醇回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材200g，粉碎成粗粉，以药材重量10倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以10倍的无水甲醇回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材20g，粉碎成粗粉，以药材重量15倍的80%乙醇先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以15倍的80%乙醇回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材50g，川芎药材300g，粉碎成粗粉，以药材重量20倍的80%乙醇先浸泡1小时，再超声提取2小时，过滤，滤渣再以20倍的80%乙醇超声提取2小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量10倍的95%乙醇先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以10倍的蒸馏水回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材300g，川芎药材30g，粉碎成粗粉，以药材重量10倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以10倍的蒸馏水回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量10倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，浓缩至膏状物，干燥，滤渣再以10倍的乙酸乙酯回流提取1小时，过滤，浓缩至膏状物。将两次提取物合并，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量20倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以20倍的无水乙醇回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量40倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以40倍的95%乙醇溶液回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量30倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以30倍的95%乙醇溶液回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量30倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以30倍的70%乙醇溶液回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量30倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以30倍的无水乙醇回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
取当归药材200g，川芎药材100g，粉碎成粗粉，以药材重量40倍的蒸馏水先浸泡1小时，再回流提取1小时，过滤，滤渣再以40倍的无水乙醇回流提取1小时，将两次滤液合并，浓缩至膏状物，干燥，制备得到当归和川芎提取物。
实施例二：中药提取物的制备和用途。
将当归和川芎粉碎，以重量比1:0、1:1、1:2、2:1、1:1.5、0:1混合，分别称取药材粉末4.5 g，放入圆底烧瓶，以蒸馏水为溶媒提取。药材粉末加入150 mL蒸馏水，称重记录，加热回流1 h，放冷，补足溶剂失重，混匀，抽滤，滤渣重新加入150 mL蒸馏水，称重，加热回流1h，冷却，补足溶剂失重，合并两次滤液，得到不同配比当归和川芎水提液，浓缩，干燥，得到当归和川芎提取物。
提取溶媒再分别以95%乙醇、50%乙醇、先水后醇（此实施例中的醇指95%乙醇溶液）、先醇后水制备当归和川芎提取物。
实验一、对当归和川芎有效成分的协同溶出作用。
按照实施例二中的提取方案，当归和川芎以不同比例不同溶剂提取，合并提取液，研究其化学成分的溶出。当归和川芎提取液取样，通过HPLC法测试阿魏酸和川芎嗪的含量，如表1和表2所示。色谱条件：ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)，流动相甲醇- 1%醋酸水溶液（25：75），检测波长为310 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，柱温为28℃。
表1 当归-川芎提取液中阿魏酸的含量（mg/g）。
Figure 269985DEST_PATH_IMAGE001
。
表2 当归-川芎提取液中川芎嗪的含量（mg/g）。
Figure 187126DEST_PATH_IMAGE002
。
实验结果表明，川芎提取液中阿魏酸的含量最高，当归提取液中含量最低。以当归和川芎在重量比例2:1时阿魏酸的溶出为例，95%乙醇提取液中含量最低为0.735 mg/g，水提取液中的含量为1.157 mg/g，50%乙醇提取液（HE-2-1）和先水后醇提取液（WE-2-1）中阿魏酸的含量最高分别为1.342 mg/g和1.252 mg/g，以水和醇的组合提取比单独溶剂的提取效果好。川芎提取液中川芎嗪的含量最高，当归提取液中没有检测出。以当归和川芎在重量比例1:2时川芎嗪的溶出为例，95%乙醇提取液中含量最低为0.122 mg/g，水提取液中的含量为0.027 mg/g，50%乙醇提取液（HE-2-1）和先水后醇提取液（WE-2-1）中阿魏酸的含量最高分别为0.165 mg/g和0.211 mg/g，以水和醇的组合提取比单独溶剂的提取效果好。水提取有利于阿魏酸的溶出，乙醇提取有利于川芎嗪的溶出，而以水和醇的组合溶媒提取具有协同作用，对于不同有效成分也具有协同溶出的作用。
当归和川芎药对除了共有成分阿魏酸和川芎嗪以外，其它药效成分如当归中的咖啡酸、当归多糖、总黄酮以及川芎中的咖啡酸、总黄酮、川芎多糖等成分，在以水和醇的组合溶媒提取时，也有利于多种有效成分的协同溶出。
实验二、当归和川芎提取物对自由基的清除作用。
将实施例二中的当归和川芎提取液，稀释成不同浓度的测试液，以维生素C作对照品，研究其体外清除自由基的能力。移取测试液50 μL，再加入120 μg/mL的DPPH溶液100 μL，对照组用70%乙醇代替不同浓度的测试液，避光反应30 min，用多功能读板机检测517 nm处的吸光度，分别记作A测试和A对照，按照下述公式计算对DPPH自由基的清除率。
计算公式：
Figure 966863DEST_PATH_IMAGE003
。
当归和川芎提取液对DPPH·自由基的清除效果如图1所示，其中，先水后醇提取液、先醇后水以及50%乙醇对DPPH·自由基均具有较好的清除能力，而95%乙醇提取或者水提取的清除能力较弱。当归-川芎不同配比的提取液中，当归和川芎配伍后与单独的当归或川芎比较，对DPPH·自由基都的清除能力较强。
据研究报道，当归和川芎的共有成分阿魏酸和咖啡酸具有抗氧化作用，其它成分如当归中的当归多糖、总黄酮以及川芎中的川芎嗪、总黄酮、川芎多糖等成分也具有良好的抗氧化作用，组合溶媒提取有利于多种成分的协同作用，可减轻炎症过程中的氧化应激。
实验三、当归和川芎提取物对炎症的抑制作用。
按照实施例二中的方法制备当归和川芎提取物，研究其对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用。雄性昆明小鼠随机分为14组，每组10只，分别为模型组（生理盐水）、双氯芬酸钠对照组（15 mg/kg）、当归-川芎提取物组（WE-1-0、WE-1-1、WE-1-2、WE-2-1、WE-0-1、W-1-0、W-1-1、W-1-2、W-2-1、W-0-1、E-2-1、EW-2-1）。连续灌胃3 d，给药体积为 0.1 mL/10 g，末次给药1 h后，各组小鼠右耳均匀涂抹二甲苯20 μL，1 h后脱颈椎处死小鼠，剪下左右耳朵，用直径8 mm的打孔器打下左右耳片称重，计算耳肿胀度和肿胀抑制率，结果如表3所示。
表3不同当归-川芎提取物对小鼠耳肿胀抑制率比较。
Figure 830914DEST_PATH_IMAGE004
。
注：与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05。
当归和川芎提取物以3.337 g/kg剂量给药，14组提取物表现出不同程度的肿胀抑制作用。实验表明，以乙醇和水组合溶剂提取时，单独的当归提取WE-1-0组或者川芎提取WE-0-1组的肿胀抑制效果较差，而当归和川芎配伍后对肿胀的抑制效果较好，尤其是WE-2-1组和EW-2-1组的抗炎效果最好，肿胀抑制率分别为34.26%和31.38%，与模型组具有显著性差异，结果具有统计学意义。单独以水为溶剂提取时，单独的当归提取W-1-0组或者川芎提取W-0-1组的肿胀抑制效果较差，而当归和川芎配伍后对肿胀的抑制效果较好，其中W-2-1组的抑制率最高为19.03%，单独以水为溶剂提取时E-2-1组的抑制率最高为10.55%，但都明显不如乙醇和水组合溶剂提取时WE-2-1组的抑制效果。表明当归和川芎配伍后具有协同抗炎增效作用，而乙醇和水作为组合提取有利于多成分的溶出，也有抗炎增效作用。
实验四、当归和川芎提取物对疼痛的抑制作用。
按照实施例二中的方法制备当归和川芎提取物，研究其对乙酸致小鼠扭体的抑制作用。雄性昆明小鼠随机分为10组，每组10只，分别为模型组（生理盐水）、双氯芬酸钠对照组（15 mg/kg）、当归-川芎提取物组（WE-1-0、WE-2-1、WE-1-1、WE-0-1、W-1-0、W-2-1、W-1-1、W-0-1），提取物给药体积为 0.1 mL/10 g。灌胃给药前，禁食12小时，自由饮水。给药1h后，腹腔注射0.7% 醋酸生理盐水溶液0.2 mL/只，观察并记录15分钟内的扭体次数，计算各组的平均扭体次数。与空白组比较，再计算扭体抑制率，结果如表4所示。
表4 不同当归-川芎提取物对小鼠扭体抑制率比较。
Figure 645286DEST_PATH_IMAGE005
。
注：与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05。
当归和川芎提取物以3.337 g/kg剂量给药，10组提取物表现出不同程度的疼痛抑制作用。实验表明，以乙醇和水组合溶剂提取时，单独的当归提取WE-1-0组或者川芎提取WE-0-1组的疼痛抑制效果较差，而当归和川芎配伍后WE-2-1组对疼痛的抑制效果较好，疼痛抑制率为30.77%，与模型组具有显著性差异，结果具有统计学意义。以水为溶剂提取时，当归和川芎配伍后W-2-1组对疼痛的抑制明显不如乙醇和水组合溶剂提取时的效果。表明以乙醇和水组合溶剂提取时，当归和川芎配伍后具有更好的协同镇痛增效作用。
实验五、当归和川芎提取物对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。
将实施例二中的当归和川芎提取液，浓缩干燥得到膏状物，研究当归和川芎提取物对HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。血管内皮细胞（HUVEC）以0.8 mmol/L的H2O2诱导损伤4h后，细胞形态发生明显改变，MTT检测到细胞存活率为61.64%，Vc提前给药干预，保护HUVEC细胞，降低氧化损伤程度，呈浓度依赖性提高细胞存活率，8 μg/mL的维生素C提高存活率至81.81%，并且显著改善细胞形态。
表5 当归-川芎提取物对H2O2损伤HUVEC细胞存活率的影响。
Figure 467749DEST_PATH_IMAGE006
。
注：与空白组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.05，*P<0.05。
当归和川芎提取物以0.2 mg/mL提前干预，对H2O2损伤HUVEC细胞的保护作用，如表5所示。多数提取物如WE-1-0、WE-1-1、WE-1-2、WE-2-1、WE-0-1、EW-1-1.5、EW-1-2、EW-2-1、EW-0-1、HE-1-1.5、HE-1-2等，都可以不同程度的提高细胞存活率，结果具有统计学意义。其中，当归和川芎以重量比2:1配伍时，以先水后醇或先醇后水的组合溶媒提取得到WE-2-1和EW-2-1，血管内皮细胞的存活率最高，分别为88.42%和87.37%，具有较好的氧化损伤保护作用。
实验六、当归和川芎提取物的抗炎机制研究。
按照实施例二中的方法制备当归和川芎提取物，通过角叉菜胶致大鼠足肿胀实验进一步研究其抗氧化和抗炎作用，以当归和川芎提取物WE-2-1组为例。雄性SD大鼠36只，随机分为6组，空白组、模型组、双氯芬酸钠对照组（10 mg/kg），WE-2-1高剂量组（2.86 g/kg）、WE-2-1中剂量组（2.29 g/kg）、WE-2-1低剂量组（1.8 g/kg），连续灌胃3 d，末次给药1 h后，软尺测量致炎前左后足周长，除空白组外，其余5组大鼠左后足注射1%角叉菜胶0.1 mL，空白组注射等体积的生理盐水，分别测量致炎后0.5 h、1 h、2 h、3 h时左后足周长，计算足肿胀度和肿胀抑制率。
双氯芬酸纳组与WE-2-1中剂量组对角叉菜胶致大鼠足肿胀具有显著的抑制作用，在0.5~3 h之间肿胀度与模型组比较，具有显著性差异（P<0.01），WE-2-1中剂量组在1 h时肿胀抑制达到最大，抑制率为41.17%。
表6 WE-2-1组对大鼠血清中NO、MDA、SOD含量的影响。
Figure 734782DEST_PATH_IMAGE007
。
表7 WE-2-1组对大鼠血清中COX-2、PGE2、TNF-α含量的影响。
Figure 933682DEST_PATH_IMAGE008
。
注：与空白组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.05，*P<0.05。
在抗炎机制研究中，双氯芬酸钠组与WE-2-1中剂量组能够有效降低大鼠血清中NO水平，以及降低血清中的MDA水平，而WE-2-1中剂量组与高剂量组可以显著提高SOD活力，如表6所示。WE-2-1中剂量组和低剂量组能有效降低大鼠血清中COX-2、PGE2和TNF-α的水平，如表7所示。
当归和川芎提取物WE-2-1组能显著降低MDA的水平，提高SOD活力，在体内具有抗氧化作用，可减轻氧化应激程度，降低炎症大鼠血清中TNF-α和NO、PGE2的水平，病理学结果表明WE-2-1明显抑制炎性细胞的产生，从而减轻炎症反应，发挥抗炎效果。对大鼠连续两周给予提取物WE-2-1，未观察到心脏毒性反应。当归和川芎提取物对自由基具有良好的清除作用，可降低血管内皮细胞的氧化损伤，心脏病理研究表明WE-2-1对心脏具有很好的保护效果。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种具有活血抗炎作用的中药提取物，其特征在于：是由原料当归和川芎制成的，当归和川芎的重量比为1～10:1～10，是通过以下方法制备得到的：当归和川芎，经先水后醇提取得到，或经先醇后水提取得到，或经水-醇组合溶媒提取得到。
2.根据权利要求1所述的具有活血抗炎作用的中药提取物，其特征在于：所述当归和川芎的重量比为1～3:1～3。
3.根据权利要求1所述的具有活血抗炎作用的中药提取物，其特征在于：所述当归和川芎的重量比为2:1或3:1或3:2或1:1或1:2或2:3或1:3。
4.根据权利要求1所述的具有活血抗炎作用的中药提取物，其特征在于：所述先水后醇、先醇后水中的醇，选自甲醇、乙醇、95%乙醇溶液；
或/和：所述水-醇组合溶媒中，醇选自甲醇、乙醇；
或/和：所述水-醇组合溶媒中，水和醇的体积比为1～10:1～10。
5.根据权利要求1所述的具有活血抗炎作用的中药提取物，其特征在于：提取时，当归和川芎混合后提取，或当归、川芎分别提取后将提取物混合。
6.根据权利要求1所述的具有活血抗炎作用的中药提取物，其特征在于：所述中药提取物是通过以下方法制备得到的：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的组合溶媒，回流提取1～4次，合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物；
或：所述中药提取物是通过以下方法制备得到的：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的水，回流提取，滤渣加入原料药总重量2～50倍的95%乙醇溶液，回流提取；合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物；
或：所述中药提取物是通过以下方法制备得到的：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的95%乙醇溶液，回流提取，滤渣加入原料药总重量2～50倍的水，回流提取；合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物。
7.权利要求1～6中任一项所述的具有活血抗炎作用的中药提取物，其特征在于：当归和川芎的重量比为2:1，是通过以下方法制备得到的：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量30倍的水，回流提取，滤渣加入原料药总重量30倍的95%乙醇溶液，回流提取；合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物。
8.权利要求1～7中任一项所述的具有活血抗炎作用的中药提取物的制备方法，其特征在于：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的组合溶媒，回流提取1～4次，合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物；
或：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的水，回流提取，滤渣加入原料药总重量2～50倍的醇，回流提取；合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物；
或：将当归和川芎混合后粉碎或粉碎后混合，加入原料药总重量2～50倍的醇，回流提取，滤渣加入原料药总重量2～50倍的水，回流提取；合并提取液，浓缩，干燥，得中药提取物。
9.权利要求1～8中任一项所述的具有活血抗炎作用的中药提取物在制备预防或/和治疗炎症、疼痛药物中的应用，或：在制备预防或/和治疗炎症、疼痛相关病症的药物中的应用。
10.权利要求1～8中任一项所述的具有活血抗炎作用的中药提取物在制备治疗或预防心血管疾病的药物中的应用。
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