CN113512081B - 一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法。该方法包括S1、将木姜叶柯叶子与有机溶剂混合在70～90℃下进行回流提取或超声提取多次得到提取液；S2、将步骤S1得到的所述提取液中的有机溶剂去除得到木姜叶柯粗提物，之后将所述木姜叶柯粗提物与水混合在80～100℃下回流反应，之后过滤得到第一滤液；S3、将步骤S2得到的第一滤液结晶，抽滤得到第二滤液和三叶苷粗品；S4、将步骤S3得到的第二滤液上大孔树脂柱，用乙醇洗脱，之后重结晶得到根皮苷。该能够同时得到三叶苷和根皮苷，三叶苷和根皮苷的回收率高达93％以上。

Description

一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法

技术领域

本发明涉及植物提取工艺技术领域，尤其涉及一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法。

背景技术

木姜叶柯Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun，别名甜茶(通称)、甜叶子树(云南)、胖稠(广东)、甜味菜、大叶稠子、甘茶(贵州)、多穗石柯等，系壳斗科石柯属常绿乔木。木姜叶柯以野生状态分布于我国长江以南各省区海拔500～2500m的低山密林中，印度、泰国也有分布。多穗柯甜茶为木姜叶柯的叶经加工而成的代茶饮料和保健食品，民间常采集其嫩叶食用，其茶甘甜清爽，香气浓郁，色泽鲜艳，回味持久，风味独特，据称有生津止渴，消除疲劳之功效。木姜叶柯的主要有效成分为黄酮类化合物，其中三叶苷(trilobatin)和根皮苷(phlorizin)是木姜叶柯黄酮中含量最高的两个成分，二者在木姜叶柯叶中的总含量可达到10％～25％，其含量随产地和季节而不同。

三叶苷和根皮苷作为两种种天然甜味剂代替蔗糖和合成甜味剂引起了从业人员的极大兴趣，其甜度高而热量低，对于预防肥胖、糖尿病、心血管病和高血压有一定效果，具有抑制糖尿病、抗氧化、促肝细胞增殖等作用。如何用尽可能简单的方法提高三叶苷和根皮苷的产率和收率，对于三叶苷和根皮苷这样优良的天然甜味剂的生产和应用具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何同时从木姜叶柯叶子中高效提取出三叶苷和根皮苷。

为解决上述技术问题，本发明提出了一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法。

本发明提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

S1、将木姜叶柯叶子与有机溶剂混合在70～90℃下进行回流提取或进行超声提取多次得到提取液；

S2、将步骤S1得到的所述提取液中的有机溶剂去除得到木姜叶柯粗提物，之后将所述木姜叶柯粗提物与水混合在80～100℃下回流反应，之后过滤得到第一滤液；

S3、将步骤S2得到的第一滤液结晶，抽滤得到第二滤液和三叶苷粗品；

S4、将步骤S3得到的第二滤液上大孔树脂柱，用乙醇洗脱，之后重结晶得到根皮苷。

进一步地，在步骤S1中，每次回流提取的时间为60～90min。

进一步地，在步骤S2中，所述回流反应的时间为20～60min。

进一步地，在步骤S1中，所述木姜叶柯叶子与所述有机溶剂的物料比为1g:5～50mL。

进一步地，在步骤S1中，所述超声提取时间为10～60min提取多次，超声波输出功率为300～500W。

进一步地，在步骤S2中，所述木姜叶柯粗提物与所述水的质量比为1:5～50。

进一步地，在步骤S1中，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇中的一种或者多种。进一步地，在步骤S2中，所述过滤之前还包括加入活性炭脱色。

进一步地，在步骤S4中，所述乙醇的体积浓度为30～35％。

进一步地，在步骤S4中，用乙醇洗脱之前还包括用水和体积浓度为5％-10的乙醇除杂依次除杂。

本发明与现有技术对比的有益效果包括：先将木姜叶柯叶子与有机溶剂混合在70～90℃下回流提取或者超声提取多次得到提取液，将木姜叶柯叶子的有效组分尽量溶出，回收有机溶剂得到木姜叶柯粗提物，将木姜叶柯粗提物加水在80～100℃下回流反应，去除了溶于有机溶剂中的叶绿素、油脂和蜡质等小极性物质，水将木姜叶柯粗提物中的根皮苷和三叶苷浸出，之后过滤得到第一滤液，由于第一滤液中的三叶苷的含量远远高于根皮苷，根皮苷在低温水溶液中远远未达到饱和，故可以结晶得到三叶苷，将第一滤液结晶得到第二滤液和三叶苷粗品，之后将第二滤液上大孔树脂柱，用乙醇洗脱重结晶即可得到根皮苷粗品，通过本申请提出的方法处理木姜叶柯叶子能够同时得到三叶苷和根皮苷，三叶苷和根皮苷的回收率高达93％以上。

附图说明

通过参考附图会更加清楚的理解本发明的特征和优点，附图是示意性的而不应理解为对本发明进行任何限制，在附图中：

图1为本发明实施例1提取的三叶苷的HPLC谱图。

图2为本发明实施例4提取的三叶苷的HPLC谱图。

图3为本发明实施例5提取的三叶苷的HPLC谱图。

图4为本发明实施例1提取的根皮苷的HPLC谱图。

图5为本发明实施例4提取的根皮苷的HPLC谱图。

图6为本发明实施例5提取的根皮苷的HPLC谱图。

具体实施方式

本具体实施方式提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

S0、将采集到的木姜叶柯叶片洗净并在50℃～60℃温度下干燥至恒重，粉碎过35～45目筛，太细，太粗提取效率不高；

S1、将木姜叶柯叶子与有机溶剂按照物料比1g:5～50mL混合在70～90℃下回流60～90min提取多次得到提取液；或者在超声条件下将所述木姜叶柯叶子与所述有机溶剂按照物料比1g:10～20mL混合回流10～60min提取2～3次，超声波输出功率为300～500W；所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇中的一种或者多种；

S2、将步骤S1得到的所述提取液中的有机溶剂去除得到木姜叶柯粗提物浸膏，之后将所述木姜叶柯粗提物浸膏与水按照体积比1:5-50混合在80～100℃下回流反应20～60min，之后加入活性炭脱色，之后过滤得到第一滤液；

S3、将步骤S2得到的第一滤液浓缩结晶，抽滤得到第二滤液和三叶苷粗品，由于第一滤液中的三叶苷的含量远远高于根皮苷，根皮苷在低温水溶液中远远未达到饱和，故可以结晶得到三叶苷；将三叶苷粗品溶于水中在80-90℃下加热搅拌溶解，之后高速离心，分离沉淀，收集上清液，将上清液冷藏过夜，高速离心，收集结晶，用纯水洗涤，烘干得到三叶苷纯品；

S4、将步骤S3得到的第二滤液上大孔树脂柱，用体积浓度为50～70％的乙醇洗脱后回收乙醇，用水或者乙醇溶解后经结晶数次，过滤并干燥得到根皮苷纯品；所述大孔树脂包括60～80目的以苯乙烯或乙基苯乙烯为树脂骨架的非极性或弱极性大孔树脂，包含但不限于D-101、AB-8、HPD-300、LX-38、LSA-10、LX-60、上试101、X-5、D-3520、XAD-1、D1、HP-10树脂。大孔树脂层析，上样量为3BV，洗脱时依次用水洗至糖色反应呈阴性以去除多糖等杂质，用体积浓度为5-10％(v/v)的乙醇洗2BV，30-35％乙醇洗脱5BV，收集30-35％(v/v)的醇洗液，洗脱流速为1～3BV/h。

进一步地，在步骤S4和步骤S5中，所述的结晶和重结晶温度为0～10℃，溶剂为去离子水或5％～30％乙醇，三叶苷结晶时溶剂用量为植物原料质量的0.1～3倍，根皮苷结晶溶剂用量为植物原料质量的0.01～0.3倍，每次结晶时间为12～24h，重结晶次数为1～2次。

下述实施例中的木姜叶柯叶都是通过木姜叶柯叶片洗净并在55℃温度下干燥至恒重，粉碎过35～45目筛得到。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1

本实施例提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

1)准确称取木姜叶柯叶粉碎原料100g，用1600mL的乙酸乙酯在70℃下提取1次，之后每次1200mL的乙酸乙酯在80℃下提取两次，每次提取1小时，将每次所得提取液过滤，合并3次提取液；

2)将合并后的提取液浓缩至干得到木姜叶柯叶粗提物；将木姜叶柯叶粗提物与其30倍质量的95℃的去离子水混合，在100℃条件下回流30min，回流完成后加入2g活性炭搅拌5min，过滤得到第一滤液；

3)将第一滤液浓缩，之后在4℃条件下结晶，抽滤得到三叶苷粗品和第二滤液，将三叶苷粗品用90℃的热水加热搅拌溶解，高速离心，分离沉淀，收集上清液，将上清液冷藏过夜，高速离心，收集结晶，用纯水洗涤，烘干得到三叶苷纯品13.27g，HPLC图谱如图1所示，检测纯度为96.73％；所述三叶苷的回收率为94.21％；

4)将第二滤液上LX-38大孔树脂柱，水洗至流出液糖色反应呈阴性以去除多糖等杂质，之后5％(v/v)的乙醇洗2BV，30％乙醇洗脱5BV，收集30％(v/v)的醇洗液，洗脱流速为1BV/h，洗脱液经过浓缩干燥得到根皮苷粗品1.11g，将根皮苷粗品用去离子水溶解后在4℃重结晶两次，过滤并干燥后得到根皮苷纯品0.97g，HPLC图谱如图4所示，HPLC检测纯度为98.04％，所述根皮苷的回收率为94.24％。

实施例2

本实施例提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

1)准确称取木姜叶柯叶粉碎原料100g，用1600mL的乙酸乙酯在80℃下提取1次，之后每次1200mL的乙酸乙酯在80℃下提取两次，每次提取1.5小时，将每次所得提取液过滤，合并3次提取液；

2)将合并后的提取液浓缩至干得到木姜叶柯叶粗提物；将木姜叶柯叶粗提物与其40倍质量的95℃的去离子水混合，在100℃条件下回流30min，回流完成后加入2g活性炭搅拌5min，过滤得到第一滤液；

3)将第一滤液浓缩并在4℃条件下结晶，抽滤得到三叶苷粗品和第二滤液，将三叶苷粗品用90℃的热水加热搅拌溶解，高速离心，分离沉淀，收集上清液，将上清液冷藏过夜，高速离心，收集结晶，用纯水洗涤，烘干得到三叶苷纯品13.21g，HPLC检测纯度为96.76％；三叶苷的回收率为94.17％；

4)将第二滤液上LX-38大孔树脂柱，水洗至流出液糖色反应呈阴性以去除多糖等杂质，之后10％(v/v)的乙醇洗2BV，35％乙醇洗脱5BV，收集35％(v/v)的醇洗液，洗脱流速为2BV/h，洗脱液经过浓缩干燥得到根皮苷粗品1.02g，将根皮苷粗品用去离子水溶解后在4℃重结晶两次，过滤并干燥后得到根皮苷纯品0.92g，HPLC检测纯度为98.12％；根皮苷的回收率为94.04％。

实施例3

本实施例提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

1)准确称取木姜叶柯叶粉碎原料100g，用2000mL的乙酸乙酯在90℃下提取1次，之后每次2000mL的乙酸乙酯在90℃下提取1次，每次提取70min，将每次所得提取液过滤，合并两次提取液；

2)将合并后的提取液浓缩至干得到木姜叶柯叶粗提物；将木姜叶柯叶粗提物与其50倍质量的80℃的去离子水混合，在90℃条件下回流20min，回流完成后加入2g活性炭搅拌5min，过滤得到第一滤液；

3)将第一滤液浓缩并在4℃条件下结晶，抽滤得到三叶苷粗品和第二滤液，将三叶苷粗品用80℃的热水加热搅拌溶解，高速离心，分离沉淀，收集上清液，将上清液冷藏过夜，高速离心，收集结晶，用纯水洗涤，烘干得到三叶苷纯品13.13g，HPLC检测纯度为96.56％；所述三叶苷的回收率为94.15％；

4)将第二滤液上LX-38大孔树脂柱，水洗至流出液糖色反应呈阴性以去除多糖等杂质，之后5％(v/v)的乙醇洗2BV，30％乙醇洗脱5BV，收集30％(v/v)的醇洗液，洗脱流速为3BV/h，洗脱液经过浓缩干燥得到根皮苷粗品1.04g，将根皮苷粗品用去离子水溶解后在4℃重结晶两次，过滤并干燥后得到根皮苷纯品0.94g，HPLC检测纯度为98.11％，所述根皮苷的回收率为93.28％。

实施例4

本实施例提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

1)取木姜叶柯叶清洗干净，于50℃条件下干燥至恒重并粉碎；

2)准确称取木姜叶柯叶粉碎原料1kg，采用常压超声提取，超声波输出功率为500W，温度80℃，溶剂为10L乙酸乙酯，提取3次，第一次提取时间为20min，之后的两次提取时间分别为10min，将每次所得提取液过滤并合并；

3)将合并后的提取液浓缩至干得到木姜叶柯叶粗提物浸膏；将木姜叶柯叶粗提物浸膏与其40倍质量的100℃的去离子水，在100℃条件下回流20min，回流完成后加入20g活性炭搅拌2min，过滤得到第一滤液；

4)将第一滤液浓缩至600mL并在4℃下结晶，抽滤得到三叶苷粗品和第二滤液，三叶苷粗品用20％乙醇加热搅拌溶解，离心除去沉淀并收集上清液，将上清液在4℃下冷藏过夜，抽滤得到沉淀，沉淀用纯水洗涤，烘干得到三叶苷纯品133.19g，HPLC图谱如图2所示，HPLC检测纯度为99.19％；所述三叶苷的回收率为93.78％

5)第二滤液上AB-8大孔树脂柱，水洗至流出液糖色反应呈阴性后，用体积浓度为10％(v/v)的乙醇洗2BV，30％乙醇洗脱5BV，收集30％(v/v)的醇洗液，洗脱流速为3BV/h，收集醇洗脱段，洗脱液经过浓缩干燥得到根皮苷粗品13.67g，将根皮苷粗品用去离子水溶解后在4℃下重结晶两次，过滤并干燥后得到根皮苷纯品6.59g，HPLC图谱如图5所示，HPLC检测纯度为97.49％，所述根皮苷的回收率为93.69％。

实施例5

本实施例提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

1)取木姜叶柯叶清洗干净，于55℃条件下干燥至恒重并粉碎；

2)准确称取木姜叶柯叶粉碎原料2kg，用36L的乙酸乙酯提取1次，之后用12L的乙酸乙酯分别提取两次，每次提取1小时，将每次所得提取液过滤并合并3次提取液；

3)将合并后的提取液浓缩至干得到木姜叶柯叶粗提物；将木姜叶柯叶粗提物与其50倍质量的100℃的去离子水并在90℃条件下回流30min，回流完成后加入25g活性炭搅拌4min，过滤得到第一滤液；

4)将第一滤液在2℃条件下结晶，抽滤得到三叶苷粗品和第二滤液，将三叶苷粗品用15％乙醇加热搅拌溶解，高速离心，分离不溶物，收集上清液，将上清液冷藏过夜，过滤得沉淀，沉淀用纯水洗涤，烘干得到三叶苷纯品263.94g，HPLC图谱如图3所示，HPLC检测纯度为97.67％；所述三叶苷的回收率为94.25％；

5)将第二滤液b上LSA-10大孔树脂柱，水洗至流出液糖色反应呈阴性后用之后10％(v/v)的乙醇洗2BV，35％乙醇洗脱5BV，收集35％(v/v)的醇洗液，洗脱流速为2BV/h洗脱液经过浓缩干燥得到根皮苷粗品27.39g，将根皮苷粗品用去离子水溶解后在2℃结晶，所得结晶用10％的乙醇水溶解，最终得到根皮苷纯品13.25g，HPLC图谱如图6所示，HPLC检测纯度为98.04％，所述根皮苷的回收率为94.13％。

对比例1

本实施例提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

1)取木姜叶柯叶清洗干净，于50℃条件下干燥至恒重并粉碎；

2)准确称取木姜叶柯叶粉碎原料1kg，采用常压超声提取，超声波输出功率为500W，温度80℃，溶剂为10L水，提取3次，第一次提取时间为20min，之后的两次提取时间分别为10min，将每次所得提取液过滤并合并；

3)将合并后的提取液浓缩至干得到木姜叶柯叶粗提物浸膏；将木姜叶柯叶粗提物浸膏与其50倍质量的100℃的去离子水，在100℃条件下回流20min，回流完成后加入20g活性炭搅拌2min，过滤得到第一滤液；

4)将第一滤液浓缩至600mL并在4℃下结晶，抽滤得到三叶苷粗品和第二滤液，三叶苷粗品用20％乙醇搅拌溶解，离心除去沉淀并收集上清液，将上清液在4℃下冷藏过夜，抽滤得到沉淀，沉淀用纯水洗涤，烘干得到三叶苷纯品66.31g，HPLC检测纯度为97.19％；所述三叶苷的回收率为46.04％；

5)第二滤液上AB-8大孔树脂柱，水洗至流出液糖色反应呈阴性后，用体积浓度为10％(v/v)的乙醇洗2BV，30％乙醇洗脱5BV，收集30％(v/v)的醇洗液，洗脱流速为3BV/h，收集醇洗脱段，洗脱液经过浓缩干燥得到根皮苷粗品6.53g，将根皮苷粗品用去离子水溶解后在4℃下重结晶两次，过滤并干燥后得到根皮苷纯品2.98g，HPLC检测纯度为97.27％，所述根皮苷的回收率为42.38％。

对比例2

本实施例提出一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，包括以下步骤：

1)取木姜叶柯叶清洗干净，于50℃条件下干燥至恒重并粉碎；

2)准确称取木姜叶柯叶粉碎原料1kg，采用常压超声提取，超声波输出功率为500W，温度80℃，溶剂为10L的70％乙醇(v/v)，提取3次，第一次提取时间为20min，之后的两次提取时间分别为10min，将每次所得提取液过滤并合并得到第一滤液；

4)将第一滤液浓缩至600mL，回收乙醇，加水稀释后上D-101大孔树脂，水洗去杂质，之后用60％的乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥，用加入1000mL的水加热溶解，在4℃条件下结晶，抽滤得到滤饼和滤液b，滤饼用纯水洗涤，烘干得到三叶苷纯品103.52g，HPLC检测纯度为99.19％，所述三叶苷的回收率为75.62％。

5)第二滤液上AB-8大孔树脂柱，水洗至流出液糖色反应呈阴性后，用体积浓度为10％(v/v)的乙醇洗2BV，30％乙醇洗脱5BV，收集30％(v/v)的醇洗液，洗脱流速为3BV/h，收集醇洗脱段，洗脱液经过浓缩干燥得到根皮苷粗品9.61g，将根皮苷粗品用去离子水溶解后在4℃下重结晶两次，过滤并干燥后得到根皮苷纯品5.17g，HPLC检测纯度为97.42％，所述根皮苷的回收率为73.5％。

对比例1与实施例4的区别在于采用的溶剂为水，对比例2与实施例4的区别在于对比例2需要柱层析，从而需要更高的成本，而且树脂吸附造成目标产物的部分损失。从对比例1可以看出水溶剂提取得到的三叶苷和根皮苷的纯度和回收率都较低；从对比例2可以用高浓度乙醇提取后面的纯化也一定程度上影响了三叶苷和根皮苷的回收率。

本发明其他有益效果：

1)本发明用乙酸乙酯提取，粗提物中目标成分提取的更为充分，滤渣中残留更少，创造的价值更大，由于粗提物中目标成分含量高，且后续进一步富集更为简便；

2)本发明中由于粗提物中三叶苷含量比较高，可以直接在合适的浓度下析出结晶，用水或极低浓度的乙醇结晶可减少乙醇的使用量，减少乙醇回收工作量。

3)使用乙酸乙酯作为溶剂进行提取，比起水作为溶剂在植物细胞中具有更强的渗透性，且乙酸乙酯相对于水对三叶苷具有更好的溶解性，因此具有更高的回收率。

4)采用较低浓度的乙醇结晶对三叶苷具有较高的回收率，结晶后减少了目标产物三叶苷和根皮苷提取物中的脂溶性杂质和水溶性杂质。

5)该方法不仅能得到高纯度和回收率的三叶苷，亦能得到副产物根皮苷，一次即可提取得到两种产物，提高了木姜叶柯叶植物资源的利用价值。

6)木姜叶柯中除了有丰富的天然甜味剂三叶苷外，另一种天然甜味剂根皮苷的含量也较高，本发明首次提出在提取得到木姜叶柯叶中三叶苷的同时，亦能得到含量较为丰富的根皮苷，这样就增强了木姜叶柯叶的实用价值，也增强了经济效益。

7)整个过程未用到任何有毒有害溶剂，实现了分离纯化过程的绿色化，不需要昂贵的设备和复杂的操作，工艺简单，设备、溶剂和原料常见，能耗低，适合工厂的大规模生产。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

Claims (3)

1.一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将木姜叶柯叶子与有机溶剂混合在70～90℃下回流提取或超声提取多次得到提取液，有机溶剂为乙酸乙酯；

S2、将步骤S1得到的所述提取液中的有机溶剂去除得到木姜叶柯粗提物，之后将所述木姜叶柯粗提物与水混合在80～100℃下回流反应，之后过滤得到第一滤液；过滤之前还包括加入活性炭脱色；

S3、将步骤S2得到的第一滤液结晶，抽滤得到第二滤液和三叶苷粗品；

S4、将步骤S3得到的第二滤液上大孔树脂柱，用乙醇洗脱，之后重结晶得到根皮苷；乙醇的体积浓度为30～35％；用乙醇洗脱之前还包括用水和体积浓度为5％-10％的乙醇除杂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，超声提取时间为10～60min，并多次提取，超声波输出功率为300～500W。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述木姜叶柯粗提物与所述水的质量比为1:5～50。

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