CN114166956A - 一种快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，包括如下步骤：测定多穗柯叶片叶绿素含量，高效液相色谱法测定根皮苷和三叶苷标准品绘制曲线方程，多穗柯新鲜叶片样品溶液的制备，高效液相色谱法测定多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷含量，再建立根皮苷含量、三叶苷含量与叶绿素含量间的相关性方程，采用手持叶绿素测定仪测定不同成熟叶片的叶绿素含量，通过叶绿素与根皮苷、三叶苷的相关性方程，从叶绿素含量计算出根皮苷、三叶苷的含量。本方法操作简单、检测成本低、检测时间短，为多穗柯鲜叶活性成分的快速检测提供了有效途径，更好地指导农户进行多穗柯鲜叶选择性采摘，为多穗柯原料筛选及多穗柯茶加工提供直观的评价和科学参考。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分检测技术领域，具体是一种快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法。
背景技术
多穗柯(Lithocarpus Litseifolius(Hance)Chun)，别名甜茶，属于壳斗科柯属常绿乔木，作为药食同源植物，其根、叶以及果实均可入药，具有抗氧化、降血糖、抗菌消炎等药理作用。研究表明多穗柯叶含有丰富的黄酮类和二氢查耳酮，如根皮苷、三叶苷和根皮素，其中根皮素的含量较根皮苷、三叶苷含量低。但是通过肠道菌群的作用，根皮苷通过人体代谢会转化为根皮素。根皮苷和三叶苷的含量受种植地域、鲜叶采收时间和树叶成熟度的影响，不同种源多穗柯的根皮苷和三叶苷含量存在显著差异。根皮苷的含量在一年中也随季节的推移呈现出先升后降的趋势，在秋季时，根皮苷含量达到最高，49.959mg/g。野生多穗柯同一植株上的嫩叶和老叶中根皮苷和三叶苷的含量变化具有一定的规律性：从嫩叶到老叶，根皮苷含量增加，三叶苷含量却大幅度下降。根皮苷在老叶中含量可达14.46％，而三叶苷在嫩叶中高达24.35％。光质量、光强、光周期影响多穗柯的基因表达水平，从而直接影响多穗柯中根皮苷含量，随着日照时数的增加，根皮苷含量会显著降低，而三叶苷含量随着无霜期的增加而显著降低。通过检测多穗柯根皮苷和三叶苷的含量更更直观快速地评价多穗柯的主要活性成分，为选取和大力多穗柯提供有力的科学依据，为多穗柯产业化打下良好的基础。目前有关于检测多穗柯根皮苷和三叶苷的方法主要有如下几种：
如专利CN 104090040 B公开了一种快速检测多穗柯主要活性成分的HPLC方法，包括测定样品处理、提取测定样品、制备标准样品和检测工序，选取60目和120目之间的多穗柯叶粉为原料样品，用甲醇水溶液超声提取，重复提取4次，合并上清液，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪进行分析测定，HPLC的流动相为乙腈和体积百分含量0.02-0.06％的甲酸水溶液的体积比为26-30∶70-74等度洗脱，流速为0.7-0.9mL·min-1，检测波长：285nm。本方法能直观快速评价野生多穗柯的质量，为多穗柯优良品的选择并对其定向培育提供科学依据。
如专利CN 110540558 A公开了一种高纯度根皮苷的制备及其质量检测方法，先利用TLC检测收集流份中的根皮苷，再利用HPLC检测干根皮苷产品的纯度。其中TLC检测方法为：薄层板：硅胶G；3种展开剂系统：系统(1)二氯甲烷-甲醇体积比例7:3，系统(2)石油醚–乙酸乙酯-甲醇-甲酸体积比例为2:18:2:1，系统(3)乙酸乙酯-甲酸-水体积比例14:1:1；点样：用甲醇制1mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为2μg、5μg、10μg、20μg、25μg；置展开缸分别展开，展距：15cm；定位：喷以3％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯，365nm，下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，10μm；流速：0.6-1.5ml/min；进样量：19～118μg；面积归一化法、主成分自身对照法定量；系统条件为以下三个条件的其中之一：条件(1)流动相：甲醇–水体积比例30:70-90:10，检测波长：220～370nm；条件(2)流动相：乙腈–水体积比25:75-80:20，检测波长：220～370nm；条件(3)流动相：甲醇–水体积比例20:80-80:20，检测波长：220～370nm。本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查、含量测定及质量控制，确保产
品的质量。
虽然采用高效液相色谱法能够对多穗柯叶片的根皮苷含量进行比较精准的测定，比较适合在科研人员使用，但由于设备成本较高、对检测人员的操作技能要求高、耗时长等原因，对于批量种植或生产多穗柯茶的场所并不适用。为了能够简化多穗柯活性成分的检测过程，更好地指导农户进行多穗柯鲜叶选择性采摘，确保原料符合生产需求，本发明采用手持叶绿素测定仪测定不同成熟叶片的叶绿素含量，通过叶绿素与根皮苷、三叶苷的相关性方程，从叶绿素含量计算出根皮苷、三叶苷的含量，为多穗柯鲜叶的针对性采摘提供科学参考。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
本发明针对当前检测多穗柯根皮苷和三叶苷存在的问题，提供一种快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法。本方法通过检测多穗柯鲜叶中叶绿素的含量，再根据叶绿素与根皮苷及三叶苷的拟合曲线方程关系，快速计算出根皮苷含量和三叶苷含量；简化了生产过程中鲜叶根皮苷和三叶苷的测定过程，为多穗柯的原料采收及多穗柯茶的加工提供了直观的评价和参考，在多穗柯种植基地或茶叶加工场所对产品质量控制提供有利的支撑。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，包括如下步骤：
S1:测定叶绿素含量：采集新鲜的多穗柯叶片，按照叶片大小和成熟度分为多类，每类叶片随机采集3-5片，用叶绿素测定仪测定叶片的叶绿素含量；
S2:高效液相色谱法测定根皮苷和三叶苷标准品：分别准确称取根皮苷和三叶苷标准25mg，用甲醇溶解，定容至25ml，配成浓度为1mg/ml的混合标样母液；用移液枪分别定量抽取不用量的混合标样母液，用甲醇分别定容至10ml，配制成一些列浓度的标准溶液，再利用高效液相色谱法测定标准溶液的峰面积值，以根皮苷和三叶苷的进样量作为横坐标，峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，分别绘制根皮苷和三叶苷线性回归方程；
S3:多穗柯样品溶液的制备：称取测定多组过叶绿素的多穗柯叶片0.2000g，装入10ml离心管中，用5ml纯甲醇在超声辅助下浸提，高速离心，取上层清液，浸提多次，合并上层清液，定容至25ml容量瓶中，摇匀，经过0.45μm超滤膜进行过滤，取滤液作为待测样品溶液；
S4:高效液相色谱法测定多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷含量：取多组待测样品溶液注入高效液相色谱柱，与步骤S2相同的色谱条件下测定溶液的峰面积，根据线性回归方程计算各组别根皮苷和三叶苷的含量；
S5:建立叶绿素与根皮苷、三叶苷含量的相关性方程：以各组测得的根皮苷含量或三叶苷含量作为纵坐标，步骤S1测得的叶绿素含量作为横坐标，作根皮苷含量或三叶苷含量与叶绿素含量的相关性曲线方程；
Y根皮苷＝0.12X+2.39(R2＝0.9980)
Y三叶苷＝＝-0.008+1521.58*0.785x
S6:通过测定新鲜多穗柯叶片的叶绿素含量，根据步骤S5的相关性曲线方程即可计算出多穗柯根皮苷及三叶苷的含量。
作为本发明方案的进一步优化：步骤S2中一系列标准溶液的浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的标准溶液。
作为本发明方案的进一步优化：所述高效液相色谱的测定条件为：色谱柱为C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.04％甲酸(28:72)；流速0.8mL/min；检测波长285nm；柱温为室温；进样量20μL。
作为本发明方案的进一步优化：步骤S1至少分为5类以上样品。
作为本发明方案的进一步优化：步骤S3所述超声辅助浸提是在45kHz、30℃下浸提10-20min。
作为本发明方案的进一步优化：步骤S3所述高速离心是在转速为3500r/min下离心10min。
作为本发明方案的进一步优化：所述浸提多次是浸提5次以上。
作为本发明方案的进一步优化：步骤S5根皮苷的线性范围为21.9-48.2。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
本方法只需通过检测多穗柯鲜叶中叶绿素的含量，再根据叶绿素与根皮苷及三叶苷的拟合曲线方程关系，快速计算得知根皮苷含量和三叶苷含量；简化了生产过程中鲜叶根皮苷和三叶苷的测定过程，为多穗柯鲜叶活性成分的快速检测提供了有效途径，更好地指导农户进行多穗柯鲜叶选择性采摘，确保原料符合生产需求，为多穗柯的原料筛选及多穗柯茶加工现场色选分级提供了直观的评价和科学参考，在多穗柯种植基地或茶叶加工场所对多穗柯甜茶质量控制提供有利的支撑。
附图说明
图1为不同成熟度的多穗柯新鲜叶片的图片；
图2为多穗柯甲醇浸提液紫外可见光谱图；
图3为根皮苷含量与叶绿素含量的相关性曲线；
图4为三叶苷含量与叶绿素含量的相关性曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
多穗柯样品于2021年6月采于广西林科院多穗柯良种基地。标准品根皮苷(phloridzin)和三叶苷(trilobatin)购于(HPLC≥98.0％，四川省维克奇生物科技有限公司)。
一种快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，包括如下步骤：
S1:测定叶绿素含量
采集新鲜的多穗柯叶片，按照叶片大小和成熟度(表观颜色)分为9类，如附图1所示，每类树叶采集50片树叶，每类叶片随机采集5片，用叶绿素测定仪测定叶片的叶绿素含量，测定结果如表1。
表1：多穗柯鲜叶的叶绿素含量
S2:高效液相色谱法测定根皮苷和三叶苷标准品
分别准确称取根皮苷和三叶苷标准25mg，用甲醇溶解，定容至25ml，配成浓度为1mg/ml的混合标样母液；用移液枪分别定量抽取0.5、1、2、3、4、5ml混合标样母液，用甲醇分别定容至10ml，配制成50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的系列标准溶液；再利用高效液相色谱法测定标准溶液的峰面积值，以根皮苷和三叶苷的进样量作为横坐标，峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，分别绘制根皮苷和三叶苷线性回归方程。
Y根皮苷＝9.248×103X+1.1950×104(R2＝0.9998)……式1
Y三叶苷＝1.516×104X+2.447×104(R2＝0.9998)……式2
S3:多穗柯样品溶液的制备
称取0.2000g多穗柯鲜叶(已测定过叶绿素含量)，装入10ml离心管中，用5mL纯甲醇在超声辅助下(45kHz，30℃)浸提15min，再以3500r/min转速进行离心10min，取上层清液，浸提5次，合并上层清液，定容至25ml容量瓶中。待样品在进样检测之前经0.45μm超滤膜进行过滤，取滤液作为待测样品溶液。
S4:用紫外可见分光光度计进行叶绿素浸提液全波长扫描
取上述待测样品溶液采用紫外可见进行全波长扫描，从600～700nm，得到光谱图，见图2。在664nm处的吸光度值与叶绿素测定仪测得的数据呈现相同的规律。样品1是老叶，样品9是嫩叶(刚萌芽的)，样品1的叶绿素含量最高，所对应的吸光度值也是最高，而样品9的叶绿素含量最低，所对应的吸光度值也是最低。因此，手持叶绿素测定仪得到的检测数据与紫外可见得到的数据呈现出相似规律，说明采用叶绿素测定多穗柯根皮苷和三叶苷的方法可靠。
S5:高效液相色谱法测定多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷含量
取上述9组待测样品溶液注入高效液相色谱柱，与步骤S2相同的色谱条件下测定溶液的峰面积平均值，每组进样3针根据线性回归方程计算各组别根皮苷和三叶苷的含量，计算结果如表2所示。
表2：样品的根皮苷和三叶苷含量
S6:建立叶绿素与根皮苷、三叶苷含量的相关性方程
以样品测定得到的测得的根皮苷含量或三叶苷含量作为纵坐标，步骤S1测得的叶绿素含量作为横坐标，作根皮苷含量或三叶苷含量与叶绿素含量的相关性曲线方程，如图3和图4所示。
Y根皮苷＝0.12X+2.39(R2＝0.9980)……式3
Y三叶苷＝＝-0.008+1521.58*0.785x……式4
由图3和式3可知，多穗柯的根皮苷含量和叶绿素含量的在一定范围内存在线性关系，确定线性范围为21.9-48.2。说明多穗柯叶绿素的积累与根皮苷的积累呈现相同规律，均随着叶片的成熟度增加而增加，且在一定范围内，可通过手持叶绿素测定仪测得的叶绿素含量，估算多穗柯中根皮苷的含量，为多穗柯甜茶制作的原料筛选，提供了快速检测手段。
从图4和式4可以看出，多穗柯三叶苷含量随着叶绿素含量增加而下降。
本方法应用在广西巴马瑶族自治县多穗柯种植基地对根皮苷叶片根皮苷和三叶苷含量的检测，使用手持叶绿素测定仪测定五组鲜叶的叶绿素含量分别为49.8SPAD、42.3SPAD、38.1SPAD、30.2SPAD、26.5SPAD，通过曲线方程式3和式4计算得根皮苷含量分别为8.37％、7.47％、6.96％、6.01％、5.57％，三叶苷含量分别为0、0.04％、0.14％、1.00％、2.48％；利用高效液相色谱法测得根皮苷的含量是8.20％、7.35％、7.02％、6.12％、5.60％，三叶苷的含量是0、0、0.10％、1.10％、2.50％，叶绿素法和高效液相色谱法所得的测定结果基本一致，说明本方法可靠，为多穗柯鲜叶的采摘提供了有效途径。
本方法应用在广西柳州市三江县加工多穗柯茶叶场所，对根皮苷叶片根皮苷和三叶苷含量的检测，使用手持叶绿素测定仪测定三组叶片的叶绿素含量分别为44.6SPAD、34.5SPAD、30.8SPAD，通过曲线方程式3和式4计算得根皮苷含量分别为7.74％、6.53％、6.09％，三叶苷含量为0.02％、0.35％、0.87％；利用高效液相色谱法测得根皮苷的含量是7.78％、6.35％、6.06％，三叶苷的含量是0、0.42％、0.90％，叶绿素法和高效液相色谱法所得的测定结果基本一致，说明本方法可靠，为多穗柯茶叶加工对质量监控提供有力的依据。
由此得知，本方法只需要通过测定多穗柯的叶绿素含量，根据曲线方程式3和式4分别估算多穗柯根皮苷含量和三叶苷含量，为多穗柯活性生物活性成分根皮苷和三叶苷含量的快速检测提供了科学手段，可有效指导多穗柯林区鲜叶采收时原料筛选，为制成多穗柯条形茶的原料选择提供了科学参考，简化了生产过程中鲜叶根皮苷和三叶苷的测定过程，在多穗柯种植基地或茶叶加工场所对多穗柯甜茶质量控制提供有利的支撑。
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应视为属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1:测定多穗柯叶片叶绿素含量：采集新鲜的多穗柯叶片，按照叶片大小和成熟度分为多类，每类叶片随机采集3-5片，用叶绿素测定仪测定叶片的叶绿素含量；
S2:高效液相色谱法测定根皮苷和三叶苷标准品：分别准确称取根皮苷和三叶苷标准，用甲醇溶解，定容至25ml，配成浓度为1mg/ml的混合标样母液；用移液枪分别定量抽取不用量的混合标样母液，用甲醇分别定容至10ml，配制成一些列浓度的标准溶液，再利用高效液相色谱法测定标准溶液的峰面积值，以根皮苷和三叶苷的浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，分别拟合出多穗柯根皮苷和三叶苷的线性回归方程；
S3:多穗柯新鲜叶片样品溶液的制备：准确称取已知叶绿素的多穗柯叶片0.2000g，装入10ml离心管中，用5ml纯甲醇在超声辅助下浸提，高速离心，取上层清液，浸提多次，合并上层清液，定容至25ml容量瓶中，摇匀，经过0.45 μm超滤膜进行过滤，取滤液作为待测样品溶液；
S4:高效液相色谱法测定多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷含量：取多组待测样品溶液注入高效液相色谱柱，与步骤S2相同的色谱条件下测定样品溶液的峰面积，根据线性回归方程计算各组别根皮苷和三叶苷的含量；
S5:建立根皮苷含量、三叶苷含量与叶绿素含量间的相关性方程：以各组测得的根皮苷含量或三叶苷含量作为纵坐标，步骤S1测得的叶绿素含量作为横坐标，作根皮苷含量或三叶苷含量与叶绿素含量的相关性曲线方程；
Y根皮苷=0.12X+2.39 (R2=0.9980)
Y三叶苷=-0.008+1521.58*0.785x
S6:通过测定新鲜多穗柯叶片的叶绿素含量，根据步骤S5的相关性曲线方程即可计算出多穗柯根皮苷及三叶苷的含量。
2.根据权利要求1所述快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，其特征在于：步骤S2中一系列标准溶液的浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的标准溶液。
3. 根据权利要求1所述快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，其特征在于：所述高效液相色谱的测定条件为：色谱柱为C18（4.6 mm×250 mm，5μm）； 流动相为乙腈-0.04% 甲酸（28: 72）；流速0.8 mL/min；检测波长285 nm；柱温为室温；进样量20 μL。
4.根据权利要求1所述快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，其特征在于：步骤S1至少分为5类以上样品。
5. 根据权利要求1所述快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，其特征在于：步骤S3所述超声辅助浸提是在45 kHz、30 ℃下浸提10-20min。
6. 根据权利要求1所述快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，其特征在于：步骤S3所述高速离心是在转速为3500 r/min下离心10min。
7.根据权利要求5或6所述快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，其特征在于：所述浸提多次是浸提5次以上。
8.根据权利要求1所述快速检测多穗柯叶片中根皮苷和三叶苷的方法，其特征在于：步骤S5根皮苷的线性范围为21.9-48.2。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103323406A (zh) * | 2013-06-05 | 2013-09-25 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 一种茶树鲜叶氟含量无损快速确定方法 |
| CN104090040A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-10-08 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种快速检测多穗柯主要活性成分的hplc方法 |
| CN106690244A (zh) * | 2015-11-14 | 2017-05-24 | 黄志萍 | 一种新的甜味绞股蓝甜味素制备及其应用 |
| CN113512081A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-10-19 | 湖南绿蔓生物科技股份有限公司 | 一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法 |
-
2021
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103323406A (zh) * | 2013-06-05 | 2013-09-25 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 一种茶树鲜叶氟含量无损快速确定方法 |
| CN104090040A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-10-08 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种快速检测多穗柯主要活性成分的hplc方法 |
| CN106690244A (zh) * | 2015-11-14 | 2017-05-24 | 黄志萍 | 一种新的甜味绞股蓝甜味素制备及其应用 |
| CN113512081A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-10-19 | 湖南绿蔓生物科技股份有限公司 | 一种从木姜叶柯叶子中分离出三叶苷和根皮苷的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 王坤 等: "野生多穗柯主要活性成分及其含量变化", 经济林研究, vol. 34, no. 04, pages 96 - 100 * |
| 罗文姬 等: "镉胁迫下多穗柯幼苗的生长及生理响应", 热带作物学报, vol. 38, no. 08, pages 1446 - 1450 * |
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